GraftMaturity

千葉大学大学院

佐藤 祐介

目次

・腱と靭帯

・腱を移植することになった経緯

・Graft maturityにおけるヒトと動物の違い

・Ligamentizationに関して（ヒトの報告を中心に）

・Tendon to Bone healingに関して（ヒトの報告を中心に）

・Graft maturityに影響しそうな因子（動物の報告から）

・まとめ

前十字靭帯再建術における自家腱グラフト

必要とされる機械的特性を提供するために靭帯と腱は組成が異なる。

腱と靭帯の構造的な相違にもかかわらず、腱移植片がACL再建で使用されている。

靭帯 腱

目次

・腱と靭帯の違い

・腱を移植することになった経緯

・Graft maturityにおけるヒトと動物の違い

・Ligamentizationに関して（ヒトの報告を中心に）

・Tendon to Bone healingに関して（ヒトの報告を中心に）

・Graft maturityに影響しそうな因子（動物の報告から）

・まとめ

“Law of functional adaptation”「臓器は機能的、量的、質的に変化することに構造に適応する」

靱帯や腱などの軟部組織が、異なる機械的負荷や生物学的環境にさらされたときに、その機械的および生物学的特性に変化を起こす。

２０世紀初頭、ヴィルヘルム・ルー

“Ligamentization”1986年、Amielらは、ウサギのACL再建を自家腱で 「靭帯化」のプロセスを実証。

“Ligamentization” animal

Early healing

Remodeling

Maturation

Neo Vascularization

hyper vascularity

Hypo vascularity

原繊維崩壊Neclosis

細胞数増加繊維芽細胞は卵円形に不規則に配置代謝的に活性

細胞は卵形縦方向に平行に整列

コラーゲン線維がACLに比べて小さい

Cellularity

Proliferation

Phase mechanical strength

Scheffler,KSSTA2008

“Ligamentization” animal

Early healing

Remodeling

Maturation

Neo Vascularization

hyper vascularity

Hypo vascularity

原繊維崩壊Neclosis

細胞数増加繊維芽細胞は卵円形に不規則に配置代謝的に活性

細胞は卵形縦方向に平行に整列

コラーゲン線維がACLに比べて小さい

Cellularity

Proliferation

Phase mechanical strength

Scheffler,KSSTA2008

The Ligamentization Process:A 4 Year Case Study Following ACL Reconstruction With a Semitendinosis Graft

J.G.Lane、Arthroscopy 1993

44歳 男性ACL術後４年の再建靭帯

64歳女性正常 ACL

VS VS44歳 男性ハムストリング腱

幅狭で短い長軸方向に配列

幅が太く長い 粗い 幅が狭く短い

HE染色

偏光顕微鏡

自家移植腱（ST)はACLと細胞組成が類似していた（術後４年）

目次

・腱と靭帯の違い

・腱を移植することになった経緯

・Graft maturityにおけるヒトと動物の違い

・Ligamentizationに関して（ヒトの報告を中心に）

・Tendon to Bone healingに関して（ヒトの報告を中心に）

・Graft maturityに影響しそうな因子（動物の報告から）

・まとめ

Ligamentizationにおけるヒトと動物の決定的な違い

Healing Processの早さ

Graft Maturityまでに要する期間

Leo,Arthroscopy2013

Ligamantaization Process早 Animal＞＞＞Human 遅

Humanの報告を中心に

Steven, Am J Sports Med 2011

目次

・腱と靭帯の違い

・腱を移植することになった経緯

・Graft maturityにおけるヒトと動物の違い

・Ligamentizationに関して（ヒトの報告を中心に）

・Tendon to Bone healingに関して（ヒトの報告を中心に）

・Graft maturityに影響しそうな因子（動物の報告から）

・まとめ

GraftMaturity

・Ligamentization

関節内（グラフト全体）

・Tendon to Bone Healing骨孔内

animal＞human

animal＞＞human

・Ligamentization関節内

MATURATION OF ALLOGRAFT TENDONS TRANSPLANTED INTO THE KNEE

Shino,JBJS Br 1988

Material ＆Method

69例(女性:26 男性:43) 手術時平均年齢22.3歳他家グラフト：アキレス腱、前脛骨筋腱、後脛骨筋腱、ハムストリング腱

Second look biopsy:術後6週～55か月

術後 関節鏡所見 関節鏡写真

６週 Thick hypervascularsynovial sheathで既に被覆

３か月 Synovial sheathはより薄くなるが正常より厚い表面のhyper vascularは残存

６か月 Synovial sheathは正常程度に薄くなるhyper vascularは残存

12か月 正常ACLと似てくる中間部はhypo vascular大腿骨側、脛骨側はhyper

3年 全体的に表面はhyper

病理所見

３か月 紡錘形核を有する

線維芽細胞

６か月 細胞増殖屈折しながらコラーゲン束が規則的に配列

12か月 滑膜表層細胞はACLに類似

細胞数の増加は持続

18～55か月

きれいに配列したコラーゲン束、紡錘形の核

正常細胞数

病理所見

３か月 紡錘形核を有する

線維芽細胞

６か月 細胞増殖屈折しながらコラーゲン束が規則的に配列

12か月 滑膜表層細胞はACLに類似

細胞数の増加は持続

18～55か月

きれいに配列したコラーゲン束、紡錘形の核

正常細胞数

11～12か月で正常ACLと似た構造となりGraft maturityまでは18か月を要し以後は変わらなかった

Revascularization and Ligamentization of Autogenous Anterior Cruciate Ligament Grafts in Humans

Falconiero、Arthroscopy1998

ACL術後 48人（平均年齢26.1歳）→second look時にmidsubstance biopsy

①3-6か月 (n=10)➁7-12か月 (n=10)③12か月- (n=23)④control(native ACL) (n=5)

評価項目(1)Vascularity (2)Cellularity (3)Metaplasia (4)Fiber pattern

異形成は無血管、無細胞により配列が乱れた結果に起こるが新生血管の増生にともない解消される

Maturity:-12か月

Remodelling of human hamstring autografts after anterior cruciate ligament reconstructionKnee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 2011

セカンドルック時に再建靭帯（関節内）をbiopsy⇒組織評価Hamstring autograft (F:Bone Mulch Screw ,T: WasherLoc ,90–100 N ;knee in full extension. )

group 1 (6–12 months; n = 15) group 2 (13–24 months; n = 16)group 3 (24 months＜; n = 11)

controls:native HT (n = 17) and 受傷から８週以内のACL (n = 8)

〇細胞密度：haematoxylin–eosin and Masson-Goldner-Trichrom〇新生血管：immunostaining von Willebrandt factor (factor VIII) antibody〇筋線維芽細胞密度 ： immunostained with a mouse anti-human ASMA monoclonal抗体〇コラーゲン配列

細胞密度

３群とも native HTより細胞密度が高い, 特に術後 13–24 months で高く２４か月以降になると減ってくる

新生血管

術後６－１２か月ではまだまだ少ない１３－２４か月でnative HTと同じくらいになってくるが、native ACL には及ばない

筋線維芽細胞

術後１２か月までと１３ー２４か月では大きな差がある。

細胞密度

３群とも native HTより細胞密度が高い, 特に術後 13–24 months で高く２４か月以降になると減ってくる

新生血管

術後６－１２か月ではまだまだ少ない１３－２４か月でnative HTと同じくらいになってくるが、native ACL には及ばない

筋線維芽細胞

術後１２か月までと１３ー２４か月では大きな差がある。

ヒトハムストリング腱のリモデリングは二年では終わらない

The “Ligamentization”Process in Anterior Cruciate Ligament ReconstructionWhat Happens to the Human Graft? A Systematic Review of the Literature

Steven, Am J Sports Med 2011

血管新生

すべてのグラフトの周囲に血管新生が認められ、関節内でグラフトは生存する

ACL再建後早期に高血管形成するが、リモデリング中に徐々に低下する。

新生血管は、滑膜、膝蓋下脂肪体、pseudoligamentummucosumからの発生が示唆されているがこれを裏付ける証拠が含まれている研究はない。

Neo Vascularization

hyper vascularity

Hypo vascularity

細胞のリモデリング

新たな線維芽細胞の正確な供給源は不明。

ACL再建後にグラフトの細胞再増殖が起こる（血管新生と並行して、術後初期に細胞数の増加を示す）。

この初期段階では、繊維芽細胞は、塊状の核に解体され、ランダムに配置され、代謝的に活性である。

リモデリングが進むにつれ、細胞はACLのように縦方向に整列し、核は卵形にならなくなる。

細胞外基質

初期には組織化されていない、不規則なコラーゲン束。

移植片が成熟するにつれコラーゲン束は密集し平行に整列。

横断切片におけるコラーゲン線維が正常腱およびACLのものに比べて均一に小さい

コラーゲン線維直径の二峰性は、時間の経過と共に単峰性の径の小さな繊維になる

〇Falconiero術後12ヶ月のグラフトは組織学的にACLと比較して有意な差異なし。Ligamentizationは12ヶ月間にわたって起こり、成熟は1年以降。

〇Rougraff術後3年までは、変性、新生血管および細胞増加を観察し続けた。

〇Abe術後1年でまだリモデリングが継続している。（15ヶ月以上の症例なし）

〇Sa 'nchezグラフトは術後約2年で成熟する。

Systematic Review“Ligamentization” in Hamstring Tendon Grafts After Anterior CriciateLigament Reconstruction:A Systematic Review of the Literature and a Glimpse Into the Future

Leo,Arthroscopy2013

Systematic Review“Ligamentization” in Hamstring Tendon Grafts After Anterior CriciateLigament Reconstruction:A Systematic Review of the Literature and a Glimpse Into the Future

Leo,Arthroscopy2013

グラフト表面に滑膜由来治癒反応HTと同様のコラーゲンパターンと、不規則なコラーゲン配列が混在

血管再生の徴候がなく血管密度は最も低い局所的な細胞減少、全体の細胞密度は増加

細胞密度上昇、強烈な細胞増殖血管新生増加、グラフト周囲は高血管新生

繊維芽細胞密度ならびに全体の細胞密度は、この段階で最大に増加

コラーゲン束は規則的に配列

レムナントとグラフトは区別不可全体的に細胞は、成熟したコラーゲンマトリックス内で良好に配列

ACLと同様の規則的なパターン不規則な細胞およびコラーゲン配列が、グラフト周囲に一部残存

細胞密度は減少（＞正常ACL）血管密度はさらに増加（＜正常ACL）

Earlyhealing

前半

後半

Remodering

maturation

Ligamentization of humstring tendon

ACLに類似した構造になるがACLの特性を完全に復元することはできない

Ligamentization of Autogenous Hamstring Grafts After Anterior Cruciate Ligament ReconctructionMidterm Versus Long-term Results

Dong, Am J Sports Med 2015

背景：過去の研究では、前十字靱帯（ACL）再建で移植されたグラフトの

最終的なコラーゲン構造は単峰性で小径のコラーゲン線維のみ。

ACLおよびハムストリング腱は、大小のコラーゲン線維からなる二峰性のコラーゲン線維分布を示す。

仮説：時間依存性に二峰性のコラーゲン線維分布が出現する

方法：ACL再建後、second look biopsy：52人

：中期群（27人の患者）、13～30ヶ月：長期群（25人の患者）、 31～62ヵ月Contorol:正常ACL9人、ハムストリング腱9人

コラーゲン原線維分布を分析した

bimodal distribution62.9% in the midterm group 52.0% in the long-term group

目次

・腱と靭帯の違い

・腱を移植することになった経緯

・Graft maturityにおける人と動物の違い

・Ligamentizationに関して（ヒトの報告を中心に）

・Tendon to Bone healingに関して（ヒトの報告を中心に）

・Graft maturityに影響しそうな因子（動物の報告から）

・まとめ

・Tendon to Bone Healing骨孔内

Histological Evaluation of Tendon-Bone Healing of an Anterior Cruciate Ligament Hamstring Graft in a 14-Year-Old BoyAm J Sports Med 2015 ハムストリング腱を用いたsingle 再建

（F; EndoButton T; Milagro screw）術後４か月でのwhole Knee Histlogical evaluation（骨肉腫のため切断）

脛骨側:・新生血管、良好なosteointegrationを認めコラーゲン線維が移植腱と並行に配列していた・スクリューに直接触れている骨は死んでいたが、スクリュー近くの骨梁は成熟しており新生骨が混在・層状に成熟した骨がグラフトを取り囲み新生骨がグラフト内にingrowthしていた・Interfaceのコラーゲンは未熟で不規則な配列だった

大腿骨側:・腱内に脂肪あり 血管新生は脛骨ほどない

osteointegrationなし

Salcoma(脛骨近位）が放出する血管内皮細胞増殖因子の影響

★脛骨側

グラフトは成熟したコラーゲンファイバーになっておりグラフトを取り囲むように新たなコラーゲンファイバー(Sharpy like fiber)が多く見られた

層状に成熟した骨がグラフトを取り囲み新生骨がグラフト内にbone ingrowth

動物より時間はかかるが傾向は同じIndirect Healing

Hamstring Insertion Site Healing After Anterior Cruciate Ligament Reconstruction in Patients With Symptomatic Hardware or Repeat Rupture:A Histologic Study in 12 Patients

Robert,Arthroscopy,2003

術後3か月:1例境界には多数の細胞や繊維組織と毛細血管を確認しEdemaにより境界が明瞭に区切られ骨と細胞や繊維組織はコンタクトしていない

術後5,6か月:２例骨と腱をつないでいる結合組織（線維芽細胞、毛細血管）が明瞭となるが、Sharpy fiber(type Ⅲ collagen)は少ない層状骨はWOVEN boneに完全に覆われている

術後10-12か月:3例境界には多くのsharpy fiber。グラフトは波状に整列し正常な細胞密度となる。

術後1年-:4例全周性にsharpy fiber

幼弱なコラーゲンファイバーが３か月からみられ

indirect anchorage が成熟するまで１０～１２か月を要した。

目次

・腱と靭帯の違い

・腱を移植することになった経緯

・Graft maturityにおける人と動物の違い

・Ligamentizationに関して（人の報告を中心に）

・Tendon to Bone healingに関して（人の報告を中心に）

・Graft maturityに影響しそうな代表因子（人、動物の報告）

・まとめ

年齢Age-Dependent Healing Potential of Anterior Cruciate Ligament Remnant-Derived Cells

Am J Sports Med 2015

ヒトACLレムナントを手術時に採取しACL由来細胞を培養

10 to 19 years (younger group)

30 to 39 years (older group)PBS group

→ラットACLRモデルに閉創時IAI

評価項目

ラットの組織 micro-CT 引張り試験

軟骨内骨化様Osteointegrationがyounger groupで術後４週で観察された

８週するとolder groupとPBS groupでもこの反応が見られた。その間にyounger groupはbone ingrowthが完成していた

human-derived Morphometric Evaluation 毛細血管（血管新生）、骨芽細胞内皮細胞、オステオカルシン

Bone Tunnel Evaluation byMicro–Computed Tomography

Biomechanical Assessment

CD34陽性細胞は多分化能、増殖能力が高いことがin vitroで証明されている

Healing potentialTeen＞older

性別Sex Influences the Biomechanical Outcomes of Anterior Cruciate Ligament Reconstruction in a

Preclinical Large Animal ModelAm J Sports Med 2015

adolescent Yucatan minipigs (23 male, 18 female) に片側のACL再建sex-matched bone–patellar tendon–bone allografts

評価項目（術後１５週）

引張り試験 組織 不安定性 軟骨損傷（OA)

Healing potentialFemale ＜ Male

腱へのストレスが増強するとリモデリング後の腱に生体力学的および組織学的に影響を及ぼすか？

Group1 :そのまま膝蓋腱を液体窒素で凍結し、その後解凍

Group2:断面積が元の断面積の66％～67％。理論的には、生理的ストレスの150％

Group3: 断面積は49％から51％。理論的には、生理的ストレスの200％。

Control:intact膝蓋腱

3週、6週で屠殺し組織修復後の膝蓋腱を評価力学試験、組織評価

腱への負荷

3週 6週

組織学的所見

Group１3週間で後方に卵形または紡錘形の核を有する細胞。芯部は無細胞。コラーゲン束は縦方向に整列。

Group2（ストレス150％）細胞核の形状は、第1群のものと同様であったが、芯部において無細胞領域がより広い。

Group３（ストレス200％）3週間でコラーゲン束の断片化。紡錘形核、桿状の核を有する細胞はあまり観察されない。６週でコラーゲン配列の乱れ（図3f）。

組織学的所見

Group１3週間で後方に卵形または紡錘形の核を有する細胞。芯部は無細胞。コラーゲン束は縦方向に整列。

Group2（ストレス150％）細胞核の形状は、第1群のものと同様であったが、芯部において無細胞領域がより広い。

Group３（ストレス200％）3週間でコラーゲン束の断片化。紡錘形核、桿状の核を有する細胞はあまり観察されない。６週でコラーゲン配列の乱れ（図3f）。

リモデリング過程において過度に高いストレスは腱の機械的性質を低下させた。

膝蓋腱自家移植に対する高いストレスは靱帯再建後に回避するべき

Influence of the Injury-to-Surgery Interval on the Healing Potential of HumanAnterior Cruciate Ligament–Derived Cells

Inokuchi. Am J Sports Med 2017

方法：ヒトのACL断裂組織を、関節鏡視下ACL再建を受けた患者から採取（1）Erarly群（受傷から3ヶ月以内）（2）Chronic群（受傷から3ヶ月以降）。

雌性免疫不全ラットにACL再建後ヒトACL由来細胞を関節内投与

手術のタイミング

ACL由来細胞の増殖能

TB界面でのQtracker 655染色によって示された移植細胞分布。 Qtracker染色（赤色）はTB境界部の移植細胞。

組織学的評価

第4週 Early群脛骨孔に軟骨内骨化様のosteointegrationTendon-Bone healingの増強 促進

第8週Chronic群とPBS群でも軟骨内骨化のような集積が見られた.Early群では成熟骨が認められた

4週：早期群の腱骨境界で有意に多くの線維軟骨が出現

8週：3群間で線維軟骨領域の有意差はなし

ヒトACL由来細胞移植後に増強された血管新生および骨形成

毛細血管密度で評価した脈管形成 骨形成

骨孔拡大 力学試験

ヒトACL由来細胞移植後に増強された血管新生および骨形成

毛細血管密度で評価した脈管形成 骨形成

骨孔拡大 力学試験

Healing PotentialEarly＞Chronic

目次

・腱と靭帯の違い

・腱を移植することになった経緯

・Graft maturityにおける人と動物の違い

・Ligamentizationに関して（ヒトの報告を中心に）

・Tendon to Bone healingに関して（ヒトの報告を中心に）

・Graft maturityに影響しそうな因子（ヒト、動物の報告）

・まとめ

Graft maturity

12-18か月早 遅

teen早期手術

Elder陳旧例女性

過度な再建靭帯への負荷

まとめ