PeptidePeptide

Alanin Glycin

Peptidbindung

(Adapted from the handouts of Prof. AG Beck-Sickinger, Leipzig)

Peptidbindung

NHH

H O

Bindungslänge in Å

C=O C-N

Kristallverband

Gasphase

1,241

1,219

1,318

1,352

Dieder Winkel Φ und Ψ

H-Ala-Leu-Gly-Lys-His-OH

H-Ala-Leu-Gly-Lys-His-OH

H-Ala-Leu-Gly-Lys(Ac)-His-OH

Acetyl, CH3CO-

Acetylierung der Lys-Seitenkette

+

H-Ala-Leu-Gly-Lys-His-OH

Ac-Ala-Leu-Gly-Lys-His-OH

Acetyl,CH3CO-

Acetylierung von N-Terminus

H-Ala-Leu-Gly-Lys-His-OH

H-Ala-Leu-Gly-Lys-His-NH2

CONH2Säureamid

Verzweigte Peptide

O

S

Cyclopeptide und verzweigte Peptide

H-Ala-Lys(tert.butyl-oxy-carbonyl)-Asp(tert.butyl)-Tyr(tert.butyl)-Leu-OH

N

H

CC

R5

H

HO

O_

N

H

R4

CC

H

NC

R3

CN

H

R2

CC

H

NC

R1

COO_

H

H

H

H

O

O

O

H

C-Terminus

N-Terminus

Peptidbindung

α-Aminosäure Peptid

Kondensation zurKettenverlängerung

Schema der Peptidsynthese

H

+

H

+

N

H

CC

R2

H

HO

OH N

H

R1

CC

HO

H OH

N

H

CC

R2

H

HO

O_

N

H

R1

CC

HO

H O

H

+

Aktivierung

N

H

CC

R2

HO

N

H

R1

CC

HO

OHN

H

CC

R2

H

HO

N

H

R1

CC

HO

Aktivierungund Schutzgruppen

N

H

CC

R2

H

HO

N

H

R1

CC

HO

OH

_

H

+

Peptidsynthese

Chemische AktivierungChemische Aktivierung Enzymatische AktivierungEnzymatische Aktivierung

(keine Schutzgruppen)(Schutzgruppen)

H3

H3

H3

C

C

C

O C

OOH2 C

O

H

C

Nα -Schutzgruppen

Fmoc Bocbasenlabil

säurelabil

COOH-Schutzgruppen

Ester

Methyl-Estertert. Butyl-EsterBenzyl-EsterAllyl-Ester

alkalischsauerhydrogenolytischPd(0)

NH2

NH2

H COOHNH2

CH2

SH

H COOH NH2

CH2

OH

H COOH

COOHH

COOH

NH2NH2

CONH2

H COOH

Trifunktionelle Aminosäuren

LysCys

Tyr

GlnGlu

Seitenketten-Schutzgruppen in der Fmoc-Strategie (säurelabil, basenstabil)

R = Peptid

H3

H3

C

3HC

C O

SOR 2

C RH3

H3

H3

C

C

C

RH3

H3

C

H3C

C

O C

O

R

tert. butyloxycarbonylBoc

Lys, Orn, Trp

tert. butyltBu

Tyr, Thr, SerGlu, Asp

tritylTrt

His, Cys, Asn, Gln

pentamethylchromansulfonylPmc

Arg

ohne Schutzgruppe: Ala, Phe, Gly, Ile, Leu, Met, Pro, Val

3HC

3HC

O2 C

O

N

H

H

H

C C

O

OHCH

Fmoc-Ala-OH

Aktivierung, Kupplung

O2

C

O

N

H

H

H

C C

O

CHR

N

H

H C

O

OCH2 CH2

CH3

H-Gly-Bzl

C

O

OCH2 CH2N

H

Fmoc-Ala-Gly-Bzl

Reagenzien zur Aktivierung

+

BF4_

NN

N

O

CH3

CH3

H3C

CH3

C

N

N NN

N

OH

DIC TBTU HOBt

R CO

OH

+

+

+

+ C

N

N

R C

O

O CN

N

H

NN

N

OH

_

1-Hydroxybenzotriazol

R C

O

NH R`R

O

C O NN

NH2N R`

NN

N

OH

NH C NH

O

DIC O-Acylisoharnstoff

Aktivester

Mechanismus der Aktivierung

Peptidbindung

C

N

N

CH3

H3C

H3C

CH3

N

P

N

N

H3C CH3CH3

CH3CH3H3C

N

P N

N

C

N

N

CH3

H3C

H3C

CH3

N

N

N

X

OR

BF4

PF6

HBTU (X=CH)HATU (X=N)

PF6

PyBOP (X=CH)

PF6

BOP (X=CH)

TBTU (X=CH)

mit R =

Uronium-Aktivierungsreagenzien

O2 C

O

N

H

H

H

C C

O

OHCH

Fmoc-Ala-OH

Aktivierung, Kupplung

O2

C

O

N

H

H

H

C C

O

CHR

N

H

H C

O

OCH2 CH2

CH3

H-Gly-Bzl

C

O

OCH2 CH2N

H

Fmoc-Ala-Gly-Bzl

COOH-Schutzgruppen

Ester

Methyl-Estertert. Butyl-EsterBenzyl-EsterAllyl-Ester

Merrifield (Nobelpreis 1978): Polymer

1963: Festphasenpeptidsynthese

(OCH

H2C

CH2CH2)nO CH2 CH2 X

Poly(ethylen-glykol)-Spacer

Polystyrol-Matrix

FunktionelleGruppe

Festphasensynthese vonPeptide, Proteine und Peptidmimetika

Polymerträger

Peptidketten gebunden amPolymerträger

Synthese

Linker

LinkerLinker

Kupplungs-reagenzien

H

G

PD

E

L

Linker

LinkerLinker

FestphasensyntheseAnkergruppe: Chlorid, Alkohol

Linker

LinkerLinker

Linker

LinkerLinker

Cl

Cl NH(Pg)CH(R)COOH

BaseCl

Cl

OC(O)CH(R)NH(Pg) H[NHCH(R)CO]nOH• Synthese

2. Abspaltung mit1 % TFA

OH

O NH(Pg)CH(R)COOH

Aktivierungsreagens, BaseH[NHCH(R)CO]nOH

• Synthese

2. Abspaltung mit> 80 % TFA

OH

O

4-BenzyloxybenzylAlkohol

2-ChlortritylChlorid

NH

O

O

OMeOH

NH(Pg)CH(R)COOH

Aktivierungsreagens, BaseH[NHCH(R)CO]nOH

• Synthese

2. Abspaltung mit1-5 % TFA

NH

O

O

OMeOH

4-Hydroxymethyl-3-Methoxyphenoxybutter-säure Benzhydrylamin

OC(O)CH(R)NH(Pg)

OC(O)CH(R)NH(Pg)

FestphasensyntheseAnkergruppe: Amin

Linker

LinkerLinker

Linker

LinkerLinker

H[NHCH(R)CO]nNH2

• Synthese

2. Abspaltung mit1 % TFA

Amino-xanthen-3-yloxy

NH(Pg)CH(R)COOH

Aktivierungsreagens, Base

• Synthese

2. Abspaltung mit> 5 % TFA

4-(2´,4´-Dimethoxyphenyl-aminomethyl-phenoxy

NH2

OO

NH(Pg)CH(R)COOH

Aktivierungsreagens, Base

NH2

OO

COCH(R)NH(Pg)

H[NHCH(R)CO]nNH2

NH2

O

OMe

OMe

NH

O

OMe

OMe

COCH(R)NH(Pg)

FestphasensyntheseAnkergruppe: Aldehyd

Linker

LinkerLinker

Linker

LinkerLinker

4-Formyl-3-methoxyphenoxy

O

OMe

H

O

O

OMe

HN

R

RNH2/TMOF

DCM/NaBH(OAc)3

O

OMe

RN

R´

O

O

OMe

RN

S

O O

R´

R´COO

H/HOA

t/DIC

R´SO2Cl/TEA

25 % TFA 5 % TFA

R´ NHR

O

S

O O

R´ NHR

FestphasensyntheseAnkergruppe: Sulfamyl

Linker

LinkerLinker

Linker

LinkerLinker

4-Sulfamyl-butyryl

HN RCOOH/DIC/MeIm

ICH2CN/DIPEA

R´NH2

R NHR´

O

O

(CH2)3

S

O O

NH2HN

O

(CH2)3

S

O O

HN

O

R

HN

O

(CH2)3

S

O O

N

O

R

CN

R OR´

O

R OH

O R SR´

OR´OHOH -

R´SH

O2 C

O

N

H

H

H

C C

O

OH ACHR HO-

Fmoc-AminosäurePolymer mit Anker

Aktivierung, Beladung des Polymers

Polymer

O2 C

O

N

H

H

H

C C

O

OCHR A Polymer

PiperidinAbspaltung der Nα -Schutzgruppe

O2

C

O

N

H

H

H

C C

O

OCHR A Polymer

H N

H

C

O

OCHR A Polymer

CH2 + CO

ONHR

_

_

+

+H2N

HN

H2N++

H

C NH2

CO2

+

Dibenzofulven Carbaminsäure- Anion

Carbanion

_

OH2 C

O

NHR

H

C_

OH2 C

O

NHRC

NH2R

R = Peptid

Mechanismus der Fmoc-Abspaltung

O2

C

O

N

H

H

H

C C

O

OHCHR

Fmoc-Aminosäure

H N

H

C

O

OCHR A Polymer

Aktivierung, Kupplung

O2 C

O

N

H

H

H

C C

O

CHR N

H

C

O

OCHR A Polymer

Fmoc-geschütztes, Dipeptid am Polymer

Synthese Cyclus

Peptid

AbspaltungKupplung

Deblockieren

Aktivierung

Aminosäure

Polymer

BocBut-

Trifluoressigsäure

Trifluoressigsäure

Schema der Fmoc-Strategie

C

O

O

Piperidin

O2 C

O

N

H

H

H

C A PolymerPeptid

Trifluoressigsäure

Schema der Boc-Strategie

C

O

OO C

O

N

H

A PolymerPeptid

HF, TFMSA

HF

ZCH3

CH3

H3C

Ada

Automatisierung der SPPS (Festphasen-Peptidsynthese)

polymerer Träger: - filtrieren, statt kristallisieren- auswaschen der Reagenzien- hoher Ueberschuss an Reagenzien

Probleme: Fehlsequenzen, ähnliche Peptide gute Analytik nötig (HPLC)

Syntheseprotokoll

1. Quellen den Harzes:2. Waschen mit DMF:3. Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe: 30 % Piperidin in DMF 4. Waschen mit DMF5. Kupplung der Aminosäure 10-facher Ueberschuss Aminosäure TBTU/HOBt/Diisopropylethylamin6. Waschen mit DMF7. Waschen mit Ether8. Trocknen mit Stickstoff

10 min2 x 5 min

2 x 10 min

8 x 5 min2 x 30 min

6 x 5 min2 x 5 min

20 min

Multiple Peptidsynthese gleichzeitige, parallele Synthese von vielen Peptiden

Bedingung: Festphasensynthese

Vorteile: rasch viele, unterschiedliche Peptide kleiner Ansatz, günstig

Fmoc-Abspaltung, Waschschritte gemeinsam, Kupplung selektiv

Nachteile: keine Synthesekontrolle möglich Aufarbeitung und Analytik aufwendig

Synthesizer für Parallel-Peptidsynthese