5. SEPARACE A DETEKCE PROTEINŮ II

5.1. SDS-PAGE

Anna Kotrbová-KozakJana Vobořilová,Vlasta Fürstová,Tereza Kopská

SDS-PAGE(= sodium dodecylsulphate-polyacrylamide gel electrophoresis)

-metoda pro separaci proteinů dle jejich velikosti

Jednotlivé kroky experimentu*Příprava polyakrylamidových gelů*Příprava vzorků pro SDS-PAGE*Povaření vzorků při 95C po dobu 4 min. *Aplikace vzorků na gel *Vlastní elektroforesa probíhá při konstantním napětí 200 V po 30-40 min*Barvení gelu pomocí Coomassie Blue *Odbarvení gelu MetOH/HOAc *Identifikace myosinu a aktinu ve vzorcích tkaně pomocí proteinového markeru

1 2 3 4 5 6 7

Myosin (těžký řetězec)

Aktin

Tropomyosin

Myosin (lehký řetězec)

Myosin (lehký řetězec)

Myosin (lehký řetězec)

1. Marker 5. Aktin

2. Játra 6. Myosin

3. Srdce 7. Marker

4. Sval

Separace proteinů v akrylamidovém gelu

-proteiny jsou tepelně denaturovány ve vzorkovém pufru obsahujícím dodecyl sulfát sodný (SDS)- zachována je tak pouze jejich primární struktura -denaturované proteiny mají vláknitý tvar a stejný záporný náboj daný vazbou SDS – migrace tedy závisí pouze na jejich molekulové hmotnosti

Pohyb takto upravených proteinů v elektrickém poli:-proteiny mající negativní náboj se pohybují směrem ke kladně nabité elektrodě

Jak funguje SDS-PAGE?

•Negativně nabité proteiny se pohybují ke kladné elektrodě

•Menší proteiny se pohybují rychleji

•Proteiny se rozdělují podle velikosti (molekulové hmotnosti)

-

+

s-s

SDS, zahřátí

Proteiny s SDS

Co obsahuje vzorkový pufr pro SDS-PAGE?

*Tris pufr utváří vhodné pH*SDS (dodecyl sulfát sodný) detergent poskytující proteinům negativní náboj*Glycerol vzhledem ke své vyšší specifické hmotnosti zajišťuje klesnutí vzorku ke dnu jamky v gelu po nanesení *“Bromophenol Blue“ barvivo umižňující sledovat průběh elektroforézy (pohyb čela v gelu)

SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)

•SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) aniontový detergent

–solubilizuje a denaturuje proteiny

–dodává proteinům negativní náboj

Většina proteinů váže SDS ve stejném poměru, asi 1,4 g SDS/g proteinu

•Zvýšená teplota denaturuje proteiny

O

S

O

O

O

-

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH3

SDS

Proč používat akrylamidový gel k separaci proteinů? Akrylamidový gel: pevná a inertní matrix

Ideální pro separaci proteinů

Menší velikost pórů než u agarosy

Proteiny jsou menší než

intaktní chromoz. DNA

Gel je vytvořen polymerací aktylamidu a N´,N´-

methylenbisakrylamidu zahájenou volnýmí radikály

vzniklými při rozkladu persíranu amonného.

Molekulová hmotnost proteinů

velikost měřena v daltonech (Da) či kilodaltonech (kDa)

Dalton = jednotka atomové hmotnosti

= přibližně se rovná hmotnosti atomu

vodíku (1,66 x 10 -24 g)

= definován také jako 1/16 hmotnosti atomu

kyslíku

Průměrná aminokyselina = 110 Da

Průměrný nukleotidový pár = 649 Da

Protein kDa Functiontitin 3000 center myosin in sarcomere dystrophin 400 anchoring to plasma membranefilamin 270 cross-link filaments into gel

myosin heavy chain 210 slide filamentsspectrin 265 attach filaments to plasma

membranenebulin 107 regulate actin assembly -actinin 100 bundle filaments gelosin 90 fragment filamentsfimbrin 68 bundle filaments

actin 42 form filaments

tropomyosin 35 strengthen filaments

myosin light chain 27 slide filamentstroponin (T, I, C) 30, 19, 17 mediate regulation of

contractionthymosin 5 sequester actin monomers

Hlavní proteinové složení svalů

Imunochemická detekce proteinů

= WESTERN Blot Analýza

*transfer proteinů separovaných pomocí SDS-PAGE z gelu na membránu

*identifikace proteinu pomocí imunodetekce, tj. komplexu primární a případně sekundární protilátky

*vizualizace pomocí barevné reakce nebo chemiluminiscence

WESTERN blot (metoda detekce proteinu):

-název vznikl jako slovní hříčka dle metody Southern blot (technika detekce DNA) zavedené Edwardem Southernem -analogicky byl vytvořen také název pro metodu NORTHERN blot (technika detekce RNA

přez nesporné kvality Lysenkovy a Mičurinovy vědecké školy se sovětským vědcům nepodařilo vyvinou vlastní metodu Eastern blotu