AGENCOURT CLEANSEQ · 2014. 7. 24. · Agencourt® CleanSEQ® Protokol 000600v32 Strana 4 z 12...

Agencourt® CleanSEQ® Protokol 000600v32

Strana 1 z 12

AGENCOURT® CLEANSEQ®

Dye-Terminator Removal – přípravek pro odstranění fluorescenčně značených terminátorů Pokyny pro manipulaci s jakýmikoli nebezpečnými chemickými látkami a jejich přepravu najdete v aktualizovaných protokolech na adrese http://www.agencourt.com/technical a v bezpečnostních listech materiálů na adrese http://www.beckmancoulter.com/customersupport/msds/msds.asp . AGENCOURT CLEANSEQ® je registrovaná obchodní známka společnosti Agencourt Bioscience, která je určena pouze pro laboratorní použití. Obsah Obsah 1 Úvod 1 Přehled procesu 2 Specifikace soupravy 2 Materiály obsažené v soupravě 2 Agencourt CleanSEQ® pro terminátor ABI BigDye 3

Materiály dodané uživatelem: 3 Terminátor ABI BigDye pro 96 jamek: 4 Terminátor ABI BigDye pro 384 jamek: 6

Beckman Coulter CEQ DTCS 8 Materiály dodané uživatelem: 8 Beckman Coulter CEQ DTCS pro 96 jamek: 8

Průvodce odstraňováním závad (pouze pro terminátor ABI BigDye): 12 Úvod Agencourt CleanSEQ je systém pro purifikaci sekvenačních produktů metodou SPRI® (Solid Phase Reversible Immobilization – reverzní imobilizace na pevné fázi) na bázi magnetických částic s jednoduchým protokolem o třech krocích. Tento flexibilní a jednoduchý formát, který lze automatizovat, představuje oblíbený purifikační systém pro mnoho zařízení zabývajících se genomickým výzkumem. Metodu Agencourt CleanSEQ lze provádět přímo v destičkách z termocyklerů bez potřeby jakéhokoli odstřeďování nebo filtrace. Systém efektivně purifikuje sekvenační produkty pro poskytnutí vysoce kvalitních sekvenačních dat. Poznámky k aplikaci systému Agencourt CleanSEQ lze nalézt na adrese http://www.agencourt.com/technical/. Společnost Agencourt vyvinula optimalizované protokoly Agencourt CleanSEQ pro všechny běžně používané sady fluorochromů pro sekvenace. Tento protokol poskytuje pokyny pro sekvenační metody ABI a Beckman (viz Obsah). Pro uživatele systému ET Terminator je k dispozici protokol CleanSEQ for MegaBACE* na adrese http://www.agencourt.com/technical/.

S dotazy ohledně tohoto protokolu se obracejte na technickou podporu společnosti Agencourt, tel. 1-800-773-9186

Agencourt Bioscience Corporation, A Beckman Coulter Company • 800-361-7780 • 978-867-2600 500 Cummings Center, Suite 2450 • Beverly, Massachusetts 01915 • www.agencourt.com

http://www.agencourt.com/technical

http://www.beckmancoulter.com/customersupport/msds/msds.asp




Strana 2 z 12

Přehled procesu

1. Navázání produktů sekvenační reakce na magnetické částice, poté jejich separace na magnetické desce

2. Promytí částic za účelem odstranění neinkorporovaných barviv, nukleotidů, solí a dalších kontaminujících látek

3. Eluce DNA za použití pufru na vodné bázi

Specifikace soupravy Množství reagencie CleanSEQ používané na jednu sekvenační reakci závisí na sekvenační metodě a formátu destičky. Počet čištění, na který vystačí každá souprava, zjistíte v následujících tabulkách.

Tabulka 1 ABI BigDye*Terminator

8 ml A29151 000121

50 ml A29154 000136

Formát pro 96 jamek 800 5 000 Formát pro 384 jamek 1 600 10 000

Tabulka 2 Beckman Coulter CEQ DTCS

Objem reakce 8 ml A29151 000121

50 ml A29154 000136

10 µl 800 5 000 20 µl 400 2 500

Materiály obsažené v soupravě Roztok Agencourt CleanSEQ

• Po dodání skladujte při teplotě 4 °C po dobu až 6 měsíců. • Reagencii Agencourt CleanSEQ před použitím dobře promíchejte. • NEZMRAZUJTE.




Strana 3 z 12

Agencourt CleanSEQ pro terminátor ABI BigDye1

Materiály dodané uživatelem: Spotřební materiál a hardware:

• Magnetická deska Agencourt SPRIPlate®: Pro formát pro 96 jamek:

Agencourt SPRIPlate 96R Ring Magnet Plate, Beckman katalog. č. A29164 / Agencourt katalog. č. 000219

Pro formát pro 384 jamek:

Agencourt SPRIPlate 384 Magnet Plate, Beckman katalog. č. A29165 / Agencourt katalog. č. 000222

• Reakční destička: Pro formát pro 96 jamek:

Cyklační destička o 96 jamkách; doporučujeme destičku ABGene katalog. č. AB-1000 nebo AB-1400, http://www.abgene.com/


Pevná cyklační destička o 384 jamkách; doporučujeme destičku ABGene Diamond katalog. č. AB-1111, http://www.abgene.com/

• Vícekanálové pipety na objemy 10 µl a 100 µl • Doplňkový magnet Agencourt Direct Inject Magnet (eliminuje závěrečný

krok přenosu) Pro formát pro 96 jamek:

Agencourt 96-Well Direct Inject Plate, Beckman katalog. č. A29173 / Agencourt katalog. č. 000596


Agencourt 384 Direct Inject Plate, Beckman katalog. č. A29166 / Agencourt katalog. č. 000296

Reagencie:

• 85% etanol vyrobený z nedenaturovaného etanolu (American Bioanalytical katalog. č. AB-00138, http://www.americanbio.com/ )

o Spotřeba 25 ml 85% etanolu na jednu destičku o 96 jamkách o Etanol se v protokolu CleanSEQ používá ke srážení, proto je velmi důležité, aby byl

85% etanol čerstvě připravený. Aby nedocházelo ke ztrátám etanolu, připravte pouze takové množství, které bude spotřebováno během 1–3 dnů, a skladujte je v těsně uzavřené nádobě. (American Bioanalytical katalog. č. AB00138; http://www.americanbio.com/ )

• Eluční pufr: voda reagenční čistoty nebo 0,1mM EDTA (pH 8,0) o Optimální eluční pufr se liší v závislosti na chemickém složení barviva a reakčních

podmínkách. Podrobné informace viz jednotlivé protokoly. _________________________________ 1

Agencourt CleanSEQ lze používat se všemi verzemi terminátorů BigDye (1.1 a 3.1).



http://www.abgene.com/


http://www.americanbio.com/

http://www.americanbio.com/


Strana 4 z 12

Terminátor ABI BigDye pro 96 jamek: 1. Reagencii Agencourt CleanSEQ před použitím důkladně promíchejte, aby došlo

k úplnému resuspendování magnetických částic.

Reagencie by měla mít homogenní vzhled a konsistentní barvu.

2. Ke každému vzorku přidejte 10 µl reagencie Agencourt CleanSEQ.

Objem 10 µl reagencie Agencourt CleanSEQ se používá bez ohledu na objem sekvenační reakce.

3. Ke každému vzorku přidejte 85% etanol podle níže uvedené tabulky. Promíchejte pomocí pipety 7krát, nebo dokud není roztok homogenní.

Etanol se hromadí v horní části vzorku, zatímco reagencie Agencourt CleanSEQ klesá ke dnu. Promíchání vrstev je velmi důležité pro úplné navázání sekvenačních produktů na magnetické částice.

Agencourt CleanSEQ 96 pro terminátor BigDye Objem sekvenační reakce (µl) Objem 85% etanolu (µl)

5 31 10 42 15 52 20 62 25 73

Pro jiné objemy vzorků použijte níže uvedený výpočet, případně kalkulátor CleanSEQ na stránkách http://www.agencourt.com/technical/:Objem 85% etanolu = 2,077 x (10 µl + objem vzorku)

4. Destičku se vzorky umístěte na 3–5 minut nebo až do vyjasnění roztoku na magnetickou desku Agencourt SPRIPlate 96R.

Magnetické částice vytvoří na stěnách jamky prstenec nebo půlměsíc.

5. Z destičky odsajte čirý roztok (supernatant) a zlikvidujte jej.

Při provádění tohoto kroku musí být destička umístěna na magnetu. Aby nedošlo k rozvíření částic, při odsávání umístěte špičku pipety na dno jamky. Odstraňte co nejvíce supernatantu, který obsahuje nadbytečné fluorescenční barvivo a kontaminující látky.

6. Do každé jamky dávkujte 100 µl 85% etanolu. Než přistoupíte k dalšímu kroku, počkejte nejméně 30 sekund, aby se částice mohly znovu usadit.

Při provádění tohoto kroku by destička měla být umístěna na magnetu. Během tohoto kroku není částice nutné míchat ani resuspendovat.





Strana 5 z 12

7. Odsajte veškerý etanol a zlikvidujte jej.

Při provádění tohoto kroku musí být destička umístěna na magnetu. Při odsávání umístěte špičku pipety na dno jamky, aby nedošlo k rozvíření částic. Odstraňte co nejvíce etanolu, který obsahuje nadbytečné fluorescenční barvivo a kontaminující látky.

8. Kroky 6–7 zopakujte, takže provedete celkem dvě promytí 85% etanolem.

9. Vzorky ponechejte 10 minut schnout na vzduchu při laboratorní teplotě.

Destička se vzorky může být během sušení umístěna na magnetu i mimo něj. Poznámka: Přílišné vysušení může vést k degradaci fluorescenčního barviva.

10. Přidejte 40 µl elučního pufru (viz níže uvedená tabulka) a destičku inkubujte 5 minut při laboratorní teplotě, aby proběhla eluce. Jestliže používáte magnetickou desku Agencourt 96 Direct Inject2

(eliminuje závěrečný přenos z destičky), použijte k eluci 70–80 µl elučního pufru.

Eluce sekvenačního produktu je rychlá. Pro úplnou výtěžnost není nutné, aby částice přešly zpět do roztoku. Před vložením vzorků do kapilárního sekvenátoru neprovádějte jejich denaturaci. Doporučené eluční pufry jsou 0,1mM EDTA3

(pH 8,0) nebo voda reagenční čistoty. Voda se používá pro dosažení maximálního signálu, zatímco EDTA ke snížení signálu v případech, kdy je signál příliš silný. Vhodný eluční pufr se liší v závislosti na citlivosti detektoru v sekvenátoru, množství terminátoru BigDye použitého k sekvenační reakci a na typu templátu. Jako obecné vodítko pro volbu elučního pufru použijte následující tabulku.

ABI 3100 / 3130 ABI 3700 ABI 3730

> 2 µl BigDye s produkty PCR 0,1mM EDTA3 0,1mM EDTA3 0,1mM EDTA3

< 2 µl BigDye s produkty PCR 0,1mM EDTA3 DiH2O 0,1mM EDTA3

> 2 µl BigDye s plazmidy 0,1mM EDTA3 DiH2O 0,1mM EDTA3

< 2 µl BigDye s plazmidy DiH2O DiH2O DiH2O

Pro uživatele sekvenátoru ABI 3100 nebo jiné uživatele, kteří v současné době používají eluci ve formamidu: Viz poznámka k aplikaci v dokumentu „Agencourt CleanSEQ on the ABI 3100“; http://www.agencourt.com/technical.

11. Destičku se vzorky nechejte separovat na magnetu 3–5 minut nebo až do vyjasnění roztoku. Přeneste 35 µl čirého vzorku na novou destičku pro vložení do detektoru. Jestliže používáte magnetickou destičku Agencourt 96 Direct Inject, vzorek nepřenášejte.

V jamce ponechejte 5 až 10 µl kapaliny, aby nedošlo k přenesení částic na konečnou destičku. Zbytkové částice mohou vadit při vstřikování, způsobit opožděný start nebo chybná vstříknutí. Pokud k přenosu částic dojde, znovu přeneste vzorek oddělený od částic a proveďte nové vstříknutí.

______________________________ 2

Viz protokol pro přímé vstříknutí Direct Inject Protocol na adrese http://www.agencourt.com/technical/; Beckman katalog. č. A29173 / Agencourt katalog. č. 000596 3

Pokud používáte magnet Direct Inject, namísto 0,1mM EDTA použijte 0,05mM EDTA.




http://www.agencourt.com/technical/%3B


Strana 6 z 12

Vzorky utěsněte a uskladněte je při teplotě 4 °C. Vzorky lze před vložením do detektoru skladovat až 24 hodin. Pokud vzorky nebudou vloženy do detektoru do 24 hodin, uložte je při teplotě -20 °C. Při -20 °C lze vzorky uchovávat nejméně 1 měsíc.

Terminátor ABI BigDye pro 384 jamek: 1. Reagencii Agencourt CleanSEQ před použitím důkladně promíchejte, aby došlo



2. Ke každému vzorku přidejte 5 µl reagencie Agencourt CleanSEQ.

Objem 5 µl reagencie Agencourt CleanSEQ se používá bez ohledu na objem sekvenační reakce.

3. Ke každému vzorku přidejte 85% etanol podle níže uvedené tabulky. Každou jamku promíchejte pomocí pipety 7krát, nebo dokud není roztok homogenní.

Etanol se hromadí v horní části vzorku, zatímco reagencie CleanSEQ klesá ke dnu. Promíchání vrstev je velmi důležité pro úplné navázání sekvenačních produktů na magnetické částice.

Agencourt CleanSEQ 384 pro terminátor ABI BigDye Objem sekvenační reakce (µl) Objem 85% etanolu (µl)

5 14,3 10 21,4 15 28,6

Pro jiné objemy vzorků použijte níže uvedený výpočet, případně kalkulátor CleanSEQ na stránkách http://www.agencourt.com/technical/:Objem 85% etanolu = 1,428 x (5 µl + objem vzorku)

4. Destičku se vzorky umístěte na na 2–3 minuty nebo až do vyjasnění roztoku na magnetickou desku Agencourt SPRIPlate 384.

Magnetické částice se stáhnou k bočním stěnám jamky.


Při provádění tohoto kroku musí být destička umístěna na magnetu. Aby nedošlo k rozvíření částic, při odsávání vždy umístěte špičku pipety na dno jamky. Odstraňte co nejvíce supernatantu, který obsahuje nadbytečné fluorescenční barvivo a kontaminující látky.

6. Do každé jamky dávkujte 30 µl 85% etanolu a poté obsah jamky promíchejte 7krát pipetou, aby se částice promyly. Než přistoupíte k dalšímu kroku, počkejte nejméně 30 sekund, aby se částice mohly znovu usadit. Při provádění tohoto kroku by destička měla být umístěna na magnetu.





Strana 7 z 12

7. Odsajte veškerý etanol a zlikvidujte jej.

Při provádění tohoto kroku musí být destička umístěna na magnetu. Při odsávání umístěte špičku pipety na dno jamky, aby nedošlo k rozvíření částic. Odstraňte co nejvíce etanolu, který obsahuje nadbytečné fluorescenční barvivo a kontaminující látky.

8. Kroky 6–7 zopakujte, takže provedete celkem dvě promytí 85% etanolem.

9. Vzorky ponechejte 10 minut schnout na vzduchu při laboratorní teplotě.

Destička se vzorky může být během sušení umístěna na magnetu i mimo něj. Poznámka: Přílišné vysušení může vést k degradaci fluorescenčního barviva.

10. Přidejte 15–30 µl elučního pufru (viz níže uvedená tabulka) a destičku inkubujte 5 minut při laboratorní teplotě, aby proběhla eluce.

Eluce sekvenačního produktu je rychlá. Pro úplnou výtěžnost není nutné, aby částice přešly zpět do roztoku. Před vložením vzorků do kapilárního sekvenátoru neprovádějte jejich denaturaci. Doporučené eluční pufry jsou 0,1mM EDTA (pH 8,0) nebo voda reagenční čistoty. Voda se používá pro dosažení maximálního signálu, zatímco EDTA ke snížení signálu v případech, kdy je signál příliš silný. Vhodný eluční pufr se liší v závislosti na citlivosti detektoru v sekvenátoru, množství terminátoru BigDye použitého k sekvenační reakci a na typu templátu. Jako obecné vodítko pro volbu elučního pufru použijte následující tabulku.

ABI 3100 / 3130 ABI 3700 ABI 3730

> 2 µl BigDye s produkty PCR 0,1mM EDTA 0,1mM EDTA 0,1mM EDTA

< 2 µl BigDye s produkty PCR 0,1mM EDTA DiH2O 0,1mM EDTA

> 2 µl BigDye s plazmidy 0,1mM EDTA DiH2O 0,1mM EDTA

< 2 µl BigDye s plazmidy DiH2O DiH2O DiH2O

11. Destičku se vzorky nechejte separovat na magnetu 3–5 minut nebo až do vyjasnění

roztoku. Čirý vzorek přeneste na novou destičku pro vložení do detektoru: Jestliže používáte magnetickou desku Agencourt 384 Direct Inject4, vzorek nepřenášejte.

V jamce ponechejte 2 až 5 µl kapaliny, aby nedošlo k přenesení částic na konečnou destičku. Zbytkové částice mohou vadit při vstřikování, způsobit opožděný start nebo chybná vstříknutí. Pokud k přenosu částic dojde, znovu přeneste vzorek oddělený od částic a proveďte nové vstříknutí.

Vzorky těsně uzavřete a uskladněte je při teplotě 4 °C. Vzorky lze před vložením do detektoru skladovat až 24 hodin. Pokud vzorky nebudou vloženy do detektoru do 24 hodin, uložte je při teplotě -20 °C. Při -20 °C lze vzorky uchovávat nejméně 1 měsíc. ________________________ 4 Destička Agencourt 384 Direct Inject Plate eliminuje krok závěrečného přenosu pro sekvenátor ABI 3100/3130 a 3730. Beckman katalog. č. A29166 / Agencourt katalog. č. 000296; http://www.agencourt.com/



http://www.agencourt.com/


Strana 8 z 12

Beckman Coulter CEQ DTCS Materiály dodané uživatelem: Spotřební materiál a hardware:

• Magnetická deska Agencourt SPRIPlate 96R Ring Magnet Plate; Beckman katalog. č. A29164 / Agencourt katalog. č. 000219

• Utěsnění destiček: pomocí adheziva nebo tepelné, MUSÍ odolat izopropanolu (například: ABgene katalog. č. AB0558; http://www.abgene.com/ )

• Vícekanálové pipety na objemy 20 µl a 200 µl • Destička na vzorky Beckman Coulter CEQ; Beckman katalog. č. 609801

http://www.beckmancoulter.com/ Reagencie:

• 73% izopropanol připravený ze 100% izopropanolu: Sigma katalog. č. I9516-500ML - Izopropanol se v protokolu CleanSEQ používá ke srážení, proto je velmi důležité,

aby byl 73% izopropanol čerstvě připravený. Aby nedocházelo ke ztrátám izopropanolu, připravte pouze takové množství, které bude spotřebováno během 1–3 dnů, a skladujte je v těsně uzavřené nádobě.

• Roztok pro vložení vzorku (SLS – Sample Loading Solution): Dodává se v soupravě Beckman Coulter Dye Terminator Cycle Sequencing Quick Start Kit; Beckman katalog. č. 608120, http://www.beckmancoulter.com/

• Složky roztoku Beckman pro zastavení reakce: - 3M octan sodný, pH 5,2 – Sigma katalog. č. S7899 - 100mM Na2EDTA, pH 8,0, roztok připravený z 0,5 M Na2EDTA – Sigma

katalog. č. E7889 - Glykogen: Dodává se v soupravě Beckman Dye Terminator Cycle Sequencing

Quick Start Kit, katalog. č. 608120, http://www.beckmancoulter.com/ Beckman Coulter CEQ DTCS, formát pro 96 jamek: Tento protokol CleanSEQ je optimalizován pro použití se sekvenačními reakcemi 1X DTCS. Pro dosažení nejlepších výsledků postupujte podle pokynů pro nastavení reakce uvedených u soupravy DTCS Quickstart, katalog. č. 608120:

• Předběžnou tepelnou úpravu templátů, nastavení reakcí 1X 5 a tepelného cyklu proveďte podle doporučení společnosti Beckman.

_________________________ 5

Tyto a další reakce ředění barviva viz Biotechniques 32:24–28 (leden 2002).




http://www.beckmancoulter.com/




Strana 9 z 12

1. Na každý 1 µl objemu sekvenační reakce přidejte 0,55 µl ředicího roztoku pro zastavení reakce (složení je uvedeno níže). Například: Na 10 µl objemu sekvenační reakce přidejte 5,5 µl ředicího roztoku pro zastavení reakce.

Varování: Pokud není roztok pro zastavení reakce přidán, pozdější eluce vzorků v protokolu bude obtížná.

Objem ředicího roztoku pro zastavení reakce, který je třeba připravit, vypočítejte podle následující rovnice:

(0,55 x reakční objem x počet reakcí) + 50 µl mrtvého objemu

Složky ředicího roztoku pro zastavení reakce

Na 1 µl ředicího roztoku pro

zastavení reakce

100 µl ředicího roztoku pro zastavení reakce

(8 x 10 µl reakčního objemu)

600 µl ředicího roztoku pro zastavení reakce

(96 x 10 µl reakčního objemu)

H2O 0,5 µl 50 µl 300 µl 3M octan sodný, pH 5,2 0,2 µl 20 µl 120 µl 100 mM Na2EDTA, pH 8,0 0,2 µl 20 µl 120 µl glykogen 20 mg/ml (v soupravě DTCS) 0,1 µl 10 µl 60 µl

2. Reagencii Agencourt CleanSEQ před použitím důkladně promíchejte, aby došlo



3. Do každé jamky v reakční destičce přidejte 1 µl reagencie Agencourt CleanSEQ na každý 1 µl objemu sekvenační reakce (bez ohledu na objem roztoku pro zastavení reakce přidaného v kroku č. 1).

Například: Na 10 µl objemu sekvenační reakce přidejte 10 µl reagencie Agencourt CleanSEQ® (bez ohledu na 5,5 µl roztoku pro zastavení reakce přidaného v kroku č. 1).

4. Ke každému vzorku přidejte 73% izopropanol podle níže uvedené tabulky. Promíchejte 10krát pipetou nebo destičku dobře utěsněte a míchejte 30 sekund na vortexu, aby se všechny reagencie důkladně promíchaly. Poznámka k míchání pomocí vortexu: Některé adhezivní uzávěry destiček nejsou odolné vůči izopropanolu!

Izopropanol se hromadí v horní části vzorku, zatímco reagencie Agencourt CleanSEQ klesá ke dnu. Promíchání vrstev je velmi důležité pro úplné navázání sekvenačních produktů na magnetické částice.

Agencourt CleanSEQ® 96 pro Beckman Coulter CEQ DTCS Objem sekvenační reakce (µl) Objem 73% izopropanolu (µl)

10 55 20 110

Pro jiné objemy vzorků použijte níže uvedený výpočet:

Objem 73% izopropanolu = 5,5 x (objem vzorku)




Strana 10 z 12

5. Vzorky inkubujte minimálně 10 minut mimo magnet, aby se mohly reakční produkty navázat.

Delší doba inkubace povede k mírnému zvýšení signálu všech bazí. Kratší doba inkubace může signál snížit.

6. Destičku se vzorky umístěte na 3–5 minut nebo až do vyjasnění roztoku na magnetickou desku Agencourt SPRIPlate 96R.

Magnetické částice vytvoří na stěnách jamky prstenec nebo půlměsíc.


Při provádění tohoto kroku musí být destička umístěna na magnetu. Při odsávání umístěte špičku pipety na dno jamky, aby nedošlo k rozvíření částic. Odstraňte co nejvíce supernatantu, který obsahuje nadbytečné barvivo a kontaminující látky.

8. Ke každému vzorku dávkujte 200 µl 73% izopropanolu. Inkubujte 3 minuty při laboratorní teplotě a teprve poté pokračujte dalším krokem.

Při provádění tohoto kroku by destička měla být umístěna na magnetu. Během tohoto kroku není částice nutné míchat ani resuspendovat.

9. Odsajte veškerý izopropanol a zlikvidujte jej.

Při provádění tohoto kroku musí být destička umístěna na magnetu. Při odsávání umístěte špičku pipety na dno jamky, aby nedošlo k rozvíření částic. Odstraňte co nejvíce izopropanolu, který obsahuje nadbytečné barvivo a kontaminující látky.

10. Kroky 8–9 zopakujte, takže provedete celkem dvě promytí izopropanolem.

11. Vzorky ponechejte 10–20 minut schnout na vzduchu při laboratorní teplotě. Vzorky nesmí příliš vyschnout!

Destička se vzorky může být během sušení umístěna na magnetu i mimo něj. Poznámka: Pokud necháte vzorky sušit déle než 30 minut, může to vést ke snížení signálu v důsledku méně účinné eluce.

12. Umístěte destičku mimo magnet a do každé jamky přidejte 40 µl roztoku Beckman SLS pro vložení vzorku (formamidu). Promíchejte 10–12krát pipetou nebo destičku utěsněte a krátce promíchejte na vortexu, dokud nejsou částice homogenně resuspendovány v roztoku SLS.

Částice musejí přejít zpět do roztoku. V míchání pokračujte, dokud nejsou částice důkladně resuspendované. Pokud nebyl použit roztok na zastavení reakce, resuspendace částic bude velmi obtížná.

Poznámka: Výtěžnost závisí na kvalitě roztoku SLS. Pokud byl roztok SLS vícekrát zmrazen a rozmrazen, může to vést k pouze částečné eluci a snížené intenzitě signálu a/nebo nižší kvalitě sekvenovaných vzorků.

13. Destičku se vzorky nechejte separovat na magnetu 3–5 minut nebo až do vyjasnění roztoku. Přeneste 35 µl čirého vzorku na novou destičku pro vložení do sekvenátoru CEQ.




Strana 11 z 12

V jamce ponechejte 5 až 10 µl kapaliny, aby nedošlo k přenesení částic na konečnou destičku. Přenos částic do určité míry nevadí, je však třeba se snažit o jeho minimalizaci. Pokud dojde k významnému přenosu, dávkujte vzorek zpět do jamky, nechejte částice 1–3 minuty se znovu usadit a zkuste provést krok přenosu znovu.

14. Krátce odstřeďte pro odstranění vzduchových bublin. Objem 35 µl převrstvěte jednou kapkou minerálního oleje obsaženého v soupravě Beckman Coulter katalog. č. 608120 a proveďte reakce v sekvenátoru CEQ obvyklým způsobem.




Strana 12 z 12

Průvodce odstraňováním závad (pouze pro terminátor ABI BigDye)

Příznak Příčina Řešení Vizuálně zkontrolujte destičku a ujistěte se, že došlo k úplnému odstranění supernatantu a etanolu použitého k promytí; v případě potřeby proveďte odsátí podruhé.

Nedostatečné odstranění supernatantu

Při sekvenační reakci použijte menší množství barviva BigDye; v případě potřeby se obraťte na adresu

Příliš mnoho barviva BigDye [email protected]


.

Eluce do formamidu Proveďte eluci do vody nebo EDTA; viz protokol a poznámka k aplikaci: CleanSEQ®

na sekvenátoru ABI 3100 na adrese http://www.agencourt.com/technical/

Skvrny barviva (píky barviva obvykle na úrovni 70 a 100 bazí)

Přidejte správné množství etanolu odpovídající objemu sekvenační reakce a zajistěte, aby byl etanol správně připraven.

Příliš vysoká koncentrace etanolu

Zajistěte provedení dostatečného promíchání; vizuálně zkontrolujte jamky a ujistěte se, že reakční směs se jeví jako homogenní.

Nedostatečné promíchání

Zajistěte, aby během odstranění supernatantu nedošlo k odsátí žádných částic; pokud k tomu dojde, dávkujte supernatant zpět a po usazení částic se znovu pokuste o odsátí menšího objemu.

Ztráta částic Nízký signál (intenzita signálu je podobná intenzitě šumu pozadí)

Zajistěte, aby v zásobní láhvi byl čerstvý etanol; zajistěte dávkování správného objemu vzhledem k objemu sekvenační reakce; etanol a vodu před smísením odměřujte v samostatných nádobách.

Nízká koncentrace etanolu

Při sekvenační reakci použijte menší množství barviva BigDye; v případě potřeby se obraťte na adresu [email protected]

Přetížení .

Příliš mnoho barviva

BigDye (Intenzita signálu je mimořádně vysoká, v elektroferogramu se to může projevit jako ploché píky)

Na vložení přeneste pouze část eluentu. Pokud je signál vysoký pouze na začátku elektroferogramu a poté rychle klesá, proveďte eluci do EDTA (viz protokol)

LICENCE OPRAVŇUJÍCÍ K OMEZENÉMU POUŽITÍ

Tento výrobek je kryt nejméně jedním nebo více patentovými nároky patentů USA č. 5,898,071, 5,705,628 a/nebo 6,534,262, na které má výsadní licenci společnost Agencourt Bioscience Corporation. Tento výrobek je prodáván výhradně pro účely použití kupujícím a kupující není oprávněn

převést tento výrobek [ani žádné materiály vyrobené za použití tohoto výrobku] na žádnou třetí stranu.

© 2006 Agencourt Bioscience Corp. Všechna práva vyhrazena.

* Všechny ochranné známky jsou majetkem svých příslušných vlastníků.

Agencourt Bioscience Corporation, A Beckman Coulter Company • 800-361-7780 • 978-867-2600

500 Cummings Center, Suite 2450 • Beverly, Massachusetts 01915 • www.agencourt.com

mailto:[email protected]


mailto:[email protected]

Date post:	26-Sep-2020
Category:	Documents
Upload:	others
View:	1 times
Download:	0 times

AGENCOURT CLEANSEQ · 2014. 7. 24. · Agencourt® CleanSEQ® Protokol 000600v32 Strana 4 z 12...

Documents