Post on 19-Mar-2016
description
transcript
Imunoglobuliny – strukturaImunoglobuliny – funkceGenetický základ tvorby imunoglobulinů Biologické a chemické vlastnosti jednotlivých tříd imunoglobulinů I. (IgG, IgA)Biologické a chemické vlastnosti jednotlivých tříd imunoglobulinů II. (IgM, IgD, IgE)Izotypový přesmyk. Idiotypy a antiidiotypy - význam. Imunologická paměťOntogeneze imunitní odpovědiPrimární imunitní odpověďSekundární imunitní odpověď. Efektorové funkce protilátek
Simona Kaftanová
Struktura imunoglobulinů• 4 polypeptidové řetězce:
2 identické těžké (H)2 identické lehké (L)
H řetězce: μ, δ, γ, α, ε (rozdíly ve složení AK) L řetězce: κ, λ
Izotypy = třídy Igg:IgM (μ)IgD (δ)IgG (γ)IgA (α)IgE (ε)
Struktura Ig - členění
Dle štěpení enzymem papainem:• Fab-fragmenty – obsahují
vazebné místo pro Ag• Fc-fragment - reaguje s Fc-
receptory na buňkách těla
Domény („oblasti“) na H i L řetězci:• variabilní (V) - formuje
rozpoznávací část pro Ag• konstantní (C) - určuje sekundární
biologické funkce Ig
Paratop - vazebné místo pro Ag; reaguje specificky s epitopem Ag = oblast Ig tvořená hypervariabilními oblastmi VH a VL (hypervariabilní oblast – „špička“ variabilní oblasti s vysoce variabilním složením sekvencí AMK; určuje strukturu/specifitu vazebného místa pro Ag na základě složení sekvencí AMK, ale i morfologie a tvaru oblasti)
Idiotop - jednotlivé unikátní struktury variabilní oblasti daného Ig (Ab); některé idiotopy mohou být totožné s vazebným místem pro antigen, jiné leží mimo paratop
Idiotyp - suma všech idiotopů jedné Ig molekuly; společný identickým Ig molekulám
Struktura Ig – vazebné místo pro Ag
VL
VH
hypervariabilní úsek
Antiidiotypové protilátky• tzv. protilátky 2. generace (idiotyp protilátek I. generace se chová jako antigen, tj. mohou proti němu vznikat Abb - antiidiotypové)• tvoří vnitřní obraz antigenu (některé antiidiotypové Abb mají vazebné místo, které se alespoň částečně podobá epitopu Ag, který vyvolal tvorbu Abb I. generace)• vyvolávají další tvorbu Abb proti sobě samým → antiantiidiotypové protilátky (protilátky 3. generace)→ vzniká idiotypová síť• regulační fce
Funkce Igg
• obecně:– protilátky – Igg sekretované (solubilní)– antigenní receptor (BCR) - membránové Igg (IgM a IgD na povrchu
B lymfo) • biologické vlastnosti jednotlivých izotypů Igg dány odlišnostmi v H-
řetězcích resp. jejich konstantní částí resp. Fc-fragmentem:– při vazbě v IK váže C1 → aktivuje komplement (klasická cesta)– reaguje s Fc-receptory na buňkách těla – určuje sekundární biologické aktivity izotypů Ig (př. biologický
poločas, distribuci v těle a přechod přes placentu, schopnost opsonizace bakt., vazba IgE na mastocyty apod.)
Izotyp Obsah v séru dospěl.(g/l)
Biolog. poločas Tělesné tekutiny Funkce
IgG(podtřídy IgG1-4 )-monomer
8-18 21 dnů sérum, intersticiální tekutina
opsonizace (hlavní opsonizující Ig)neutralizaceaktivace komplementu (klasic.)přestup placentou (jediný Ig)sekundární protilátková reakce (hlavní protilátka)
IgA- sérový - slizniční (dimer + sekreční komponenta)
0,9-3,5 6 dnů sérum, slzy, sliny, povrch sliznic a jejich sekrety, mléko, pot
ochrana sliznic (neutralizace)opsonizace
IgM- pentamer- monomer (BCR)
0,9-2,5 6 dnů sérum, membrána B lymfo
aktivace komplementu (klasic.)primární protilátkové reakce (první a hlavní protilátka)při intrauterinní infekci produkovaná plodemreceptor pro Ag (BCR)
IgD-monomer
0,1 3 dny sérum, membrána B lymfo
receptor pro Ag (BCR)
IgE-monomer
3x10-4 2 dny sérum, interstic.t., povrch mastocytů a bazofilů
ochrana proti parazitůmatopická reakce
Genetické základy tvorby imunoglobulinů
Geny pro H-řetězec (14. chromozóm) • geny se člení do sekvenčních oblastí V, D, J, C (mezi nimi jsou
dlouhé nekódující sekvence)– V (několik set – zajišťují variabilitu)– D (cca 50)– J (9)– C (kódují izotypy Ig - Cμ, Cγ, Cα, Cδ, Cε)
Geny pro L-řetězec (κ - 2. chromozom, λ - 22. chromozom)• struktura jednodušší – V, J, C
a) nejprve tzv. D-J přeskupení částí genu, čímž se spojí náhodně určitý úsek D s některým úsekem J
b) vyštěpení úseku mezi některým V a D-J; dochází k tzv. V-D přeskupení
c) pokud vzniklý V-D-J produkt vyhovuje (= „dá se přečíst“), dojde k transkripci do mRNA a sestřihu (k VDJ se připojí C sekvence pro sestavování AMK pro daný Ig) d) translace v protein, jehož struktura je kódována sekvencemi V, D, J, C
Proces rekombinace těžkého řetězce:
Proces rekombinace lehkého řetězce:
Tvorba Ig molekuly
Izotypový přesmyk
• v průběhu imunitní odpovědi na Ag dochází u plazmocytů k přesmyku od tvorby IgM k produkci IgG nebo jiných tříd Ig
• mechanismus: segment Cμ je vyštěpen a na jeho místo se dostane v pořadí další segment př. Cγ (produkce protilátek IgG)
• směr přesmyku (volbu izotypu) regulují cytokiny - hlavně IL-4 (stimuluje produkci IgG1, IgE), TGF-β, IL-10 ...
• změna se týká konstantní domény H-řetězc; antigenní specifita je zachována
K velké diverzitě protilátek přispívají hlavně:
• různost kombinací genových segmentů a následný sestřih
• nepřesné spojování V, D a J a připojení náhodných segmentů • somatické mutace = mutace genů variabilní oblasti až po
přeskupení a to v okamžiku setkání zralého B lymfocytu s Ag v lymfoidních foliklech (ponechány jsou mutanty s vysokou afinitou k Ag)
Imunitní reakce založené na protilátkách
• probíhá ve dvou navazujících fázích – primární a sekundární
• charakteristický vznik paměťových bb. a vysokoafinních Abb v procesu tzv. afinitní maturace
a) Primární imunitní odpověď (protilátková reakce při primární infekci):
b) Sekundární imunitní odpověď (protilátková reakce při opětovném setkání s infekcí):
• první setkání B lymfo s Ag v sekund. lymf. org. → …viz Th2 reakce… • vznik klonu mnoha dceřiných B lymfo s identickou nebo velmi podobnou
specifitou → jejich diferenciace v plazmatické bb. (část B buněk se mění v paměťové bb.)
• část plazmatických bb. zpět do oběhu (do kostní dřeně aj. v organismu)• za 3-4 dny od imunizace (primární infekce) plazmatické bb. vyprodukují
množství Abb.• první se tvoří IgM s nízkou afinitou k Ag → účinné při blokování šíření
infekce • IgM tvoří s Ag imunokomplexy (IK) → zachycovány v sekund. lymf. org. na
povrchu tzv. folikulárních dendritických bb. (FDC) → IK mohou být skladovány na povrchu FDC či odstraňovány fagocytózou
Výjimka: T-nezávislé Ag (hl. bakteriální polysacharidy) vyvolávají diferenciaci B
lymfo na plazmatické bb. bez spolupráce s Th, př. aktivují B lymfo nespecificky tím, že se váží na receptory pro LPS, tj. nezávisle na specifitě)
Primární imunitní odpověď – primární fáze:
a) změna afinity: Agg skladované v IK na FDC jsou rozeznávány B lymfo → další dělení a diferenciaci B lymfo (spolupráce Th2) → mutace genů pro variabilní oblast Igg → vzniklé klony mají odlišná vazebná místa BCR a produkovaných Abb. než B lymfo z primární fáze → v soutěži o snižující se množství Ag uspějí B lymfo s nejvyšší afinitou k Ag (ostatní B bb. hynou) = proces afinitní maturace → vede ke vzniku Abb s několikanásobně vyšší afinitou než IgM z primární reakce („kvalitnější“ Abb)
b) izotypový přesmyk (viz Genetika Igg): záměna těžkého řetězce μ
(nevratné vyštěpení genové sekvence) původního IgM za jiný a následná tvorba odpovídajícího izotypu (IgG – druhý v pořadí nebo IgA, IgE, IgD) pod vlivem cytokinů (př. IL-4) za současného přímého kontaktu aktivovaných T lymfo s B lymfo (prostřednictvím adhezivní a kostimulační molekuly CD40/CD40L)
Pozn. po primární infekci dlouhou dobu přetrvává hladina Abb, které jsou
schopné zabránit novému vzniku té samé infekce hned v počátku.
Primární imunitní odpověď – sekundární fáze:
Sekundární imunitní odpověď (protilátková reakce při opětovném setkání s infekcí):• rychlá aktivace paměťových bb. vzniklých při primární odpovědi
→ další zvýšení afinity Abb, počtu Abb a změny v izotypovém složení (IgG dosahuje dříve vyšší hodnoty)
• potlačení infekce je rychlejší a účinnější
Imunologická paměť – část populace T a B-ly se po prvním setkání s Ag mění na paměťové buňky; jsou připraveny pro sekundární (anamnestická) odpověď, kdy jsou rychle aktivovány (vylepšují se vazebné schopnosti Abb k Ag – afinitu; rychlejší izotypový přesmyk)
Efektorové mechanismy působení protilátek:• neutralizace – Abb blokují aktivitu toxinů, virů a jiných mikroorg. tím, že
se váží na kritické epitopy nutné pro toxické působení
• inhibice adherence patogenů na buněčné povrchy – Abb navázané na patogen blokují jeho přichycení na slizniční povrchy (hl. fce sIgA)
• opsonizace – Abb navázané na Ag částici zlepšují či umožňují pohlcení této částice fagocyty či její napadení NK bb. (viz ADCC)
• ADCC (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) – NK bb. mají receptor FcR pro IgG; je-li Ag opsonizován IgG a dojde k navázání Fc-IgG na FcR NK b., aktivuje se degranulace NK b. na Ag
• vazba Ab-Ag aktivuje komplement klasickou cestou → produkty
komplementu přispívají k opsonizaci, chemotaxi fygocytů a rozvoji zánětlivé rce, k osmotické lýze cílových buněk
Ontogeneze imunitní odpovědi
a/ prenatální vývoj • krvetvorba extraembryonální začíná ve 2.-3.týdnu gestace →
postupně se krvetvorným orgánem stávají játra (celé intrauterinní období) → částečně se zapojuje i slezina → hlavní úlohu hematopoezy přejímá kostní dřeň (pokračuje postnatálně)
• T-buňky - prekurzory postupují do thymu → diferenciaci do lymfoidních bb., selekce.
• B-buňky – syntéza specifických IgM již intrauterině, ale koncentrace prakticky neměřitelná (měřitelné konc. IgM při porodu = známka intrauterinní infekce) x IgG se začínají tvořit až po porodu.
• zralé monocyty-makrofágy, neutrofily již ve fetální cirkulaci; neutrofily v menším počtu
Ontogeneze imunitní odpovědib/ postnatální vývojB lymfo:• po narození reakce na Ag podněty - hl. tvorba IgM (konc. srovnatelná
s dospělými v 1.- 3.r.)• tvorba IgG pozvolná a současně mizí mateřské IgG (největší pokles mezi 3.
- 6. měs. → vyšší nemocnost) (konc. srovnatelná s dosp. mezi 10.-15.r. )• protilátková reakce na polysacharidové antigeny (př. haemophilus) se
objevuje až kolem 2. roku T lymfo :• po narození převážně naivní; nižší aktivita Tc, nižší funkce Th se normalizuje
do 1 roku • vzestup Th1-reaktivity kulminuje na začátku dospělosti (zvýšený výskyt AI
onem.) nespecifická imunita novorozenců – funkčně méně zdatná
Ontogeneze imunitní odpovědi
c/ stáří • snížená cytotoxicita NK-buněk a makrofágů• přesmyk od Th1 k Th2
• snížená protivirová a protinádorová imunita• nižší protilátková odpověď na nové podněty• vyšší produkce autoprotilátek
Monoklonální protilátky (mAbb)
• Abb produkované jedním určitým klonem plazmatických bb. (bb. odvozené od jednoho B lymfo)
• identické molekuly (Abb jednoho izotypu a jedné specifity - variabilní část namířena jen proti jedné specifické části daného Ag)
XXX
Polyklonální protilátky (konvenční) • „směs“ monoklonálních protilátek• Abb namířené proti různým epitopům daného Ag• získávají se obvykle imunizací zvířat – tzv. antiséra
Monoklonální protilátky (mAbb) Výskyt:a) nádor z plazmatických bb. (mnohočetný myelom, plazmocytom)b) produkt hybridonu (= in vitro výroba) Hybridon = b. získaná fúzí b. myelomu a slezinného lymfocytu myši
imunizované příslušným Ag:– nádorová b. dodává hybridonu nesmrtelnost a schopnost produkce Abb
jednoho izotypu– lymfocyt dodává specifitu vůči určitému Ag
→ spojením těchto bb. vzniknou kultivované hybridomy schopné uvolňovat mAbb do kultivačního media
Využití: mAbb označené enzymy a fluorescenčními látkami atd. (= konjugát)
→ využití v labo dg., tp. pozn. humanizované monoklon. Abb - metodou genetického inženýrství se
zmodifikují molekuly tak, že z myší pocházejí jen vazebná místa, kdežto ostatní části protilátkové molekuly jsou kódované z lidských genů
Příprava monoklonálních Abb (mAbb)
slezinné lymfo z myši imunizované příslušným Ag buňky myelomu
fúze myelomových bb. a slezinných lymfo
selekce hybridomů a jejich další kultivace
klonování hybridomů
výběr vhodných hybridních klonů tvořících jen tu žádanou mAb
Příprava polyklonálních Abb