BiodiverzitaBiodiverzita kultivovatelnýchkultivovatelných prokaryotprokaryotv Hranické propastiv Hranické propasti

Bc. Marcel Kosina

RNDr. Ivo Sedláček, CSc.

Mgr. Dana Nováková, Ph.D.

Česká sbírka mikroorganismůMasarykova univerzita, Přírodovědecká fakulta

Cíle:Cíle:

�� IzolaceIzolace

�� UchováníUchování

�� CharakterizaceCharakterizace

�� IdentifikaceIdentifikace

�� Průkaz biotické složky Průkaz biotické složky specifických specifických speleotémspeleotém

TESTY:

FENOTYPOVÉ

MOLEKULÁRNĚ-BIOLOGICKÉ

CHEMOTAXONOMICKÉ

Hranická propast(součást NPR Hůrka u Hranic)

� Nejhlubší v ČR (274,1 m)� Hranický kras

- devonské vápence- řeka Bečva

„suchá část“

„mokrá část“

TEPLOTA VODY

16°C

13,5°C – 24 °C

pH

6,3

Speleotémy = sekundární výplně jeskyň - povlaky

SpeleotémySpeleotémy -- povlakypovlaky

U Gejzíráků

Odběr vzorkůOdběr vzorků

�� 4 odběry: XII/2005; III,VI, IX/20064 odběry: XII/2005; III,VI, IX/2006

�� Vzorky: Vzorky:

vodavoda

povlakypovlaky

guánoguáno

U Gejzíráků

IzolaceIzolace

�� TSATSA

�� NWRINWRI--agar (= pro agar (= pro oligotrofyoligotrofy))

�� 15°C15°C

Charakterizace / identifikaceCharakterizace / identifikace

�� Biochemické a fyziologické testy: Biochemické a fyziologické testy: �� všechny všechny izolátyizoláty

�� Analýza celkových buněčných proteinů SDSAnalýza celkových buněčných proteinů SDS--PAGE PAGE (SDS=(SDS=dodecyldodecyl sulfát sodný; PAGE=sulfát sodný; PAGE=polyakrylamidovápolyakrylamidová gelovágelová elektroforéza):elektroforéza):

�� GG-- tyčkytyčky

�� RibotypizaceRibotypizace::�� GG-- nefermentující tyčky (rod nefermentující tyčky (rod PseudomonasPseudomonas))

�� MALDIMALDI--TOF MS:TOF MS:�� GG-- nefermentující tyčky (rod nefermentující tyčky (rod PseudomonasPseudomonas))

OPTIMALIZACE METODYOPTIMALIZACE METODY

VýsledkyVýsledky

�� Izolováno a uchováno 80 kmenůIzolováno a uchováno 80 kmenů(61(61--voda, 18voda, 18--povlaky, 1povlaky, 1--guáno)guáno)

�� 29,5 % 29,5 % psychrofilníchpsychrofilních kmenů z vody kmenů z vody �� 28 % 28 % psychrofilníchpsychrofilních kmenů z povlakůkmenů z povlaků

�� Jezírko: 27 % Jezírko: 27 % psychrofilníchpsychrofilních�� U U GejzírákůGejzíráků: 32 % : 32 % psychrofilníchpsychrofilních

Zařazení kmen ů do skupinZařazení kmen ů do skupin(mikroskopie, fermentace cukr ů)(mikroskopie, fermentace cukr ů)

18Gram-pozitivní koky až rozpadající se tyčky

6Gram-pozitivní sporulujícítyčky

29Gram-pozitivní nesporulujícítyčky

3Gram-negativní fermentující tyčky

24Gram-negativní nefermentující tyčky

POČET KMENŮSKUPINA

Celkové zastoupení skupin (%)Celkové zastoupení skupin (%)

30%4%

35%

8%

23% G-nefermentující tyčky

G-fermentující tyčky

G+nesporulující tyčky

G+sporulující tyčky

G+koky-rozpadající setyčky

!!! G+ bakterie převažovaly nad G- negativními !!!

Identifikace Identifikace

Celkem identifikováno 19 kmenů

Aneurinibacillus sp. (2 kmeny)

Bacillus sp. (2 kmeny)

Rotunda sucháBacillus fusiformis (1 kmen)

U GejzírákůPseudomonas fluorescens (2 kmeny)

Sporosarcina psychrophila (1 kmen)

Pseudomonas putida (1 kmen)

Pseudomonas stutzeri (1 kmen)

Pseudomonas alcaligenes (1 kmen)

Pseudomonas fluorescens (6 kmenů)Jezírko

Aeromonas hydrophila (2 kmeny)

PŮVODIDENTIFIKACE

Průkaz biotické složky povlak ůPrůkaz biotické složky povlak ů

�� Kultivace: 18 kmenůKultivace: 18 kmenů�� BacillusBacillus spsp. (2 kmeny). (2 kmeny)�� PseudomonasPseudomonas fluorescensfluorescens (1 kmen)(1 kmen)�� PseudomonasPseudomonas stutzeristutzeri (1 kmen)(1 kmen)

�� Mikroskopie bujónové kulturyMikroskopie bujónové kultury(přímá (přímá inokulaceinokulace homogenizovanými povlaky)homogenizovanými povlaky)

�� GramovoGramovo barveníbarvení

Výsledky mikroskopie 2Výsledky mikroskopie 2 --denní bujónové denní bujónové kultury povlak ůkultury povlak ů

ZÁVĚRZÁVĚR

�� Rovnoměrný výskyt Rovnoměrný výskyt psychrofilníchpsychrofilních kmenů kmenů ––původ, původ, místo odběrumísto odběru

�� !!! G+ převažovaly nad G!!! G+ převažovaly nad G-- !!!!!!

�� Identifikováno 19 Identifikováno 19 kmenůkmenů, , z nich 11 rod z nich 11 rod PseudomonasPseudomonas , , 2 kmeny2 kmenyAeromonasAeromonas hydrophilahydrophila, , 6 kmenů G+ 6 kmenů G+ sporulujícísporulující tyčky: tyčky: BacillusBacillus spsp., ., AneurinibacilusAneurinibacilus spsp., ., SporosarcinaSporosarcina psychrophilapsychrophila, , BacillusBacillus fusiformisfusiformis..

�� Biotická složka prokázánaBiotická složka prokázána

Poděkování:Poděkování:

Fraňo Travěnec „Sabbath“Bc. Andrea Teshim

Mgr. Ondřej Šedo, Ph.D. Mgr. Milan Geršl

Podpořeno: MSM0021622416

Děkuji za pozornost…Děkuji za pozornost…