(Pre)historie buněčného cyklu.

Základní pojmy, modely a metody.

Definice BC

Buněčný cyklus je posloupnost událostí, kterými z jedné buňky vzniká větší počet buněk, zpravidla dvě.

• typická biologická definice• BC je (také) „minimální ontogeneze“ - včetně

morfogenetických aspektů!

(B. N

ěme

c, 1

90

0?)

Inoue, 50. léta: „vláknité struktury“ (meiose mikrospor Lilium longiflorum)

Endosperm, Haemanthus sp.

Saccharomyces cerevisiae(budding yeast)

Mikroskopické metody: od barvení k GFP, SEM a konfokální mikroskopii

Buněčný cyklus a morfogeneze – úhly pohledu

• Strukturní události (replikace DNA, segregace chromozómů, cytokineze)

• Začlenění do ontogeneze mnohobuněčného organismu

• Regulační stránka

???

• Why do events occur in a particular order?

• How are superficially unrelated events kept in phase?

• How are growth and division co-ordinated?

• How does the cell know where to locate new structures?

(A.E. Wheals, 1976)

(G0)

Obecné schéma eukaryotního buněčného cyklu

Identifikace fází BC: metoda FLM (frequency of labelled mitoses)

Howard, A. & Pelc, S. Heredity 6 (suppl.), 261–273 (1953) - na buňkách kořene bobu!

Metoda FLM přímo měří trvání fází

... ale je velmi pracná:

• 3H thymidin toxický ... nutno slabé značení

(Prescott, 1976)(autoradiografováno 3 měsíce!)

Kde (pokud vůbec) buňky odcházejí z cyklu, a kde tráví většinu času?

(G0)

FACS: moderní „alternativa“ FLM(ale měří něco jiného - zastoupení buněk v jednotlivých fázích!)

(J. Doležal, ÚEB)

Odbočka: metody studia (nejen) časového rozvrhu BC

• Pozorování (sensu lato):– Mikroskopie– FLM (frekvence značených mitóz– FACS

• Synchronizace– Přirozená– Indukční – Selekční

Přirozeně synchronní buňky: embrya bezobratlých a obojživelníků

Indukční synchronizace

• Hladověním– stacionární fáze, spory– specificky - P, Si (rozsivky),

světlo (řasy)– auxotrofové

• Specifickou inhibicí procesů BC– inhibitory - nocodazol (mt)– signální působky ( faktor

kvasinek)– mutace

Chlorella sp.

Synchronizace pučivé kvasinky - faktorem

Selekční synchronizace savčích buněk in vitro setřepáním buněk v M

fibroblasty (Gough lab)

Selekční synchronizace

Selekční synchronizace - „baby machine“

(Helmstetter et al.)

„lepkavý“ filtr (polylysin, lektiny)

Další možnosti selekční synchronizace

• Centrifugace do rovnováhy (isopyknická)– autospory Chlorella sp. ve ficollu

• Dělení podle velikosti (při stálé hustotě), t.j. podle odporu při centrifugaci– klasicky - lineární sacharózový gradient– moderně - elutriace

Pozor na shluky!

Synchronizace (kvasinek) centrifugální elutriací

Ať už synchronizujeme jakkoli, dlouho to nevydrží.

(Prescott 1976)

Složení reálných populací: kde v BC jsou rostlinné buňky?

(metodou FACS)

Trvání eukaryotního BC - příklady

• Saccharomyces - v bohatém médiu 1,5-2 h• Drosophila: 6 min až 10 hod

M S

6 min 10 h

M M

S

SG2

G2 G1

Lindner, Wochenschrift für Brauerei 10:1298-1300, 1893

Schizosaccharomyces pombe - fission yeast - poltivá kvasinka

Porovnání pučivé a poltivé kvasinky: proč se liší?

S. cerevisiae

S. pombe

Metazoa

Odchylky od obecného schématu: lze vynechat fáze?

• Meioza: „2 mitózy na 1 replikaci“

• Embryonální cykly: rýhování bez růstu

• Polytenní chromozómy a jiné „speciality“: endoreduplikace

(G0)

Cykly bez cytokineze: endosperm, embryo Drosophily ...

fie (fertilisation-independent endosperm), Arabidopsis

(Ohad et al. 1999)

(Sullivan et al., www)

Cykly s jiným počtem dceřinných buněk: Cn

Scenedesmus quadricaudaCn ... 2n

n = 1 - 15!

(„větší počet buněk, zpravidla dvě“)

Životní cyklus Scenedesmus sp.

(Zachleder 1995)

www.alga.cz

Chlamydomonas sp.

C2

Varianty BC - shrnutí

Co je původní?

Prokaryotní buněčné cykly

(u pomalých synchronních kultur zjištěna „S fáze“!)

(Atlung 2004)

ALE při rychlejším růstu replikace kontinuální!

Překryvné cykly, neustálá akumulace 3H thymidinu (Schaechter,Bentzon,Maaløe, 1959)

Jsou všechny regulační kroky nezbytné?

• suprimovaní oriC- mutanti: bez kontroly velikostí

• par- mutanti: replikace bez septace• sulA- mutanti: ztráta kontroly

integrity DNA• minCDE- mutanti: náhodná

lokalizace sept

(Donachie 1992 - E. coli)

Evoluce cyklu: první buňky zřejmě měly cyklus typu Cn

(0 < n ≤ 1)