3DYHO &RXIDO 3 ) 8. 3UDKD

Modern² separaļn² techniky

Pavel Coufal PŚF UK Praha

Pražské analytické centrum inovacíProjekt CZ.04.3.07/4.2.01.1/0002 spolufinancovaný ESF a Státním rozpočtem ČR

SUPERVISOR

Poznámka

Accepted nastavil SUPERVISOR

Obsah

1. Úvod1.1. Miniaturizace v analytické chemii1.2. Přednosti a nevýhody kapilárních technik1.2.1. Kapilární zónová elektroforéza1.2.2. Kapilární kapalinová chromatografie1.2.3. Nanokapalinová chromatografie na čipu2. Použití miniaturizovaných separačních technik 2.1. NanoLC-ESI-MS/MS2.2. Srovnání CZE a CLC2.3. Monolitické kolony pro CLC

© Pavel Coufal, Univerzita Karlova v Praze, Katedra analytické chemie, 4.9.2006 2

Miniaturizacevýznamný trend dnešní doby


Miniaturizace v separačních metodách

Mikroextrakcena tuhé fázi

SPME

Kapilárníseparačnítechniky

CLC, CZE a CEC

Tištěnámikropole

Microarrays

Čipy

Lab-on-chip


Proč zmenšujeme separační prostor?

Vysokoúčinnákapalinová

chromatografie

HPLC

1 mL/min

525 L

Kapilárníkapalinová

chromatografie

CLC

3 µL/min

1,6 L

Nanokapalinová

chromatografie

nanoLC

0,3 µL/min

158 mL


Tlak analytické praxe na zlepšení některých parametrůvyvinutých a vyvíjených analytických metod 1. zvýšení citlivosti2. zlepšení selektivity3. zrychlení analýzy4. zmenšení vzorku5. použití méně běžných substancí6. snížení neurčitosti7. zajištění správnosti a přesnosti8. snížení nákladů9. minimalizace vlivu na životní prostředí

10. kompatibilita s hmotnostní spektrometrií

miniaturizace

Požadavky analytické praxe


Kapilární separační metodypoužívané v analytické chemii

1. Kapilární zónová elektroforéza (CZE)

2. Kapilární kapalinová chromatografie (CLC)

3. Kapilární elektrochromatografie (CEC)

4. Kapilární plynová chromatografie (CGC)

5. Nanokapalinové mikrofluidní technikyrealizované na čipu v plošném uspořádání(Lab-on-a-chip)


Problémy miniaturizacevyplývají z principu separačních metod a

technických možností doposud známých technologií

1. instrumentální náročnost

2. zmenšení průtoku eluentu a detekční cely

3. nestabilita elektroosmózy u CZE

4. reprodukovatelnost dávkování malých objemů

5. plnění kolon pro CLC

6. frity u kolon pro CLC


Kapilární zónová elektroforéza

+ -+25000 V

254 nm 0 2 4 6 8 10 12 14 160,0

0,2

0,4

0,6

0,8

Sign

álde

tekt

oru,

mAU

5

43

2

1

ropi

niro

l

Migrační čas, min


vhodná pro látky iontové povahy(rozdílné elektroforetické pohyblivosti)1. velká separační účinnost2. rychlý vývoj metody3. krátká doba analýzy4. malá spotřeba vzorku 5. snadné odstranění všech látek z předchozí analýzy6. snadné a rychlé určení pKa analytů7. dobrá kompatibilita s MS detekcí1. menší selektivita2. malá robustnost3. nestabilita elektroosmotického toku4. horší opakovatelnost a reprodukovatelnost5. problémy s validací

Přednosti a nevýhody CZE


Kapilární kapalinová chromatografie


6 MPa

210 nm

0 2 4 6 8 10 12

0

2

4

6

8

10

12

5

4

3

2

1

Sign

álde

tekt

oru,

mAU

Retenèní èas, min

Přednosti a nevýhody CLCvhodná pro neutrální látky a ionty(rozdílná distribuce mezi mobilní a stacionární fází)1. velká separační účinnost2. velká selektivita3. možnost gradientové eluce4. velká robustnost5. výborná opakovatelnost a reprodukovatelnost6. možnost validace7. dobrá kompatibilita s MS detekcí1. komplikovaná příprava separační kolony2. pomalejší vývoj metody3. delší doba analýzy4. větší spotřeba vzorku5. látky z předchozí analýzy mohou zůstat v koloně


Nanokapalinová chromatografie na čipu

4 L/minµ

0,3 L/minµ

1 Lµ

300 - 1800 m/z

Prekoncentrace


4 L/minµ

0,3 L/minµ

1 Lµ

300 - 1800 m/z

Separace

Nanokapalinová chromatografie na čipu


Čip a jeho příslušenství


Přednosti a nevýhody nanoLC na čipu

vhodná pro neutrální látky a ionty(rozdílná distribuce mezi mobilní a stacionární fází)1. výborná kompatibilita s MS detekcí2. dobrá selektivita, robustnost a opakovatelnost3. žádná šroubovací spojení4. prekoncentrace vzorku5. možnost výměny plastového čipu po několika analýzách1. instrumentální náročnost na pumpy2. instrumentální náročnost na dávkovací ventil3. obtížná výroba čipu ve vlastní laboratoři


Identifikace bílkovinpomocí nanoLC-ESI-MS/MS

1. bílkovina2. štěpení trypsinem

3. specifické peptidy4. separace na čipu

5. elektrosprej6. hmotnostní spektrometrie

7. sekvence aminokyselin8. porovnání s databází

9. identifikace peptidů10. identifikace bílkoviny

nanoLC

ESI

MS/MSproteomika


Chromatogram

W568J053.D: BPC 300-1800 ±All MS

0

2

4

6

7x10Intens.

2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 Time [min]

Identifikováno 10 fmol hovězího α-S1 kaseinu.70 ze 214 aminokyselin, 3 peptidy identifikovány, 32% pokrytíMKLLILTCLVAVALARPKHPIKHQGLPQEVLNENLLRFFVAPFPEVFGKEKVNELSKDIGSESTEDQAMEDIKQMEAESISSSEEIVPNSVEQKHIQKEDVPSERYLGYLEQLLRLKKYKVPQLEIVPNSAEERLHSMKEGIHAQQKEPMIGVNQELAYFYPELFRQFYQLDAYPSGAWYYVPLGTQYTDAPSFSDIPNPIGSENSEKTTMPLW


Štěpení bílkovin trypsinem

hovězí α-S1 kaseinMKLLILTCLVAVALARPKHPIKHQGLPQEVLNENLLRFFVAPFPEVFGKEKVNELSKDIGSESTEDQAMEDIKQMEAESISSSEEIVPNSVEQKHIQKEDVPSERYLGYLEQLLRLKKYKVPQLEIVPNSAEERLHSMKEGIHAQQKEPMIGVNQELAYFYPELFRQFYQLDAYPSGAWYYVPLGTQYTDAPSFSDIPNPIGSENSEKTTMPLW

Trypsin je bílkovina o Mr = 23300.Enzym katalyzující hydrolýzu peptidických vazebza Lys (K) a Arg (R) nenásleduje-li Pro (P).

YLGYLEQLLRH3N+-Tyr-Leu-Gly-Tyr-Leu-Glu-Gln-Leu-Leu-Arg-COOH


Fragmentace peptidu v MSKolizí indukovaná disociace (CID) srážkou iontu peptidu s atomem hélia v iontové pasti MSdochází k fragmentaci peptidu na peptidické vazbě -CO-NH-a vznikají fragmenty b a y.

YLGYLEQLLR+

H3N+-Tyr-Leu-Gly-Tyr-Leu-Glu-Gln-Leu-Leu-Arg-COOHY+ b1 LGYLEQLLR+ y9YL+ b2 GYLEQLLR+ y8YLG+ b3 YLEQLLR+ y7YLGY+ b4 LEQLLR+ y6YLGYL+ b5 EQLLR+ y5YLGYLE+ b6 QLLR+ y4YLGYLEQ+ b7 LLR+ y3YLGYLEQL+ b8 LR+ y2YLGYLEQLL+ b9 R+ y1


kapalinová chromatografiegradientová eluce: eluent A: voda s 0,1 % HCOOH

0 min 2% B eluent B: acetonitril s 0,1 % HCOOH40 min 42% B42 min 85% B 44 min 85% B 45 min 2% B 50 min 2% B

průtok nanopumpy: 300 nL/minprůtok kapilární pumpy: 4 µL/min eluentu Aobjem vzorku: 1 µL, prekoncentrace vzorku: 5 minuthmotnostní spektrometriesušící plyn: N2, průtok: 2,5 L/min, teplota 230 °Cnapětí ESI: -2400 V, skenovaný rozsah: 300 – 1800 m/z

Experimentální podmínky


je vynikajícím analytickým nástrojempro identifikaci

bílkovin v proteomiceale i menších organických molekul,jako např. metabolických produktů

léčiv ve farmacii.

NanoLC-ESI-MS/MS


Nanokapalinová nebokapilární kapalinová chromatografie

Průměr kolonyMikrokapalinová chromatografie 1 mmKapilární kapalinová chromatografie 300 μmNanokapalinová chromatografie 75 μm

Vhodná detekceCLC UV-VIS, CCD, EDNanoLC MS, LIF, CCD, ED


látky iontové povahy

rozdílné elektroforetické pohyblivosti

výborná separační účinnostrychlý vývoj metodykrátká doba analýzymalá spotřeba vzorku snadné odstranění všech látek

z předchozí analýzy

nestabilita elektroosmotického tokuhorší opakovatelnost

a reprodukovatelnostproblémy s validací

neutrální látky a ionty

rozdílná distribuce mezi mobilnía stacionární fází

velká separační účinnostvýborná opakovatelnost

a reprodukovatelnostmožnost validace

komplikovaná přípravaseparační kolony

pomalejší vývoj metodydelší doba analýzyvětší spotřeba vzorkulátky z předchozí analýzy

mohou zůstat v koloně

CZE CLC


Ropinirol a jeho nečistoty

HCl.HN

OHN

ropinirol 1 2

4 53

ONH

N(CH CH CH ) HCl.2 2 23

O

O

HN


O

Cl

NH


ONH

HNCH CH CH HCl.2 2 3

ONH



Experimentální podmínky

křemenná kapilára50 μm x 40 cm x 47 cm100 mM boritanový pufr30 mM MgSO4pH = 8,720 % acetonitril2 nl vzorku+30 kV, 51 μAdetekce při 254 nm

Obě analytické metody byly optimalizovány pro separacia stanovení ropinirolu v reálných vzorcích ze syntézy.

Nucleosil 100-5 C18, 5 μm 320 μm x 41 cm8,7 mM pufr MESpH = 6,055 % acetonitril

60 nl vzorku4 μL/mindetekce při 254 nm

CZE CLC


Separace a stanovení pomocí CZE a CLC

0 2 4 6 8 10 12 14 160,0

0,2

0,4

0,6

0,8CZE

Sig

nál d

etek

toru

, mA

U

5

43

2

1

ropi

niro

lMigrační čas, min

0 5 10 15 20 25 300,0

0,2

0,4

0,6

0,8CLC

5

4

3

2

1

ropinirol

thiomočovina

Sig

nál d

etek

toru

, mA

U

Retenční čas, min

0 2 4 6 8 10 12 14 160,0

0,1

0,2

0,3

0,4CZE1.vzorek

S

igná

l det

ekto

ru, m

AU

53

2

1

ropinirol

Migrační čas, min0 5 10 15 20 25 30

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10CLC1.vzorek

2

53

ropinirol

1Si

gnál

det

ekto

ru, m

AU



Kvantifikace pomocí CZE a CLC

------------------------------------------------------------------------------------CZE CZE CLC CLC

Analyt r LOQ r LOQ------------------------------------------------------------------------------------Ropinirol0-2,5 mg/mL 0,998 0,9950-25 µg/mL 0,996 3,6 0,997 5,6

1 0,998 2,3 0,998 3,62 0,998 3,0 0,998 4,33 0,998 2,0 0,999 6,94 0,999 2,6 0,996 6,35 0,996 3,3 0,997 7,9

------------------------------------------------------------------------------------

Korelační koeficient (r) lineárních kalibračních křiveka limity stanovení (LOQ) v µg/mL.


Porovnání obou kapilárních metod

Dva různé vzorky ropinirolu ze syntézy byly analyzovány pomocí optimalizovaných metod CZE a CLC.

Doba analýzy 13 min 27 minOpakovatelnost 0,1 – 19,7 % 0,1 – 2,9 % (n = 6)Čistota ropinirolu1.vzorek 98,69 % 98,24 %2.vzorek 99,65 % 99,59 %

(1.vzorek metodou HPLC: 98,3%)(2.vzorek metodou HPLC: 99,6%)

CZE CLC


Optimalizace pH základního elektrolytuOptimalizace pH základního elektrolytu v CZE poskytuje

hodnoty pKa separovaných látek.

0 2 4 6 8 10 12 14-2

-1

0

1

2

3

ropinirol 1 2 3 4 5

Elek

trofo

retic

ká p

ohyb

livos

t, 10

-4 c

m2 /V

s

pH


Určení disociačních konstant

)pK(pHi a1011mm −+

⋅=

----------------------------------------------------------------------------Analyt pKa (CZE) mi r----------------------------------------------------------------------------Ropinirol 9,79 2,27 0,991

1 9,43 2,26 0,9552 9,52 2,22 0,9893 9,95 2,21 0,991 4 10,06 2,47 0,9925 9,36 2,12 0,986

----------------------------------------------------------------------------


Reprodukovatelnost aopakovatelnost v CZE

Elektroosmotický tok se často mění i v průběhu jedné analýzy.

Nestabilní elektroosmotický tok vede ke špatnéa) reprodukovatelnosti a opakovatelnosti migračních časů

(řešení: kovalentní či dynamické pokrytí vnitřní stěny)b) opakovatelnosti plochy píků

(řešení: normalizace plochy A/t, vnitřní standard)

Validace analytických metod v CZE je obtížná.


Elektroosmotický tok, EOF

TRIS pufrpH = 8,2■ bez promytí

fosforečnanovýpufr, pH = 6,8■ promytí NaOH■ promytí HNO3■ bez promytí

0 5 10 15 204

5

6

7

Pohy

bliv

ost E

OF,

10-4

cm

2 /Vs

Číslo analýzy


Analýza aminokyselin pomocí CZE

Experimentální podmínky:křemenná kapilára 50 μm x 66,5 cm x 80 cm2,3 M CH3COOH (pH 2,1) s 0,1% hydroxyethylcelulosou300 mbar.s, 0,1 – 0,5 mM roztok aminokyselin+30 kV, 15,3 μA, 25 °Cbezkontaktní vodivostní detekce (CCD)

Hydroxyethylcelulosa (HEC) významně zlepšujereprodukovatelnost a opakovatelnost použité

analytické metody.


20 nederivatizovaných aminokyselin

0 5 10 15 20 25 30 35-0,221

-0,220

14

21

2018

968754

32

1

Sig

nál d

etek

toru

CC

D, V


Elektroosmotická pohyblivost bez HEC 0,12·10-4 cm2/VsElektroosmotická pohyblivost s 0,1% HEC 0,03·10-4 cm2/VsRSD migračních časů prolinu 0,19 % (n = 12)RSD migračních časů kys. asparagové 0,22 % (n = 12)

1 Lys 8 Leu 15 Glu2 Arg 9 Ser 16 Phe3 His 10 Thr 17 Pro4 Gly 11 Asn 18 Tyr5 Ala 12 Met 19 Cys-Cys6 Val 13 Gln 20 Cys7 Ile 14 Trp 21 Asp


Efektivní elektroforetické pohyblivosti

20,0 22,5 25,0 27,5 30,0-0,221

-0,220

1419

2018

96 8712 17

161110

Sig

nál d

etek

toru

CC

D, V


1 Lys 2,91·10-4 8 Leu 1,40·10-4 15 Glu 1,16·10-4

2 Arg 2,74·10-4 9 Ser 1,39·10-4 16 Phe 1,13·10-4

3 His 2,67·10-4 10 Thr 1,26·10-4 17 Pro 1,10·10-4

4 Gly 2,00·10-4 11 Asn 1,24·10-4 18 Tyr 1,08·10-4

5 Ala 1,77·10-4 12 Met 1,23·10-4 19 Cys-Cys 1,02·10-4

6 Val 1,47·10-4 13 Gln 1,19·10-4 20 Cys 1,00·10-4

7 Ile 1,44·10-4 14 Trp 1,18·10-4 21 Asp 0,96·10-4

allo-Thr 1,17·10-4 cm2/Vs

0 5 10 15 20 25 30 35-0,222

-0,221

Cys-

Cys

allo

-Thr

ThrCys

Sign

ál d

etek

toru

CC

D, V



jsou slibným konkurentem konvenční HPLC.

Vyznačují se lepší separační účinností,sníženou spotřebou

základního elektrolytu / eluentu,menšími nároky na množství vzorku

a nízkou cenou každodenního provozu.

CZE a CLC


Separační kolony pro CLC

Náplňové kolony s částicemi stacionární fáze

Monolitické kolony s roubíkem monolitu

320 μm x 450 μm

320 μm x 450 μm

75 μm x 280 μm

220 μm x 375 μm


Charakter monolitických kolon

1. snadná příprava kolony radikálovou polymerizací2. žádné frity k udržení sorbentu3. polarita monolitu závisí na funkčním monomeru4. kolony libovolného průměru a délky5. nízká cena kolony

organické polymery

silikagelové monolity


Polyakrylamidový monolithydrofilní sorbent

akrylamid H2C=CH-CONH2

methylenbisakrylamid H2C=CH-CONH-CH2-NHCO-CH=CH2

HN CH

OC

C C

OC

C

a b

CH

H

C CCH

H

C

c d

2

2

H

2CH2

H NOC2

H HH

CH2 CH2 CH2

H NOC2 H NOC2

H NOC2

NH


Polystyrenový monolithydrofobní sorbent

styren H2C=CH-C6H5

divinylbenzen H2C=CH-C6H4-CH=CH2

C Ce f

CHCH CHCH

H

C

g h

2

H

2CH2

H

CH2 CH2

H C5 6

H C5 6 H C5 6

CHCH2

H C5 6


Polybutylmethakrylátový monolitstředně hydrofobní sorbent

butylmethakrylát H2C=C(CH3)-COO-CH2CH2CH2CH3

ethylendimethakrylát H2C=C(CH3)-COO-CH2CH2-OOC-C(CH3)=CH2

CH CH

O C

C C

O C

C

r s

CH

H C

C CCH

H C

C

t u

2 2

2

2

3

3H C3

2CH2

H C O C249 H C O C249

H C O C249 H C O C249

H C3 H C3H C3

CH2 CH2 CH2

2


Přípravapolybutylmethakrylátového monolitu

Silanizace kapilárysilanizační činidlo: 3-(trimethoxysilyl)propylmethakrylát

Polymerizační směs (40:60)funkční monomer: butylmethakrylátsíťovací monomer: ethylendimethakrylátiniciátor polymerizace: α,α’-azobisisobutyronitrilporogenní rozpouštědlo: 1-propanol

1,4-butandiolvoda


Složení polymerizační směsifunkční monomer: butylmethakrylát 17,8 %síťovací monomer: ethylendimethakrylát 21,8 %iniciátor polymerizace: α,α’-azobisisobutyronitril 0,4 %porogenní rozpouštědlo: 1-propanol 36,0 %

1,4-butandiol 18,0 %voda 6,0 %


Vliv síťovacího monomeru Polymerizační směs Hmotnostní %butylmethakrylát 23,8 19,8 17,8ethylendimethakrylát 15,8 19,8 21,8α,α’-azobisisobutyronitril 0,4 0,4 0,41-propanol 36,0 36,0 36,01,4-butandiol 18,0 18,0 18,0voda 6,0 6,0 6,0

0 5 10 15 20

0

1

2

3

4

5

anilin

urac

il

tolu

en

2 µL/min65:35 (v/v)acetonitril-voda

Sign

ál d

etek

toru

, mAU

Retenční čas, min0 5 10 15 20

0

2

4

6

anili

n

urac

il

tolu

en

2 µL/min65:35 (v/v)acetonitril-voda

Sig

nál d

etek

toru

, mA

U



HETP v μm: Analyt 1 μL/min 4 μL/minuracil 52 134fenol 44 132benzen 27 57toluen 26 63ethylbenzen 30 77

0 5 10 15 20 25 30 35 400

5

10

15

20

urac

il ethy

lben

zen

feno

l

benz

en

tolu

en1 µL/min

Sig

nál d

etek

toru

, mA

U

Retenční čas, min0 5 10 15 20 25 30 35 40

0

2

4

6

8

10

12

ethy

lben

zen

benz

enfe

nol

urac

il

tolu

en 4 µL/min65:35 (v/v)acetonitril-voda

Sig

nál d

etek

toru

, mA

U


Separace malých organických molekul


uCuBAHETP ⋅++=

0 1 2 3 4 50

25

50

75

100

125

150

ethylbenzen

toluenbenzen

fenoluracilH

ETP,

µm

Průtok eluentu, µL/min

0 2 4 6 8 10 12

0

2

4

6

8

10

12

ethylb

enze

n

benz

en

fenol

uracil

tolue

n4 µL/min

Sig

nál d

etek

toru

, mAU


0 5 10 15 20 25 30 35 400

5

10

15

20

uracil

ethylb

enze

nfen

ol

benz

en

tolue

n1 µL/minS

igná

l det

ekto

ru, m

AU


Separační účinnost kolony


jsou slibnou alternativouke kapilárním náplňovým kolonám.

Vyznačují se srovnatelnouseparační účinností a jejich přednostíje jejich cena a jednoduchost přípravy.

Kapilární monolitické kolony


Budoucnostkapilárních separačních technik

Problém reprodukovatelnosti CZE je řešitelný použitím kapilárních kolon s pokrytým vnitřním povrchem.

Problém přípravy kapilárních kolon pro CLC je řešitelnývyužitím monolitických kolon.

Domnívám se, že CLC a CZE budou postupně nahrazovatHPLC i v komerční sféře chemické analýzy.

CZE se bude více využívat k rychlé kontrole vzorkůz výrobního procesu a CLC bude sloužit především

ke kontrole kvality konečných produktů.


Děkuji Vám za pozornost.

Chemickýústav

Přírodovědeckáfakulta

Univerzita Karlovav Praze


Date post:	30-Nov-2021
Category:	Documents
Upload:	others
View:	1 times
Download:	0 times

3DYHO &RXIDO 3 ) 8. 3UDKD

Documents