MALDIMALDI--TOF MSTOF MStypizace rodu typizace rodu AeromonasAeromonas

Andrea Teshim (Vávrová)Andrea Teshim (Vávrová)1,21,2

PřF MU, BrnoPřF MU, Brno

•• (1) (1) Oddělení mikrobiologieOddělení mikrobiologie, Přírodovědecká fakulta Masarykovy univerzity, Brno, , Přírodovědecká fakulta Masarykovy univerzity, Brno, Česká republikaČeská republika

•• (2) (2) Česká sbírka mikroorganismůČeská sbírka mikroorganismů, Přírodovědecká fakulta Masarykovy univerzity, , Přírodovědecká fakulta Masarykovy univerzity, Brno, Česká republikaBrno, Česká republika

•• (3) (3) Oddělení funkční genomiky a proteomikyOddělení funkční genomiky a proteomiky, Přírodovědecká fakulta Masarykovy , Přírodovědecká fakulta Masarykovy univerzity, Brno, Česká republikauniverzity, Brno, Česká republika

•• (4) (4) Oddělení informačních technologiíOddělení informačních technologií, Fakulta informatiky Masarykovy univerzity, , Fakulta informatiky Masarykovy univerzity, Brno, Česká republikaBrno, Česká republika

•• Spoluautoři:Spoluautoři:RNDr. Ludmila Tvrzová, Ph.D.RNDr. Ludmila Tvrzová, Ph.D.11RNDr. Ivo Sedláček, CSc.RNDr. Ivo Sedláček, CSc.22RNDr. Zbyněk Zdráhal, Dr.RNDr. Zbyněk Zdráhal, Dr.33Mgr. Ondrej Šedo, Ph.D.Mgr. Ondrej Šedo, Ph.D.33Ing. Matej Lexa, Ph.D.Ing. Matej Lexa, Ph.D.44

1/20

Hmotnostní spektrometrieHmotnostní spektrometries laserovou desorpcí a ionizací za účasti s laserovou desorpcí a ionizací za účasti

matricematriceMatrixMatrix--assisted laser desorption/ionizationassisted laser desorption/ionization

time of flight MStime of flight MS

•• AnalytickAnalytická technikaá technika•• Aplikace:Aplikace: Detekce a analýzaDetekce a analýza biomolekul biomolekul

IdentifikaceIdentifikace proteinů, struktury, proteinů, struktury, protein.interakcí protein.interakcí

•• Rychlá Rychlá chemotaxonomiechemotaxonomie založená na založená na detekci biomarkerůdetekci biomarkerů

2/20

Význam metody MALDI TOF pro Význam metody MALDI TOF pro taxonomii mikroorganismůtaxonomii mikroorganismů

•• Potřeba jasných a rychlých výsledků identifikace neznámých Potřeba jasných a rychlých výsledků identifikace neznámých vzorků vzorků –– zařazení do rodů, druhůzařazení do rodů, druhů

•• Významná je Významná je autentizace a identifikace kmenůautentizace a identifikace kmenů•• Př.rod Př.rod Aeromonas Aeromonas –– 1984 1984 –– 4druhy4druhy

2004 2004 –– 17druhů17druhů (Stackebrandt, Donohue a kol., (Stackebrandt, Donohue a kol., 2005)2005)

Výhoda MALDI MS :: při rozlišení dvoupři rozlišení dvouchemotaxonomicky a fenotypicky neodlišitelnýchchemotaxonomicky a fenotypicky neodlišitelnýchdruhů (Př. druhů (Př. B. anthracis a B. cereusB. anthracis a B. cereus))

3/20

Rod AeromonasRod Aeromonasčastý izolát klinického a veterinárního materiálu, podmíněný patogen,častý izolát klinického a veterinárního materiálu, podmíněný patogen,

maso, mléko, ryby, zelenina, plody moře, vodní prostředímaso, mléko, ryby, zelenina, plody moře, vodní prostředí

»» nový systém klasifikace! nový systém klasifikace! ------ řád Aeromonadalesřád Aeromonadales»» heterogenita a genetická proměnlivost v rámci roduheterogenita a genetická proměnlivost v rámci rodu

»» klinika: klinika: sekreční faktorysekreční faktory: cytotoxiny, enterotoxiny,: cytotoxiny, enterotoxiny,aerolyzin, proteázy, sideroforyaerolyzin, proteázy, siderofory

povrchové faktorypovrchové faktory: fimbrie, membr.proteiny, : fimbrie, membr.proteiny, S vrstvaS vrstva, , pouzdro, LPSpouzdro, LPS

A. caviae –– mírné průjmy, Lac+, nehemolitickámírné průjmy, Lac+, nehemolitickáA. hydrophila -- dyzenteriedyzenterieA. jandaei, A. trota, A. schubertii

IInfekce ran, septikémie, nfekce ran, septikémie, gastroenteritidy, gastroenteritidy, endokarditidy,endokarditidy,meningitidy, pneumonie, osteomyelitimeningitidy, pneumonie, osteomyelitidy, dy, konjunktivitidykonjunktivitidy

Rezistence k AmpRezistence k Amp

»» DiagnostikaDiagnostika: selektiv.půda s Amp, TCŽS, alkal.pepton.voda, KA : selektiv.půda s Amp, TCŽS, alkal.pepton.voda, KA -- mukózní kolonie, mukózní kolonie, ox+, kat+, lac ox+, kat+, lac –– (mimo (mimo A.caviaeA.caviae)), Glu+, Gas+, string, Glu+, Gas+, string--ββ hemol.hemol.

Aeromonas hydrophila

4/20

CíleCíle

•• Ověřit diferenciační schopnost MALDI MS pro Ověřit diferenciační schopnost MALDI MS pro bakterie rodu bakterie rodu AeromonasAeromonas na typových kulturách na typových kulturách a izolátech z prostředía izolátech z prostředí

•• Snaha získat : Snaha získat : reprodukovatelná spektrareprodukovatelná spektra -- odlišnosti mezi kmenyodlišnosti mezi kmeny

---------------------->> autentizace, identifikaceautentizace, identifikace

Aeromonas hydrophila

Cellulitis

5/20

MALDI MS analýzaMALDI MS analýza

VzorkyVzorky::~~ buňkybuňky: : celobuněčné preparátycelobuněčné preparáty

prostředí, klinika, potravinyprostředí, klinika, potraviny

kokrystalizace matricekokrystalizace matrice se vzorkemse vzorkem

NN22 laser 337nmlaser 337nm –– excitace UV, absorbce E laseruexcitace UV, absorbce E laseruhluboké vakuum 10hluboké vakuum 10--66PaPa

Ionizace molekulIonizace molekul –– uvolnění protonovaných uvolnění protonovaných molekul molekul [[M+HM+H]]+ + analytuanalytu

Spot na MALDI desce

Destička MALDI

6/20

MatriceMatriceDeriváty kys.benzoové a skořicové:Deriváty kys.benzoové a skořicové:

CHCACHCA –– αα--kyanokyano--44--hydroxyskořicová (do hydroxyskořicová (do ~ 5000~ 5000 Da)Da)SASA –– sinapovásinapová

sDHBsDHB –– gentisová (vysokomolekulární látky)gentisová (vysokomolekulární látky), , sDHB v 20% ACN s 1%sDHB v 20% ACN s 1% TFATFA

»»Rozpustná ve stejném rozpouštědleRozpustná ve stejném rozpouštědlejako vzorek, v nadbytku ke vzorkujako vzorek, v nadbytku ke vzorku

»»Neměla by se vzorkem reagovatNeměla by se vzorkem reagovat

»»Absorbce vln.délky laseruAbsorbce vln.délky laseru

»»FotostabilitaFotostabilita

Struktura hl.typů matric

5000 7000 9000 11000 13000 m/z0

500

1000

1500

2000

2500

3000

a.i.

Vliv matrice na kvalitu signálu

sDHB

FA

SA

CHCA

7/20

Technika charakterizuje biomarker Technika charakterizuje biomarker poměrem m/z částicepoměrem m/z částice

•• Měří se Měří se doba letu a intenzitadoba letu a intenzita signálusignálu•• Zobrazení jako Zobrazení jako spektrum ionizovatelných spektrum ionizovatelných

částicčástic bakteriálního proteomu v přítomnosti bakteriálního proteomu v přítomnosti matricematrice

Schéma metody MALDI TOF

8/20

A. hydrophila ssp. dhakensis7146T

Výstupní spektrum Výstupní spektrum Výška píkuVýška píku = = koncentracekoncentrace proteinu proteinu v místě odstřeluv místě odstřelu

(není kvantitativní metodou)(není kvantitativní metodou)

Závisí také na Závisí také na krystalizaci, ionizačních vlastnostech vzorku ajkrystalizaci, ionizačních vlastnostech vzorku aj..

9/204 000 600 0 80 00 10 000 m /z 0

1 00

2 00

3 00

4 00

5 00

a.i.

A. media 3653T

Pík = hodnota m/z

Optimalizace metodyOptimalizace metody

Hustota Hustota suspenze bakt.vzorkususpenze bakt.vzorkuTest konzervačních vlastností Test konzervačních vlastností acetonitriluacetonitrilu

vliv délky zamraženívliv délky zamraženíTest typu použité Test typu použité matrice matrice –– dle poměru signál/šumdle poměru signál/šumTest Test okyseleníokyselení matricematriceTest reprodukovatelnostiTest reprodukovatelnosti, opakovatelnosti, opakovatelnosti

10/20

Analyzované kmeny:Analyzované kmeny:

•• CCM 4363CCM 4363TT A. allosaccharophilaA. allosaccharophila•• CCM 4707CCM 4707TT A. bestiarumA. bestiarum•• CCM 4491CCM 4491TT A. caviaeA. caviae•• CCM 7231 CCM 7231 A. caviaeA. caviae•• CCM 4582CCM 4582TT A. encheleiaA. encheleia•• CCM 7243CCM 7243TT A. enteropelogenesA. enteropelogenes•• CCM 4354CCM 4354TT A. eucrenophilaA. eucrenophila•• CCM 4528 CCM 4528 A. hydrophila A. hydrophila ssp.ssp.hydrophilahydrophila•• CCM 7146CCM 7146TT A. hydrophila A. hydrophila ssp.ssp.dhakensisdhakensis•• CCM 7232CCM 7232TT A. hydrophila A. hydrophila ssp.ssp.hydrophilahydrophila•• CCM 7147CCM 7147TT A. hydrophila A. hydrophila ssp. ssp. ranaeranae•• CCM 7244 CCM 7244 „A. ichthiosmia“„A. ichthiosmia“•• CCM 4355CCM 4355TT A. jandaeiA. jandaei•• CCM 3653CCM 3653TT A. mediaA. media•• CCM 7245CCM 7245TT A. molluscorumA. molluscorum•• CCM 7233CCM 7233TT A. salmonicida A. salmonicida ssp.ssp.achromogenesachromogenes•• CCM 4124CCM 4124TT A. salmonicida A. salmonicida ssp.ssp.masoucidamasoucida•• CCM 7020CCM 7020TT A. salmonicida A. salmonicida ssp.ssp.pectinolyticapectinolytica•• CCM 1307 CCM 1307 A. salmonicida A. salmonicida ssp.ssp.salmonicidasalmonicida•• CCM 7246CCM 7246TT A. salmonicida A. salmonicida ssp.ssp.salmonicidasalmonicida

•• CCM 4103CCM 4103TT A. salmonicida A. salmonicida ssp. ssp. smithiasmithia•• CCM 4356CCM 4356TT A. schuberttiiA. schuberttii•• CCM 7234CCM 7234TT A. simiaeA. simiae•• CCM 2807CCM 2807TT A. sobriaA. sobria•• CCM 4368 CCM 4368 „A. trota“„A. trota“•• CCM 4359CCM 4359TT A. veronii A. veronii bv.bv. veroniiveronii•• CCM 1242 CCM 1242 A. veronii A. veronii bv. sobriabv. sobria•• CCM 4708 CCM 4708 A. popoffiiA. popoffii•• CCM 2280 CCM 2280 A. hydrophila A. hydrophila ssp.ssp.hydrophilahydrophila•• CCM 4243CCM 4243TT A. allosaccharophilaA. allosaccharophila•• CCM 4232CCM 4232TT A. caviaeA. caviae•• CCM 1242 CCM 1242 A. veronii A. veronii •• P 1753 P 1753 A. encheleiaA. encheleia•• P 1767 P 1767 A. encheleiaA. encheleia•• P 1669 = CCM 7406 P 1669 = CCM 7406 A. encheleiaA. encheleia•• P 1688 = CCM 7408 P 1688 = CCM 7408 A. encheleiaA. encheleia•• P 1292 P 1292 A. encheleiaA. encheleia•• P 1700 P 1700 A. encheleiaA. encheleia•• P 1290 P 1290 A. encheleiaA. encheleia•• P 660 P 660 A. popoffiiA. popoffii•• CCM 7330 CCM 7330 A. popoffiiA. popoffii•• P 666 P 666 A. popoffiiA. popoffii•• P 1909 P 1909 A. encheleiaA. encheleia•• P 1769 P 1769 A. encheleiaA. encheleia•• P 658 P 658 A. popoffiiA. popoffii•• P 655 P 655 A. popoffiiA. popoffii•• P 667 P 667 A. popoffiiA. popoffii

11/20

4491

4368

4363

4356

4354

2807

1909

1769

667

658

655

srovnání

6000 8000 10000 m/z0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

a.i.

4491

4368

4363

4356

4354

2807

1909

1769

667

658

655

Srovnání uvnitř roduA. caviae

“A. trota”

A.allo-saccharophila

A. schuberttii

A. eucrenophila

A. sobria

**

* * * * * ****

5000 7000 9000 11000 m/z0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

a.i.

7330

2280

666

660 Vz. 2

660 Vz. 1

Srovnání uvnitř rodu

**

** *

*

** *

**

*

Srovnání mezi rodySrovnání mezi rodyAeromonas,Aeromonas, Pseudomonas, Sphingomonas Pseudomonas, Sphingomonas

4000 6000 8000 10000 12000 14000 m/z0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

a.i.

Aeromonas bestiarum CCM 4707T

Pseudomonas fluorescensCCM 2115T

SphingomonasCCM 284

=>

*

*

*

*

*

*

14/20

6000 8000 10000 m/z0

100

200

300

400

500

600

700

800

a.i.

P 1669Opakovaná kultivace

Analýza 23. 11. 2006

Analýza 16. 11. 2006

MALDI MSdendrogram spektrální analýzy příbuznosti 17ti druhů rodu Aeromonas (Donohue et al., 2005)Journal of MicrobiologicalMethods Volume 65, Issue 3 , June 2006, Pages 380-389

16/20

Dendrogram příbuznosti 42 kmenů rodu Aeromonas získaný klastrovou analýzou

A. schuberttii

A. encheleia

A. encheleia

A. eucrenophila

A. bestiarum

A.salmonicidaA. salmonicida

A.sobriaA. allosacch.A.veroniibv.veroniiA.veroniibv.sobria

A.mediaA.jandaei

A.hydrophilassp.hydrophilaA.caviae

„A.trota“17/20

ShrnutíShrnutí

•• Optimalizace metodyOptimalizace metody na sbírkových kmenech na sbírkových kmenech pro identifikaci izolátůpro identifikaci izolátů

•• Zisk Zisk reprodukovatelných spekterreprodukovatelných spekter z různých z různých kultivací za stejných podmínek kultivací za stejných podmínek –– srovnatelné srovnatelné výstupyvýstupy

•• Vytvoření dendrogramu příbuznosti 46ti kmenů Vytvoření dendrogramu příbuznosti 46ti kmenů rodu rodu Aeromonas Aeromonas pomocí klastrové analýzypomocí klastrové analýzy

•• Byl stanoven Byl stanoven MS profilMS profil rodu rodu AeromonasAeromonas18/20

VýhodyVýhodySrovnání s biochem., fenotypizač. a metodami MB:Srovnání s biochem., fenotypizač. a metodami MB:•• Vysoká Vysoká rychlost a jednoduchárychlost a jednoduchá přípravapříprava vzorkuvzorku•• MalýMalý objemobjem vzorku vzorku •• RReprodukovatelný výstupeprodukovatelný výstup•• Rychle vyvíjející se metodika tvorby Rychle vyvíjející se metodika tvorby databázídatabází•• Možnost srovnáníMožnost srovnání s informacemi sekvenování s informacemi sekvenování

genomu, proteinů genomu, proteinů •• Možnost Možnost kombinace kombinace s dalšími metodamis dalšími metodami•• Šetření chemikáliemiŠetření chemikáliemi

19/20

PoděkováníPoděkování

RNDr. Ludmila Tvrzová, PhD. RNDr. Ludmila Tvrzová, PhD. –– odborná pomoc při práciodborná pomoc při práciRNDr. Ivo Sedláček, CSc.RNDr. Ivo Sedláček, CSc. -- odborná pomoc při práciodborná pomoc při práciRNDr. Zbyněk Zdráhal, Dr. RNDr. Zbyněk Zdráhal, Dr. –– konzultant, vyhodnocení spekterkonzultant, vyhodnocení spekterMgr. Ondrej Šedo, Ph.D. Mgr. Ondrej Šedo, Ph.D. -- analýza vzorků, vyhodnocení spekter analýza vzorků, vyhodnocení spekter Ing. Matej Lexa , Ph.D. Ing. Matej Lexa , Ph.D. –– statistické zpracování výsledkůstatistické zpracování výsledků