21.10.2014

ACH/IM 1

© David MILDE, 2004-2014

ABSORPČNÍ A LUMINISCENČNÍ SPEKTROMETRIE V UV/Vis

OBLASTI SPEKTRA

ABSORPČNÍ SPEKTROMETRIE

21.10.2014

ACH/IM 2

David MILDE, 2004

Absorpce záření ve Vis oblasti

Při dopadu bílého světla na vzorek může být záření zcela odraženo látku vidíme jako bílou; nebo zcela pohlceno látku vidíme jako černou.

Pokud vzorek část záření pohltí a část odrazí barva látky viditelná prolidské oko odpovídá barvě odraženého záření (tzv. doplňková barva).

(nm) Pohlcená barva Doplňková barva

400-435 fialová žlutozelená

435-480 modrá žlutá

500-560 zelená červeno-purpurová

560-580 žlutozelená fialová

580-595 žlutá zelená

595-610 oranžová zelenomodrá

620-760 červená modrozelená

David MILDE, 2014

Molekulové orbitaly (MO)

MO–LCAO (Molecular Orbital – Linear Combination ofAtomic Orbitals) popisuje vznik MO pomocí lineárníkombinace atomových orbitalů (AO).K tomu dojde prostorovým překryvem AO atomů.Ze dvou AO se vytvoří 2 MO: vazebný a protivazebný: 2 typy vazebných orbitalů (σ, π) 2 typy protivazebných orbitalů (σ*, π*) 1 nevazebný orbital (n); n* neexistuje, protože n orbitaly se nepodílí na

vazbě!

HOMO a LUMO: nejvyšší obsazený molekulový orbital(Highest Occupied Molecular Orbital) a nejnižší neobsazenýmolekulový orbital (Lowest Unoccupied Molecular Orbital). Energetický rozdíl mezi těmito orbitaly charakterizuje schopnost

excitace molekuly, čím je nižší, tím je jednodušší molekulu excitovat.

21.10.2014

ACH/IM 3

David MILDE, 2014

Teoretický základ

Za normálních podmínek se molekula nachází v základnímelektronovém stavu E0 = Ee + Ev + Er.Pohlcením fotonu záření z UV/Vis oblasti se změníelektronová konfigurace nebo spin e- a molekula přejde doexcitovaného stavu. Zde setrvá cca 10-15 s a přechází dozákladního stavu deaktivačními procesy.

ΔE = E1 - E0 = hν = ΔEe + ΔEv + ΔEr.ΔEe ~ 150-600 kJ.mol-1, ΔEv ~ 2-60 kJ.mol-1,ΔEr ~ 3 kJ.mol-1

E

Teoretický základ

David MILDE, 2014

Povolené přechodySymetricky zakázané přechody

21.10.2014

ACH/IM 4

David MILDE, 2004

Teoretický základ

Intenzita pásů (dle kvantové mechaniky):1. Přechody dovolené – ze základní singletové do excitované singletové

hladiny; max 104 – 105 l.mol-1.cm-1

2. Přechody spinově zakázané – málo pravděpodobné přechody ze základnísingletové do excitované tripletové hladiny; max 100 l.mol-1.cm-1

3. Přechody symetricky zakázané max 102 l.mol-1.cm-1; vibrace jadermolekuly vede k diferenci v rozdělení e- a tím ke změně dipólovéhomomentu molekuly a přechodu e-.

Elektronové přechody v organických molekulách:

David MILDE, 2004

Elektronové přechody v organických molekulách

n uvedeme společně, chemické skupiny častoobsahují jak tak n e-, oba typy přechodů přispívají k tvorběabsorpčních pásů. Přechody jsou relativně nezávislé na atomech spojených

s dvojnou vazbou, jsou dovolené a intenzivní: 103-105 l.mol-1.cm-1. Přechody n jsou symetricky zakázané a nejsou příliš intenzivní (

10-102 l.mol-1.cm-1), jejich absorpční maximum je silně závislé nadruhu atomu (poloha n e- je silně závislá ne elektronegativitěheteroatomu).

vytvářejí jednoduché vazby – alifatické uhlovodíky.Prakticky nepoužívané vzhledem ke krátkým (nutnopracovat ve vakuu).n poskytují substituenty s nevazebnými e- – nasycenésloučeniny se S, N, Br, I, které absorbují do 200 nm a O a Cl,které absorbují nad 200 nm.

21.10.2014

ACH/IM 5

David MILDE, 2004

Chromofor – funkční skupina v molekule odpovědná zaabsorpci záření v UV a Vis oblasti. Obecně lze říci, že skupinys e- jsou chromofory pro UV a Vis oblast a skupiny se e-

pro dalekou UV oblast.Auxochrom – funkční skupina, která není chromoforem, alezvyšuje (mění) účinek chromoforů. |působuje posun absorpčních maxim chromoforů a zvyšují intenzitu pásů, př.:OH, NH2, halogenidy. Bathochromní (červený) posun – k delším . Hypsochromní (modrý) posun – ke kratším Hyperchromický efekt – zvýšení intenzity absorpce. Hypochromní efekt – snížení intenzity absorpce.

Elektronové přechody v organických molekulách

David MILDE, 2014

Vliv rozpouštědla – při rozpouštění se může měnitelektronová struktura rozpouštěné látky, což se projevíposunem λmax nebo ε. Podstatný je vliv polarity rozpouštědla atvorba vodíkových vazeb. Polarita minimálně ovlivňuje absorpci chromoforů CC a CC. Polarita výrazně ovlivňuje λmax u přechodů nπ* a nσ* (polární

chromofory CO, -NO2, -COOH, -NH2). Měřením spekter vzorku v různých rozpouštědlech lze rozlišit pásy

nπ* a nσ* od π π*, protože v polárnějším rozpouštědle seposouvají maxima prvních dvou ke kratší vlnové délce.

Nepolární rozpouštědla – spektra s ostrými maximy.

Vliv pH – posun λmax se projeví, když se se změnou pH měnícharakter chromoforu, např. -NH2, -COOH, -OH. Můžedocházet i ke změně intenzity pásu.

Vliv prostředí na absorpční spektrum

21.10.2014

ACH/IM 6

David MILDE, 2014

UV-Vis spektrometrie koordinačních sloučenin a anorganických iontů

Přenos náboje: dvojice anorganických látek, či organické +anorganické látky, kde jedna se chová jako donor a druhá jakoakceptor elektronů. Vzájemně reagují s výměnou elektronů avzniku komplexu D-A.

Absorpce záření komplexem D-A se projeví novýmabsorpčním pásem ( , n )

D-A + h D+-A-

Intenzivní přechody v UV: 103 - 104 l.mol-1.cm-1

Př: Fe3+ s fenantrolinem, Fe3+Fe(SCN)2+,

komplexy fenolů s Cu2+ či Fe3+.

Spektrum Fe3+ s o-fenantrolinem

David MILDE, 2014

UV-Vis spektrometrie koordinačních sloučenin přechodných kovů

Přenos v ligandovém poli:Méně intenzivní přechody zejména ve Vis oblasti 10-1 - 102 l.mol-1.cm-1.

Volný ion přechodového kovu = všechny d orbitaly mají stejnou E (jsoudegenrovány); působením ligandu dochází k rozštěpení na 2 nebo vícehladin s rozdílnou E, což umožňuje absorpci fotonu. Rozdíl vzniklýchenergetických hladin závisí na síle elektrostatického pole ligandu.

Př.:[Cu(H2O)6]2+ absorbuje při 790 nm, či [Fe(CN)6]3-.

21.10.2014

ACH/IM 7

David MILDE, 2004

INSTRUMENTACE

KOLORIMETR(ie) – vizuální porovnávání intenzity zbarvení vzorku a standardu nebo řady standardů.

FOTOMETR(ie) – objektivní měření prošlého toku záření: FOTOMETR – barevný filtr k vymezení .

SPEKTROFOTOMETR – obsahuje monochromátor.

David MILDE, 2004

Zdroje záření: D2 výbojka s W žárovkou; Xe vysokotlaká výbojka

Detektory: fotonásobič, CCD

Materiál kyvet: sklo, křemen, plast

INSTRUMENTACE

21.10.2014

ACH/IM 8

Aplikace UV-Vis spektrometrie

Kvalitativní analýzaKvantitativní analýza: Analýza anorganických solí – např. kyanidy, amonné ionty, fluoridy.

Př.: fosforečnany – reakce s (NH4)2MoO4 a SnCl2 – vznikámolybdenová modř a měří se absorbance při 690 nm.

Analýza nízkých koncentrací kovů – Cu, Hg, Al, Zn, … Př.: stanoveníFe po reakci s o-fenanthrolinem v kyselém prostředí.

Stanovení organických látek – př. fenoly. Aplikace v klinické analýze: cholesterol v séru, kyselina močová,

glukóza, celkové proteiny v séru, …

Průmyslové aplikace: farmaceutický, potravinářský, sklářský,výroba barev.Další vybrané aplikace: stanovení látek ve směsi, titrace,studium komplexů.

David MILDE, 2014

Stanovení 2 látek ve směsi

Je možné provést díky aditivním vlastnostem Lambert-Beerova zákona.Proměřením čistých látek získáme jejich ε při dvou zvolenýchvlnových délkách.Proměříme směsný vzorek, př: stanovení Fe3+ a Cu2+ ve směsipo reakci s Ru(CN6)4-

David MILDE, 2014 Pavel Šiman, FAF UK

21.10.2014

ACH/IM 9

David MILDE, 2004

Studium komplexů – Jobova metoda(metoda kontinuálních variací)

Slouží k určení stechiometrického složení a podmíněné konstanty stability komplexu:

M + yL MLy

Měří se série roztoku s konstantním ntot a proměnným nM a nL

(ekvimolární roztoky): ntot = nM + (nL)i

Maximum Abs je dosaženo pro stechiometrické složení komplexu.

Je-li to možné měříme při , kde absorbuje pouze komplex.

XL = 0,75 y = 3 ML3

XL = 0,5 y = 1 MLXL = 0,67 y = 2 ML2

L iL i

to t

M L i

( n )(X )

n

X 1 ( X )

L L

M L

X Xy

X 1 X

David MILDE, 2004

Spektrofotometrické titrace

Určování BE na základě změny absorbance s přídavkemtitračního činidla. Tento způsob titrace je experimentálnějednoduchý a má uspokojivou přesnost.

Titrační křivky:A. Absorbuje pouze titrační činidlo (titrace s uvolňováním Br2, I2).

B. Absorbuje produkt titrační reakce.

C. Absorbuje pouze titrovaná látka (stanovení Pb titrací chelatonem uvolňování xylenové oranže z komplexu s Pb).

21.10.2014

ACH/IM 10

(FOTO)LUMINISCENČNÍ SPEKTROMETRIE

(Emisní spektrometrie)

David MILDE, 2014

Teorie fotoluminiscence

Jde o emisi záření látkou, které bylo před tím absorbováno.Dělení: FLUORESCENCE, FOSFORESCENCE.Návrat látky z excitovaného (doba života excitovaného stavu 10-5 – 10-9 s) do základního stavu – relaxace: Vibrační (nezářivá) deaktivace – nadbytek E uvolněn ve formě tepla Emise – nadbytek E uvolněn jako foton (zářivá deaktivace) Relaxace pomocí fotochemické reakce: A* X + Y

Elektronové stavy organických molekul se dělí na: singletový – základní i excitovaný, opačné spiny obou e-, tripletový – pouze excitovaný, stejné spiny dvou e-, dubletový – lichý e- u volného radikálu, který může zaujmout 2

orientace.

21.10.2014

ACH/IM 11

David MILDE, 2004

Teorie fotoluminiscence

FLUORESCENCE: emise fotonu při přechodu z S1(ojediněle z S2) do základního stavu S0. Doba životaexcitovaného stavu (za jakou dobu dojde k emisi) závisí na při absorpci záření: pro 104 – 105 l.mol-1.cm-1 je doba 10-7

– 10-9 s, pro 101 – 102 l.mol-1.cm-1 je doba 10-5 – 10-6 s. Fluorescence odeznívá velmi rychle po ukončení excitace (vypnutí

zdroje excitačního záření).

FOSFORESCENCE: emise fotonu při přechodu z T1 na S0.Doba života excitovaného T stavu je 10-4 – 102 s fosforescenční záření sledujeme delší dobu po ukončeníexcitace. Elektron po absorpci záření nejprve přejde z S1 na T1 (přechod z S0 na

T1 je zakázaný)!

David MILDE, 2014

Teorie fotoluminiscence

VR … vibrační relaxace (vibrational relaxation)IC … vnitřní konverze (internal conversion)

ISC … mezisystémový přechod(intersystem crossing)

Schéma zářivých a nezářivých přechodů

fotoluminiscentní molekuly (Jablonského diagram)

21.10.2014

ACH/IM 12

David MILDE, 2004

Deaktivační procesy v molekulách

Preferovaný přechod do základního stavu je ten, kterýminimalizuje dobu života excitovaného stavu!

Nezářivá deaktivaceVibrační relaxace – rychlý proces (10-12 s), molekula ve vyšším vibračnímstavu snižuje svou E přechodem na nejnižší vibrační podhladinuexcitovaného (i základního) stavu.Vnitřní konverze – molekula na nejnižší vibrační podhladině excitovanéhostavu přechází do vyšší vibrační podhladiny nižšího energetického stavu.

Kombinací těchto dvou přechodů může molekula přejít z excitovaného do základního stavu bez emise fotonu!

Vnější konverze – nadbytek E je předán rozpouštědlu či jiné složce matrice.Mezisystémový přechod – molekula na nejnižší vibrační podhladiněexcitovaného stavu přechází na vysokou energetickou podhladinu stavu snižší E a jiným spinem.

Zářivé deaktivace: fluorescence a fosforescence

David MILDE, 2014

Frank-Condonův princip

Elektronové přechody jsou velmi rychlé (10-15 s). Frank-Condonův princip umožňuje pochopit podstatu elektronovýchpřechodů.Hmotnost atomových jader je několik řádů větší než hmotnostelektronu a vzájemný pohyb jader atomů v molekule (vibracemolekuly) je pomalejší (10-12 s).Přechody elektronů z jednoho stavu do druhého jsou rychlejšínež rychlost změny délky vazby mezi atomy absorbujícímolekuly.Tzn., že vzdálenost jader atomů je konstantní po dobuexcitace elektronu. Vzhledem k tomu, že molekuly stálevibrují a nacházejí se v různých vibračních stavech, výslednéspektrum bude superpozicí všech přechodů a bude mít pásovýcharakter.

21.10.2014

ACH/IM 13

David MILDE, 2014

Frank-Condonův princip

Potenciálové jámy s vibračními podstavy. Minimum křivky potenciálníenergie odpovídá rovnovážné vzdálenosti mezi oběma atomy.Vysvětlení vibronických přechodů z hlediska kvantové chemie,nejpravděpodobnější na ten vibrační podstav, kde je největší překryv sezákladním..

David MILDE, 2004

Fluorescence

Lze ji pozorovat pouze pokud je účinnějším prostředkem deaktivace nežnezářivé přechody.

Intenzita fluorescence IF: (F = NF/N … flourescenční výtěžek)

IF roste s F, P0, a koncentrací.

Vliv teploty a viskozity rozpouštědla na F.

Fluorescenční přechod může skončit na různých vibračních podhladináchS0 pásové spektrum.Ke fluorescenci dochází z nejnižší podhladiny S1, nezáleží na tom, zdabyla molekula excitována do S1 nebo do vyšších singletových hladin(např. S2).

cbPk303,2I)PP(kI 0FFT0FF

bc0T 10PPzákonaBeerovaLambertovaZ

21.10.2014

ACH/IM 14

David MILDE, 2004

Excitační a emisní spektra

VLIV STRUKTURY NA LUMINISCENCI1. Luminiscenci neposkytují nasycené uhlovodíky a zřídka nenasycené

alifatické uhlovodíky.2. Intenzivní F: aromatické uhlovodíky s nízkoležícími S stavy *.3. P vykazují aromatické sloučeniny s C=O nebo heteroatomy.4. Vliv substituce aromatického jádra na F: -NO2, -OH, …5. Aromáty s halogen substituenty zvyšují P a snižují F.6. Luminiskují zejména velké a pevné rovinné molekuly s rigidní

strukturou.

David MILDE, 2004

Souvislost absorpčních a emisních spekter

Luminiscence začíná na nejnižšívibrační podhladině S1 (T1) Eemitje menší než Eabs. Luminiscence seobjevuje u vyšších než absorpce.Luminiscenční spektrum bývázrcadlovým obrazem absorpčního.Mohou se protínat v 0.0 odpovídá nejmenší E proabsorpci a je v absorpčním spektrunejintenzivnější.

21.10.2014

ACH/IM 15

David MILDE, 2004

Instrumentace - fluorescence2 typy fluorescenčních spekter:

1. Excitační: IF v závislosti na budícího záření při konstantní emitovaného záření – slouží k určení účinné pro vyvolánífluorescence.

2. Emisní: IF v závislosti na emitovaného záření při konstantní excitačního záření.

Fluorimetr: k vymezení slouží filtry; zdroj: Hg výbojka.Spektrofluorimetr: mřížkové monochromátory; zdrojnejčastěji Xe vysokotlaká výbojka (spojité spektrum).Optická dráha mezi zdrojem a detektorem svírá 90°.Kyvety: 1 cm, křemenRozpouštědla: nesmí fluoreskovat.

David MILDE, 2004

Nutné rozlišit fluorescenci a fosforescenci!

Instrumentace - fosforescence

PŘÍPRAVA VZORKŮ

Kapalné: zmrazení vkapalném N2 vytvoříopticky čistou pevnoulátku (vzorek vrozpouštědle).Pevné: nanesení vzorkuna pevný substrát (deskytenkovrstvé chromato-grafie) – možno měřit zalaboratorní teploty.

21.10.2014

ACH/IM 16

Analytické využití

KVALITATIVNÍ ANALÝZA: menší využití – zejménapro polycyklické aromáty; molekuly s jemnýmistrukturními rozdíly mají velmi podobná spektra.

KVANTITATIVNÍ ANALÝZA: Přímé stanovení polyaromatických

uhlovodíků, vitamínů či steroidů. Stanovení aniontů na principu

zhášení fluosrescence. Stanovení kovů – vytvoření

komplexu, př. Al s alizarinovoučervení.

Fluorescenční detektor pro HPLC.

David MILDE, 2014

David MILDE, 2014

Analytické využití

• Chemiluminiscence: chemická reakce produkujemolekuly v excitovaném stavu, které emitují fotony.[A] + [B] → [excitovaný meziprodukt] → [produkty] + h

Př.: reakce luminolu s peroxidem vodíkuluminol + H2O2 → 3-aminoftalát* → 3-aminoftalát + h

• Bioluminiscence: k reakcím produkujícím molekuly vexcitovaném stavu dochází v biologických systémech,např. světlušky, meduzy, některé ryby.

Základní princip je oxidace luciferinu (biologickýpigment), při níž se 96 % energie emituje ve formě zářenía 4 % ve formě tepla.

luciferin + O2 → oxyluciferin + h

luminol