Министерство образования и науки Украины
Сумский государственный университет
Медицинский институт
4700 Методические указания к практическим занятиям
по дисциплине «Биологическая и биоорганическая химия» для студентов специальности 221 «Стоматология»
В двух частях
Часть 1
Общие закономерности метаболизма.
Метаболизм углеводов, липидов и его регуляция
(Содержательные модули 1, 2)
Сумы
Сумский государственный университет
2020
2
Методические указания к практическим занятиям по
дисциплине «Биологическая и биоорганическая химия» : в 2 ч.
Часть 1 «Общие закономерности метаболизма. Метаболизм
углеводов, липидов и его регуляция» (Содержательные модули
1, 2) / составители: Л. И. Гребеник, Л. А. Примова,
С. А. Гончарова, И. В. Черная. – Сумы : Сумский
государственный университет, 2020. – 108 с.
Кафедра биофизики, биохимии, фармакологии
и биомолекулярной инженерии МИ
3
СОДЕРЖАНИЕ С.
Введение …………………………………………………….. 5
Занятие 1 Контроль начального уровня знаний. Усвоение
принципов проведения биохимических
лабораторных исследований; обоснование и
клинико-диагностическое значение изменений
биохимических показателей……………………. 6
Занятие 2 Изучение методов исследования и
фракционирования аминокислотного состава
биологических жидкостей...................................... 10 Занятие 3 Физико-химические свойства белков. Методы
выделения и фракционирования белков.
Классификация белков. Изучение особенностей
строения и методов исследования сложных
белков. Изучение нуклеотидов………………….. 18 Занятие 4 Изучение структуры, физико-химических
свойств и классификации ферментов. Усвоение
методов виявления ферментов в биологических
объектах. Определение активности ферментов,
исследование механизма их действия …………. 26 Занятие 5-6 Изучение кинетики ферментативного катализа.
Исследование роли кофакторов и коферментных
витаминов в проявлении каталитической
активности ферментов. Изучение регуляции
ферментативных процессов и анализ
механизмов возникновения энзимопатий.
Медицинская энзимология ………….………… 32 Занятие 7 Обмен веществ и энергии. Изучение стадий
аеробного катаболизма и тканевого дыхания.
Исследование функционирования, регуляции и
энергетического балланса цикла лимонной
кислоты …………………………………………… 38 Занятие 8 Исследование биологического окисления,
окислительного фосфорилирования и
синтеза АТФ. Усвоение принципов
хемиосмотической теории. Анализ механизма
4
действия ингибиторов и разъединителей
окислительного фосфорилирования…….............. 42
Занятие 9 Итоговый контроль усвоения содержательного
модуля 1 «Общие закономерности метаболизма» 49 Занятие 10 Исследование гликолиза – анаэробного
окисления углеводов. Исследование аэробного
окисления глюкозы………..….….….….….….….. 53 Занятие 11 Исследование катаболизма и биосинтеза
гликогена. Регуляция обмена гликогена.
Исследование механизмов глюконеогенеза и
альтернативных путей обмена углеводов.
Изучение методов определения концентрации
глюкозы в крови ………..……..……..……..…….. 62
Занятие 12 Исследование механизмов метаболической и
гормональной регуляции обмена глюкозы.
Биохимия сахарного диабета…………………… 70
Занятие 13 Решение ситуационных задач из раздела
“Общие закономерности метаболизма” из
“Крок-1”…………………………….….….….…. 78
Занятие 14 Общая характеристика липидов. Биохимия
насыщенных и ненасыщенных жирных кислот.
β-Окисление жирных кислот. Исследование
обмена кетоновых тел…………………………… 78 Занятие 15 Исследование биосинтеза жирных кислот,
триацилглицеролов и сложных липидов ……… 85
Занятие 16 Исследование биосинтеза и биотрансформации
холестерола. Липопротеины крови.
Исследование механизмов метаболизма в
адипоцитах. Липолиз и его регуляция………… 90
Занятие 17-
18
Итоговый контроль усвоения содержательного
модуля 2 «Метаболизм углеводов, липидов и его
регуляция»………………………………………… 96 Приложе-
ние А
……………………………………………………... 101
Литература
……………………………………………………... 107
5
ВВЕДЕНИЕ
Биологическая химия - фундаментальная наука, изучение
которой является обязательным в системе подготовки будущих
врачей. Овладение базовыми знаниями по предмету создает
почву для формирования у студентов биохимического
мышления, развития основных умений и навычек оценки
метаболических процессов в организме здорового человека и в
случае развития патологического процесса.
Методические указания к практическим занятиям для
студентов специальности 221 «Стоматология» Часть I содержит
темы содержательных модулей 1 и 2 «Общие закономерности
метаболизма. Метаболизм углеводов, липидов и его регуляция».
В пособии приведена информация, необходимая студентам для
подготовки к практическим занятиям: теоретические вопросы;
рекомендованная литература; лабораторный практикум,
который объединяет современные биохимические методы
исследований с алгоритмом к каждой лабораторной работе,
методикой ее выполнения и клинической оценкой отдельных
показателей; вопросы к модулю; справочный материал.
Авторы надеются, что пособие поможет студентам быстро
сориентироваться в достаточно большом объеме научной
информации при изучении такой одновременно сложной и
интересной науки, как биохимия, а также получить знания о
современных методах биохимических исследований, овладеть
практическими навыками определения определенных веществ в
биологическом материале, умением обобщать, анализировать и
оценивать результаты лабораторных исследований, что имеет
значение в будущей профессиональной деятельности.
6
ЗАНЯТИЕ 1
Тема. КОНТРОЛЬ НАЧАЛЬНОГО УРОВНЯ ЗНАНИЙ.
УСВОЕНИЕ ПРИНЦИПОВ ПРОВЕДЕНИЯ
БИОХИМИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ
ИССЛЕДОВАНИЙ; ОБОСНОВАНИЕ И КЛИНИКО-
ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ИЗМЕНЕНИЙ
БИОХИМИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ
При подготовке к занятию используйте литературу:
1. Тюкавкина Н.А. Биоорганическая химия. / Тюкавкина Н.А., Баунов Ю.Н. - М.: Медицина, 1991.
2. Маршалл В. Дж. Клиническая биохимия / В. Дж. Маршалл. – М.: БИНОМ; Санкт-Петербург: Невский диалект, 2000.
Теоретические вопросы
1 Определение биохимии как науки. Место биохимии среди других медико-биологических дисциплин.
2 Достижения и перспективы развития биохимии, теоретической и молекулярной биологии, биотехнологии,
генной инженерии.
3 Цель биохимических лабораторных исследований, критерии оценки лабораторных методов, принципы сбора материала
для исследований, ошибки лабораторной диагностики.
4 Химический состав живых организмов, его особенности сравнительно с объектами неживой природы. Химический
состав организма человека.
5 Биохимические компоненты клеток (биомолекулы), их биохимические функции. Основные классы биомолекул.
6 Общая характеристика циклических соединений, белков, жиров, углеводов, нуклеиновых кислот: особенности
химического состава и структуры, биологическая роль.
Правила работы в лаборатории биологической химии:
1 Каждый студент должен быть внимательным, точным и аккуратным при выполнении лабораторных опытов.
2 Во время работы в лаборатории никогда не нужно спешить, особенно при выполнении аналитических исследований.
7
3 В лабораториях студенты должны работать в халатах и шапочках.
4 Лабораторные работы нужно выполнять соответственно методики проведения опытов.
5 Никогда не начинать работу без разрешения преподавателя или лаборанта.
6 Во время работи можно использовать только ту химическую посуду, реактивы, которые необходимы для проведения
эксперимента.
7 Аккуратно обращаться с химической посудой, реактивами и приборами, не переносить их с места на место.
8 Не оставлять в лаборатории без присмотра работающие приборы, водяные бани, газовые горелки.
9 Необходимо быть особенно осторожным при работе с концентрированными растворами кислот, щелочей, огнеопасными
и ядовытыми веществами.
10 Опыты с ядовитыми, летучими и огнеопасными веществами, необходимо проводить только в вытяжном шкафу.
11 Не выливать в раковину щелочи, кислоты, огнеопасные реактивы, а использовать специальные емкости для сливания отработанных
реактивов.
12 Набирать реактивы только с помощью специальной мерной посуды. Для опыта брать то количество вещества, которое
указано в описании лабораторной работы. Неиспользованные
остатки не возвращать назад в бутылочки.
13 Наливать и насыпать реактивы только над столом. Разлитые и разсыпанные вещества нужно сразу убрать. Участки кожи или
одежды, на которые попал реактив, нужно тщательно смыть
водой, а потом протереть нейтрализирующим веществом.
14 Не оставлять открытой бутылочки с жидкостями и емкости с сухими реактивами. Открывая банку или бутылку с реактивом,
пробки нужно держать в руке или класть на стол внешней
поверхностью.
15 В химической лаборатории категорически запрещается принимать пищу, пробовать органические вещества на вкус.
16 Определяя вещество по запаху, глубоко не вдыхайте. Нюхать содержимое посуды необходимо осторожно, направляя воздух
рукой от пробирки к носу.
17 Не нагревать вещества в посуде с толстыми стенками.
8
18 Нагревать в пробире небольшое количество раствора, жидкость не должна занимать больше чем треть объема пробирки.
19 Пробирку с реагентом сначала нужно прогреть всю, потом ниже уровня жидкости в ней.
20 При нагревании пробирки над пламенем необходимо следить, чтобы ее отверстие было направлено в сторону,
противоположную от себя и других студентов. Никлгда не
заглядывать в пробирку через отверстие, а наблюдать за
течением реакции со стороны.
21 Осторожно обращаться с легковоспламеняющимися и летучими веществами. Работать с ними подальше от огня, включенных
плиток, не разливать и не вдыхать их паров. Нужно нагревать их
только на водяной бане или электрической плитке с закрытой
спиралью. Нагревать огнеопасные вещества на открытом огне
запрещено.
22 При возгорании легковоспламеняющихся веществ тушить их можно противопожарной тряпкой, песком, но не водой.
23 В случае возгорания одежды нужно набросить на пострадавшего противопожарное одеяло.
24 При разведении концентрированной серной кислоты нужно кислоту лить в воду, но не наоборот. Разлитую кислоту
необходимо нейтрализовать щелочью, а потом смыть большим
количеством воды.
25 После окончания работы необходимо убрать свое рабочее место. 26 Выходя из лаборатории, нужно обязательно выключить воду, газ,
свет.
27 При ожогах: а) сильными щелочами - необходимо промыть пораженные участки тела водой и наложить компресс,
смоченный 1% раствором уксусной кислоты; б) сильными
кислотами – необходимо промыть пораженные участки тела
водой и наложить компресс, смоченный 1% раствором соды; в)
фенолом – необходимо растереть побелевший от ожога участок
до нормального состояния кожи, а потом промыть водой и
наложить повязку с глицерином.
28 В случае попадания кислоты или щелочи в глаза необходимо промыть их большим количеством воды, а потом 2% раствором
соды или борной кислоты.
9
29 При порезах стеклом необходимо удалить остатки стекла пинцетом, смазать края раны раствором йода и наложить
повязку. При сильных кровотечениях – наложить жгут.
Выполните задание и проверьте правильность их решения
с эталоном ответа.
Задание 1
Назовите полиненасыщенные жирные кислоты:
А. Арахидоновая.
В. Олеинова.
С. Стеариновая.
D. Каприловая.
Е. Пальмитиновая.
Задание 2
Какие вещества образуются при полном гидролизе пуриновых
нуклеотидов?
А. Цитозин, рибоза, фосфорная кислота.
В. Аденин, дезоксирибоза, фосфорная кислота.
С. Гуанин, дезоксирибоза.
D. Аденин, рибоза.
Е. Урацил, рибоза, фосфорная кислота.
Задание 3
Какой моносахарид образуется при полном гидролизе
крахмала?
А. D-галактоза.
В. D-глюкоза.
С D-фруктоза.
D. D-фруктозо-6-ф.
Е. Глюкозо-1-ф.
Задание 4
Какой дисахарид содержит остаток фруктозы?
А. Целобиоза.
В Целлюлоза.
С Мальтоза.
D. Лактоза.
Е. Сахароза.
10
Задание 5
Какое соединение является аминокислотой?
А. Серин.
В. Этаноламин.
С. Карнозин.
D. Креатин.
Е. Вазопрессин.
Задание 6
При образовании первичной структуры пептидов и белков
между аминокислотами образуются связи:
А. Гликозидные.
В. Дисульфидные.
С. Пептидные.
D. Гидрофобные.
Е. Водородные.
Ответы: 1-А, 2-В, 3-В, 4-Е, 5-А, 6-С.
ЗАНЯТИЕ 2
Тема: ИЗУЧЕНИЕ МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ И
ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ АМИНОКИСЛОТНОГО
СОСТАВА БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЕЙ
При подготовке к занятию используйте литературу:
1. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия: Учебник. – 3-е изд., перераб. и доп.– М.: Медицина, 1998.– С. 19-23, 33-
43.
2. Николаев А.Я. Биологическая химия. – 3-е изд., перераб. и доп.– М.: Медицинское информационное агентсво, 2004.– С.
17-43, 48-49. 3. Марpи Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека:
В 2-х томах. Т.1. Пер с англ.: – М.: Мир, 1993. – С. 21-51.
4. Северин Е.С., Алейникова Т.Л., Осипов Е.В., Силаева С.А. Биологическая химия. — М.: ООО «Медицинское
информационное агентство», 2008. – С. 9-25.
11
Теоретические вопросы 1 Общая характеристика и биологические функции белков и
пептидов.
2 Аминокислотный состав белков и пептидов; строение, классификация и физико-химические свойства аминокислот.
Образование пептидной связи.
3 Уровни структурной организации белков. Химические связи в белковой молекуле.
4 Методы изучения и исследования в биологических жидкостях аминокислот и белков. Цветные реакции на аминокислоты.
Хроматографические методы разделения аминокислот. На занятии студенты выполняют экспериментальную часть работы согласно алгоритму лабораторной работы и методики ее
проведения.
Алгоритм лабораторной работы
1 Лабораторная работа имеет элементы исследования. В предложенных пробирках с растворами определяют наличие
аминокислот и белков.
2 Из каждой пробирки берут необходимое количество раствора и определяют наличие белков и пептидов с помощью биуретовой
реакции.
3 Аналогично в каждом растворе определяют наличие цикличных и серосодержащих аминокислот. Для этого проводят
нингидриновую, ксантопротеиновую, нитропруссидную реакции,
реакции Адамкевича и Фоля.
Методика проведения экспериментов
1 Цветные реакции на белки и аминокислоты 1.1 Биуретовая реакция (реакция Пиотровского) Принцип метода: это характерная реакция на группу
-СО-NН-. Соединения, имеющие в своем составе не менее двух пептидных связей (белки, пептиды), в щелочной среде образуют
с сульфатом меди комплекс розово-фиолетового цвета.
Биуретовая реакция доказывает наличие пептидных связей в
белках и полипептидах. Биуретовая реакция лежит в основе
количественного определения белков.
12
Ход работы: в пробирку вливают 3-5 капель раствора
яичного белка, добавляют 3-5 капель 10% раствора NаОН и 1-2
капли 1% раствора CuSO4. Наблюдают появление розово-
фиолетовой окраски.
1.2 Нингидриновая реакция Принцип метода: белки, полипептиды и свободные
аминокислоты при нагревании с нингидрином дают синюю или
фиолетовую окраску. Реакция характерна для NH2-группы в
α-положении и используется для определения α-аминокислот,
разделенных хроматографическим методом.
Ход работы: в пробирку вливают 3-5 капель раствора
аминокислот (или 1% раствора белка), добавляют 5 капель 0,5%
спиртового раствора нингидрина, немного подогревают и
наблюдают появление фиолетовой окраски.
1.3 Ксантопротеиновая реакция Принцип метода: реакция характерна для бензольного ядра
циклических аминокислот (фенилаланина, тирозина,
триптофана). Ароматическое кольцо аминокислот нитруется под
действием концентрированной азотной кислоты с образованием
нитросоединений, окрашенных в желтый цвет. Окраска
переходит в оранжевую при добавлении аммиака.
Ход работы: в пробирку вливают 5 капель тирозина (или 1%
раствора яичного белка) и 5 капель HNO3(конц.). Осторожно
нагревают и наблюдают за образованием осадка желтого цвета.
Затем добавляют по каплям раствор аммиака до появления
оранжевой окраски.
1.4 Реакция Адамкевича Принцип метода: эта реакция характерна для триптофана,
который имеет в своем составе индольное кольцо. При
добавлении к раствору триптофана концентрованной уксусной
кислоты (которая всегда имеет остаток глиоксалевой кислоты) и концентрированной серной кислоты на границе двух жидкостей образуется красно-фиолетовое кольцо. Положительную реакцию
Адамкевича дают все белки, содержащие триптофан.
Ход работы: в пробирку вливают 5 капель раствора
триптофана (или белка), добавляют 5 капель CH3COOH(конц.)
13
и, наклонив пробирку, осторожно по стенке пробирки вливают 5
капель H2SO4(конц.). Через некоторое время на границе двух
жидкостей образуется красно-фиолетовое кольцо. Этот процесс
можно ускорить, если поставить пробирку на кипящую водяную
баню.
1.5 Реакция Фоля
Принцип метода: эта реакция открывает серосодержащие
аминокислоты (цистин и цистеин). В процессе кипячения белка
со щелочью от этих аминокислот легко отщепляется сера в виде
сероводорода, который с ацетатом свинца образует черный
осадок сернистого свинца. Все белки, содержащие цистин или
цистеин, дают положительную реакцию Фоля. Метионин этой
реакции не дает, т.к. сера в нем связана метильной группой.
Ход работы: в пробирку вливают 5 капель 1% раствора
яичного белка, добавляют 5 капель 30% раствора NаОН и одну
каплю 5% раствора (CH3COO)2Pb (или реактива Фоля).
Нагревают и наблюдают за появлением черной окраски.
1.6 Нитропруссидная реакция
Принцип метода: определяет серосодержащие
аминокислоты в белках.
Ход работы: к 10 каплям 1% раствора яичного белка
добавляют 10 капель раствора щелочи, интенсивно кипятят,
после охлаждения доливают 3-5 капель свежеприготовленного
нитропруссида натрия, после чего появляется красно-
фиолетовая окраска.
После выполнения экспериментальной части оформляется протокол лабораторной работы. Для этого полученные результаты
заносят в таблицу, делают выводы.
Пр
об
а
Результаты реакций Выводы
Фо
ля
Би
ур
ето
вая
Ни
нги
др
ин
о-
вая
Кса
нто
пр
оте
и-
но
вая
Ни
тро
-
пр
усс
ид
ная
Ад
амкев
ич
а
14
2 Хроматографические методы разделения аминокислот. Определение аминокислот методом
распределительной хроматографии. Для разделения белков и аминокислот используют разные
виды хроматографии: адсорбционную, ионообменную,
распределительную, диффузионную, афинную.
Принцип метода: распределительная хроматография
основывается на разной растворимости разделяемых веществ в
двух жидкостях, которые частично смешиваются.
Растворитель, содержащий смесь аминокислот, поднимается
по полоске бумаги. Аминокислоты перераспределяются между
подвижной фазой (фенолом) и стационарной (водой), связанной
с волокнами бумаги. Чем меньше растворимость аминокислот в
воде и больше в феноле, тем быстрее они двигаются за фронтом
органического растворителя и пройдут большее расстояние от
места старта. Чем больше растворимость аминокислот в воде и
меньше в феноле, тем медленнее они будут двигаться и пройдут
меньшее расстояние от места старта. Для проявления
хроматограмм (выявление положения аминокислот на бумаге)
используют раствор нингидрина, который окрашивает
аминокислоты в фиолетовый цвет. Измеряют путь, который
прошла аминокислота, и путь растворителя. Коэффициент
распределения определяют по формуле
А
Rf = -----,
В
где Rf – коэффициент распределения;
А – расстояние от места нанесения смеси аминокислот до
середины пятна (мм);
В - расстояние от линии старта до фронта растворителя
(мм).
Коэффициент распределения является постоянной величиной
для каждой аминокислоты в условиях опыта (растворитель,
температура, сорт бумаги). По коэффициенту распределения
определяют аминокислоты, входящие в состав смеси.
15
Клинико-диагностическое значение. Метод используют для
определения аминокислотного состава белков, пептидов,
качественного и количественного определения аминокислот в
биологических жидкостях и тканях.
Нормальное содержание аминокислот в плазме крови
составляет около 21,4 ммоль/л.
Гипераминоацидемия – увеличение содержания аминокислот
в крови - наблюдается при наследственных энзимопатиях,
поражениях печени, почечной недостаточности, сахарном
диабете.
Гипоаминоацидемия розвивается при высокой температуре,
белковом голодании, заболевании почек.
Гипераминоацидурия – возникает при заболеваниях печени,
сахарном диабете, инфекционных заболеваниях,
злокачественных опухолях, гипертиреозе.
Выполните задание и проверьте правильность их решения
с эталоном ответа.
Задание 1
Какая аминокислота является незаменимой для человека?
А. Аланин.
В. Тирозин.
С. Пролин.
D. Глицин.
E. Метионин.
Задание 2
Какая аминокислота обладает положительным зарядом в
радикальной части?
А. Аспарагин.
В. Глутамин.
С. Лизин.
D. Глутамат.
E. Валин.
16
Задание 3
Какая аминокислота является серосодержащей?
A. Метионин.
B. Лизин.
C. Валин.
D. Лейцин.
E. Аргинин.
Задание 4
Какая аминокислота относится к гидрофобным
аминокислотам?
А. Глутамин.
В. Валин.
С. Треонин.
D. Лизин.
E. Аргинин.
Задание 5
Какая аминокислота относится к гидрофильным
аминокислотам?
А. Глутамин.
В. Аланин.
С. Триптофан.
D. Фенилаланин.
Е. Лейцин.
Задание 6
Какая аминокислота содержит сульфгидрильную группу
(тиогруппу)?
А. Аспарагин.
В. Гистидин.
С. Лизин.
D. Цистеин.
E. Метионин.
17
Задание 7
Нингидриновая реакция отрицательная с
А. Простыми белками.
B. Дипептидами.
C. Трипептидами.
D. Свободными аминокислотами.
E. Карбоновыми кислотами.
Задание 8
Какая аминокислота даёт положительную
ксантопротеиновую реакцию?
А. Фенилаланин.
В. Метионин.
С. Цистеин.
D. Аргинин.
Е. Аспарагин.
Задание 9
Какая аминокислота даёт положительную реакцию Фоля?
А. Триптофан.
В. Гистидин.
С. Тирозин.
D. Треонин.
Е. Цистеин.
Задание 10
Какие связи являются наиболее прочными в молекуле белка?
А. Пептидные.
B. Дисульфидные.
C. Водородные.
D. Ионные.
E. Гидрофобные. Ответы: 1-Е, 2-С, 3-А, 4-В, 5-А, 6-D, 7-Е, 8-A, 9-E, 10-A.
18
Занятие 3 Тема. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ.
МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ
БЕЛКОВ. КЛАССИФИКАЦИЯ БЕЛКОВ. ИЗУЧЕНИЕ
ОСОБЕННОСТЕЙ СТРОЕНИЯ И МЕТОДОВ
ИССЛЕДОВАНИЯ СЛОЖНЫХ БЕЛКОВ. ИЗУЧЕНИЕ
НУКЛЕОТИДОВ
При подготовке к занятию используйте литературу:
1. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия: Учебник. – 3-е изд., перераб. и доп.– М.: Медицина, 1998.– С. 23-33, 44-
49, 71-111.
2. Николаев А.Я. Биологическая химия. – 3-е изд., перераб. и доп.– М.: Медицинское информационное агентсво, 2004.–
С. 35-38, 46-47, 54-59, 101-117. 3. Марpи Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека: В
2-х томах. Т.1. Пер с англ.: – М.: Мир, 1993. – С. 35 – 41, 48-51.
4. Северин Е.С., Алейникова Т.Л., Осипов Е.В., Силаева С.А. Биологическая химия. — М.: ООО «Медицинское
информационное агентство», 2008. – С. 19-28, 47-56.
Теоретические вопросы
1 Физико-химические свойства белков: амфотерность,
изоэлектрическая точка (рІ), растворимость белков,
термодинамическая стабильность белковых молекул,
денатурация.
2 Методы выделения белков из биообъектов, их
фракционирование и анализ строения: распределение белков
методом электрофореза.
3 Современные классификации белков. Общая характеристика отдельных классов белков, их роль.
Сложные белки: классификация, представители
отдельных классов, содержание в организме человека.
4 Общая характеристика хромопротеинов, особенности структуры, биологическая роль. Гемопротеины:
миоглобин, гемоглобин, цитохромы. Их биологические
19
функции и структурные особенности. Нормальное
содержание гемоглобина в крови. Общая характеристика
гемоглобинопатий и таласемий.
5. Нуклеотиды: строение, структурные компоненты, номенклатура, биологическая роль. Свободные
нуклеотиды: участие в метаболических реакциях и их
регуляции. Циклические нуклеотиды.
На занятии студенты выполняют экспериментальную часть работы
согласно алгоритму лабораторной работы и методики ее проведения.
Методика проведения экспериментов
1 Необратимое осаждение (денатурация) белков под
влиянием солей тяжелых металлов, концентрированных
кислот, высокой температуры
1.1 Осаждение солями тяжелых металлов Принцип метода: соли тяжелых металлов (меди, свинца,
серебра, ртути) осаждают белки из растворов, образуя
комплексные соединения, растворимые в избытке этих солей, но
нерастворимые в воде. Избыток ионов металла, адсорбируюясь,
вызывает перезарядку белкового комплекса, в результате чего в
раствор переходит комплекс измененного белка с металлом. Это
явление называется адсорбционной пептизацией.
Ход работы: в две пробирки вносят по 5 капель 1% раствора
яичного белка. В первую пробирку добавляют 2-3 капли 5%
раствора СиSO4; во вторую – 2 капли раствора (CH3COO)2Pb. Во
всех пробирках образуется осадок, не растворимый в воде. Если
потом в первую пробирку добавить 5-10 капель 1% раствора
СиSO4, наблюдают растворение бледно-голубого осадка в
избытке реактива. Во второй пробирке, если добавить 5 - 10
капель 5% раствора (CH3COO)2Pb, осадок растворяется тоже. Клинико-диагностическое значение. Свойство белка
связывать ионы тяжелых металлов в виде нерастворимого
осадка в воде используется при отравлении солями ртути, меди,
свинца и т.д. Рекомендуют сразу же после отравления
употреблять белки молока или яиц до тех пор, пока эти соли
20
присутствуют еще в желудке. После этого у больного вызывают
рвоту, чтобы вывести яд.
1.2 Осаждение концентрированными органическими и
минеральными кислотами
Принцип метода: под действием концентрированных
минеральных и органических кислот происходит денатурация
белка в результате дегидратации и образование комплексных
солей белка с кислотами.
В избытке всех минеральных кислот, кроме азотной, осадок
белка растворяется. Поэтому реакция осаждения
концентрированной азотной кислотой лежит в основе
количественного определения белка по методу Робертса-
Стольникова-Брандберга.
Ход работы:
Осаждение азотной кислотой (проба Геллера)
На 1 мл HNO3(конц.) осторожно наслаивают 1 мл 1%
раствора белка. На границе раздела двух жидкостей
образуется осадок в виде белого кольца.
Осаждение серной кислотой
К 1 мл 1% раствора яичного белка осторожно по стенке
пробирки добавляют несколько капель H2SO4(конц.).
Выпадает осадок.
Осаждение трихлоруксусной и сульфосалициловой кислотами
В две пробирки вносят по 1 мл раствора белка. В первую
добавляют 1 мл 20% раствора сульфосалициловой, а во
вторую – 1 мл 10% раствора трихлоруксусной кислот.
Выпадает осадок белка. Осаждение белков с помощью
трихлоруксусной кислоты применяют для полного удаления
белков из биологических жидкостей, поскольку она осаждает
только белки. Сульфосалициловую кислоту используют для
качественного определения белка в моче. 1.3 Денатурация белков под влиянием высокой температуры
Принцип метода. Под действием высокой температуры
гидрофобные и водородные связи в белках разрушаются,
происходит перестройка структуры молекулы. Белок теряет
свои нативные свойства, в том числе растворимость.
21
Реакция денатурации проходит постепенно и ускоряется с
повышением температуры, поэтому кратковременное
нагревание может и не привести к коагуляции.
Ход работы: в пробирку вносят 1 мл раствора белка,
нагревают и наблюдают за образованием осадка.
Алгоритм лабораторной работы 1 Маркируют 6 пробирок. 2 Пробирки заполняют соответственно таблице, создавая
определенное значение рН в каждой пробирке путем внесения
разного количества реактивов заданных концентраций.
3 Пробирки выдерживают при комнатной температуре 30 мин. 4 Изоэлектрическую точку определяют по степени помутнения
раствора.
Методика проведения эксперимента
2 Определение изоэлектрической точки желатина
Принцип метода: определение изоэлектрической точки
желатина основывается на исследовании растворимости белка
при разных значениях рН. Когда значение рН раствора отвечает
изоэлектрической точке белка, растворимость желатина
уменьшается, и он выпадает в осадок.
Ход работы: заполнить 6 пробирок согласно с таблицей.
Реактив / Номер пробирки 1 2 3 4 5 6
Н2О, мл 3,8 3,5 3,0 2,0 ─ 3,2
Уксусная кислота (0,1 М) 0,8 0,5 1,0 2,0 4,0 ─
Уксусная кислота (1 М) ─ ─ ─ ─ ─ 0,8
СН3СООNа (0,1 М) 2 2 2 2 2 2
Раствор желатина (1%) 2 2 2 2 2 2
Ацетон 2 2 2 2 2 2
рН среды 5,6 5,3 5,0 4,7 4,4 4,1
Степень помутнения
Через 30 мин обозначают степень помутнения раствора
знаком (+). рН буфера, где наблюдается наибольшее
помутнение, отвечает изоэлектрической точке желатина.
22
3 Разделение белков методом электрофореза
Принцип метода: метод основывается на разной
подвижности белков в электрическом поле в зависимости от
заряда и молекулярной массы белка. Электрофорез на бумаге
позволяет определить 5 отдельных фракций белков крови:
альбумины, ά1-, ά2-, β-, γ-глобулины. При электрофорезе в
полиакриламидном геле белки сыворотки крови разделяются на
20 фракций.
Клинико-диагностическое значение. Метод электрофореза
широко используется в медицинской практике для разделения
белков сыворотки крови на фракции, которые характеризуют
состояние организма и используются с диагностической целью.
Гипоальбуминемия (уменьшение количества альбуминов)
характерна для заболеваний печени, почек, злокачественных
опухолей.
Гипер-γ-глобулинемия (увеличение содержания γ-глобули-
нов) наблюдается при инфекционных заболеваниях.
4 Выделение муцина из слюны и проведение
качественной реакции на углеводный компонент Принцип метода: выделение муцина (или других
гликопротеинов и протеогликанов) основывается на его
хорошей растворимости в щелочах и осаждении при
подкислении раствора.
Ход работы: в пробирку собирают 2-3 мл слюны и по каплям
добавляют CH3COOH(конц.) (10-12 капель) до образования
осадка. Сгусток муцина вынимают, переносят в пробирку и
проводят качественную реакцию на углеводний компонент. Для
этого в пробирку с муцином добавляют 1-2 капли 1%
спиртового раствора α-нафтола и по стенке пробирки медленно
вливают пипеткой равный объем H2SO4(конц.). Фиолетово-
красное кольцо на границе двух слоев жидкости
свидетельствует о наличие углеводов.
После проведения экспериментальной части оформляется
протокол лабораторной работы.
23
Выполните задание и проверьте правильность их решения
с эталоном ответа.
Задание 1
Укажите, какие из следующих белков относятся к простым:
А. Гистоны.
В. Хромопротеины.
С Флавопротеины.
D. Металлопротеидов.
Е. Гемопротеины.
Задание 2
Назовите вещество, под действием которого происходит
высаливание белков:
А. Н2SO4 (к).
В. (NH4)2SO4.
C. РbSO4.
D. NaOH (к).
Е. HNO3 (к).
Задание 3
Назовите фактор, под действием которого происходит
денатурация белков:
А. NaCl.
В. MgSO4.
С. (NH4)2SO4.
D. Na2SO4.
Е. CuSO4.
Задание 4
Назовите метод, который может быть использован для
фракционирования белков:
А. Хроматография.
В. Диализ.
С Кислотный гидролиз.
D. Денатурация.
Е. Гомогенизация.
24
Задание 5
Укажите, какая свойство белков позволяет разделять их
методом электрофореза:
А. Высокая вязкость.
В. Высокое онкотическое давление.
С. Наличие электрического заряда.
D. Оптическая активность.
Е. Способность к набуханию.
Задание 6
Укажите факторы, которые вызывают необратимую
денатурацию белков:
А. Ацетат свинца.
В. Сульфат аммония.
С. Сульфат магния.
D. Сульфат натрия.
Е. Хлорид натрия.
Задание 7
Больной принят в реанимационное отделение с подозрением
на отравление угарным газом (монооксидом углерода). Какое
соединение гемоглобина будет обнаружено при спектральном
анализе?
A. Карбоксигемоглобин.
B. Карбгемоглобин.
C. Метгемоглобин.
D. Оксигемоглобин.
E. Дезоксигемоглобином.
Задание 8
Наряду с нормальными типами гемоглобина в организме
человека могут быть патологические. Назовите один из них.
A. HbS.
B. HbF.
C. HbA1.
D. HbA2.
E. HbO2.
25
Задание 9
У больного обнаружена серповидно-клеточная анемия.
Замена какой аминокислоты в полипептидной цепи Hb на валин
приводит к этому заболеванию?
A. Глутаминовой кислоты.
B. Аспарагиновой кислоты.
C. Лейцина.
D. Аргинина.
E. Треонина.
Задание 10
Гемоглобин взрослого человека (HbA) - белок-тетрамер,
который состоит из двух альфа- и двух бета-полипептидных
цепей. Как называется такая структура этого белка?
A. Четвертичная.
B. Третичная.
C. Вторичная.
D. Первичная.
Задание 11
Какие связи не нарушаются при денатурации белка?
А. Дисульфидные
В. Водородные
С. Пептидные
D. Ионные
E. Гидрофобные
Задание 12
Потребление грязных овощей и фруктов в течение
длительного времени привело к отравлению пациента
нитратами и образования в крови производного гемоглобина:
A. Hb-OH.
B. Hb СО.
C. Hb O2.
D. Hb CN.
E. Hb NHCOOH.
26
Ответы: 1-А, 2-В, 3-Е, 4-А, 5-С, 6- А, 7-А, 8-А, 9-А, 10-А, 11-
С, 12-А.
Занятие 4 Тема. ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРЫ, ФИЗИКО-
ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ И КЛАССИФИКАЦИИ
ФЕРМЕНТОВ. УСВОЕНИЕ МЕТОДОВ ВИЯВЛЕНИЯ
ФЕРМЕНТОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ,
ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМА ИХ ДЕЙСТВИЯ
При подготовке к занятию используйте литературу:
1. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия: Учебник. – 3-е изд., перераб. и доп.– М.: Медицина, 1998.–
С. 114-126, 159-162.
2. Николаев А.Я. Биологическая химия. – 3-е изд., перераб. и доп.– М.: Медицинское информационное агентсво, 2004.–
С. 61-80.
3. Северин Е.С., Алейникова Т.Л., Осипов Е.В., Силаева С.А. Биологическая химия. — М.: ООО «Медицинское
информационное агентство», 2008. – С. 29-32.
Теоретические вопросы
1. Ферменты как биологические катализаторы реакций обмена веществ; свойства белков-ферментов.
2. Номенклатура ферментов и их классификация по типу реакции.
3. Строение ферментных белков; олигомерные белки-ферменты; мультиэнзимные комплексы, мебранно-
асоциированные ферменты и мультиэнзимные
комплексы.
4. Кофакторы и коферменты. Строение и свойства коферментов; витамины как предшественники в
биосинтезе коферментов.
5. Механизмы действия ферментов:
27
а) термодинамические закономерности ферментативного
катализа;
б) активные центры ферментов;
в) гипотезы ферментативного катализа Э.Фишера и
Д. Кошленда.
6. Последовательность этапов каталитического процесса.
7. Методы определения активности ферментов: по количеству
продукта, который образуется под действием фермента за
единицу времени, по количеству потраченного субстрата за
единицу времени.
8. Единицы измерения активности и количества ферментов: международные единицы, катал, удельная активность фермента.
На занятии студенты выполняют экспериментальную часть
работы согласно алгоритму лабораторной работы и методики ее
проведения.
Алгоритм лабораторной работы 1
1 Собирают 2-3 мл слюны. 2 Получают разведенную и прокипяченную слюну (согласно с
методикой эксперимента).
3 Готовят 3 пробирки, маркируют их, вносят в каждую пробирку субстрат и фермент амилазу, который содержится в слюне
(согласно методике).
4 Инкубируют в течение 10 мин в термостате при t0=380С. 5 После инкубации содержимое каждой пробирки делят на две
равные части - всего 6 пробирок.
6 В 3 пробирках проводят качественную реакцию на продукты гидролизза крахмала.
Методика проведения эксперимента.
Определение термолабильности амилазы слюны
1 Термолабильность амилазы Принцип метода: о зависимости активности амилазы слюны
от температуры свидетельствует расщепления этим ферментом
крохмала в разных температурных условиях. Степень
28
расщепления крахмала определяют по реакции с йодом или
реакцией Троммера.
Ход роботи: в чистую пробирку собирают 2-3 мл слюны. Из
нее отбирают 4 капли слюны и добавляют 16 капель воды
(слюна разводится в 5 раз).
Остаток слюны кипятят 5 мин на открытом огне, после чего
охлаждают. Затем берут 3 пробирки, в каждую наливают по 10
капель 1% раствора крохмала. В пробирку №1 добавляют 10
капель разведенной в 5 раз слюны, В пробирку №2 – 10 капель
прокипяченной слюны, в пробирку №3 – 10 капель воды как
контроль. Все пробирки ставят в термостат на 10 мин при 380С.
Содержимое всех пробирок делят на 2 части и проводят
качественные реакции на крахмал и продукты его гидролиза –
глюкозу и мальтозу (всего 6 пробирок).
1.1 Реакция на крахмал (йодная проба)
В три пробирки вливают по 1 капле раствора Люголя (йод в
йодиде калия). При наличии крахмала появляется синяя окраска.
1.2 Реакция Троммера
В три пробирки вливают 5 капель 10% раствора NaOH и
добавляют 3 капли 1% раствора CuSO4. Осторожно нагревают
пробирки до кипения и кипятят 1 мин на открытом огне.
Появление красной окраски свидетельствует о положительной
реакции Троммера при наличии мальтозы и глюкозы.
Полученные результаты записывают в таблицу и делают
выводы.
№
пробирки Фермент Субстрат
Т,
ºС
Йодная
проба
Реакция
Троммера
1
2
3
Алгоритм лабораторной роботы 2
1 Готовят 3 пробирки, маркируют их. 2 Собирают слюну и разводят ее в 5 раз.
29
3 В пробирки с разными субстратами (1 - крахмал, 2 - сахароза) вносят фермент.
4 Инкубируют пробирки 10 мин в термостате при t0 = 380C. 5 После инкубации проводят качественную реакцию на продукты
гидролиза крахмала.
Методика проведения эксперимента
2 Определение специфичности амилазы слюны
Принцип метода: амилаза расщепляет крахмал и не
действует на сахарозу. Гидролиз крахмала определяется
положительным результатом реакции Троммера.
Ход работы: в 2 пробирки наливают по 5 капель слюны,
розведенной в 5 раз. В 1-вую пробирку добавляют 10 капель 1%
раствора крахмала, во 2-ую – 10 капель 1% раствора сахарозы.
Обе пробирки ставят в термостат при 380С на 10 мин. После
этого с содержимым пробирок проводят реакцию Троммера.
Результаты записывают в таблицу и делают выводы.
№
пробирки Фермент Субстрат
Результат реакции
Троммера
Алгоритм лабораторной работы 3
1 Готовят 2 пробирки, маркируют их. 2 Собирают слюну. 3 Заполняют пробирки реактивами (согласно методики
эксперимента), создавая растворы с разными значениями рН,
куда помещают субстрат и фермент.
4 Инкубируют пробирки 15 мин в термостате при t0 = 380C. 5 После инкубации с содержимым пробирок проводят
качественную реакцию на крахмал.
Методика проведения эксперимента
3 Влияние рН среды на активность амилазы
Принцип метода: влияние рН среды на активность амилазы
определяют по расщеплению этим ферментом крахмала при
разных значениях рН.
30
Ход работы: в две пробирки собирают по 1 мл слюны. В
первую пробирку добавляют 20 капель 0,4% раствора NаОН, во
вторую – 20 капель 0,4% раствора НСl; в обе – по 10 капель 1%
раствора крахмала и ставят в термостат при 380С на 15 мин. В
первую пробирку (с NаОН) вносят 20 капель 0,4% раствора НСl
для нейтрализации. После этого добавляют по 1 капле раствора
Люголя в обе пробирки. Результаты работы записывают в
таблицу и делают выводы.
Номер
пробирки Фермент Субстрат
Реакция
среды
Йодная
проба
1
2
3 После проведения экспериментальной части оформляется протокол
лабораторной работы.
Выполните задание и проверьте правильность их решения
с эталоном ответа.
Задание 1
Общими свойствами ферментов и неорганических катализаторов
являются:
А. Термолабильность.
В. Катализ только термодинамически возможных реакций.
С. Специфичность действия.
D. Зависимость от количества субстрата.
Е. Зависимость от эффекторов.
Задание 2
Абсолютная специфичность свойственна ферментам:
А. Сахаразе, уреазе.
В. Амилазе.
С Пепсину, трипсину.
D. Алкогольдегидрогеназе.
Е. Фосфатазе.
31
Задание 3
Наиболее весомым доказательством белковой природы ферментов
являются:
А. Высокая молекулярная масса.
В. Получение кристаллических форм.
С. Возможность лабораторного синтеза.
D. Гидрофильность.
Е. Разрушение протеолитическими ферментами.
Задание 4
Фермент гексокиназа катализирует перенос фосфорной группы от
АТФ на гексозы с образованием гексозо-6-фосфата. К какому классу
принадлежит этот фермент?
А. Оксидоредуктазы.
В. Трансферазы.
С Гидролазы.
D. Изомеразы.
Е. Лигазы.
Задание 5
Назовите кофермент - производное витамина РР:
А. ФАД.
В. ФМН.
С НАД.
D. ПАЛФ.
Е. ПАМФ.
Занятие 6
Производным какого витамина является кофермент
тиаминпирофосфат:
А. В1.
В. В2.
С В3.
D. В5.
Е. В6.
Ответы: 1- В, 2- А, 3- Е, 4- В, 5- С, 6- А.
32
Занятие 5-6 Тема. ИЗУЧЕНИЕ КИНЕТИКИ
ФЕРМЕНТАТИВНОГО КАТАЛИЗА.
ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ КОФАКТОРОВ И
КОФЕРМЕНТНЫХ ВИТАМИНОВ В ПРОЯВЛЕНИИ
КАТАЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ
ФЕРМЕНТОВ. ИЗУЧЕНИЕ РЕГУЛЯЦИИ
ФЕРМЕНТАТИВНЫХ ПРОЦЕССОВ И АНАЛИЗ
МЕХАНИЗМОВ ВОЗНИКНОВЕНИЯ
ЭНЗИМОПАТИЙ. МЕДИЦИНСКАЯ
ЭНЗИМОЛОГИЯ
При подготовке к занятию используйте литературу:
1. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия: Учебник. – 3-е изд., перераб. и доп.– М.: Медицина, 1998.–
С. 126-158, 162-168.
2. Николаев А.Я. Биологическая химия. – 3-е изд., перераб. и доп.– М.: Медицинское информационное агентсво, 2004.–
С. 61-65, 80-101. 3. Марpи Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека: В
2-х томах. Т.1. Пер с англ.: – М.: Мир, 1993. –
- С. 81-90.
4. Северин Е.С., Алейникова Т.Л., Осипов Е.В., Силаева С.А.
Биологическая химия. — М.: ООО «Медицинское
информационное агентство», 2008. – С. 33-47.
Теоретические вопросы
1 Кинетика ферментативных реакций: зависимость скорости реакций от концентрации фермента, субстрата, рН и
температуры.
2 Регуляция ферментативных процессов. Ингибиторы и активаторы. Обратимое (конкурентное и неконкурентное) и
необратимое ингибирование ферментов. Физиологически
активные соединения и ксенобиотики как обратимые и
необратимые ингибиторы ферментов.
3 Пути и механизмы регуляции ферментативных процессов:
33
а) регуляция каталитической активности: аллостерические
взаимодействия у ферментов; ковалентная модификация
ферментов; протеолитическая активация, действие
регуляторных белков-эффекторов (кальмодулина, протеиназ,
протеиназных ингибиторов), компартментация
ферментативных процессов. Циклические нуклеотиды как
регуляторы ферментативных реакций и биологических
функций клеток;
б) изменение концентрации ферментов в клетке.
4 Изоферменты в энзимодиагностике, тканевая специфичность распределения изоферментов.
5 Основные аспекты современной энзимодиагностики. Энзимотерапия – использование ферментов как
лекарственных средств.
На занятии студенты выполняют экспериментальную часть
работы согласно алгоритму лабораторной работы и методики ее
проведения.
Алгоритм лабораторной работы 1
1 Маркируют 3 пробирки – контрольную и две опытных. 2 Заполняют пробирки соответственно ходу работы с
установлением влияния активаторов и ингибиторов на
активность амилази слюны.
3 Инкубируют пробирки в термостате в течение 10 минут при t=380С.
4 После инкубации во всех пробирках проводят качественную пробу на крахмал с раствором Люголя.
5 Наблюдают окраску, по которой определяют наличие в пробирке активатора или ингибитора амилазы.
6 Результаты заносят в таблицу и делают вывод о действии активаторов и ингибиторов на активность энзима.
1 Методика проведения эксперимента. Влияние
активаторов и ингибиторов на активность амилазы слюны
Принцип метода: активирующее влияние хлорида натрия и
ингибирующее действие сульфата меди на активность амилазы
34
слюны определяют по степени расщепления крахмала, о чем
свидетельствуют результаты реакции с йодом. Ход работы: в три пробирки вносят по 1 мл слюны,
разведеной в 5 раз (к 1 мл слюны нужно добавить 4 мл воды). В
первую пробирку вливают 2 капли воды (контроль), во вторую –
2 капли 1% раствора NaCl, в третью – 2 капли 1% раствора
CuSO4. В каждую пробирку добавляют по 5 капель 1% раствора
крахмала. Все пробирки выдерживают в термостате 10 минут
при температуре 38°С. После инкубации в каждую пробирку
добавляют по 2 капли раствора Люголя, перемешивают,
наблюдают окраску, по которой определяют наличие в пробирке
активатора или ингибитора. Можно добавить в каждую
пробирку по 1-2 капли воды – окраска будет более яркой.
Результаты опыта записывают в таблицу и делают выводы.
Содержимое
пробирок
№ Пробирки
1 2 3
Слюна
1% NaCl
1% CuSO4
Крахмал
Окраска с йодом
Алгоритм лабораторной работы 2
1 Готовят 8 пробирок, маркируют их по порядку от 1 до 8. 2 Во все пробирки вносят субстрат и активатор амилазы. 3 В первую пробирку вносят амилазу (которая содержится в моче)
и разводят фермент в геометрической прогрессии.
4 Пробирки инкубируют 30 мин при t0 = 380C. 5 Активность амилазы определяют качественной реакцией с
йодом.
2 Методика проведения эксперимента. Определение
активности амилазы в моче методом Вольгемута
Принцип метода: метод базируется на определении
минимального колличества амилазы, которая способна
расщепить данное количество крахмала в течение некоторого
35
времени в стандартных условиях. За единицу активности
диастазы взято количество, мл, 0,1% раствора крахмала, которое
может расщепить амилаза в 1 мл мочи при 370С за 30 мин.
Ход работы: в 8 пробирок вносят по 1 мл 0,85% раствора
NаСl. В первую пробирку добавляют 1 мл мочи, перемешивают,
отбирают 1 мл этой смеси и переносят в другую пробирку.
Содержимое другой пробирки тоже перемешивают, отбирают
1 мл смеси и переносят в третью пробирку и т.д. Из последней
пробирки 1 мл смеси выливают для уравнивания объемов во
всех пробирках. Получают ряд разведений мочи, где
концентрация фермента в каждой следующей пробирке в два
раза меньше, чем у предыдущей (разведение мочи у 2, 4, 8, 16 и
т.д. раз). Далее в каждую пробирку добавляют по 2 мл раствора
крахмала, перемешивают и ставят на 30 мин в термостат при
370С. После инкубации в каждой пробирке проводят реакцию с йодом. Обозначают последнюю пробирку в ряду, где
наблюдается желтая окраска с йодом (то есть крахмал
расщепился).
Результаты заносят в таблицу.
Показатель Пробирка
1 2 3 4 5 6 7 8
Разведение мочи
Количество 0,1%
раствора крахмала
Результат йодной
пробы
Расчет проводят по формуле
Х = 1· 2 · разведение мочи,
где 1 – количество мочи, мл;
2 – количество 0,1% раствора крахмала.
Клинико-диагностическое значение. Определение
активности α-амилазы в моче используют для диагностики
заболеваний поджелудочной железы. Амилаза – один из экскреторных ферментов, которые всасываются в кровь из
тонкого кишечника и выделяются с мочой как
низкомолекулярные белки. Нормальные значения активности α-
36
амилазы мочи (диастазы), которая определена по Вольгемуту,
варьируют в границах 16-64 единиц.
При острых панкреатитах активность диастазы в моче резко
увеличивается. При почечной недостаточности амилаза в моче
отсутствует. После проведения экспериментальной части оформляется
протокол лабораторной работы.
Выполните задание и проверьте правильность их решения
с эталоном ответа.
Задание 1
В отделение реанимации принят больной 47 лет с диагнозом
инфаркт миокарда. Какая из фракций лактатдегидрогеназы (ЛДГ)
будет преобладать в сыворотке крови в течение первых двух суток?
А. ЛДГ 4.
В. ЛДГ 2.
С ЛДГ 3.
D
