biomarkerů v kondenzátu vydechovaného vzduchu Nová cesta ...

STŘEDOŠKOLSKAacute ODBORNAacute ČINNOST 2008 2009

Obor O3 ndash Chemie

Detekce biomarkerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu

ndash Novaacute cesta diagnostiky plicniacutech

onemocněniacute

Erika Gedeonovaacute Septima B

Sportovniacute gymnaacutezium Kladno Plzeňskaacute 3103 Kladno

Středočeskyacute kraj

Miacutesto vypracovaacuteniacute VŠCHT Praha UacuteOT Vedouciacute praacutece Ing Kamila Syslovaacute

Doc Ing Petr Kačer PhD

2

Prohlašuji že jsem předloženou praacuteci vypracovala samostatně pod vedeniacutem Doc Ing Petra

Kačera PhD a Ing Kamily Sysloveacute a uvedla jsem veškerou použitou literaturu v seznamu

literatury

helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

Poděkovaacuteniacute Zde bych raacuteda poděkovala všem kteřiacute mi s vypracovaacuteniacutem praacutece jakyacutemkoli způsobem pomohli

Můj diacutek patřiacute na prvniacutem miacutestě Ing Kamile Sysloveacute a Doc Ing Petru Kačerovi PhD za vedeniacute

praacutece a všestrannou pomoc při jejiacutem zpracovaacuteniacute

Daacutele bych chtěla poděkovat prof Ing Liboru Červeneacutemu DrSc za možnost pracovat v jeho

kolektivu

Nemohu opominout RNDr Marii Pokornou organizaacutetorku školniacuteho kola kteraacute mi pomohla

s administrativniacutemi zaacuteležitostmi a RNDr Hanu Vokounovou mou učitelku chemie

3

Anotace Analyacuteza kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduch (KVV) spočiacutevaacute v kvantifikaci přiacutetomnyacutech specifickyacutech

laacutetek tzv bdquobiomarkerůldquo jejichž koncentračniacute hladina je v důsledku probiacutehajiacuteciacutech patologickyacutech dějů

v dyacutechaciacutech cestaacutech a pliciacutech vyacuteznamně zvyacutešena (oproti fyziologickeacutemu stavu) což je signaacutelem pro

zahaacutejeniacute terapie

Předklaacutedanaacute praacutece se zabyacutevaacute vyacutevojem multimarkeroveacuteho screeningu KVV pro identifikaci a

kvantifikaci řady vyacuteznamnyacutech biomarkerů oxidativniacuteho stresu ‐ 8‐isoprostan prostaglandin E2

prostaglandin D2 malondialdehyd a 4 ‐ hydroxynonenal

Principem vyvinutyacutech metod je kombinace vhodneacute separačniacute techniky ndash imunoextrakce a

extrakce na pevneacute faacutezi (SPE) s vysoce selektivniacute a citlivou detekčniacute metodou hmotnostniacute

spektrometriiacute Vyvinuteacute metody pro stanoveniacute jednotlivyacutech markerů v KVV lze charakterizovat

vysokou přesnostiacute a spraacutevnostiacute niacutezkou chybou stanoveniacute a niacutezkyacutemi limity detekce a kvantifikace

Nediacutelnou součaacutestiacute praacutece byla i klinickaacute studie (realizovanaacute ve spolupraacuteci s 1 LF UK) kteraacute ověřila

vhodnost metody pro diferenciaacutelniacute neinvazivniacute diagnostiku oxidativniacuteho stresu

4

Obsah

Obsah 4 1 Seznam zkratek 5 2 Uacutevod 6 3 Teoretickaacute čaacutest 7

31 Kondenzaacutet vydechovaneacuteho vzduchu (KVV) 7 311 Složeniacute KVV 7 312 Odběr kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu 8

32 Oxidativniacute stres 9 321 Markery oxidativiacuteho stresu 9 322 Oxidativniacute stres a poškozeniacute organismu 15

33 Metody stanoveniacute biomarkerů v KVV 17 331 Extrakce biomarkerů 17 332 Hmotnostniacute spektrometrie (MS = mass spectrometry) 18

34 Pracovniacute hypoteacuteza 19 4 Metodika praacutece 20

41 Chemikaacutelie a pomůcky 20 42 Synteacuteza standardu malondialdehydu a methylmalondialdehydu 21 43 Odběr kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu 21 44 Stanoveniacute α‐amylasy v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu 21 45 Stanoveniacute koncentrace biomarkerů v KVV 21

452 LC‐ESI‐MSMS analyacuteza 22 46 Klinickaacute studie 24

5 Vyacutesledky a Diskuze 25 51 Odběr KVV 26 52 Stanoveniacute kontaminace kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu slinami 26 53 HPLCMS metoda 26

531 Extrakčniacute metody 29 532 Extrakce afinitniacutemi sorbenty 29 533 Extrakce na pevneacute faacutezi ‐ SPE 31

54 Stabilita markerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu 31 541 Klinickaacute studie 32

6 Zaacutevěr 33 7 Seznam literatury 34

5

1 Seznam zkratek

8‐iso‐PGF2α 8‐isoprostan 8‐iso prostaglandin F2α API atmospheric pressure ionization (ionizace za atmosferickeacuteho tlaku)

Aλ absorbance při vlnoveacute deacutelce λ b tloušťka vrstvy (cm) c laacutetkoveacute koncentrace (mol l‐1) CID Collision Induced Dissociation (kolizně indukovanaacute disociace) COX enzym cyklooxygenaacuteza ESI electrospray ionizacion (elektrosprejovaacute ionizace) GC‐MS plynovaacute chromatografie spojenaacute s hmotnostniacutem spektrometrem HNE 4‐hydroxynonenal HPLC‐MS vysokouacutečinnaacute kapalinovaacute chromatografie spojenaacute s hmotnostniacutem

spektrometrem HPLC‐UV vysokouacutečinnaacute kapalinovaacute chromatografie s UV detekciacute KVV kondenzaacutet vydechovaneacuteho vzduchu LOD limit detekce LOQ limit kvantifikace MDA malondialdehyd MeMDA methylmalondialdehyd MRM Multiple Reaction Monitoring PG Prostaglandin PGE2 Prostaglandin E2 PGD2 Prostaglandin D2

RE relative error (relativniacute chyba) RSD relative standard deviation (relativniacute směrodatnaacute odchylka) ROS reactive oxygen species (reaktivniacute kysliacutekoveacute čaacutestice) SPE Solid Phase Extraction (extrakce na pevneacute faacutezi) TMP 1133‐tetramethoxypropan TXA2 thromboxan A2

VFN všeobecnaacute fakultniacute nemocnice

ε molaacuterniacute absorpčniacute koeficient (l mol‐1 cm‐1)

μ skutečneacute přidaneacute množstviacute

x průměr stanoveneacute koncentrace

6

2 Uacutevod

Sledovaacuteniacute specifickyacutech molekul produkovanyacutech organismem při patologickyacutech procesech je

v dnešniacute době součaacutestiacute moderniacute leacutekařskeacute diagnostiky Běžně se setkaacutevaacuteme s analyacutezou laacutetek v krevniacute

plazmě a moči Vyacutesledky ziacuteskaneacute analyacutezou těchto tělniacutech tekutin jsou odrazem procesů odehraacutevajiacuteciacutech

se v raacutemci celeacuteho organismu a k lokalizaci patologickeacuteho procesu se využiacutevajiacute jen v omezeneacute miacuteře

přiacutepadně pouze jako doplněk dalšiacutech diagnostickyacutech metod K vyšetřeniacute nemociacute plic a dyacutechaciacutech cest

(např diagnostika bronchiaacutelniacuteho astmatu asbestoacutezy silikoacutezy ad) se v běžneacute praxi použiacutevaacute celaacute řada

diagnostickyacutech metod ktereacute jsou v naprosteacute většině metodami invazivniacutemi (bronchiaacutelniacute biopsie

bronchoalveolaacuterniacute lavaacutež) přiacutepadně semi‐invazivniacutemi (metoda indukovaneacuteho sputa) ty jsou pro

pacienta zatěžujiacuteciacute u dětiacute a seniorů mohou byacutet dokonce až stresovou zaacuteležitostiacute Včasnaacute diagnostika

plicniacutech onemocněniacute ovšem hraje důležitou roli z hlediska zahaacutejeniacute uacutečinneacute terapie a minimalizace

poškozeniacute organismu pacienta

Analyacuteza kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu je poměrně novou metodou jež představuje

alternativniacute cestu kterou lze charakterizovat jako zcela neinvazivniacute a pro pacienta nezatěžujiacuteciacute

Složeniacute kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu koresponduje s ději odehraacutevajiacuteciacutemi se bezprostředně

v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech odkud se do něj dostaacutevaacute celaacute řada specifickyacutech laacutetek

Princip analyacutezy kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu spočiacutevaacute v kvantifikaci specifickyacutech laacutetek

pro uvedenaacute onemocněniacute ndash tzvbdquobiomarkerůldquo ktereacute se vyskytujiacute v uvedeneacute tělniacute tekutině a jejichž

koncentračniacute hladina je v důsledku probiacutehajiacuteciacuteho patologickeacuteho procesu v dyacutechaciacutech cestaacutech a pliciacutech

vyacuteznamně zvyacutešena K analyacuteze dechoveacuteho kondenzaacutetu se použiacutevajiacute biochemickeacute metody nebo metody

využiacutevajiacuteciacute vysoce citliveacute a specifickeacute techniky na baacutezi hmotnostniacute spektrometrie V současneacute době se

problematika využitiacute kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu jako zdroje biomarkerů plicniacutech

onemocněniacute nachaacuteziacute ve stavu kdy byla popsaacutena celaacute řada metodik stanoveniacute biomarkerů ovšem

vyacutesledky uvedenyacutech studiiacute vykazujiacute značnyacute rozptyl danyacute opomenutiacutem důležityacutech specifickyacutech faktorů

ktereacute je nutneacute respektovat při zpracovaacuteniacute a naacutesledneacute analyacuteze teacuteto tělniacute tekutiny

Předklaacutedanaacute praacutece si kladla za ciacutel postihnout a kvantifikovat parametry ktereacute mohou byacutet

zdrojem v literatuře uvaacuteděnyacutech rozporuplnyacutech vyacutesledků a vypracovat protokol zpracovaacuteniacute

dechoveacuteho kondenzaacutetu a stanoveniacute specifickyacutech biomarkerů oxidativniacuteho stresu (8‐isoprostan

malondialdehyd 4‐hydroxynonenal prostaglandin D2 a prostaglandin E2) metodou hmotnostniacute

spektrometrie Vyacutesledkem experimentaacutelniacute činnosti v teacuteto oblasti je vypracovaacuteniacute metody kombinujiacuteciacute

extrakci biomarkerů s dostatečně citlivou a selektivniacute detekčniacute metodou ndash hmotnostně‐

spektrometrickou analyacutezou kteraacute umožňuje kvantifikaci těchto specifickyacutech laacutetek

3 T

31 K

311 S

vzduchuvedle ds dostatea řada dna epitese v tomPřiacutekladetěkavyacutechdostaacutevajvzduchu

vydechojež kores

(metaboidentifik

O

zvyacutešeneacute může si

Teoretick

ondenzaacutet

Složeniacute KV

Každyacute člov se nachaacutezejusiacuteku kysliacutekečnou tenziacute alšiacutech organlu plic a dyacutec

mto přiacutepadě m laacutetek obh laacutetek rozpujiacute jako aeros v bronšiacutech aZkondenzo

ovaneacuteho vzdusponduje s dKVV obsa

olity kyselinyovaacuteno viacutece n

Obraacutezek 1 Sc

Z pmakap

V KVV bylkoncentraciignalizovat p

kaacute čaacutest

t vydechov

VV

ěk během djiacute ve dvou faacuteku oxidu upar při tělesickyacutech laacutetekchaciacutech cest sčiacutetajiacute a tiacutemohacujiacuteciacute KVustnyacutech ve vsoloveacute čaacutestica bronchioleovaacuteniacutem tohouchu (KVV) ději odehraacutevahuje celou y arachidonnež 200 [3]

cheacutema obohacovrchu plicniacutecleacute kapičky kpičky)

y detekovaacuteni při patologplicniacute onem

vaneacuteho vz

dne vydechnziacutech ndash v plynuhličiteacuteho osneacute teplotě a V plynneacute frspolu s vodo

m se odpařiacute iVV touto cevodě (vazoakce ktereacute jsoch (obraacutezek oto vzduchu kteraacute odraacutežajiacuteciacutemi se bezřadu z me

noveacute) pepti

ceniacute vydechovch skliacutepků a dktereacute unaacutešiacute p

ny specifickeacutegickyacutech proceocněniacute (nap

7

zduchu (K

e 15‐25 m3

neacute a v kapaloxidu uhelna atmosfeacuterickakci se nachou vytvaacuteřejiacute laacutetky ktereacuteestou jsou ktivniacute peptidou strhaacutevaacuteny1) se ziacuteskaacute kaiacute složeniacute brozprostředně ediciacutenskeacuteho idy enzymy

vaneacuteho vzducyacutechaciacutech cestproud vydech

eacute biomolekuesech odehpř asthma

KVV)

vzduchu Laacuteneacute (ve forměnateacuteho a oxkeacutem tlaku ‐ vaacuteziacute i ve voděbinaacuterniacute systeacuteeacute jsou za norleukotrieny dy enzymy y z povrchu s

apalnaacute matronchoalveolaacutev pliciacutech a dyacutehlediska z

y DNA ad

chu laacutetkami zt se odpařujiacute thovaneacuteho vzd

uly (tzv bioraacutevajiacuteciacutech sebronchiale

aacutetky obsaženě aerosolů) [xidu dusnatvoda peroxiě nerozpustneacutem Tenze parmaacutelniacutech poda prostanoDNA proteisliznice turb

rice označovaacuterniacute extracelyacutechaciacutech cesajiacutemavyacutech kteryacutech b

organismu těkaveacute laacutetky (duchu (kapal

omarkery) ke v pliciacutech Jeoxidativniacute

neacute ve vydech[1] V plynneacuteteacuteho přiacutetomid vodiacuteku uhneacute biomolekuar biomolekdmiacutenek maacutelooidy Molekuiny a soli) seulentniacutem pr

vaacutena jako kouaacuterniacute plicniacute staacutech [2] laacutetek ‐ eikbylo k dnešn

plynnaacute faacuteze) alnaacute faacuteze ndash a

ktereacute se vysejich zvyacutešenaacutestres rakov

hovaneacutem eacute faacutezi jsou mny laacutetky hlovodiacuteky uly ktereacute ul a vody o těkaveacute uly maacutelo e do KVV rouděniacutem

ondenzaacutet tekutiny

kosanoidy niacutemu dni

a strhaacutevajiacute erosoloveacute

kytujiacute ve aacute hladina vinu plic

cystickouzahaacutejeniacute

cestaacutech

312 O

vydechočaacutestiacute konaacutedobka

stanoven

přiacutetomnyacuteJednocepotencioz nejdůlemeacutedia do

odběr přlabilniacutech

vydecho

Ob

u fibroacutezu a diacute uacutečinneacute teraVyacutehodou Ka nikoliv v c

Odběr kond

Na speciaovaneacuteho vzduondenzaacutetoru a a chladiacuteciacute a

ny vysokeacute

yacutech v KVV stnyacute ventil sonaacutelniacute znečežitějšiacutech čaacutesosahovat růzK dosaženiacute

ři teplotě ‐1 laacutetek jakyacutemBěhem odb

ovaacuteniacute nosem

braacutezek 2 Scheacute

dalšiacute) Včasnpie a minimaKVV je že oeleacutem těle ja

denzaacutetu vyd

alizovanyacutech uchu (obraacutezevydechovanparatura Uacutek

koncentrace

Možnaacute kontsloužiacute k oddčištěniacute kondstiacute kondenzaacuteznyacutech teplotnižšiacutech tepl

10degC až ‐20degmi jsou prostaběru kteryacute t je pacientov

eacutema kondenz

naacute diagnostikalizace poškoodraacutežiacute procesak je tomu v

dechovaneacute

klinickyacutech ek 2) kteryacute neacuteho vzduckolem lapače

e biomarker

taminace sliděleniacute vdechdenzovaneacutehaacutetoru je chla ktereacute pak oot se použiacutevC Tato niacutezkaglandiny letrvaacute obvykle vi nasazen n

zaacutetoru pro od

8

ka uvedenyacutecozeniacute paciensy odehraacutevapřiacutepadě jinyacutec

ho vzduchu

pracovištiacutechzkapalniacute aerhu je naacuteuste slin je zam

rů (např le

nami se zjišovaneacuteho a vo vzduchu diciacute systeacutem ovlivňujiacute mnovaacute chladiacuteciacute pkaacute teplota jeeukotrieny a15 ndash 20 minosniacute klips

běr KVV

h onemocněta jiacuteciacute se vyacutelučch tělniacutech te

u

h se ziacuteskaacutevrosoloveacute čaacutestek lapač sezeniacute kontam

eukotrieny

šťuje stanovvydechovaneacute

čaacutesticemikteryacute může

ožstviacute zachycrotiproudovyacute důležitaacute praldehydy ad nut lze ziacuteska

ěniacute hraje důl

čně v pliciacutechkutin (v moč

vaacute KVV postice a laacutetky slin jednoceminace slina

8‐iso Prosta

veniacutem aktiviteacuteho vzduchuz vnějšiacuteho podle typu

cenyacutech laacutetekyacute okruh [5] o kvantitativ at 2 ndash 3 ml K

ležitou roli z

přiacutepadně dči krevniacute plaz

omociacute kondz plynneacute faacutezestnyacute ventilmi neboť v

aglandin F2α

ty slinneacute αminusu a tiacutem se e

prostřediacute použiteacuteho c umožňujiacuteciacute vniacute uchovaacuteniacute

KVV Aby se

z hlediska

dyacutechaciacutech změ)

enzaacutetoru ze Hlavniacute l sběrnaacute nich byly

α ad) [4]

minusamylasy eliminuje Jednou

hladiacuteciacuteho

provaacutedět iacute tepelně

zamezilo

9

32 Oxidativniacute stres

Oxidativniacute stres je proces spojenyacute se vznikem velkeacuteho množstviacute ROS (reaktivniacute kysliacutekoveacute

čaacutestice ‐ reactive oxygen species) ktereacute atakujiacute biomolekuly přiacutetomneacute v organismu a naacutesledně

způsobujiacute jejich oxidaci Mezi ROS se řadiacute volneacute radikaacutely kysliacuteku s volnyacutem nepaacuterovyacutem elektronem

(∙HOˉ HO2∙ RO∙ RO2∙ O2ˉ ) a laacutetky ktereacute nemajiacute nepaacuterovyacute elektron a vznikajiacute přeměnami z volnyacutech

radikaacutelů ‐ peroxid vodiacuteku a kyselina chlornaacute Volneacute radikaacutely jsou v organismu tvořeny přirozenou

metabolickou drahou (likvidace fagocytovanyacutech organismů signalizačniacute vyacuteznam v buňce

mitochondriaacutelniacute dyacutechaacuteniacute) při patologickyacutech poškozeniacutech (narušeniacute antioxidačniacute ochrany) nebo jako

důsledek působeniacute xenobiotik (exhalace z průmyslu kouřeniacute) [6]

Buňky disponujiacute obsaacutehlou řadou antioxidačniacutech mechanismů (inaktivujiacuteciacute peroxidy enzymy

a proteiny) ktereacute zabraňujiacute tvorbě ROS tiacutem eliminujiacute jejich možnyacute ničivyacute efekt v organismu Životnost

ROS v organismu je omezena na kraacutetkyacute časovyacute interval což je přiacutečinou absence citliveacute a přesneacute

analytickeacute metody pro jejich stanoveniacute Kvůli tomuto probleacutemu je řada představ o působeniacute ROS

nedokonalaacute či nevyjasněnaacute Neniacute jasneacute zda ROS vyvolaacutevajiacute daneacute onemocněniacute nebo jsou‐li pouze

formovaacuteny v důsledku nemoci [6]

Nestabilita ROS vede k tomu že se hledajiacute stabilnějšiacute biomarkery pro oxidativniacute stres ktereacute

by pomohly objasnit mechanismy působeniacute různyacutech xenobiotik [7] např krystalickyacute oxid křemičityacute

vlaacuteknityacute azbest dioxiny a řada dalšiacutech

321 Markery oxidativiacuteho stresu

Z kyseliny arachidonoveacute působeniacutem ROS vznikaacute 8‐iso PGF2α oxidaciacute dalšiacutech mastnyacutech

kyselin (předevšiacutem ω-6 a ω-3 polynenasycenyacutech mastnyacutech kyselin) vznikajiacute konjungovaneacute dieny

alkany aldehydy nasyceneacute a nenasyceneacute ketony ad (obraacutezek 3)

Velkou většinu produktů oxidace mastnyacutech kyselin lze charakterizovat cytotoxickyacutemi

a genetoxickyacutemi vlastnostmi Daneacute biomarkery jsou stabilnějšiacute než ROS a lze jejich koncentrace měřit

v tělniacutech tekutinaacutech (plazma moč a KVV) V současneacute době se jako možneacute markery oxidativniacuteho

stresu lipidů monitoruje vedle vyacuteskytu 8‐iso PGF2α i malondialdehyd (MDA) 4‐hydroxynonenal (HNE)

PGD2 a PGE2

10

R

OOH

R

R O OOR O

R OOH

OH

OH

COOH

OH

CH2

NH2 COOH

OH

O

N

N

N

N

O

NH2

O

H

HOH

OH OH

ROS

8-hydroxy guanosin

H2O2

lipidoveacute peroxidy

oxidace aminokyselin

o - tyrosin

konjugovaneacute dieny alkany

malondialdehydn-aldehydy

nenasyceneacute aldehydy

8-iso PGF2αoxidace nukleovyacutech

kyselin

oxidace kyseliny arachidonoveacute

oxidace mastnyacutech kyselin

Obraacutezek 3 Produkty působeniacute volnyacutech radikaacutelů v organismu

3211 Prostaglandiny (PG)

Prostaglandiny patřiacute do skupiny eikosanoidů tedy laacutetek obsahujiacuteciacute dvaceti uhliacutekatyacute řetězec

PG jsou všudypřiacutetomneacute lipidy ktereacute se podiacuteliacute na řadě fyziologickyacutech ale i patologickyacutech procesech

odehraacutevajiacuteciacutech se v organismu

Prostaglandiny mohou vznikat několika způsoby Biologicky nejaktivnějšiacute jsou však

metabolity kyseliny arachidonoveacute (prostaglandin E2 (PGE2) prostaglandin D2 (PGD2) a thromboxan

A2) Kyselina arachidonovaacute je viacutecesytnaacute mastnaacute kyselina vaacutezaacutenaacute v membraacutenovyacutech fosfolipidech

odkud může byacutet působeniacutem enzymů nebo volnyacutech kysliacutekovyacutech radikaacutelů uvolněna do organismu

Cesta kyseliny arachidonoveacute katalyzovanaacute cyklooxygenaacutezou (COX) upřednostňuje synteacutezu

prostaglandinů a thromboxanů Isoprostany se v tomto přiacutepadě mohou vyskytovat pouze jen jako

vedlejšiacute produkty V prvniacutem kroku přeměny kyseliny arachidonoveacute dochaacuteziacute působeniacutem COX

k navaacutezaacuteniacute dvou molekul kysliacuteku a vzniku bicyklickeacuteho endoperoxidoveacuteho prostaglandinu G2 (PGG2)

jehož hydroperoxidovaacute skupina se enzymem peroxid reduktaacuteza redukuje na hydroxylovou skupinu

prostaglandinu H2 (PGH2) Enzym coklooxygenaacutezy je v organismu přiacutetomen v několika možnyacutech

izomerickyacutech formaacutech ‐ COX‐1 (jejiacutem uacutekolem je udržovat fyziologickou hladinu prostanoidů pro

homeostatickou regulaci organismu) a COX‐2 kteraacute je zodpovědnaacute za průběh zaacutenětliveacute reakce [8]

Osud prekursoru PGH2 (obraacutezek 4) zaacutevisiacute na miacutestě vzniku a přiacutepadneacute aktivitě dalšiacutech enzymů

Přiacutemou přeměnou PGH2 vznikaacute thromboxan A2 (katalyzovaacuteno enzymem thromboxan A synthetaacuteza)

PGD2 (enzym prostaglandin D synthetaacuteza) PGE2 (enzym prostaglandin E synthetaacuteza) PGF2α (enzym

prostaglandin H 911‐endoperoxid reduktaacuteza) a prostacyklin (enzym prostacyklin synthetaacuteza) PGF2α

11

se v organismu vytvaacuteřiacute i redukciacute ketonickeacute skupiny PGE2 enzymem prostaglandin E 9‐ketoretuktaacuteza

PGA2 a PGB2 vznikajiacute postupnou metabolizaciacute PGE2 u ktereacuteho nejprve proběhne dehydratace ve

vodneacutem roztoku albuminu na PGA2 jež je naacutesledně izomerizovaacuten na PGB2 Vodnyacute roztok albuminu se

uplatňuje i při dehydrataci PGD2 na PGJ2

Fyziologickyacutem uacutekolem prostaglandinů je podiacutelet se na homeostatickeacute regulaci traacuteviciacute

oběhoveacute vylučovaciacute a dyacutechaciacute soustavy a uplatňujiacute se i v obdobiacute těhotenstviacute a porodu Při

patologickyacutech pochodech se s prostaglandiny můžeme setkat při zaacutenětech kardiovaskulaacuterniacutech

onemocněniacutech rakovině a oxidativniacutem stresu

Jejich biologickaacute aktivita je daacutena interakciacute se specifickyacutem G‐proteinovyacutem receptorem a

ovlivněniacutem lokaacutelniacute funkce ostatniacutech hormonů v cirkulaci Receptory se klasifikujiacute podle selektivity

k danyacutem prostaglandinům PGE2 se předevšiacutem vaacuteže na EP receptory PGI2 aktivuje IP receptory PGF2α

interaguje s FP receptory pro PGD2 se v organismu vyskytujiacute DP receptory a s TP receptory

přednostně vytvaacuteřiacute aktivniacute komplex thromboxany ale byacutevajiacute aktivovaacuteny i PGD2 PGF2α a 8‐iso PGF2α

Jednotliveacute prostanoidy navaacutezaacuteniacutem na odpoviacutedajiacuteciacute receptor v určiteacutem miacutestě ovlivňujiacute řadů procesů

Nejdůležitějšiacute prostaglandiny PGD2 a PGE2 se podiacutelejiacute na bronchokonstrikci draacuteždiacute dyacutechaciacute

cesty a tiacutem indukujiacute vznik kašle znaacutesobujiacute efekt působeniacute histaminu a zvyšujiacute produkci hlenu

v dyacutechaciacutech cestaacutech a lze je označit za promotory alergickeacute reakce

12

OO

COOH

OOH

OO

COOH

OH

O

COOH

OH

OH

O

COOH

OHOH

O

OHOH

COOHOH

OH

COOH

OH

OO

OH

COOH

COOH

O

COOH

OH

COOH

OH

O

O

COOH

OH

Prostaglandin G2

Prostaglandin H2

Prostaglandin D2Prostaglandin E2

Prostaglandin I2

Kyselina arachidonovaacute

Prostaglandin F2α

Thromboxan A2

COX

Prostaglandin A2

Prostaglandin B2

Prostaglandin J2

1

2

3

4

5

6 7

8

9

Peroxidreduktaacuteza

2 O2

Obraacutezek 4 Biosynteacuteza prostanoidů z kyseliny arachidonoveacute působeniacutem enzymu coklooxygenaacutezy (COX)

Přeměna nestabilniacuteho meziproduktu prostaglandinu H2 na přiacuteslušneacute prostaglandiny probiacutehaacute za přiacutetomnosti enzymů 1 ‐ prostaglandin H 911‐endoperoxid reduktaacuteza 2 ‐ prostaglandin E synthetaacuteza 3 ‐ prostaglandin E 9‐ketoreduktaacuteza 4 ‐ dehydratace 5 ‐ izomeraacuteza 6 ‐ thromboxan A synthetaacuteza 7 ‐ prostaglandin D synthetaacuteza 8 ‐ dehydratace 9 ‐ prostacyklin synthetaacuteza

13

3212 Isoprostany

Isoprostany vznikajiacute neenzymatickou peroxidaciacute membraacutenově vaacutezaneacute kyseliny arachidonoveacute

působeniacutem ROS (obraacutezek 5) Vyacutesledkem reakce arachidonoveacuteho radikaacutelu s molekulou kysliacuteku jsou

možneacute čtyři peroxyl radikaacutely kyseliny arachidonoveacute Peroxyl radikaacutely po podstoupeniacute intramolekulaacuterniacute

cyklizaci a navaacutezaacuteniacute druheacute molekuly kysliacuteku vytvaacuteřiacute čtyři regioizomery bicyklickyacutech endoperoxidů

isoprostanů G2 Vyacutesledkem čaacutestečneacute redukce iso‐PGG2 jsou isoprostany seacuterie E2 a D2 uacuteplnou redukciacute

ziacuteskaacuteme isoprostany F2α

COOH

COOH COOH COOH

COOHO O

COOHO O

COOH

O O COOH

O O

OO

COOH

OO

COOH

OO

COOH

OO

COOH

OO

COOHOOH

OO

COOH

OOH

OO

COOHOOH

OO

COOH

OOH

COOHOHOH

OH COOH

OH

OH

OH

COOHOHOH

OH COOH

OH

OH

OH

O2

O2O2

O2

O2O2

O2 O2

Kyselina arachidonovaacuteROS

ROSROS

[H]

[H]

[H]

[H]

VI IV

IIIVObraacutezek 5 Mechanismus vzniku F2α isoprostanů z kyseliny arachidonoveacute působeniacutem ROS

14

Isoprostany se vyskytujiacute v pliciacutech kardiovaskulaacuterniacutem a lymfatickeacutem systeacutemu v centraacutelniacute

nervoveacute soustavě a v ledvinaacutech Největšiacute biologickaacute aktivita byla prokaacutezaacutena u 8‐iso PGF2α kteryacute

v organismu může způsobit vazokonstrikci ceacutev a bronchů vyacuterazně redukovat průtok krve ledvinami a

ovlivňovat agregaci krevniacutech destiček

3213 Malondialdehyd a 4 ndash hydroxynonenal

Jednaacute se o konečneacute produkty oxidace ω‐6 a ω‐3 polynenasycenyacutech mastnyacutech kyselin

(obraacutezek 6) 4‐ hydroxynonenal a malondialdehyd způsobujiacute naacutesledneacute poškozeniacute zaacutekladniacutech

stavebniacutech organismu (nukleoveacute kyseliny aminokyseliny a biacutelkoviny) a proto lze jejich vlastnosti

označit za genetoxickeacute (poškozeniacute DNA RNA a i translačniacutech a transkripčniacutech mechanismů) a

cytotoxickeacute (projevuje se poškozeniacutem buněk a jejich naacuteslednyacutem možnyacutem zaacutenikem)

R

OOH

R

R O

OO

R O

R O

OH

R

OOHO

RO

OH

R

OOH

O

R O

RR

R

O

R

R

O

RR R

O


malondialdehyde

n-aldehydy

4-hydroxyalk-2-en-1-al 2-hydroxylalkan-1-al

4-hydroperoxyalk-2-en-1al

alk-2en-1-al

2-hydroperoxyalkan-1al

nasyceneacute ketony

nenasyceneacute ketony

ω-3 a ω-6 polynenasyceneacutemastneacute kyseliny

Obraacutezek 6 Scheacutema oxidace ωminus3 a ωminus6 polynenasycenyacutech mastnyacutech kyselin

15

322 Oxidativniacute stres a poškozeniacute organismu

3221 Expozice dioxiny

Jako dioxiny je souhrnně označovaacuteno 210 chemickyacutech laacutetek ze dvou skupin laacutetek odborně nazyacutevanyacutech polychlorovaneacute dibenzo‐p‐dioxiny (PCDDs) a polychlorovaneacute dibenzofurany (PCDFs) Mezi bdquonejvyacuteznamnějšiacuteldquo zaacutestupce se řadiacute 2378‐tetrachlordibenzo‐ p‐dioxin (TCDD ‐ obraacutezek 7) kteryacute patřiacute mezi jedny z nejjedovatějšiacutech laacutetek (40kraacutet jedovatějšiacute než kyanid draselnyacute)

Dioxiny jsou vysoce toxickeacute laacutetky nebezpečneacute již ve stopovyacutech koncentraciacutech Jsou to laacutetky ktereacute se kumulujiacute v tukovyacutech tkaacuteniacutech organismů Jejich dlouhodobyacutem působeniacutem na organismus dochaacuteziacute k poškozeniacute imunitniacuteho a nervoveacuteho systeacutemu ke změnaacutem v endokrinniacutem systeacutemu (zejmeacutena štiacutetneacute žlaacutezy) a reprodukčniacutech funkciacute Ve vysokyacutech akutniacutech koncentraciacutech způsobujiacute dioxiny zaacuteněty kůže (alergickaacute dermatitida chlorakneacute) při vdechnutiacute vyvolaacutevaacute zaacuteněty sliznice a plicniacute tkaacuteně což může končit i smrtiacute Dalšiacutemi nejviacutece postiženyacutemi orgaacuteny jsou oči jaacutetra a ledviny Při nižšiacutech chronickyacutech daacutevkaacutech způsobujiacute poškozeniacute plicniacutech epitelů podiacutelejiacute se na vzniku oxidativniacuteho stresu z ktereacuteho se naacutesledně může vyviacutejet rakovinneacute onemocněniacute Převaacutežnaacute většina dioxinů se do organismu

dostaacutevaacute potravou inhalaciacute ze vzduchu nebo při styku s kůžiacute [9]

O

O Cl

ClCl

Cl

2378-tetrachlordibenzo- p-dioxin

Obraacutezek 7 Struktura 2378‐tetrachlordibenzo‐ p‐dioxinu (TCDD)

Dioxiny obecně vznikajiacute jako vedlejšiacute produkt průmysloveacute vyacuteroby ktereacute se uacutečastniacute chlor

(vyacuteroba PVC běleniacute buničiny chlorem ad) Nejvyacuteznamnějšiacutem zdrojem dioxinů jsou však v dnešniacute době předevšiacutem spalovny kde vznikajiacute neuacuteplnou oxidaciacute 12‐dichlorbenzenu což je přiacutečinou jejich vyacuteskytu v kouřovyacutech plynech technologicky nedořešenyacutech spaloven komunaacutelniacuteho odpadu obsahujiacuteciacuteho chlorovaneacute plasty předevšiacutem polyvinylchlorid (PVC)

Cl

Cl

OO

Cl

Cl O

OCl

Cl

Cl

Cl+ +

oxidace

TCDD

2 2 H2O+

Rovnice 1 Vznik TCDD hořeniacutem o‐dichlorbenzenu

V minulosti se můžeme setkat s několika přiacuteklady expozice lidiacute dioxiny V 60 letech Spolana

Neratovice zahaacutejila vyacuterobu chlorovanyacutech pesticidů včetně složky pro Agent Orange (směs pesticidů 24‐dichlorfenoxyoctoveacute kyseliny a 245‐trichlorfenoxyoctoveacute kyseliny kteryacute byl americkou armaacutedou

16

použiacutevaacuten v průběhu Vietnamskeacute vaacutelky) Při vyacuterobě chlorovanyacutech pesticidů byly dioxiny (předevšiacutem TCDD) nežaacutedouciacute vedlejšiacute laacutetkou Vyacuteskyt těchto laacutetek v provozech zapřiacutečinil řadu vaacutežnyacutech onemocněniacute velkeacuteho počtu zaměstnanců a je spojovaacuten s vysokou uacutemrtnostiacute zaměstnanců Spolany na rakovinu koncem 60 let minuleacuteho stoletiacute

3222 Expozice oxidem křemičityacutem

Silikoacuteza plic je typickeacute onemocněniacute profesionaacutelniacuteho původu ktereacute je vyvolaacuteno inhalaciacute prachu s obsahem krystalickeacuteho oxidu křemičiteacuteho jakožto hlavniacute složkou zemskyacutech mineraacutelů Při inhalaci se do alveol dostaacutevajiacute čaacutestice ze kteryacutech většina je vykašlaacutena nepatrnaacute čaacutest prachu však přechaacuteziacute v makrofaacuteziacutech stěnou alveolu do intersticia odkud je dopravovaacutena do miacutezniacutech uzlin Činnostiacute makrofaacutegů vznikaacute drobnyacute zaacutenět kteryacute se opakovanou inhalaciacute oxidu křemičiteacuteho postupně zvětšuje Nemoc se vyviacutejiacute 15 ndash 20 let a může vyuacutestit až v rakovinu plic

3223 Expozice azbestem

Azbestoacuteza je profesionaacutelniacute plicniacute onemocněniacute ktereacute vznikaacute v důsledku nadměrneacuteho vystaveniacute azbestovyacutech vlaacuteken Azbestovaacute vlaacutekna jsou zanesena proudem vdechovaneacuteho vzduchu až do alveol Vyacutesledkem je aktivace alveolaacuterniacutech makrofaacutegů a rozvoj zaacutenětliveacuteho procesu Přesnyacute mechanismus tohoto působeniacute neniacute znaacutem ale vyacuteznamnou roli hraje tvar azbestovyacutech vlaacuteken a jejich relativniacute nezničitelnost Inhalovanaacute vlaacutekna mohou v pliciacutech přetrvaacutevat řadu let Pro svůj charakteristickyacute tvar ndash uacutezkeacute a dlouheacute vlaacutekno ndash nemohou byacutet zcela fagocytovaacutena makrofaacutegy a tak jedno vlaacutekno po dlouhou dobu aktivuje řadu makrofaacutegů To vede k uvolňovaacuteniacute některyacutech enzymů a hlavně volnyacutech kysliacutekovyacutech radikaacutelů ktereacute poškozujiacute okolniacute plicniacute tkaacuteň Nebezpečnost inhalace azbestoveacuteho prachu spočiacutevaacute předevšiacutem ve zvyacutešeniacute rizika vzniku plicniacuteho karcinomu

17

33 Metody stanoveniacute biomarkerů v KVV

Složitost matrice KVV spojenaacute s velkyacutem počtem rozdiacutelnyacutech biomarkerů a rozmanitost dnešniacutech analytickyacutech metod naacutem daacutevaacute nepřeberneacute množstviacute kombinaciacute stanoveniacute V řadě praciacute bylo popsaacuteno stanoveniacute prostaglandinů a isoprostanů v různyacutech tělniacutech tekutinaacutech (krevniacute plazma moč mozkomiacutešniacute mok a KVV) s využitiacutem rozdiacutelnyacutech analytickyacutech metod jako je RIA (Radioimmunoassay) [10] EIA (Enzyme Immunoassay) [11] ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) [12] přiacutepadně GC‐MS [13] nebo LC‐MS [14] Biochemickyacutemi metodami lze stanovit řaacutedově nižšiacute koncentrace laacutetek než jakyacutech je dnes dosahovaacuteno použitiacutem hmotnostně‐spektrometrickyacutech metod (GC‐MS LC‐MS) nicmeacuteně meze detekce těchto instrumentaacutelniacutech metod se v průběhu posledniacuteho desetiletiacute dostaly na uacuteroveň piko‐ femto‐ přiacutepadně attomolů což je plně postačujiacuteciacute pro detekci většiny biologicky aktivniacutech laacutetek vyskytujiacuteciacutech se v lidskeacutem organismu [6] Spojeniacute kapalinoveacute přiacutepadně plynoveacute chromatografie s hmotnostniacutem spektrometrem poskytuje oproti biochemickyacutem metodaacutem nejenom kvantitativniacute informaci ale rovněž i informaci strukturniacute (kvalitativniacute) kteraacute je při využitiacute MS technik vysoce specifickaacute Tiacutem jsou vyloučeny falešně pozitivniacute či negativniacute vyacutesledky ktereacute se v důsledku ldquozkřiacuteženyacutech reakciacuteldquo vyskytujiacute u imunochemickyacutech nebo enzymatickyacutech metod

Měřeniacute koncentrace MDA a HNE v řadě praciacute probiacutehaacute s využitiacutem spojeniacute kapalinoveacute chromatografie s UV nebo fluorescenčniacute detekciacute Nediacutelnou součaacutestiacute jejich stanoveniacute je derivatizace Tento způsob stanoveniacute se vyznačuje velice niacutezkou selektivitou k danyacutem analytům a k možneacutemu zkresleniacute vyacutesledků dalšiacutemi aldehydy přiacutetomnyacutemi v matrici neboť tyto metody neposkytujiacute strukturniacute informaci

Proces stanoveniacute eikosanoidů HNE a MDA v KVV při využitiacute hmotnostně‐spektrometrickeacute detekce je možneacute rozdělit do třiacute čaacutestiacute V prvniacutem kroku se provaacutediacute odběr KVV (viz kapitola kondenzaacutet vydechovaneacuteho vzduchu) Z biologickeacute matrice se před samotnou hmotnostně‐spektrometrickou analyacutezou analyty extrahujiacute a zakoncentrovaacutevajiacute přiacutepadně se provaacutediacute jejich derivatizace

331 Extrakce biomarkerů

Extrakce biomolekul z komplexniacute biologickeacute matrice se provaacutediacute z důvodu (1) zakoncentrovaacuteniacute (2) kompatibility rozpouštědla s mobilniacute faacuteziacute LC a (3) eliminace rušiveacuteho efektu matrice Jako extrakčniacute metody je možno použiacutet např specifickou extrakci laacutetky založeneacute na imunitniacute reakci antigenu s protilaacutetkou a nespecifickeacute odstraněniacute soliacute extrakciacute na pevneacute faacutezi (SPE ndash Solid Phase Extraction)

3311 Imunoseparace

Princip imunoseparačniacutech metod je založen na imunitniacute odpovědi organismu kde imunitniacute reakce probiacutehaacute na zaacutekladě vytvořeniacute komplexu antigen ndash protilaacutetka Antigen je pro organismus strukturně ciziacute laacutetka vyvolaacutevajiacuteciacute tvorbu přiacuteslušneacute specifickeacute protilaacutetky kteraacute je schopna vychytaacutevat danyacute antigen a proto lze reakce mezi antigenem a protilaacutetkou charakterizovat jako vysoce specifickou Tedy pokud je k dispozici specifickaacute protilaacutetka může byacutet při použitiacute vhodneacute laboratorniacute techniky provedena extrakce sledovaneacuteho antigenu z biologickeacuteho vzorku kvantitativně

Pro separaci vytvořeneacuteho komplexu antigen ‐ protilaacutetka z biologickyacutech matric musiacute byacutet protilaacutetka zakotvena na nosiči kteryacute umožniacute bezprobleacutemovou separaci z tělniacutech tekutin (pomociacute

18

odstředěniacute ndash např Sepharosa 4B v magnetickeacutem poli ndash magnetickeacute mikro‐ a nanočaacutestice [6] nebo různeacute druhy destiček) při zachovaacuteniacute dostatečneacute vazebneacute kapacity pro antigen

3312 Extrakce na pevneacute faacutezi (SPE)

Princip extrakce na pevneacute faacutezi vychaacuteziacute z kapalinoveacute chromatografie (použiacutevajiacute se i obdobneacute stacionaacuterniacute faacuteze ‐ např silikagelovyacute nosič modifikovanyacute oktadecylovou ethylovou cyklohexylovou aj skupinou) Funkčniacute skupiny sorbentu a rozpouštědla interagujiacute s laacutetkami z roztoku a zadržujiacute analyty Naacuteslednyacutem vymytiacutem se ze SPE kolonky ziacuteskaacute analyt (nečistoty zachyceny) nebo se z kolony nejprve vymyjiacute nečistoty a použitiacutem dalšiacuteho rozpouštědla se ziacuteskaacute analyzovanaacute laacutetka SPE extrakci lze

charakterizovat jako jednoduchou nenaacuteročnou metodu o tom svědčiacute i jejiacute časteacute použitiacute [15]

Obraacutezek 8 Scheacutema extrakce na pevneacute faacutezi (SPE) ‐ SPE kolona se před naneseniacutem vzorku (B) zaktivuje

vhodnyacutem rozpouštědlem (A) Nezadržovaneacute složky se ze SPE kolonky vymyjiacute (C) a nakonec se

provede vymytiacute zadrženyacutech molekul (D)

332 Hmotnostniacute spektrometrie (MS = mass spectrometry)

Nedaacutevnyacute bouřlivyacute vyacutevoj v oblasti LC‐MS umožňuje dnes bezprobleacutemovou separaci a paralelniacute detekci velmi niacutezkyacutech koncentraciacute analytů i ve značně komplexniacutech matriciacutech Z tohoto důvodu stejně jako pro svou vysoce specifickou strukturniacute informaci se LC‐MS staacutevaacute metodou prvniacute volby v analyacuteze laacutetek v biologickyacutech matriciacutech Stanoveniacute pikogramovyacutech množstviacute v komplexniacute tělniacute tekutině je řešitelnyacute probleacutem metodou LC‐MS a to i z hlediska budouciacute rutinniacute praxe

Vysokouacutečinnaacute kapalinovaacute chromatografie (High Performance Liquid Chromatography‐HPLC) se použiacutevaacute předevšiacutem pro analyacutezu maacutelo těkavyacutech a tepelně labilniacutech laacutetek Vysokeacute selektivity separace se dosahuje vhodnou volbou chromatografickyacutech faacutezovyacutech systeacutemů Nejčastěji se využiacutevaacute kapalinovaacute chromatografie s reverzniacutemi faacutezemi kde stacionaacuterniacute faacuteze kolony je tvořena silikagelem kteryacute může byacutet modifikovaacuten nepolaacuterniacutemi oktadecylovyacutemi skupinami a mobilniacute faacuteziacute nejčastěji ze směsi polaacuterniacutech rozpouštědel ‐ voda methanol a acetonitril s přiacutedavkem pufrů

Při využitiacute hmotnostně‐spektrometrickeacute detekce se analyzovaneacute laacutetky musejiacute převeacutest do plynneacute faacuteze a iontoveacuteho stavu S objevem technik umožňujiacuteciacutech ionizaci za atmosfeacuterickeacuteho tlaku (API ndash athmospheric pressure ionization) je možneacute proveacutest tento převod i u tepelně labilniacutech laacutetek Mezi nejvyužiacutevanějšiacute API techniky patřiacute ionizace elektrosprejem (ESI ndash elektrospray ionozation) za kterou

19

byla v roce 2002 udělena Nobelova cena za chemii Johnu B Fennovi ESI se řadiacute mezi měkkeacute ionizačniacute techniky vyznačujiacuteciacute se zachovaacuteniacutem molekuloveacuteho piacuteku při minimaacutelniacutem počtu vzniklyacutech fragmentů molekuly Kombinace ESI ionizace s vhodnyacutem analyzaacutetorem (jednoduchyacute nebo trojityacute kvadrupoacutel iontovaacute past) je vhodnou detekčniacute technikou pro kvantitativniacute stanoveniacute laacutetek Trojityacute kvadrupoacutel a iontovaacute past vedle kvantitativniacute informace přinaacutešiacute při praacuteci v MSn moacutedu (pro trojityacute kvadrupoacutel maximaacutelně MS2 častěji označovaacuten MSMS) i kvalitativniacute informaci o sledovaneacute molekule Hmotnostniacute spektrometr s trojityacutem kvadrupoacutelem využiacutevaacute vysoce selektivniacute MRM (multiple reaction monitoring) moacuted kde na prvniacutem kvadrupoacutelu Q1 se izoluje quasi‐molekulaacuterniacute ion (deprotonovanyacute molekulaacuterniacute ion [M‐H]‐ pro negativniacute ionizaci a pro pozitivniacute ionizaci např protonovanyacute ion [MH]+) přiacuteslušneacute molekuly kteryacute je použit jako prekursor (rodičovskyacute ion) pro naacuteslednou kolizně‐indukovanou disociaci (CID) V kolizniacute cele kvadrupoacutelů Q2 dochaacuteziacute k selektivniacutemu rozpadu molekuly za vzniku dceřineacuteho spektra z ktereacuteho se na třetiacutem kvadrupoacutelu Q3 izoluje specifickyacute dceřinyacute ion s nejvyššiacute abundanciacute [6]

34 Pracovniacute hypoteacuteza

Ciacutelem předklaacutedaneacute praacutece je sledovaacuteniacute hladin biomarkerů oxidativniacuteho stresu v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu jako tělniacute tekutině kteraacute odraacutežiacute bezprostředniacute děje odehraacutevajiacuteciacute se v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech

V experimentaacutelniacute čaacutesti bude vypracovanaacute analytickaacute metoda pro kvantitativniacute i kvalitativniacute

stanoveniacute 8‐iso PGF2α malondialdehydu 4‐hydroxynonenalu PGD2 a PGE2 Nediacutelnou součaacutestiacute metody by měly byacutet separačniacute kroky (imunoseparace extrakce na pevneacute faacutezi) a samotneacute stanoveniacute vysoce přesnou a selektivniacute metodou HPLC‐ESI‐MSMS Jistaacute pozornost je věnovaacutena stabilitě sledovanyacutech markerů za podmiacutenek odběru skladovaacuteniacute a zpracovaacuteniacute KVV

Vyvinutaacute analytickaacute metoda bude testovaacutena na klinickyacutech vzorciacutech s ciacutelem porovnaacuteniacute koncentračniacutech hladin biomarkerů pacientů s diagnostikovanyacutem onemocněniacutem a zdravyacutech jedinců Veškeraacute ziacuteskanaacute data budou statisticky vyhodnocena

20

4 Metodika praacutece

41 Chemikaacutelie a pomůcky

Naacutezev čistota vyacuterobce 8‐iso Prostaglandin F2α (8‐iso‐PGF2α) ge 99 Cayman Chemical USA

Prostaglandin E2 ge 99 Cayman Chemical USA

Prostaglandin D2 ge 99 Cayman Chemical USA

8‐iso Prostaglandin F2β (8‐iso‐PGF2β) ge 98 Cayman Chemical USA

8‐iso15(R)‐Prostaglandin F2α ge 98 Cayman Chemical USA

Prostaglandin F2α (PGF2α) ge 99 Cayman Chemical USA

Prostaglandin F2β (PGF2β) ge 99 Cayman Chemical USA

15(R)‐Prostaglandin F2α (15(R)‐PGF2α) ge 98 Cayman Chemical USA

11b‐Prostaglandin F2α (11b‐PG F2α) ge 99 Cayman Chemical USA

[3344 2H4] 8‐iso Prostaglandin F2α ge 98 Cayman Chemical USA

4‐Hydroxynonenal (HNE) ge 98 Cayman Chemical USA

[9 9 9 2H3] 4‐Hydroxynonenal (HNE‐d3) ge 99 Cayman Chemical USA

8 ndash isoprostane Affinity Sorbent Cayman Chemical USA

Prostaglandin E2 Affinity Sorbent Cayman Chemical USA

Argon 50 SAID Českaacute republika

Vzduch technickyacute SAID Českaacute republika

Dusiacutek technickyacute SAID Českaacute republika

Methanol LCMS Riedel de Haeumln Německo

Acetonitril LCMS Riedel de Haeumln Německo

Voda LCMS Riedel de Haeumln Německo

Ethanol HPLC Merkc Německo

Amoniak 28 ‐niacute roztok Aldrich USA

1133‐Tetramethoxypropan 99 Aldrich USA

3‐(Dimethylamino)‐2‐methyl‐2‐propenal 99 Aldrich USA

2‐Propanol ge999 Riedel de Haeumln Německo

Aceton ge998 Riedel de Haeumln Německo

Kyselina mravenčiacute 999 Riedel de Haeumln Německo

Kyselina chlorovodiacutekovaacute pa Penta Českaacute republika

Hydroxid sodnyacute pa Penta Českaacute republika

Uhličitan sodnyacutebezvodyacute pa Penta Českaacute republika

Škrob Zulkowsky Merk Německo

35‐Dinitrosalicylovaacute kyselina ge98 Fluka Švyacutecarsko

Bond elut ndash C18 ndash hmotnost sorbentu 100 mg velikost čaacutestic 40μm objem 1ml (varian USA)

Hypercarb Thermo 100 x 21 mm x 5 microm s předkolonou Hypercarb (Thermo Electron Corporation

USA)

21

42 Synteacuteza standardu malondialdehydu a methylmalondialdehydu

Pro synteacutezu standardu malondialdehydu byl použit 1133‐tetramethoxypropan (TMP) kteryacute byl kysele hydrolyzovaacuten 60 minut při teplotě 40 degC Reakčniacute směs byla naacutesledně neutralizovaacutena (pH 7) roztokem uhličitanu sodneacuteho Pro přiacutepravu zaacutesobniacuteho roztoku o koncentraci cca 10 mM bylo použito 17ml TMP a 10 ml 01 M kyseliny chlorovodiacutekoveacute

Methylmalondialdehyd (MeMDA) byl připraven zahřiacutevaacuteniacutem 05 g 3‐dimethylamino‐2 methyl‐2‐propenalu s 02 g hydroxidu sodneacuteho v 07 ml vody Reakce se provaacuteděla při teplotě 70degC do vymizeniacute faacuteziacute (cca 3 hodiny) Při ochlazovaacuteniacute roztoku se začaly tvořit biacuteleacute krystaly Ze suspenze bylo odpařeno rozpouštědlo za sniacuteženeacuteho tlaku a ziacuteskaneacute krystaly byly promyty směsiacute rozpouštědel aceton2‐propanol (5050 ‐ VV) a acetonethanol (5050 ndash VV)

Přesnaacute koncentrace MDA a MeMDA byla stanovena využitiacutem UVVis spektrofotometru na

zaacutekladě Lambertova‐Beerova zaacutekona podle ktereacuteho je hodnota absorbance Aλ při vlnoveacute deacutelce λ přiacutemo uacuteměrnaacute laacutetkoveacute koncentraci c (mol l‐1) V přiacutepadě jedineacute absorbujiacuteciacute laacutetky v roztoku platiacute

rovnice Aλ = ελbc kde ελ (l mol‐1 cm‐1) představuje molaacuterniacute absorpčniacute koeficient při daneacute vlnoveacute deacutelce a b (cm) tloušťku vrstvy kterou prochaacuteziacute paprsek (v tomto přiacutepadě b = 1cm) Absorbance pro MDA

byla měřena při vlnoveacute deacutelce λ = 267 nm kdy molaacuterniacute absorpčniacute koeficient ε267 maacute hodnotu 31800 l mol‐1 cm‐1 Pro stanoveniacute koncentrace připraveneacuteho roztoku MeMDA bylo využito vlnoveacute deacutelky

λ = 274 nm jejiacute molaacuterniacute absorpčniacute koeficient ε274 odpoviacutedaacute hodnotě 29900 l mol‐1 cm‐1

43 Odběr kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu

KVV byl ziacuteskaacutevaacuten prostřednictviacutem kondenzaacutetoru vydechovaneacuteho vzduchu EcoScreen (Jaeger

Německo) na Klinice nemociacute z povolaacuteniacute VFN a 1 LF UK Bezprostředně po odběru vzorku bylo do 1 ml

KVV přidaacuteno 250 pg 8 ‐iso PGF2α‐d4 500 pg HNE‐d3 a 500 pg MeMDA a vzorek byl zmražen při teplotě

‐80 degC

44 Stanoveniacute α‐amylasy v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu

Enzymatickaacute reakce α‐amylasy obsaženeacute v KVV byla provaacuteděna při teplotě 37 degC smiacutechaacuteniacutem

KVV a 1 ‐niacuteho škrobu v poměru 12 Po 40 minutaacutech byla přidaacutena 35‐dinitrosalicylovaacute kyselina a

směs byla zahřaacutetaacute na teplotu 90 C (5 minut) kdy došlo k denaturaci α‐amylasy a redukci 35‐

dinitrosalyciloveacute kyseliny přiacutetomnyacutemi redukujiacuteciacutemi cukry Koncentrace vznikleacuteho produktu reakce

byla stanovena měřeniacutem absorbance při vlnoveacute deacutelce λ = 530 nm

45 Stanoveniacute koncentrace biomarkerů v KVV

4511 Extrakce afinitniacutemi sorbenty

Imunoafinitniacute extrakce byla provaacuteděna naacutesledujiacuteciacutem postupem k 1ml KVV označeneacutemu

vnitřniacutemi standardy bylo přidaacuteno 50 microl každeacuteho z imunoafinitniacuteho sorbentu Suspenze byla třepaacutena

(60 minut) při 480 otmin Naacutesledně byl sorbent separovaacuten odstředěniacutem (500 otmin 5 min)

22

Separovaneacute sorbenty byly promyty (2 x 1 ml deionizovanou vodou) K promytyacutem sorbentům byl

přidaacuten studenyacute methanol (2 x 05 ml miacutechaacuteniacute 5 minut odstředěniacute 2500 otmin) Spojeneacute

methanolickeacute podiacutely byly podrobeny odpařeniacute methanolu proudem dusiacuteku Zbytek po odpařeniacute byl

rozpuštěn v 50 microl mobilniacute faacuteze a byla provedena LC‐ESI‐MSMS analyacuteza


Extrakce na pevneacute faacutezi byla provaacuteděna na Bond elut C18 (oktadecylovaacute kartridg) Před

samotnyacutem naneseniacutem vzorku KVV s vnitřniacutem standardem byla kolona zaktivovaacutena promytiacutem 5 x 1ml

methanolu a 3 x 1ml 005 M roztokem kyseliny mravenčiacute ve vodě Na zaktivovanou kolonu byl

nanesen 1 ml KVV Matrice KVV z kartridge SPE kolony byla odstraněna 3 x 1ml vody Zadrženeacute laacutetky

byly z kolonky eluovaacuteny 1 ml methanolu Ziacuteskanaacute frakce methanolu byla odpařena proudem dusiacuteku

do sucha Před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou byl zbytek po odpařeniacute rozpuštěn v 50 ml mobilniacute

faacuteze

452 LC‐ESI‐MSMS analyacuteza

LC‐ESI‐MS byla realizovaacutena v systeacutemu vybaveneacutem dvěma vysokotlakyacutemi pumpami Varian

ProStar 210 (Varian USA) autosamplerem Varian 410 (Varian USA) Chromatografickeacute děleniacute vzorku

(nastřikovaneacute množstviacute 20 μl) bylo realizovaacuteno na koloně Hypercarb Thermo (Thermo USA)

100 x 21 mm x 5 microm s použitiacutem mobilniacute faacuteze o složeniacute voda s pH upravenyacutem amoniakem na hodnotu

105 (rozpouštědlo A) a methanol s acetonitrilem v poměru 6040 (VV) s přidanyacutem amoniakem

(01 )(rozpouštědlo B) v gradientoveacutem uspořaacutedaacuteniacute (tabulka 1) Průtok mobilniacute faacuteze byl 150 μlmin

Chromatografickaacute kolona byla temperovaacutena na teplotu 30degC Na kolonu bylo nastřikovaacuteno 20 μl

vzorku Přiacutestroj byl vybaven trojityacutem kvadrupoacutelovyacutem analyzaacutetorem Varian 1200L (Varian USA) Při

měřeniacute bylo použito negativniacute elektrosprejoveacute ionizace (ESI‐) v MRM moacutedu Reakce kolizně‐

indukovaneacute disociace argonem pro jednotliveacute analyty jsou zachyceny v tabulce 2 Podmiacutenky na

hmotnostniacutem spektrometru byly naacutesledujiacuteciacute napětiacute na kapilaacuteře ‐70 V tlak kolizniacuteho plynu argonu

02 Pa napětiacute na jehle ‐4500 V teplota sušiciacuteho plynu 300 degC (dusiacutek 117 kPa) a teplota zamlžovaciacuteho

plynu 50 degC (vzduch 345 kPa) Data byla měřena a zpracovaacutevanaacute využitiacutem softwaru Varian MS

Workstation verze 652 (Varian USA)

Tabulka 1 Složeniacute mobilniacute faacuteze chromatografickeacute separace 8‐iso PGF2a

Čas (min) rozpouštědlo A () rozpouštědlo B()

000 70 30 1000 70 30 2500 5 95 5500 5 95 6000 70 30 7000 70 30

23

Tabulka 2 Kolizně disociačniacute reakce analytů pro MRM moacuted MS

Analyt MRM reakce Kolizniacute energie

(mz rarr mz) (eV)

8‐iso PGF2α 353 rarr 193 275 8‐iso PGF2α‐d4 357 rarr 197 275 PGE2 355 rarr 293 230 PGD2 355 rarr 275 150 MDA 71 rarr 42 135 MeMDA 87 rarr 58 160 4‐HNE 155 rarr 137 110 4‐HNE ndash d3 158 rarr 140 110

4521 Validace metody

Vyvinuteacute extrakčniacute metody byly charakterizovaacuteny naacutesledujiacuteciacutemi validačniacutemi parametry limit

detekce ndash LOD limit kvantifikace ndash LOQ přesnost spraacutevnost a vyacutetěžnost

Limit detekce odpoviacutedaacute nejmenšiacute koncentraci analytu ve vzorku pro kterou je analytickyacute

signaacutel statisticky vyacuteznamně odlišnyacute od šumu U separačniacutech metod se použiacutevaacute k vyacutepočtu meze

detekce velikost hodnoty signaacutelu slepeacuteho pokusu Opakovanou analyacutezou blanku (n =10) byly určeny

průměrneacute hodnoty a směrodatneacute odchylky slepeacuteho pokusu Limit detekce byl pak spočiacutetaacuten jako

průměrnaacute hodnota slepeacuteho pokusu zvětšeneacuteho o trojnaacutesobek směrodatneacute odchylky

Limit kvantifikace představuje nejmenšiacute množstviacute analytu ve vzorku ktereacute může byacutet

stanoveno s předem zadanou nejistotou LOQ byl určen jako průměrnaacute hodnota slepeacuteho pokusu ke

ktereacute byl přičten desetinaacutesobek směrodatneacute odchylky slepeacuteho pokusu

Přesnost metody je definovaacutena jako těsnost shody ziacuteskaneacute koncentrace se skutečnou

hodnotou Jednaacute se tedy o statisticky vyacuteznamnou rozdiacutelnost mezi ziacuteskanou a skutečnou hodnotou

kteraacute se vyjadřuje relativniacute směrodatnou odchylkou RSD (relative standard deviation) jež se počiacutetaacute

podle vztahu RSD = sx x 100 () kde sx představuje směrodatnou odchylku a x je průměr daneacute

stanoveneacute koncentrace

Spraacutevnost metody vyjadřuje odchylku vyacutesledku od referenčniacute hodnoty a udaacutevaacute se pomociacute

relativniacute chyby (RE ndash relative error) Relativniacute chyba byla počiacutetaacutena vzorcem RE = ( x ndash μ) μ100 () μ

představuje skutečneacute přidaneacute množstviacute a x je průměr daneacute stanoveneacute koncentrace

Vyacutetěžnost udaacutevaacute poměr koncentrace analytu ziacuteskaneacuteho danou analytickou metodou k přijateacute

referenčniacute hodnotě (k znaacutemeacutemu přidaneacutemu množstviacute analytu)

24

46 Klinickaacute studie

Klinickaacute studie se sklaacutedala z diferenciaacutelniacute diagnostiky nemociacute spojenyacutech s oxidativniacutem stresem

a kontrolniacute skupiny U všech dobrovolniacuteků byly sledovaacuteny hladiny biomarkerů oxidativniacuteho stresu ndash

8 ‐ iso PGF2α PGE2 PGD2 HNE a MDA Tato studie byla provedena u 120 jedinců s onemocněniacutem

azbestoacutezy nebo silikoacutezy (věk 68 plusmn 8 průměrnaacute doba působeniacute asbestu nebo křemiacuteku 25 plusmn 6 let) u 33

pacientů s expoziciacute dioxiny (věk 69 + 5 let) a u 103 jedinců kontrolniacute skupiny (věk 65 plusmn 7)

25

5 Vyacutesledky a diskuze

Analyacuteza biomarkerů obsaženyacutech v KVV je poměrně novou rychle se rozviacutejejiacuteciacute oblastiacute v oboru

leacutekařskeacute diagnostiky Diagnostika založenaacute na stanoveniacute markerů oxidativniacuteho stresu však neniacute triviaacutelniacute zaacuteležitostiacute což dokazuje absence standardizovanyacutech metod pro jejich stanoveniacute přestože metod pro kvalitativniacute i kvantitativniacute analyacutezu prokazujiacuteciacutech možnost diferenciaacutelniacutech diagnostik těchto metod byla v literatuře publikovaacutena celaacute řada [16] Důvodem chybějiacuteciacute standardizovaneacute metody je předevšiacutem nerespektovaacuteniacute niacutezkeacute stability markerů za laboratorniacutech podmiacutenek přiacutetomnost enzymů zodpovědnyacutech za jejich odbouraacutevaacuteniacute v matrici KVV a chemickeacute změny odehraacutevajiacuteciacute se v průběhu zpracovaacuteniacute vzorku

Vyvinuteacute metody pro stanoveniacute hladin sledovanyacutech biomarkerů v KVV probiacutehaly podle scheacutematu zachyceneacuteho na obraacutezku 9 a snažily se respektovat veškeraacute vyacuteše uvedenaacute omezeniacute

SPEImunoseparace

Odběr KVV

Přaacutedavek vnitřniacutechstandardů

Separace HNE MDA

HPLC-ESI-MSMSanalyacutezy

Kvalitativniacute a kvantitativniacutestanoveniacute biomarkerů

Diagnoacuteza

8-iso PGF2α--d4HNE-d3MeMDA

Separace 8-iso PGF2α PGD2a PGE2

SPE

Stanoveniacute kontaminaceslinami

Obraacutezek 9 Scheacutema metody pro stanoveniacute biomarkerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu

26

51 Odběr KVV

Odběr KVV byl provaacuteděn na Klinice nemociacute z povolaacuteniacute 1 LF UK a VFN vybaveneacute zařiacutezeniacutem pro

jeho odběr Vzhledem k citlivosti biomarkerů k celeacute řadě faktorů je ideaacutelniacute ihned po odběru proveacutest

označeniacute vzorku isotopicky značenyacutem vnitřniacutem standardem Princip standardizace izotopicky

značenyacutem analogem spočiacutevaacute v zcela identickeacutem fyzikaacutelniacutem chemickeacutem a biologickeacutem chovaacuteniacute

znaacutemeacuteho množstviacute standardu kteryacute při hmotnostně‐spektrometrickeacute analyacuteze vykazuje v důsledku

nahrazeniacute vodiacuteku deuteriem odlišneacute chovaacuteniacute v detektoru umožňujiacuteciacute velice přesneacute provedeniacute

kvantifikace a zaacuteroveň monitorovaacuteniacute změn ve složeniacute vzorku k nimž došlo v průběhu jeho zpracovaacuteniacute

Pro MDA byl z důvodu absence deuterovaneacuteho analogu zvolen jako vnitřniacute standard MeMDA kteryacute

se vyznačuje podobnyacutemi chemicko‐fyzikaacutelniacutemi vlastnostmi

52 Stanoveniacute kontaminace kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu slinami

Po odběru vzorku KVV se provaacuteděl test na kontaminaci slinami ke ktereacute by mohlo dojiacutet

v důsledku špatně provedeneacuteho odběru neboť ve slinaacutech se vyskytuje vyacuteznamneacute množstviacute

sledovanyacutech biomarkerů Zjištěniacute kontaminace je možneacute proveacutest prostřednictviacutem stanoveniacute aktivity

enzymu α-amylaacutezy kteraacute se detekuje na zaacutekladě koncentrace uvolněneacuteho redukujiacuteciacuteho cukru

z rozštěpeneacuteho škrobu Redukujiacuteciacute cukr při zahřaacutetiacute redukuje přidanou 35‐dinitrosalicylovou kyselinu

na 3‐amino‐5‐nitrosalicylovou kyselinu Koncentrace vznikleacute 3‐amino‐5‐nitrosalicyloveacute kyseliny se

stanovuje na zaacutekladě absorbance při vlnoveacute deacutelce λ = 530 nm Pro všechny vzorky klinickeacute studie byla

stanovena aktivita α-amylasy v KVV pod 01 vzhledem k jejiacute aktivitě ve slinaacutech Pokud by tato

aktivita byla vyššiacute matrice by byla znehodnocena a daacutele nezkoumaacutena

53 HPLCMS metoda

Kapalinovaacute chromatografie pro separaci prostaglandinů a aldehydů byla realizovaacutena na

koloně Hypercarb s gradientovyacutem složeniacutem mobilniacute faacuteze z rozpouštědel ‐ vody methanolu

acetonitrilu a amoniaku Vyvinutaacute HPLC metoda sloužila nejen k odděleniacute laacutetek od čela analyacutezy aby

v důsledku přiacutepadneacute koeluce soliacute a endogenniacutech složek matrice nedochaacutezelo k potlačeniacute signaacutelu

hmotnostniacuteho detektoru v důsledku negativniacuteho vlivu na ionizaci ale rovněž k separaci jednotlivyacutech

prostaglandinů a aldehydů Pro stanoveniacute 8‐iso PGF2α při použitiacute nespecifickeacute separačniacute metody SPE

bylo nutno oddělit biologicky aktivniacute diastereomery 8‐iso PGF2α (obraacutezek 10) aby detekovanaacute

koncentrace 8‐iso PGF2α nebyla zkreslena dalšiacutemi diastereomery ktereacute by se eluovaly se shodnyacutem

retenčniacutem časem neboť u nich neniacute možneacute proveacutest hmotnostně‐spektrometrickou separaci

Chromatogram separovanyacutech laacutetek a přiacuteslušnyacutech diastereomerů za podmiacutenek uvedenyacutech

v experimentaacutelniacute čaacutesti je zachycen na obraacutezku 11

27

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

8-iso PGF2 β8-iso-15(R) PGF2 α

8-iso PGF2 α

PGF2 β

15(R)-PGF2 α PGF2 α 11-β-PGF2 α

Obraacutezek 10 Biologicky aktivniacute diastereomery 8‐iso PGF2α

Obraacutezek 11 MS a MSMS spektra sledovanyacutech analytů

28

OH

O

OH

COOH

O

OH

OH

COOH


Obraacutezek 12 Struktura prostaglandinu D2 a prostaglandinu E2

Hmotnostně‐spektrometrickaacute detekce byla realizovaacutena negativniacute elektrosprejovou ionoizaciacute

(ESI‐) ve vysoce selektivniacutem MRM moacutedu Na kvadrupoacutelu Q1 byl izolovanyacute deprotonovanyacute molekulaacuterniacute

iont [M‐H]‐ přiacuteslušneacuteho analytu kteryacute byl použit jako prekursor pro naacuteslednou kolizně‐indikovanou

disociaci v kolizniacute cele kvadrupoacutelů Q2 (obraacutezek 13) kde dochaacutezelo k selektivniacutemu rozpadu molekuly

za vzniku dceřineacuteho spektra ze ktereacuteho byl na třetiacutem kvadrupoacutelu Q3 izolovaacuten specifickyacute dceřinyacute ion

s nejvyššiacute četnostiacute Kolizniacute energie a dalšiacute parametry hmotnostniacuteho spektrometru byly optimalizovaacuteny

z hlediska ziacuteskaacuteniacute maximaacutelniacute vyacutetěžnosti vyvinuteacute metody (viz experimentaacutelniacute čaacutest)


29

531 Extrakčniacute metody

Vzhledem k velmi niacutezkeacute koncentraci biomarkerů v komplexniacute matrici KVV je vhodneacute

sledovaneacute laacutetky před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou separovat a proveacutest jejich zakoncentrovaacuteniacute

Za tiacutemto uacutečelem byla testovaacutena imunoseparace imunoafinitniacutemi sorbenty a extrakce na pevneacute faacutezi

(SPE) Použiteacute metody se odlišujiacute předevšiacutem selektivitou k danyacutem analytům Extrakce založenaacute na

reakci antigen ndash protilaacutetka se vyznačuje vyššiacute selektivitou Tato vysoce specifickaacute reakce umožňuje

odděleniacute nejen organickyacutech metabolitů od soliacute přiacutetomnyacutech v KVV jako je tomu i při extrakci na pevneacute

faacutezi ale i od dalšiacutech metabolitů kyseliny arachidonoveacute Daneacute separačniacute metody byly optimalizovaacuteny

z hlediska maximaacutelniacute vyacutetěžnosti k sledovanyacutem laacutetkaacutem


Imunoafinitniacute separace byla realizovaacutena přiacutedavkem sorbentu do 1 ml KVV Veškereacute parametry

imunoextrakce s použitiacutem afinitniacutech sorbentů pro prostaglandiny byly optimalizovaacuteny vzhledem

k ziacuteskaacuteniacute maximaacutelniacute vyacutetěžnosti separace

Typickyacute průběh imunoextrakce je znaacutezorněn na obraacutezku 14 (pro 8‐iso PGF2α obdobneacute byly

ziacuteskaacuteny i pro dalšiacute prostaglandiny) kde je zachycena zaacutevislost doby imunoextrakce na separovaneacutem

množstviacute Z grafu je zřejmeacute že s prodlužujiacuteciacutem se časem imunoextrakce dochaacuteziacute k naacuterůstu

separovaneacuteho množstviacute 8‐iso PGF2α z KVV nicmeacuteně naproti tomu dochaacuteziacute k rozkladu laacutetek v důsledku

negativniacuteho vlivu teploty (25 degC) na jejich stabilitu Po dosaženiacute maxima separovaneacuteho množstviacute v 60

minutě začiacutenaacute převažovat proces degradace

Obraacutezek 14 Stanoveniacute optimaacutelniacute doby imunoextrakce 8‐iso PGF2α

Nemeacuteně důležityacutem parametrem je poměr množstviacute imunoafinitniacuteho sorbentu k 8‐iso PGF2α

k objemu KVV (množstviacute 8‐iso PGF2α v KVV se v klinickyacutech vzorciacutech pohybuje v intervalu 10 ‐100 pg1 ml) Zaacutevislost množstviacute imunoextrakčně separovanyacutech 8‐iso PGF2α na jeho množstviacute

původně přiacutetomneacutem v KVV je zachyceno na obraacutezku 15 z něhož je zřejmeacute že uvedenaacute zaacutevislost maacute

charakter adsorpčniacute isotermy na ktereacute je možneacute formaacutelně vymezit dvě oblasti V prvniacute oblasti

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100 120 140

Čas imunoextrakce min

Relativniacute koncentrace

30

s lineaacuterniacute zaacutevislostiacute se s rostouciacutem množstviacutem biomarkerů v matrici zvyšuje i množstviacute vznikleacuteho

komplexu antigen‐protilaacutetka (zvětšenaacute pracovniacute oblast) zatiacutemco v druheacute nelineaacuterniacute oblasti

se vyskytuje velkeacute množstviacute 8‐iso PGF2α pro kteryacute neniacute přiacutetomneacute dostatečneacute množstviacute volnyacutech

protilaacutetek na povrchu sorbentu Z hlediska přesnosti metody bylo v klinickyacutech analyacutezaacutech použiacutevaacuteno

50 μl sorbentu což odpoviacutedaacute imunoextrakčniacute separaci probiacutehajiacuteciacute v lineaacuterniacute čaacutesti zaacutevislosti

Vazba antigen ndash protilaacutetka byla naacutesledně rozvolněna metanolem Ziacuteskanyacute vzorek 8‐iso PGF2α byl před naacutestřikem na systeacutem LC‐ESI‐MSMS upraven odpařeniacutem methanolu proudem dusiacuteku a

naacutesledně zbylyacute odparek byl naředěn 50 μl mobilniacute faacuteze Uvedenyacutem postupem bylo možneacute separovat

viacutece než 85 v klinickeacutem vzorku přiacutetomnyacutech 8‐iso PGF2α V tabulce 3 jsou uvedeny validačniacute hodnoty (limit detekce ndash LOD limit kvantifikace ndash LOQ spraacutevnost přesnost a vyacutetěžnost) pro imunoafinitniacute

extrakci prostaglandinů

Obraacutezek 15 Zaacutevislost množstviacute separovaneacuteho 8‐iso PGF2α na jeho přidaneacutem množstviacute

0

200

400

600

800

0 500 1000 1500 2000 2500

Detekovaneacute množstviacute

8-iso PGF2α pg

Přidaneacute množstviacute 8-iso PGF2α pg

y = 08683xR2 = 09986

0

50

100

150

200

250

300

0 50 100 150 200 250 300

31

Tabulka 3 Validačniacute parametry pro prostaglandiny pro imunoafinitniacute metodu

8‐iso PGF2α PGD2 PGE2

LOD (pgml KVV) 1 1 1

LOQ (pgml KVV) 5 6 5

Spraacutevnost RE () ‐160 ‐174 ‐185

Přesnost RSD () 95 107 115

Vyacutetěžnost () 84 82 85

533 Extrakce na pevneacute faacutezi ‐ SPE

Extrakce na pevneacute faacutezi byla provaacuteděna na koloně s C18 (oktadecylovou) kartridgiacute obsahujiacuteciacute

100 mg sorbentu na ktereacute byla testovaacutena separace 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 v množstviacute 10 až 2500 pg

a HNE MDA v množstviacute 750‐2500pgml Zaacutevislost vyextrahovaneacuteho množstviacute těchto laacutetek na

původniacutem množstviacute přiacutetomneacutem ve vzorku KVV byla na zvoleneacutem intervalu lineaacuterniacute Po zaktivovaacuteniacute

kolony (promytiacute 5 x 1ml methanolu a 3 x 1ml 005 M roztokem kyseliny mravenčiacute ve vodě) a naneseniacute

vzorku na kolonu byla řada laacutetek (hlavně soliacute) z matrice KVV vymyta 2 x 1ml vody Analyty byly

z kartridge eluovaacuteny methanolem (1ml) Dalšiacute eluce methanolu (frakce sbiacuteraneacute vždy po 1ml)

obsahovaly množstviacute sledovanyacutech laacutetek pod limitem detekce Před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou

byl methanolickyacute podiacutel odpařen proudem dusiacuteku dosucha a ziacuteskaneacute laacutetky naacutesledně byly rozpuštěny

v 50 μl mobilniacute faacuteze

Tabulka 4 Validačniacute parametry pro analyty pro extrakci na pevneacute faacutezi (SPE)

8‐iso PGF2α PGD2 PGE2 MDA HNE

LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26

LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39

Spraacutevnost RE () ‐93 ‐97 ‐95 ‐71 ‐75

Přesnost RSD () 106 117 125 76 84

Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918

54 Stabilita markerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu

Většina biomarkerů obsaženyacutech v KVV je znaacutema jako maacutelo stabilniacute laacutetky Primaacuterniacute snahou při

vyacutevoji metody pro stanoveniacute těchto laacutetek v KVV bylo postihnout jejich chovaacuteniacute v uvedeneacute biologickeacute

matrici a naleacutezt postup přiacutepravy vzorku vhodneacuteho pro hmotnostně‐spektrometrickou analyacutezu

umožňujiacuteciacute zachytit koncentraci analytů bezprostředně po odebraacuteniacute vzorku KVV (matrice s majoritniacutem podiacutelem vody) bezprostředně po odběru vykazuje hodnotu pH

v rozmeziacute 72 ‐ 77 Hodnota pH KVV se však v kraacutetkeacutem časoveacutem intervalu snižuje (pH = 60 ndash 65) jako

32

důsledek absorpce CO2 ze vzduchu což může byacutet jednou z přiacutečin změn ktereacute se v uvedeneacute matrici

odehraacutevajiacute po jejiacutem odebraacuteniacute Při uchovaacuteniacute KVV pod inertniacute atmosfeacuterou (argon) nebyla pozorovaacutena

změna pH nicmeacuteně v přiacutepadě sledovanyacutech analytů se tento parametr nejevil jako zaacutesadniacute Rovněž

nebyl prokaacutezaacuten vliv světla na jejich stabilitu Parametrem kteryacute vyacuteznamně ovlivňuje obsah těchto

biomarkerů je teplota

Jako zaacutesadniacute parametr ovlivňujiacuteciacute stabilitu 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 se ukaacutezal vliv teploty

Citlivost 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 k teplotě je nejviacutece patrnyacute u teplot nad 0degC (4degC a 25degC) jak

v mobilniacute faacutezi tak v matrici KVV kde jsou pravděpodobně rozklady laacutetek urychleny přiacutetomnostiacute

enzymů způsobujiacuteciacute jejich odbouraacutevaacuteniacute Uacutebytek prostaglandinů po 6 hodinaacutech se při teplotě 25degC

sniacutežil z původniacute koncentrace na 456plusmn 7 a při teplotě 4degC byl zaznamenaacuten uacutebytek na hodnotu

672plusmn49 původniacute koncentrace Z důvodu uskladněniacute byly testovaacuteny teploty ‐20 a ‐ 80degC

Teplota ‐ 20degC se ukaacutezala vhodnaacute jen pro kraacutetkodobějšiacute skladovaacuteniacute (po 30 dnech uacutebytek o

219 plusmn 46) zatiacutemco při ndash 80 degC je možneacute vzorky skladovat až 180 dnů (uacutebytek o 1236 plusmn 45)

Zlomovou teplotou pro stabilitu laacutetek je zřejmě převedeniacute vodneacute matrice z pevneacuteho do kapalneacuteho

stavu (teplota 0 degC) S ohledem na uvedenou skutečnost byl posuzovaacuten parametr bdquocyklus

rozmrazovaacuteniacute ‐ zmrazovaacuteniacuteldquo Při každeacutem obratu uvedeneacuteho cyklu dochaacuteziacute ke sniacuteženiacute množstviacute

prostaglandinů o 8‐9 z jejich původniacuteho množstviacute v KVV

Sledovaneacute aldehydy se oproti 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 dajiacute označit za stabilniacute laacutetky

v prostřediacute KVV (vodneacute prostřediacute s pH pohybujiacuteciacute se v intervalu 6‐8) a použiteacute mobilniacute faacuteze za

laboratorniacute teploty Při teplotě 25 degC v obou matriciacute byl po šesti dnech zaznamenaacuten uacutebytek MDA do

63 plusmn 21 a HNE do 114 plusmn 23 z původniacuteho množstviacute laacutetky ve vzorku Jako vhodnou skladovaciacute

teplotu lze použiacutet ‐ 20degC po dobu nepřesahujiacuteciacute jeden měsiacutec u obou laacutetek (rozpad 104 plusmn 35 laacutetek

po 3 měsiacuteciacutech skladovaacuteniacute okolo 303 plusmn 46 laacutetek) a teplotu ‐80 degC na dobu přesahujiacuteciacute i 90 dnů (po

90 dnech zaznamenaacuten uacutebytek 106 plusmn 21 MDA a 143 plusmn 36 HNE) Cyklus rozmrazeniacute‐zmrazeniacute se

vyacuterazněji nepromiacutetl do stability laacutetek (po pěti cyklech ubylo 91 plusmn 31 MDA a 134 plusmn 36 HNE)


Hladiny markerů oxidativniacuteho stresu jedinců s azbestovounebo silikoacutezou (120 jedinců s

diagnoacutezou azbestoacutezy nebo silikoacutezy věk 68 plusmn 8 průměrnaacute doba působeniacute azbestu nebo křemiacuteku 25 plusmn

6 let) byly srovnaacuteny s jedinci po expozici dioxiny (věk 69 + 5 let) a s kontrolniacute skupinou (103 jedinců

věk 65 plusmn 7 let) Mezi jednotlivyacutemi skupinami byly prokaacutezaacuteny statisticky vyacuteznamneacute rozdiacutely pro všechny

sledovaneacute biomarkery oxidativniacuteho stresu Hladina 8‐iso PGF2α byla pro pacienty s azbestovounebo silikoacutenovou expoziciacute 637 + 106 pgml KVV pro PGD2 55 + 115 pgml KVV pro PGE2 61 + 122 pgml

KVV pro MDA 31 + 06 ngml KVV a pro HNE 112 + 21 ngml KVV U osob s expoziciacute dioxinu byly

ziacuteskaacuteny naacutesledujiacuteciacute hodnoty pro 8‐iso PGF 2α 50 + 128 pgml KVV pro PGD2 72 + 114 pgml KVV pro

PGE2 85 + 78 pgml KVV pro MDA 40 + 05 ngml KVV a pro HNE 33 + 26 ngml U zdravyacutech jedinců

byly detekovaacuteny koncentrace pro 8‐iso PGF 2α pohybujiacuteciacute se v intervalu 376 + 136 pgml KVV pro

PGD2 21 + 14 pgml KVVpro PGE2 45 + 64 pgml KVV pro MDA 15 + 08 ngml KVV a HNE 66 + 16

ngml KVV

33

6 Zaacutevěr

Předklaacutedanaacute praacutece je orientovaacutena do oblasti medicinaacutelniacute diagnostiky a zabyacutevaacute se vyacutevojem metodiky stanoveniacute důležityacutech markerů plicniacutech onemocněniacute V raacutemci experimentaacutelniacute činnosti byla

vyvinuta metoda pro detekci a kvantifikaci prostaglandinu E2 a D2 8‐iso‐PGF2α 4‐hydroxynonenalu a malondialdehydu jako potenciaacutelniacutech biomarkerů plicniacutech onemocněniacute v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu Stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin v matrici KVV umožňuje neinvazivně monitorovat děje odehraacutevajiacuteciacute se bezprostředně v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech nezaacutevisle na procesech probiacutehajiacuteciacutech v celeacutem organismu jak je tomu při stanoveniacute těchto laacutetek v krevniacute plazmě nebo moči

Ačkoliv v nedaacutevneacute době byla vyvinuta řada metod pro jejich stanoveniacute v KVV a byla prokaacutezaacutena možnost diferenciaacutelniacute diagnostiky oxidativniacuteho stresu neexistuje do současnosti standardizovanyacute postup pro stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin

Princip vyvinuteacute metody spočiacutevaacute na kombinaci vhodneacute extrakčniacute techniky (SPE imunoseparace) s vysoce selektivniacute a přesnou detekčniacute metodou hmotnostniacute spektrometrie

Jako zvoleneacute extrakčniacute techniky byly použiacutevaacuteny imunoafinitniacute extrakce a extrakce na pevneacute faacutezi Jednotliveacute separačniacute techniky se lišiacute specifitou k daneacutemu analytu Nejvyššiacute selektivitou se vyznačuje imunoseparace založenaacute na reakci antigenu s přiacuteslušnou protilaacutetkou Při využitiacute SPE je daleko většiacute důraz kladen na samotnou analytickou metodu kterou zde byla kapalinovaacute

chromatografie spojenaacute s hmotnostniacutem spektrometrem Detekce 8‐iso PGF2α byla ještě ztiacutežena možnyacutem ovlivněniacutem vyacutesledku biologicky aktivniacutemi diastereomery přiacutetomnyacutemi v KVV Za použitiacute vhodneacute kolony a mobilniacute faacuteze se podařil i tento probleacutem uacutespěšně vyřešit

Vyvinutou analytickou metodu lze charakterizovat niacutezkyacutemi limity detekce a kvantifikace niacutezkou chybou stanoveniacute vysokou přesnostiacute a vysokou selektivitou

Vyvinutaacute metoda pro detekci biomarkerů v KVV byla testovaacutena na klinickyacutech vzorciacutech kde byla prokaacutezaacutena možnost použitiacute teacuteto metody v klinickeacute praxi Byl prokaacutezaacuten statisticky vyacuteznamnyacute rozdiacutel mezi korelaciacute hladiny biomarkerů a poškozeniacutem dyacutechaciacutech cest a plic Tuto metodu lze charakterizovat jako zcela neinvazivniacute pro diagnostiku oxidativniacuteho stresu

34

7 Seznam literatury

1 Scheideler L Manke HG Schwulera U Inacker O Hammerle H American Review

Respiratory Disease (1993) s 148 778

2 Montuschi P Barnes J P Trends in Pharmacological Sciences (2002) s 23 232

3 Čaacutep P Pehal F Petrů V Musil J Alergie (2001) s 3 275

4 Zakrzewski J T Barnes N C Costello J F Piper P J American Review Respiriratory

Disease (1987) s 136 779

5 Horvaacuteth I Hunt J Barnes P J European Respiratory Journal (2005) s 26 523

6 Syslovaacute K Vyacutevoj neinvazivniacute diagnostiky asthma bronchiale metodou kombinujiacuteciacute

immunoafinitniacute separaci s hmotnostně spektrometrickou detekciacute (2008)

7 Zwert L L Meermann J H N Commandeur N M Vermeulen N P E Free Radical Biology

and Medicine (1999) s 26 202

8 Babaev V R Ding L Reese J Morrow J D Breyer M D Dey S K Fazio S Linton MacRae

F Circulation (2006) s 113108

9 httparnikaorgdioxin (2722009)

httpwebujepcznicovaostatnihtm (2722009)

10 Reynolds HY Lung (2000) s 178 271

11 Holz O Kips J Magnussen H European Respiratory Journal (2000) s 16 355

12 Antczak A Montuschi P Kharitonov S A Gorski P Barnes P J American Journal of

Respiratory and Critical Care Medicine (2002) s 166 301

13 Baraldi E Carraro S Alinovi R Pesci A Ghiro L Bodini A Piacentini G Zacchello F

Zanconato S Thorax (2003) s 58 505

14 Gonzalez‐Reche L M Musiol A K Muumller‐Lux A Kraus T Gen TJ Occupat Med Tox 1

(2006) s 5

15 Biacutelkovaacute Z Mazurovaacute J Churaacuteček J Horaacutek D Turkovaacute J The Journal of Chromatography A

(1999) s 852 141

16 Hanazawa T Kharitonov S A Barnes P J American Journal of Respiratory and Critical

Care Medicine (2001) s 162 1175

2

Prohlašuji že jsem předloženou praacuteci vypracovala samostatně pod vedeniacutem Doc Ing Petra

Kačera PhD a Ing Kamily Sysloveacute a uvedla jsem veškerou použitou literaturu v seznamu

literatury

helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

Poděkovaacuteniacute Zde bych raacuteda poděkovala všem kteřiacute mi s vypracovaacuteniacutem praacutece jakyacutemkoli způsobem pomohli

Můj diacutek patřiacute na prvniacutem miacutestě Ing Kamile Sysloveacute a Doc Ing Petru Kačerovi PhD za vedeniacute

praacutece a všestrannou pomoc při jejiacutem zpracovaacuteniacute

Daacutele bych chtěla poděkovat prof Ing Liboru Červeneacutemu DrSc za možnost pracovat v jeho

kolektivu

Nemohu opominout RNDr Marii Pokornou organizaacutetorku školniacuteho kola kteraacute mi pomohla

s administrativniacutemi zaacuteležitostmi a RNDr Hanu Vokounovou mou učitelku chemie

3














4

Obsah












5

1 Seznam zkratek









6

2 Uacutevod
































3 T

31 K

311 S


vydechojež kores

(metaboidentifik

O


Teoretick

ondenzaacutet

Složeniacute KV





Obraacutezek 1 Sc

Z pmakap


kaacute čaacutest

t vydechov

VV




vaneacuteho vz



noveacute) pepti



7

zduchu (K

e 15‐25 m3




KVV)



y DNA ad

















cestaacutech

312 O


stanoven



vydecho

Ob


Odběr kond


ny vysokeacute






denzaacutetu vyd


koncentrace



eacutema kondenz


dechovaneacute


e biomarker


zaacutetoru pro od

8


ho vzduchu


rů (např le


běr KVV


u


eukotrieny







8‐iso Prosta



ležitou roli z



aglandin F2α



KVV Aby se

z hlediska



α ad) [4]


hladiacuteciacuteho


zamezilo

9



























PGD2 a PGE2

10

R

OOH

R

R O OOR O

R OOH

OH

OH

COOH

OH

CH2

NH2 COOH

OH

O

N

N

N

N

O

NH2

O

H

HOH

OH OH

ROS

8-hydroxy guanosin

H2O2



o - tyrosin





kyselin
























11


















12

OO

COOH

OOH

OO

COOH

OH

O

COOH

OH

OH

O

COOH

OHOH

O

OHOH

COOHOH

OH

COOH

OH

OO

OH

COOH

COOH

O

COOH

OH

COOH

OH

O

O

COOH

OH

Prostaglandin G2

Prostaglandin H2


Prostaglandin I2


Prostaglandin F2α

Thromboxan A2

COX

Prostaglandin A2

Prostaglandin B2

Prostaglandin J2

1

2

3

4

5

6 7

8

9


2 O2



13

3212 Isoprostany







COOH

COOH COOH COOH

COOHO O

COOHO O

COOH

O O COOH

O O

OO

COOH

OO

COOH

OO

COOH

OO

COOH

OO

COOHOOH

OO

COOH

OOH

OO

COOHOOH

OO

COOH

OOH

COOHOHOH

OH COOH

OH

OH

OH

COOHOHOH

OH COOH

OH

OH

OH

O2

O2O2

O2

O2O2

O2 O2


ROSROS

[H]

[H]

[H]

[H]

VI IV


14











R

OOH

R

R O

OO

R O

R O

OH

R

OOHO

RO

OH

R

OOH

O

R O

RR

R

O

R

R

O

RR R

O


malondialdehyde

n-aldehydy



alk-2en-1-al






15






O

O Cl

ClCl

Cl





Cl

Cl

OO

Cl

Cl O

OCl

Cl

Cl

Cl+ +

oxidace

TCDD

2 2 H2O+




16






17







3311 Imunoseparace



18












19







20





































USA)

21













‐80 degC












22












faacuteze


















000 70 30 1000 70 30 2500 5 95 5500 5 95 6000 70 30 7000 70 30

23



(mz rarr mz) (eV)























24







25





SPEImunoseparace

Odběr KVV


Separace HNE MDA



Diagnoacuteza



SPE



26

51 Odběr KVV




















53 HPLCMS metoda












27

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH


8-iso PGF2 α

PGF2 β




28

OH

O

OH

COOH

O

OH

OH

COOH











29

























0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100 120 140



30











0

200

400

600

800

0 500 1000 1500 2000 2500


8-iso PGF2α pg


y = 08683xR2 = 09986

0

50

100

150

200

250

300

0 50 100 150 200 250 300

31





















LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26

LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39


Přesnost RSD () 106 117 125 76 84

Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918







32





































ngml KVV

33

6 Zaacutevěr









34

7 Seznam literatury






Disease (1987) s 136 779

















(2006) s 5


(1999) s 852 141



3














4

Obsah












5

1 Seznam zkratek









6

2 Uacutevod
































3 T

31 K

311 S


vydechojež kores

(metaboidentifik

O


Teoretick

ondenzaacutet

Složeniacute KV





Obraacutezek 1 Sc

Z pmakap


kaacute čaacutest

t vydechov

VV




vaneacuteho vz



noveacute) pepti



7

zduchu (K

e 15‐25 m3




KVV)



y DNA ad

















cestaacutech

312 O


stanoven



vydecho

Ob


Odběr kond


ny vysokeacute






denzaacutetu vyd


koncentrace



eacutema kondenz


dechovaneacute


e biomarker


zaacutetoru pro od

8


ho vzduchu


rů (např le


běr KVV


u


eukotrieny







8‐iso Prosta



ležitou roli z



aglandin F2α



KVV Aby se

z hlediska



α ad) [4]


hladiacuteciacuteho


zamezilo

9



























PGD2 a PGE2

10

R

OOH

R

R O OOR O

R OOH

OH

OH

COOH

OH

CH2

NH2 COOH

OH

O

N

N

N

N

O

NH2

O

H

HOH

OH OH

ROS

8-hydroxy guanosin

H2O2



o - tyrosin





kyselin
























11


















12

OO

COOH

OOH

OO

COOH

OH

O

COOH

OH

OH

O

COOH

OHOH

O

OHOH

COOHOH

OH

COOH

OH

OO

OH

COOH

COOH

O

COOH

OH

COOH

OH

O

O

COOH

OH

Prostaglandin G2

Prostaglandin H2


Prostaglandin I2


Prostaglandin F2α

Thromboxan A2

COX

Prostaglandin A2

Prostaglandin B2

Prostaglandin J2

1

2

3

4

5

6 7

8

9


2 O2



13

3212 Isoprostany







COOH

COOH COOH COOH

COOHO O

COOHO O

COOH

O O COOH

O O

OO

COOH

OO

COOH

OO

COOH

OO

COOH

OO

COOHOOH

OO

COOH

OOH

OO

COOHOOH

OO

COOH

OOH

COOHOHOH

OH COOH

OH

OH

OH

COOHOHOH

OH COOH

OH

OH

OH

O2

O2O2

O2

O2O2

O2 O2


ROSROS

[H]

[H]

[H]

[H]

VI IV


14











R

OOH

R

R O

OO

R O

R O

OH

R

OOHO

RO

OH

R

OOH

O

R O

RR

R

O

R

R

O

RR R

O


malondialdehyde

n-aldehydy



alk-2en-1-al






15






O

O Cl

ClCl

Cl





Cl

Cl

OO

Cl

Cl O

OCl

Cl

Cl

Cl+ +

oxidace

TCDD

2 2 H2O+




16






17







3311 Imunoseparace



18












19







20





































USA)

21













‐80 degC












22












faacuteze


















000 70 30 1000 70 30 2500 5 95 5500 5 95 6000 70 30 7000 70 30

23



(mz rarr mz) (eV)























24







25





SPEImunoseparace

Odběr KVV


Separace HNE MDA



Diagnoacuteza



SPE



26

51 Odběr KVV




















53 HPLCMS metoda












27

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH


8-iso PGF2 α

PGF2 β




28

OH

O

OH

COOH

O

OH

OH

COOH











29

























0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100 120 140



30











0

200

400

600

800

0 500 1000 1500 2000 2500


8-iso PGF2α pg


y = 08683xR2 = 09986

0

50

100

150

200

250

300

0 50 100 150 200 250 300

31





















LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26

LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39


Přesnost RSD () 106 117 125 76 84

Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918







32





































ngml KVV

33

6 Zaacutevěr









34

7 Seznam literatury






Disease (1987) s 136 779

















(2006) s 5


(1999) s 852 141



4

Obsah












5

1 Seznam zkratek









6

2 Uacutevod
































3 T

31 K

311 S


vydechojež kores

(metaboidentifik

O


Teoretick

ondenzaacutet

Složeniacute KV





Obraacutezek 1 Sc

Z pmakap


kaacute čaacutest

t vydechov

VV




vaneacuteho vz



noveacute) pepti



7

zduchu (K

e 15‐25 m3




KVV)



y DNA ad

















cestaacutech

312 O


stanoven



vydecho

Ob


Odběr kond


ny vysokeacute






denzaacutetu vyd


koncentrace



eacutema kondenz


dechovaneacute


e biomarker


zaacutetoru pro od

8


ho vzduchu


rů (např le


běr KVV


u


eukotrieny







8‐iso Prosta



ležitou roli z



aglandin F2α



KVV Aby se

z hlediska



α ad) [4]


hladiacuteciacuteho


zamezilo

9



























PGD2 a PGE2

10

R

OOH

R

R O OOR O

R OOH

OH

OH

COOH

OH

CH2

NH2 COOH

OH

O

N

N

N

N

O

NH2

O

H

HOH

OH OH

ROS

8-hydroxy guanosin

H2O2



o - tyrosin





kyselin
























11


















12

OO

COOH

OOH

OO

COOH

OH

O

COOH

OH

OH

O

COOH

OHOH

O

OHOH

COOHOH

OH

COOH

OH

OO

OH

COOH

COOH

O

COOH

OH

COOH

OH

O

O

COOH

OH

Prostaglandin G2

Prostaglandin H2


Prostaglandin I2


Prostaglandin F2α

Thromboxan A2

COX

Prostaglandin A2

Prostaglandin B2

Prostaglandin J2

1

2

3

4

5

6 7

8

9


2 O2



13

3212 Isoprostany







COOH

COOH COOH COOH

COOHO O

COOHO O

COOH

O O COOH

O O

OO

COOH

OO

COOH

OO

COOH

OO

COOH

OO

COOHOOH

OO

COOH

OOH

OO

COOHOOH

OO

COOH

OOH

COOHOHOH

OH COOH

OH

OH

OH

COOHOHOH

OH COOH

OH

OH

OH

O2

O2O2

O2

O2O2

O2 O2


ROSROS

[H]

[H]

[H]

[H]

VI IV


14











R

OOH

R

R O

OO

R O

R O

OH

R

OOHO

RO

OH

R

OOH

O

R O

RR

R

O

R

R

O

RR R

O


malondialdehyde

n-aldehydy



alk-2en-1-al






15






O

O Cl

ClCl

Cl





Cl

Cl

OO

Cl

Cl O

OCl

Cl

Cl

Cl+ +

oxidace

TCDD

2 2 H2O+




16






17







3311 Imunoseparace



18












19







20





































USA)

21













‐80 degC












22












faacuteze


















000 70 30 1000 70 30 2500 5 95 5500 5 95 6000 70 30 7000 70 30

23



(mz rarr mz) (eV)























24







25





SPEImunoseparace

Odběr KVV


Separace HNE MDA



Diagnoacuteza



SPE



26

51 Odběr KVV




















53 HPLCMS metoda












27

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH


8-iso PGF2 α

PGF2 β




28

OH

O

OH

COOH

O

OH

OH

COOH











29

























0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100 120 140



30











0

200

400

600

800

0 500 1000 1500 2000 2500


8-iso PGF2α pg


y = 08683xR2 = 09986

0

50

100

150

200

250

300

0 50 100 150 200 250 300

31





















LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26

LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39


Přesnost RSD () 106 117 125 76 84

Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918







32





































ngml KVV

33

6 Zaacutevěr









34

7 Seznam literatury






Disease (1987) s 136 779

















(2006) s 5


(1999) s 852 141



5

1 Seznam zkratek









6

2 Uacutevod
































3 T

31 K

311 S


vydechojež kores

(metaboidentifik

O


Teoretick

ondenzaacutet

Složeniacute KV





Obraacutezek 1 Sc

Z pmakap


kaacute čaacutest

t vydechov

VV




vaneacuteho vz



noveacute) pepti



7

zduchu (K

e 15‐25 m3




KVV)



y DNA ad

















cestaacutech

312 O


stanoven



vydecho

Ob


Odběr kond


ny vysokeacute






denzaacutetu vyd


koncentrace



eacutema kondenz


dechovaneacute


e biomarker


zaacutetoru pro od

8


ho vzduchu


rů (např le


běr KVV


u


eukotrieny







8‐iso Prosta



ležitou roli z



aglandin F2α



KVV Aby se

z hlediska



α ad) [4]


hladiacuteciacuteho


zamezilo

9



























PGD2 a PGE2

10

R

OOH

R

R O OOR O

R OOH

OH

OH

COOH

OH

CH2

NH2 COOH

OH

O

N

N

N

N

O

NH2

O

H

HOH

OH OH

ROS

8-hydroxy guanosin

H2O2



o - tyrosin





kyselin
























11


















12

OO

COOH

OOH

OO

COOH

OH

O

COOH

OH

OH

O

COOH

OHOH

O

OHOH

COOHOH

OH

COOH

OH

OO

OH

COOH

COOH

O

COOH

OH

COOH

OH

O

O

COOH

OH

Prostaglandin G2

Prostaglandin H2


Prostaglandin I2


Prostaglandin F2α

Thromboxan A2

COX

Prostaglandin A2

Prostaglandin B2

Prostaglandin J2

1

2

3

4

5

6 7

8

9


2 O2



13

3212 Isoprostany







COOH

COOH COOH COOH

COOHO O

COOHO O

COOH

O O COOH

O O

OO

COOH

OO

COOH

OO

COOH

OO

COOH

OO

COOHOOH

OO

COOH

OOH

OO

COOHOOH

OO

COOH

OOH

COOHOHOH

OH COOH

OH

OH

OH

COOHOHOH

OH COOH

OH

OH

OH

O2

O2O2

O2

O2O2

O2 O2


ROSROS

[H]

[H]

[H]

[H]

VI IV


14











R

OOH

R

R O

OO

R O

R O

OH

R

OOHO

RO

OH

R

OOH

O

R O

RR

R

O

R

R

O

RR R

O


malondialdehyde

n-aldehydy



alk-2en-1-al






15






O

O Cl

ClCl

Cl





Cl

Cl

OO

Cl

Cl O

OCl

Cl

Cl

Cl+ +

oxidace

TCDD

2 2 H2O+




16






17







3311 Imunoseparace



18












19







20





































USA)

21













‐80 degC












22












faacuteze


















000 70 30 1000 70 30 2500 5 95 5500 5 95 6000 70 30 7000 70 30

23



(mz rarr mz) (eV)























24







25





SPEImunoseparace

Odběr KVV


Separace HNE MDA



Diagnoacuteza



SPE



26

51 Odběr KVV




















53 HPLCMS metoda












27

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH


8-iso PGF2 α

PGF2 β




28

OH

O

OH

COOH

O

OH

OH

COOH











29

























0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100 120 140



30











0

200

400

600

800

0 500 1000 1500 2000 2500


8-iso PGF2α pg


y = 08683xR2 = 09986

0

50

100

150

200

250

300

0 50 100 150 200 250 300

31





















LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26

LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39


Přesnost RSD () 106 117 125 76 84

Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918







32





































ngml KVV

33

6 Zaacutevěr









34

7 Seznam literatury






Disease (1987) s 136 779

















(2006) s 5


(1999) s 852 141



6

2 Uacutevod
































3 T

31 K

311 S


vydechojež kores

(metaboidentifik

O


Teoretick

ondenzaacutet

Složeniacute KV





Obraacutezek 1 Sc

Z pmakap


kaacute čaacutest

t vydechov

VV




vaneacuteho vz



noveacute) pepti



7

zduchu (K

e 15‐25 m3




KVV)



y DNA ad

















cestaacutech

312 O


stanoven



vydecho

Ob


Odběr kond


ny vysokeacute






denzaacutetu vyd


koncentrace



eacutema kondenz


dechovaneacute


e biomarker


zaacutetoru pro od

8


ho vzduchu


rů (např le


běr KVV


u


eukotrieny







8‐iso Prosta



ležitou roli z



aglandin F2α



KVV Aby se

z hlediska



α ad) [4]


hladiacuteciacuteho


zamezilo

9



























PGD2 a PGE2

10

R

OOH

R

R O OOR O

R OOH

OH

OH

COOH

OH

CH2

NH2 COOH

OH

O

N

N

N

N

O

NH2

O

H

HOH

OH OH

ROS

8-hydroxy guanosin

H2O2



o - tyrosin





kyselin
























11


















12

OO

COOH

OOH

OO

COOH

OH

O

COOH

OH

OH

O

COOH

OHOH

O

OHOH

COOHOH

OH

COOH

OH

OO

OH

COOH

COOH

O

COOH

OH

COOH

OH

O

O

COOH

OH

Prostaglandin G2

Prostaglandin H2


Prostaglandin I2


Prostaglandin F2α

Thromboxan A2

COX

Prostaglandin A2

Prostaglandin B2

Prostaglandin J2

1

2

3

4

5

6 7

8

9


2 O2



13

3212 Isoprostany







COOH

COOH COOH COOH

COOHO O

COOHO O

COOH

O O COOH

O O

OO

COOH

OO

COOH

OO

COOH

OO

COOH

OO

COOHOOH

OO

COOH

OOH

OO

COOHOOH

OO

COOH

OOH

COOHOHOH

OH COOH

OH

OH

OH

COOHOHOH

OH COOH

OH

OH

OH

O2

O2O2

O2

O2O2

O2 O2


ROSROS

[H]

[H]

[H]

[H]

VI IV


14











R

OOH

R

R O

OO

R O

R O

OH

R

OOHO

RO

OH

R

OOH

O

R O

RR

R

O

R

R

O

RR R

O


malondialdehyde

n-aldehydy



alk-2en-1-al






15






O

O Cl

ClCl

Cl





Cl

Cl

OO

Cl

Cl O

OCl

Cl

Cl

Cl+ +

oxidace

TCDD

2 2 H2O+




16






17







3311 Imunoseparace



18












19







20





































USA)

21













‐80 degC












22












faacuteze


















000 70 30 1000 70 30 2500 5 95 5500 5 95 6000 70 30 7000 70 30

23



(mz rarr mz) (eV)























24







25





SPEImunoseparace

Odběr KVV


Separace HNE MDA



Diagnoacuteza



SPE



26

51 Odběr KVV




















53 HPLCMS metoda












27

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH


8-iso PGF2 α

PGF2 β




28

OH

O

OH

COOH

O

OH

OH

COOH











29

























0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100 120 140



30











0

200

400

600

800

0 500 1000 1500 2000 2500


8-iso PGF2α pg


y = 08683xR2 = 09986

0

50

100

150

200

250

300

0 50 100 150 200 250 300

31





















LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26

LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39


Přesnost RSD () 106 117 125 76 84

Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918







32





































ngml KVV

33

6 Zaacutevěr









34

7 Seznam literatury






Disease (1987) s 136 779

















(2006) s 5


(1999) s 852 141



3 T

31 K

311 S


vydechojež kores

(metaboidentifik

O


Teoretick

ondenzaacutet

Složeniacute KV





Obraacutezek 1 Sc

Z pmakap


kaacute čaacutest

t vydechov

VV




vaneacuteho vz



noveacute) pepti



7

zduchu (K

e 15‐25 m3




KVV)



y DNA ad

















cestaacutech

312 O


stanoven



vydecho

Ob


Odběr kond


ny vysokeacute






denzaacutetu vyd


koncentrace



eacutema kondenz


dechovaneacute


e biomarker


zaacutetoru pro od

8


ho vzduchu


rů (např le


běr KVV


u


eukotrieny







8‐iso Prosta



ležitou roli z



aglandin F2α



KVV Aby se

z hlediska



α ad) [4]


hladiacuteciacuteho


zamezilo

9



























PGD2 a PGE2

10

R

OOH

R

R O OOR O

R OOH

OH

OH

COOH

OH

CH2

NH2 COOH

OH

O

N

N

N

N

O

NH2

O

H

HOH

OH OH

ROS

8-hydroxy guanosin

H2O2



o - tyrosin





kyselin
























11


















12

OO

COOH

OOH

OO

COOH

OH

O

COOH

OH

OH

O

COOH

OHOH

O

OHOH

COOHOH

OH

COOH

OH

OO

OH

COOH

COOH

O

COOH

OH

COOH

OH

O

O

COOH

OH

Prostaglandin G2

Prostaglandin H2


Prostaglandin I2


Prostaglandin F2α

Thromboxan A2

COX

Prostaglandin A2

Prostaglandin B2

Prostaglandin J2

1

2

3

4

5

6 7

8

9


2 O2



13

3212 Isoprostany







COOH

COOH COOH COOH

COOHO O

COOHO O

COOH

O O COOH

O O

OO

COOH

OO

COOH

OO

COOH

OO

COOH

OO

COOHOOH

OO

COOH

OOH

OO

COOHOOH

OO

COOH

OOH

COOHOHOH

OH COOH

OH

OH

OH

COOHOHOH

OH COOH

OH

OH

OH

O2

O2O2

O2

O2O2

O2 O2


ROSROS

[H]

[H]

[H]

[H]

VI IV


14











R

OOH

R

R O

OO

R O

R O

OH

R

OOHO

RO

OH

R

OOH

O

R O

RR

R

O

R

R

O

RR R

O


malondialdehyde

n-aldehydy



alk-2en-1-al






15






O

O Cl

ClCl

Cl





Cl

Cl

OO

Cl

Cl O

OCl

Cl

Cl

Cl+ +

oxidace

TCDD

2 2 H2O+




16






17







3311 Imunoseparace



18












19







20





































USA)

21













‐80 degC












22












faacuteze


















000 70 30 1000 70 30 2500 5 95 5500 5 95 6000 70 30 7000 70 30

23



(mz rarr mz) (eV)























24







25





SPEImunoseparace

Odběr KVV


Separace HNE MDA



Diagnoacuteza



SPE



26

51 Odběr KVV




















53 HPLCMS metoda












27

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH


8-iso PGF2 α

PGF2 β




28

OH

O

OH

COOH

O

OH

OH

COOH











29

























0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100 120 140



30











0

200

400

600

800

0 500 1000 1500 2000 2500


8-iso PGF2α pg


y = 08683xR2 = 09986

0

50

100

150

200

250

300

0 50 100 150 200 250 300

31





















LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26

LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39


Přesnost RSD () 106 117 125 76 84

Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918







32





































ngml KVV

33

6 Zaacutevěr









34

7 Seznam literatury






Disease (1987) s 136 779

















(2006) s 5


(1999) s 852 141




cestaacutech

312 O


stanoven



vydecho

Ob


Odběr kond


ny vysokeacute






denzaacutetu vyd


koncentrace



eacutema kondenz


dechovaneacute


e biomarker


zaacutetoru pro od

8


ho vzduchu


rů (např le


běr KVV


u


eukotrieny







8‐iso Prosta



ležitou roli z



aglandin F2α



KVV Aby se

z hlediska



α ad) [4]


hladiacuteciacuteho


zamezilo

9



























PGD2 a PGE2

10

R

OOH

R

R O OOR O

R OOH

OH

OH

COOH

OH

CH2

NH2 COOH

OH

O

N

N

N

N

O

NH2

O

H

HOH

OH OH

ROS

8-hydroxy guanosin

H2O2



o - tyrosin





kyselin
























11


















12

OO

COOH

OOH

OO

COOH

OH

O

COOH

OH

OH

O

COOH

OHOH

O

OHOH

COOHOH

OH

COOH

OH

OO

OH

COOH

COOH

O

COOH

OH

COOH

OH

O

O

COOH

OH

Prostaglandin G2

Prostaglandin H2


Prostaglandin I2


Prostaglandin F2α

Thromboxan A2

COX

Prostaglandin A2

Prostaglandin B2

Prostaglandin J2

1

2

3

4

5

6 7

8

9


2 O2



13

3212 Isoprostany







COOH

COOH COOH COOH

COOHO O

COOHO O

COOH

O O COOH

O O

OO

COOH

OO

COOH

OO

COOH

OO

COOH

OO

COOHOOH

OO

COOH

OOH

OO

COOHOOH

OO

COOH

OOH

COOHOHOH

OH COOH

OH

OH

OH

COOHOHOH

OH COOH

OH

OH

OH

O2

O2O2

O2

O2O2

O2 O2


ROSROS

[H]

[H]

[H]

[H]

VI IV


14











R

OOH

R

R O

OO

R O

R O

OH

R

OOHO

RO

OH

R

OOH

O

R O

RR

R

O

R

R

O

RR R

O


malondialdehyde

n-aldehydy



alk-2en-1-al






15






O

O Cl

ClCl

Cl





Cl

Cl

OO

Cl

Cl O

OCl

Cl

Cl

Cl+ +

oxidace

TCDD

2 2 H2O+




16






17







3311 Imunoseparace



18












19







20





































USA)

21













‐80 degC












22












faacuteze


















000 70 30 1000 70 30 2500 5 95 5500 5 95 6000 70 30 7000 70 30

23



(mz rarr mz) (eV)























24







25





SPEImunoseparace

Odběr KVV


Separace HNE MDA



Diagnoacuteza



SPE



26

51 Odběr KVV




















53 HPLCMS metoda












27

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH


8-iso PGF2 α

PGF2 β




28

OH

O

OH

COOH

O

OH

OH

COOH











29

























0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100 120 140



30











0

200

400

600

800

0 500 1000 1500 2000 2500


8-iso PGF2α pg


y = 08683xR2 = 09986

0

50

100

150

200

250

300

0 50 100 150 200 250 300

31





















LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26

LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39


Přesnost RSD () 106 117 125 76 84

Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918







32





































ngml KVV

33

6 Zaacutevěr









34

7 Seznam literatury






Disease (1987) s 136 779

















(2006) s 5


(1999) s 852 141



9



























PGD2 a PGE2

10

R

OOH

R

R O OOR O

R OOH

OH

OH

COOH

OH

CH2

NH2 COOH

OH

O

N

N

N

N

O

NH2

O

H

HOH

OH OH

ROS

8-hydroxy guanosin

H2O2



o - tyrosin





kyselin
























11


















12

OO

COOH

OOH

OO

COOH

OH

O

COOH

OH

OH

O

COOH

OHOH

O

OHOH

COOHOH

OH

COOH

OH

OO

OH

COOH

COOH

O

COOH

OH

COOH

OH

O

O

COOH

OH

Prostaglandin G2

Prostaglandin H2


Prostaglandin I2


Prostaglandin F2α

Thromboxan A2

COX

Prostaglandin A2

Prostaglandin B2

Prostaglandin J2

1

2

3

4

5

6 7

8

9


2 O2



13

3212 Isoprostany







COOH

COOH COOH COOH

COOHO O

COOHO O

COOH

O O COOH

O O

OO

COOH

OO

COOH

OO

COOH

OO

COOH

OO

COOHOOH

OO

COOH

OOH

OO

COOHOOH

OO

COOH

OOH

COOHOHOH

OH COOH

OH

OH

OH

COOHOHOH

OH COOH

OH

OH

OH

O2

O2O2

O2

O2O2

O2 O2


ROSROS

[H]

[H]

[H]

[H]

VI IV


14











R

OOH

R

R O

OO

R O

R O

OH

R

OOHO

RO

OH

R

OOH

O

R O

RR

R

O

R

R

O

RR R

O


malondialdehyde

n-aldehydy



alk-2en-1-al






15






O

O Cl

ClCl

Cl





Cl

Cl

OO

Cl

Cl O

OCl

Cl

Cl

Cl+ +

oxidace

TCDD

2 2 H2O+




16






17







3311 Imunoseparace



18












19







20





































USA)

21













‐80 degC












22












faacuteze


















000 70 30 1000 70 30 2500 5 95 5500 5 95 6000 70 30 7000 70 30

23



(mz rarr mz) (eV)























24







25





SPEImunoseparace

Odběr KVV


Separace HNE MDA



Diagnoacuteza



SPE



26

51 Odběr KVV




















53 HPLCMS metoda












27

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH


8-iso PGF2 α

PGF2 β




28

OH

O

OH

COOH

O

OH

OH

COOH











29

























0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100 120 140



30











0

200

400

600

800

0 500 1000 1500 2000 2500


8-iso PGF2α pg


y = 08683xR2 = 09986

0

50

100

150

200

250

300

0 50 100 150 200 250 300

31





















LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26

LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39


Přesnost RSD () 106 117 125 76 84

Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918







32





































ngml KVV

33

6 Zaacutevěr









34

7 Seznam literatury






Disease (1987) s 136 779

















(2006) s 5


(1999) s 852 141



10

R

OOH

R

R O OOR O

R OOH

OH

OH

COOH

OH

CH2

NH2 COOH

OH

O

N

N

N

N

O

NH2

O

H

HOH

OH OH

ROS

8-hydroxy guanosin

H2O2



o - tyrosin





kyselin
























11


















12

OO

COOH

OOH

OO

COOH

OH

O

COOH

OH

OH

O

COOH

OHOH

O

OHOH

COOHOH

OH

COOH

OH

OO

OH

COOH

COOH

O

COOH

OH

COOH

OH

O

O

COOH

OH

Prostaglandin G2

Prostaglandin H2


Prostaglandin I2


Prostaglandin F2α

Thromboxan A2

COX

Prostaglandin A2

Prostaglandin B2

Prostaglandin J2

1

2

3

4

5

6 7

8

9


2 O2



13

3212 Isoprostany







COOH

COOH COOH COOH

COOHO O

COOHO O

COOH

O O COOH

O O

OO

COOH

OO

COOH

OO

COOH

OO

COOH

OO

COOHOOH

OO

COOH

OOH

OO

COOHOOH

OO

COOH

OOH

COOHOHOH

OH COOH

OH

OH

OH

COOHOHOH

OH COOH

OH

OH

OH

O2

O2O2

O2

O2O2

O2 O2


ROSROS

[H]

[H]

[H]

[H]

VI IV


14











R

OOH

R

R O

OO

R O

R O

OH

R

OOHO

RO

OH

R

OOH

O

R O

RR

R

O

R

R

O

RR R

O


malondialdehyde

n-aldehydy



alk-2en-1-al






15






O

O Cl

ClCl

Cl





Cl

Cl

OO

Cl

Cl O

OCl

Cl

Cl

Cl+ +

oxidace

TCDD

2 2 H2O+




16






17







3311 Imunoseparace



18












19







20





































USA)

21













‐80 degC












22












faacuteze


















000 70 30 1000 70 30 2500 5 95 5500 5 95 6000 70 30 7000 70 30

23



(mz rarr mz) (eV)























24







25





SPEImunoseparace

Odběr KVV


Separace HNE MDA



Diagnoacuteza



SPE



26

51 Odběr KVV




















53 HPLCMS metoda












27

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH


8-iso PGF2 α

PGF2 β




28

OH

O

OH

COOH

O

OH

OH

COOH











29

























0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100 120 140



30











0

200

400

600

800

0 500 1000 1500 2000 2500


8-iso PGF2α pg


y = 08683xR2 = 09986

0

50

100

150

200

250

300

0 50 100 150 200 250 300

31





















LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26

LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39


Přesnost RSD () 106 117 125 76 84

Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918







32





































ngml KVV

33

6 Zaacutevěr









34

7 Seznam literatury






Disease (1987) s 136 779

















(2006) s 5


(1999) s 852 141



11


















12

OO

COOH

OOH

OO

COOH

OH

O

COOH

OH

OH

O

COOH

OHOH

O

OHOH

COOHOH

OH

COOH

OH

OO

OH

COOH

COOH

O

COOH

OH

COOH

OH

O

O

COOH

OH

Prostaglandin G2

Prostaglandin H2


Prostaglandin I2


Prostaglandin F2α

Thromboxan A2

COX

Prostaglandin A2

Prostaglandin B2

Prostaglandin J2

1

2

3

4

5

6 7

8

9


2 O2



13

3212 Isoprostany







COOH

COOH COOH COOH

COOHO O

COOHO O

COOH

O O COOH

O O

OO

COOH

OO

COOH

OO

COOH

OO

COOH

OO

COOHOOH

OO

COOH

OOH

OO

COOHOOH

OO

COOH

OOH

COOHOHOH

OH COOH

OH

OH

OH

COOHOHOH

OH COOH

OH

OH

OH

O2

O2O2

O2

O2O2

O2 O2


ROSROS

[H]

[H]

[H]

[H]

VI IV


14











R

OOH

R

R O

OO

R O

R O

OH

R

OOHO

RO

OH

R

OOH

O

R O

RR

R

O

R

R

O

RR R

O


malondialdehyde

n-aldehydy



alk-2en-1-al






15






O

O Cl

ClCl

Cl





Cl

Cl

OO

Cl

Cl O

OCl

Cl

Cl

Cl+ +

oxidace

TCDD

2 2 H2O+




16






17







3311 Imunoseparace



18












19







20





































USA)

21













‐80 degC












22












faacuteze


















000 70 30 1000 70 30 2500 5 95 5500 5 95 6000 70 30 7000 70 30

23



(mz rarr mz) (eV)























24







25





SPEImunoseparace

Odběr KVV


Separace HNE MDA



Diagnoacuteza



SPE



26

51 Odběr KVV




















53 HPLCMS metoda












27

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH


8-iso PGF2 α

PGF2 β




28

OH

O

OH

COOH

O

OH

OH

COOH











29

























0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100 120 140



30











0

200

400

600

800

0 500 1000 1500 2000 2500


8-iso PGF2α pg


y = 08683xR2 = 09986

0

50

100

150

200

250

300

0 50 100 150 200 250 300

31





















LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26

LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39


Přesnost RSD () 106 117 125 76 84

Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918







32





































ngml KVV

33

6 Zaacutevěr









34

7 Seznam literatury






Disease (1987) s 136 779

















(2006) s 5


(1999) s 852 141



12

OO

COOH

OOH

OO

COOH

OH

O

COOH

OH

OH

O

COOH

OHOH

O

OHOH

COOHOH

OH

COOH

OH

OO

OH

COOH

COOH

O

COOH

OH

COOH

OH

O

O

COOH

OH

Prostaglandin G2

Prostaglandin H2


Prostaglandin I2


Prostaglandin F2α

Thromboxan A2

COX

Prostaglandin A2

Prostaglandin B2

Prostaglandin J2

1

2

3

4

5

6 7

8

9


2 O2



13

3212 Isoprostany







COOH

COOH COOH COOH

COOHO O

COOHO O

COOH

O O COOH

O O

OO

COOH

OO

COOH

OO

COOH

OO

COOH

OO

COOHOOH

OO

COOH

OOH

OO

COOHOOH

OO

COOH

OOH

COOHOHOH

OH COOH

OH

OH

OH

COOHOHOH

OH COOH

OH

OH

OH

O2

O2O2

O2

O2O2

O2 O2


ROSROS

[H]

[H]

[H]

[H]

VI IV


14











R

OOH

R

R O

OO

R O

R O

OH

R

OOHO

RO

OH

R

OOH

O

R O

RR

R

O

R

R

O

RR R

O


malondialdehyde

n-aldehydy



alk-2en-1-al






15






O

O Cl

ClCl

Cl





Cl

Cl

OO

Cl

Cl O

OCl

Cl

Cl

Cl+ +

oxidace

TCDD

2 2 H2O+




16






17







3311 Imunoseparace



18












19







20





































USA)

21













‐80 degC












22












faacuteze


















000 70 30 1000 70 30 2500 5 95 5500 5 95 6000 70 30 7000 70 30

23



(mz rarr mz) (eV)























24







25





SPEImunoseparace

Odběr KVV


Separace HNE MDA



Diagnoacuteza



SPE



26

51 Odběr KVV




















53 HPLCMS metoda












27

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH


8-iso PGF2 α

PGF2 β




28

OH

O

OH

COOH

O

OH

OH

COOH











29

























0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100 120 140



30











0

200

400

600

800

0 500 1000 1500 2000 2500


8-iso PGF2α pg


y = 08683xR2 = 09986

0

50

100

150

200

250

300

0 50 100 150 200 250 300

31





















LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26

LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39


Přesnost RSD () 106 117 125 76 84

Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918







32





































ngml KVV

33

6 Zaacutevěr









34

7 Seznam literatury






Disease (1987) s 136 779

















(2006) s 5


(1999) s 852 141



13

3212 Isoprostany







COOH

COOH COOH COOH

COOHO O

COOHO O

COOH

O O COOH

O O

OO

COOH

OO

COOH

OO

COOH

OO

COOH

OO

COOHOOH

OO

COOH

OOH

OO

COOHOOH

OO

COOH

OOH

COOHOHOH

OH COOH

OH

OH

OH

COOHOHOH

OH COOH

OH

OH

OH

O2

O2O2

O2

O2O2

O2 O2


ROSROS

[H]

[H]

[H]

[H]

VI IV


14











R

OOH

R

R O

OO

R O

R O

OH

R

OOHO

RO

OH

R

OOH

O

R O

RR

R

O

R

R

O

RR R

O


malondialdehyde

n-aldehydy



alk-2en-1-al






15






O

O Cl

ClCl

Cl





Cl

Cl

OO

Cl

Cl O

OCl

Cl

Cl

Cl+ +

oxidace

TCDD

2 2 H2O+




16






17







3311 Imunoseparace



18












19







20





































USA)

21













‐80 degC












22












faacuteze


















000 70 30 1000 70 30 2500 5 95 5500 5 95 6000 70 30 7000 70 30

23



(mz rarr mz) (eV)























24







25





SPEImunoseparace

Odběr KVV


Separace HNE MDA



Diagnoacuteza



SPE



26

51 Odběr KVV




















53 HPLCMS metoda












27

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH


8-iso PGF2 α

PGF2 β




28

OH

O

OH

COOH

O

OH

OH

COOH











29

























0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100 120 140



30











0

200

400

600

800

0 500 1000 1500 2000 2500


8-iso PGF2α pg


y = 08683xR2 = 09986

0

50

100

150

200

250

300

0 50 100 150 200 250 300

31





















LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26

LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39


Přesnost RSD () 106 117 125 76 84

Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918







32





































ngml KVV

33

6 Zaacutevěr









34

7 Seznam literatury






Disease (1987) s 136 779

















(2006) s 5


(1999) s 852 141



14











R

OOH

R

R O

OO

R O

R O

OH

R

OOHO

RO

OH

R

OOH

O

R O

RR

R

O

R

R

O

RR R

O


malondialdehyde

n-aldehydy



alk-2en-1-al






15






O

O Cl

ClCl

Cl





Cl

Cl

OO

Cl

Cl O

OCl

Cl

Cl

Cl+ +

oxidace

TCDD

2 2 H2O+




16






17







3311 Imunoseparace



18












19







20





































USA)

21













‐80 degC












22












faacuteze


















000 70 30 1000 70 30 2500 5 95 5500 5 95 6000 70 30 7000 70 30

23



(mz rarr mz) (eV)























24







25





SPEImunoseparace

Odběr KVV


Separace HNE MDA



Diagnoacuteza



SPE



26

51 Odběr KVV




















53 HPLCMS metoda












27

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH


8-iso PGF2 α

PGF2 β




28

OH

O

OH

COOH

O

OH

OH

COOH











29

























0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100 120 140



30











0

200

400

600

800

0 500 1000 1500 2000 2500


8-iso PGF2α pg


y = 08683xR2 = 09986

0

50

100

150

200

250

300

0 50 100 150 200 250 300

31





















LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26

LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39


Přesnost RSD () 106 117 125 76 84

Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918







32





































ngml KVV

33

6 Zaacutevěr









34

7 Seznam literatury






Disease (1987) s 136 779

















(2006) s 5


(1999) s 852 141



15






O

O Cl

ClCl

Cl





Cl

Cl

OO

Cl

Cl O

OCl

Cl

Cl

Cl+ +

oxidace

TCDD

2 2 H2O+




16






17







3311 Imunoseparace



18












19







20





































USA)

21













‐80 degC












22












faacuteze


















000 70 30 1000 70 30 2500 5 95 5500 5 95 6000 70 30 7000 70 30

23



(mz rarr mz) (eV)























24







25





SPEImunoseparace

Odběr KVV


Separace HNE MDA



Diagnoacuteza



SPE



26

51 Odběr KVV




















53 HPLCMS metoda












27

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH


8-iso PGF2 α

PGF2 β




28

OH

O

OH

COOH

O

OH

OH

COOH











29

























0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100 120 140



30











0

200

400

600

800

0 500 1000 1500 2000 2500


8-iso PGF2α pg


y = 08683xR2 = 09986

0

50

100

150

200

250

300

0 50 100 150 200 250 300

31





















LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26

LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39


Přesnost RSD () 106 117 125 76 84

Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918







32





































ngml KVV

33

6 Zaacutevěr









34

7 Seznam literatury






Disease (1987) s 136 779

















(2006) s 5


(1999) s 852 141



16






17







3311 Imunoseparace



18












19







20





































USA)

21













‐80 degC












22












faacuteze


















000 70 30 1000 70 30 2500 5 95 5500 5 95 6000 70 30 7000 70 30

23



(mz rarr mz) (eV)























24







25





SPEImunoseparace

Odběr KVV


Separace HNE MDA



Diagnoacuteza



SPE



26

51 Odběr KVV




















53 HPLCMS metoda












27

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH


8-iso PGF2 α

PGF2 β




28

OH

O

OH

COOH

O

OH

OH

COOH











29

























0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100 120 140



30











0

200

400

600

800

0 500 1000 1500 2000 2500


8-iso PGF2α pg


y = 08683xR2 = 09986

0

50

100

150

200

250

300

0 50 100 150 200 250 300

31





















LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26

LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39


Přesnost RSD () 106 117 125 76 84

Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918







32





































ngml KVV

33

6 Zaacutevěr









34

7 Seznam literatury






Disease (1987) s 136 779

















(2006) s 5


(1999) s 852 141



17







3311 Imunoseparace



18












19







20





































USA)

21













‐80 degC












22












faacuteze


















000 70 30 1000 70 30 2500 5 95 5500 5 95 6000 70 30 7000 70 30

23



(mz rarr mz) (eV)























24







25





SPEImunoseparace

Odběr KVV


Separace HNE MDA



Diagnoacuteza



SPE



26

51 Odběr KVV




















53 HPLCMS metoda












27

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH


8-iso PGF2 α

PGF2 β




28

OH

O

OH

COOH

O

OH

OH

COOH











29

























0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100 120 140



30











0

200

400

600

800

0 500 1000 1500 2000 2500


8-iso PGF2α pg


y = 08683xR2 = 09986

0

50

100

150

200

250

300

0 50 100 150 200 250 300

31





















LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26

LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39


Přesnost RSD () 106 117 125 76 84

Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918







32





































ngml KVV

33

6 Zaacutevěr









34

7 Seznam literatury






Disease (1987) s 136 779

















(2006) s 5


(1999) s 852 141



18












19







20





































USA)

21













‐80 degC












22












faacuteze


















000 70 30 1000 70 30 2500 5 95 5500 5 95 6000 70 30 7000 70 30

23



(mz rarr mz) (eV)























24







25





SPEImunoseparace

Odběr KVV


Separace HNE MDA



Diagnoacuteza



SPE



26

51 Odběr KVV




















53 HPLCMS metoda












27

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH


8-iso PGF2 α

PGF2 β




28

OH

O

OH

COOH

O

OH

OH

COOH











29

























0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100 120 140



30











0

200

400

600

800

0 500 1000 1500 2000 2500


8-iso PGF2α pg


y = 08683xR2 = 09986

0

50

100

150

200

250

300

0 50 100 150 200 250 300

31





















LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26

LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39


Přesnost RSD () 106 117 125 76 84

Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918







32





































ngml KVV

33

6 Zaacutevěr









34

7 Seznam literatury






Disease (1987) s 136 779

















(2006) s 5


(1999) s 852 141



19







20





































USA)

21













‐80 degC












22












faacuteze


















000 70 30 1000 70 30 2500 5 95 5500 5 95 6000 70 30 7000 70 30

23



(mz rarr mz) (eV)























24







25





SPEImunoseparace

Odběr KVV


Separace HNE MDA



Diagnoacuteza



SPE



26

51 Odběr KVV




















53 HPLCMS metoda












27

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH


8-iso PGF2 α

PGF2 β




28

OH

O

OH

COOH

O

OH

OH

COOH











29

























0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100 120 140



30











0

200

400

600

800

0 500 1000 1500 2000 2500


8-iso PGF2α pg


y = 08683xR2 = 09986

0

50

100

150

200

250

300

0 50 100 150 200 250 300

31





















LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26

LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39


Přesnost RSD () 106 117 125 76 84

Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918







32





































ngml KVV

33

6 Zaacutevěr









34

7 Seznam literatury






Disease (1987) s 136 779

















(2006) s 5


(1999) s 852 141



20





































USA)

21













‐80 degC












22












faacuteze


















000 70 30 1000 70 30 2500 5 95 5500 5 95 6000 70 30 7000 70 30

23



(mz rarr mz) (eV)























24







25





SPEImunoseparace

Odběr KVV


Separace HNE MDA



Diagnoacuteza



SPE



26

51 Odběr KVV




















53 HPLCMS metoda












27

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH


8-iso PGF2 α

PGF2 β




28

OH

O

OH

COOH

O

OH

OH

COOH











29

























0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100 120 140



30











0

200

400

600

800

0 500 1000 1500 2000 2500


8-iso PGF2α pg


y = 08683xR2 = 09986

0

50

100

150

200

250

300

0 50 100 150 200 250 300

31





















LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26

LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39


Přesnost RSD () 106 117 125 76 84

Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918







32





































ngml KVV

33

6 Zaacutevěr









34

7 Seznam literatury






Disease (1987) s 136 779

















(2006) s 5


(1999) s 852 141



21













‐80 degC












22












faacuteze


















000 70 30 1000 70 30 2500 5 95 5500 5 95 6000 70 30 7000 70 30

23



(mz rarr mz) (eV)























24







25





SPEImunoseparace

Odběr KVV


Separace HNE MDA



Diagnoacuteza



SPE



26

51 Odběr KVV




















53 HPLCMS metoda












27

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH


8-iso PGF2 α

PGF2 β




28

OH

O

OH

COOH

O

OH

OH

COOH











29

























0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100 120 140



30











0

200

400

600

800

0 500 1000 1500 2000 2500


8-iso PGF2α pg


y = 08683xR2 = 09986

0

50

100

150

200

250

300

0 50 100 150 200 250 300

31





















LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26

LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39


Přesnost RSD () 106 117 125 76 84

Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918







32





































ngml KVV

33

6 Zaacutevěr









34

7 Seznam literatury






Disease (1987) s 136 779

















(2006) s 5


(1999) s 852 141



22












faacuteze


















000 70 30 1000 70 30 2500 5 95 5500 5 95 6000 70 30 7000 70 30

23



(mz rarr mz) (eV)























24







25





SPEImunoseparace

Odběr KVV


Separace HNE MDA



Diagnoacuteza



SPE



26

51 Odběr KVV




















53 HPLCMS metoda












27

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH


8-iso PGF2 α

PGF2 β




28

OH

O

OH

COOH

O

OH

OH

COOH











29

























0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100 120 140



30











0

200

400

600

800

0 500 1000 1500 2000 2500


8-iso PGF2α pg


y = 08683xR2 = 09986

0

50

100

150

200

250

300

0 50 100 150 200 250 300

31





















LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26

LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39


Přesnost RSD () 106 117 125 76 84

Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918







32





































ngml KVV

33

6 Zaacutevěr









34

7 Seznam literatury






Disease (1987) s 136 779

















(2006) s 5


(1999) s 852 141



23



(mz rarr mz) (eV)























24







25





SPEImunoseparace

Odběr KVV


Separace HNE MDA



Diagnoacuteza



SPE



26

51 Odběr KVV




















53 HPLCMS metoda












27

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH


8-iso PGF2 α

PGF2 β




28

OH

O

OH

COOH

O

OH

OH

COOH











29

























0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100 120 140



30











0

200

400

600

800

0 500 1000 1500 2000 2500


8-iso PGF2α pg


y = 08683xR2 = 09986

0

50

100

150

200

250

300

0 50 100 150 200 250 300

31





















LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26

LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39


Přesnost RSD () 106 117 125 76 84

Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918







32





































ngml KVV

33

6 Zaacutevěr









34

7 Seznam literatury






Disease (1987) s 136 779

















(2006) s 5


(1999) s 852 141



24







25





SPEImunoseparace

Odběr KVV


Separace HNE MDA



Diagnoacuteza



SPE



26

51 Odběr KVV




















53 HPLCMS metoda












27

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH


8-iso PGF2 α

PGF2 β




28

OH

O

OH

COOH

O

OH

OH

COOH











29

























0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100 120 140



30











0

200

400

600

800

0 500 1000 1500 2000 2500


8-iso PGF2α pg


y = 08683xR2 = 09986

0

50

100

150

200

250

300

0 50 100 150 200 250 300

31





















LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26

LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39


Přesnost RSD () 106 117 125 76 84

Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918







32





































ngml KVV

33

6 Zaacutevěr









34

7 Seznam literatury






Disease (1987) s 136 779

















(2006) s 5


(1999) s 852 141



25





SPEImunoseparace

Odběr KVV


Separace HNE MDA



Diagnoacuteza



SPE



26

51 Odběr KVV




















53 HPLCMS metoda












27

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH


8-iso PGF2 α

PGF2 β




28

OH

O

OH

COOH

O

OH

OH

COOH











29

























0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100 120 140



30











0

200

400

600

800

0 500 1000 1500 2000 2500


8-iso PGF2α pg


y = 08683xR2 = 09986

0

50

100

150

200

250

300

0 50 100 150 200 250 300

31





















LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26

LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39


Přesnost RSD () 106 117 125 76 84

Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918







32





































ngml KVV

33

6 Zaacutevěr









34

7 Seznam literatury






Disease (1987) s 136 779

















(2006) s 5


(1999) s 852 141



26

51 Odběr KVV




















53 HPLCMS metoda












27

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH


8-iso PGF2 α

PGF2 β




28

OH

O

OH

COOH

O

OH

OH

COOH











29

























0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100 120 140



30











0

200

400

600

800

0 500 1000 1500 2000 2500


8-iso PGF2α pg


y = 08683xR2 = 09986

0

50

100

150

200

250

300

0 50 100 150 200 250 300

31





















LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26

LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39


Přesnost RSD () 106 117 125 76 84

Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918







32





































ngml KVV

33

6 Zaacutevěr









34

7 Seznam literatury






Disease (1987) s 136 779

















(2006) s 5


(1999) s 852 141



27

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

OH


8-iso PGF2 α

PGF2 β




28

OH

O

OH

COOH

O

OH

OH

COOH











29

























0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100 120 140



30











0

200

400

600

800

0 500 1000 1500 2000 2500


8-iso PGF2α pg


y = 08683xR2 = 09986

0

50

100

150

200

250

300

0 50 100 150 200 250 300

31





















LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26

LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39


Přesnost RSD () 106 117 125 76 84

Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918







32





































ngml KVV

33

6 Zaacutevěr









34

7 Seznam literatury






Disease (1987) s 136 779

















(2006) s 5


(1999) s 852 141



28

OH

O

OH

COOH

O

OH

OH

COOH











29

























0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100 120 140



30











0

200

400

600

800

0 500 1000 1500 2000 2500


8-iso PGF2α pg


y = 08683xR2 = 09986

0

50

100

150

200

250

300

0 50 100 150 200 250 300

31





















LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26

LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39


Přesnost RSD () 106 117 125 76 84

Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918







32





































ngml KVV

33

6 Zaacutevěr









34

7 Seznam literatury






Disease (1987) s 136 779

















(2006) s 5


(1999) s 852 141



29

























0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100 120 140



30











0

200

400

600

800

0 500 1000 1500 2000 2500


8-iso PGF2α pg


y = 08683xR2 = 09986

0

50

100

150

200

250

300

0 50 100 150 200 250 300

31





















LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26

LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39


Přesnost RSD () 106 117 125 76 84

Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918







32





































ngml KVV

33

6 Zaacutevěr









34

7 Seznam literatury






Disease (1987) s 136 779

















(2006) s 5


(1999) s 852 141



30











0

200

400

600

800

0 500 1000 1500 2000 2500


8-iso PGF2α pg


y = 08683xR2 = 09986

0

50

100

150

200

250

300

0 50 100 150 200 250 300

31





















LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26

LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39


Přesnost RSD () 106 117 125 76 84

Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918







32





































ngml KVV

33

6 Zaacutevěr









34

7 Seznam literatury






Disease (1987) s 136 779

















(2006) s 5


(1999) s 852 141



31





















LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26

LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39


Přesnost RSD () 106 117 125 76 84

Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918







32





































ngml KVV

33

6 Zaacutevěr









34

7 Seznam literatury






Disease (1987) s 136 779

















(2006) s 5


(1999) s 852 141



32





































ngml KVV

33

6 Zaacutevěr









34

7 Seznam literatury






Disease (1987) s 136 779

















(2006) s 5


(1999) s 852 141



33

6 Zaacutevěr









34

7 Seznam literatury






Disease (1987) s 136 779

















(2006) s 5


(1999) s 852 141



34

7 Seznam literatury






Disease (1987) s 136 779

















(2006) s 5


(1999) s 852 141



Date post:	21-Dec-2021
Category:	Documents
Upload:	others
View:	1 times
Download:	0 times

biomarkerů v kondenzátu vydechovaného vzduchu Nová cesta ...

Documents