MITOCHONDRIÁLNÍ PROTEÁZY

Lukáš Stibůrek

INTRACELULÁRNÍ PROTEOLÝZA

Koncept „proteinového obratu“ – 40. léta minulého století Rudolf Schoenheimer na Columbia Univ – společně s Davidem Rittenbergem pokusy s 15N-značenými AK

Lysozom – objeven v polovině 50. let Christian de Duve

ATP-dependentní proteolýza za nepřítomnosti lysozomů (retikulocyty) – 1977 Alfred Goldberg

Ubikvitin-dependentní proteolýza – 1980 Aaron Ciechanover et al. Institute of Technology, Haifa

2004 Nobelova cena – Aaron Ciechanover, Avram Hershko, Irwin Rose

A. NESELEKTIVNÍ – MAKROAUTOFAGIE (Lysozom)

B. SELEKTIVNÍ –

– VNĚJŠÍ MEMBRÁNA – 26S Proteazom

– MEZIMEMBRÁNOVÝ PROSTOR, VNITŘNÍ MEMBRÁNA A MATRIX – Mitochondriální proteázy

• selektivní intramitochondriální proteolýza - různé poločasy života mitochondriálních proteinů

• ~5% mitochondriálních proteinů degradováno za hodinu – vysoká stabilita

• 5-10% nově importovaných preproteinů degradováno – efektivita mitochondriální biogeneze >90%

MITOCHONDRIÁLNÍ PROTEOLÝZA

MITOCHONDRIÁLNÍ PROTEÁZY (funkční třídy)

1. Procesující peptidázy – odštěpení peptidů signalizujících mitochondriální lokalizaci

2. ATP-dependentní proteázy – kontrola proteinové kvality, proteolytická maturace mito proteinů

3. Oligopeptidázy – štěpení intramitochondriálních peptidů na aminokyseliny

PROCESUJÍCÍ PEPTIDÁZY

Mitochondriální procesující peptidáza (MPP) – konzervovaná heterodimerní metalopeptidáza (, podjednotky)

Mitochondriální intermediátní peptidáza (MIP) – monomerní metalopeptidáza štěpící oktapeptid z preproteinů po jejich štěpení MPP

Peptidáza vnitřní membrány (IMP) – heterotrimerní komplex ukotvený ve vnitřní membráně s aktivní doménou exponovanou do IMS

Atp23 (KUB3) – konzervovaná metalopeptidáza se specifickou funkcí – štěpí presekvenci mtDNA kódované podjednotky Atp6 (yeast). Bifunkční charakter – dále funguje jako šaperon Atp6 při její asemblaci do komplexu ATP syntázy.

Rhomboidní proteáza (Pcp1/PARL) – serinová proteáza s katalytickou doménou uvnitř svých hydrofóbních membránových segmentů, štěpí transmembránové proteiny přímo v membráně

ATP-DEPENDENTNÍ PROTEÁZY

– odstranění nadbytečných, poškozených a špatně sbalených polypeptidů, proteolytická maturace importovaných polypeptidů

ClpXP proteáza

– heterooligomerní komplex lokalizovaný v matrix skládající se z ClpP podjednotek se serin-peptidázovou aktivitou a ClpX šaperonových podjednotek zajišťujících rozpoznání a rekrutování substrátů– zevrubně charakterizovaná u prokaryot– proteolytická ClpP podjednotka chybí u kvasinek

LON proteáza

– homooligomerní serin-proteázový komplex lokalizovaný v mitochondriální matrix– afinita k mtDNA– její podjednotky podstupují proteolytickou maturaci

ATP-DEPENDENTNÍ PROTEÁZY

AAA PROTEÁZY

Obsahují Walker A a B motivy v tzv. AAA doméně zajišťující vazbu a hydrolýzu ATP, dále pak proteolytickou doménu s konzervovanou HEXGH sekvencí

i-AAA proteáza – homooligomerní komplex podjednotek YME1 zakotvený ve vnitřní membráně s aktivní doménou v IMS

m-AAA proteáza – heterooligomerní komplex podjednotek Spg7 a Afg3L2 zakotvený ve vnitřní membráně s aktivní doménou v matrixSPG7 – hereditární spastická paraplegieAFG3L2 – hereditární ataxie SCA28

OLIGOPEPTIDÁZY

• velmi málo charakterizované • delece genů pro mitochondriální oligopeptidázy nezpůsobuje kvasinkám žádnou popř. větší újmu:

– funkční redundance jednotlivých enzymů– existence ABC transporteru Mdl1 který zajišťuje export nadbytečných peptidů z matrix– spekuluje se o signalizační funkci těchto peptidů (retrográdní signál)

Thimet oligopeptidáza (Prd1/saccharolysin) – degradace peptidů produkovaných i-AAA proteázou

Mop112/PreP olygopeptidáza – degradace peptidů produkovaných i-AAA proteázou

Bleomycin hydroláza Lap3 – duální lokalizace (cytosol/matrix)

YME1L je mitochondriální integrální membránový protein s C-koncem exponovaným do IMS, nativní molekulovou hmotností 600-1100 kDa a markantními rozdíly v tkáňové expresi

Stabilní RNAi YME1L v HEK293 buňkách vede k efektivnímu snížení hladin YME1L mRNA

Stabilní RNAi YME1L vede k efektivnímu snížení hladin YME1L proteinu, akumulaci Ndufb6 a Cox4 podjednotek a změně paternu fragmentů OPA1

Stabilní RNAi YME1L vede k zpomalení proliferace takových buněk a k fragmentaci a zeslabení mitochondriální sítě

Stabilní RNAi YME1L vede k abnormální morfogenezi mitochondriálních krist, po reexpresi YME1L-FLAG dochází k reverzi tohoto fenotypu

Stabilní RNAi YME1L vede k akumulaci subkomplexů komplexu I a IV OXPHOS a snížené respirační aktivitě komplexu I

Ndufb6, Cox4 a Cox2 jsou membránově lokalizovány a koimunoprecipitují s YME1L E543Q z YME1L RNAi buněk

Reexprese YME1L-FLAG v YME1L RNAi buňkách vede k supresi akumulace Ndufb6 a Cox4, exprese Ndufb6-FLAG v HEK293 buňkách vede k indukci tvorby subkomplexů komplexu I

Stabilní RNAi YME1L vede ke zvýšení citlivosti k oxidativnímu poškození (H2O2, 200 μM ) mitochondriálních membránových proteinů (DNP, 2,4-dinitrofenyl)

Stabilní RNAi YME1L vede ke snížené rezistenci k staurosporinem (STS, 2μM ) a H2O2 (200 μM) indukovanéprogramované buněčné smrti (apoptóze)

Koimunoprecipitace radioaktivně (35S) značených mitochondriálních translačních produktů s YME1L E543Q a jejich zvýšená stabilita v YME1L buňkách

Mgr. Jana Česneková

Mgr. Daniela Fornůsková, PhD

MUDr. Laszló Wenchich, PhD

Mgr. Olga Brantová, PhD

MUDr. Josef Houštěk, DrSc.

Prof. MUDr. Jiří Zeman, DrSc.

PODĚKOVÁNÍ