4.ročník biochemie

BENG - membrány

Biomembrány

Membrány a buňka

BENG-membrány

Obecné vlastnosti a struktura

Buněčné membrányBENG-

membrány

Rostlinná buňka (lilie)

Živočišná buňka (jaterní)

Membrány - struktura

BENG-membrány

Membrána - modelBENG-

membrány

Membrány přeměnující energii

* na těchto membránách je syntetizován největší podíl ATP

(něco málo i v cytoplazmě)

* obsahují 2 odlišné typy protonových pump1) PRIMÁRNÍ - velmi různorodé podle zdroje

energie2) SEKUNDÁRNÍ - vysoce konzervované- oba systémy jsou velmi těsně spřaženy

TYPY: * plasmatická membrána prokaryot* vnitřní membrána mitochondrií* membrány thylakoidů v chloroplastech

BENG-membrány

Přehled membrán

Přehled membrán (P = positive, strana kam jsou protony čerpány)

BENG-membrány

Chemiosmotická teorie - základ

„Hypotetický“ thylakoid - chemiosmotické spřažení přenos protonů a syntézy/hydrolýzy ATP

BENG-membrány

Přídavek ATP

= čerpání protonů

Ustavení rovnováhy

Odstranění ATP

= tok protonů ven a syntéza ATP (užitečná práce)

1) pokud pracuje prim.pumpa

2) pokud spotřeba ATP a přísun ADP/P

Dynamická rovnováha (reverzibilita reakcí a

toků)

- systém nekoná užitečnou práci

Tok elektronů a protonů

Tok protonů -analogie elektrických obvodů s tokem e-

p V JH+ I CMH+ vodivost

BENG-membrány

„ATPasa - spotřebič protonového proudu“

Vlastnosti membrán

Důležité vlastnosti membrán:

a) resistence průchodu protonů („protonový odpor“)

„protonofory“ (uncouplers, rozpojovače)

- pozorovány dávno před Mitchellem

- způsobují „zkrat“ v obvodu protonů

b) transportní systémy pro metabolity

* transport negativně nabitých látek látky do MTCH

* současný přenos s H+ nebo OH-

BENG-membrány

Mitochondrie 1

BENG-membrány

Mitochondriální

a submitochondriální částice

Klasický „obraz“ – zmrazené preparáty a TEM

Mitochondrie 1

BENG-membrány

Mitochondriální

a submitochondriální částice

- dynamicky se měnící tvar v různých typek buněk podle jejich aktivity

- těsný kontakt s ER (intenzivní výměna Ca2+ iontů )

- malý kontakt mezi kristami a mezimembránovým prostorem (měření HREM a 3D modely PT)

Mitochondrie - jak je neznáme ...

BENG-membrány

Pohled shora:

Lamelární topologie 4 segmentovaných krist mezi vnější a vnitřní membránou

Boční pohled:

Otvory spojů krist (černě) spojují mezimembránový prostor s intrakristálním prostorem

Elektronová tomografie mitochondrií (National Center for Microscopy and Imaging Research at UCSD)

http://www.sci.sdsu.edu/TFrey/MitoMovie.htm

Mitochondrie - jak je neznáme ...

BENG-membrány

Nové otázky:

- gradienty metabolitů (ADP) v kristách ?

- izolované kulovité kristy ?

- vztah k patologickým vztahům ?

- propojení MTCH / EPR

3D model MTCH

(krysí játra)

- interkonektivita krist

- tubulární tvar

Normální Myopatie

Mitochondrie 2 BENG-

membrány

Mitochondrie v různých typech buněk:

NEURONY

- diskrétní filamenta v cytoplazmě

- mobilní podél axonů a dendritů

difúzní koeficient ~0.8 µm2/s

(2-4x pomaleji než v roztoku)

SVALOVĚ BUŇKY

- velké množství krist

Mitochondrie - sval BENG-

membrány

Mitochondrie

svalových buněk

Mitochondriální membrány

BENG-membrány

- vnější nespecifické póry pro metabolity < 10kDa

„poriny“ (VDAC, voltage dependent anion channels)

x není membránový potenciál

- vnitřní „energy transducing“ - dýchací řetězec a ATPasa

speciální transportní mechanismus pro proteiny

značení orientace membrány:

N-side (negative): do matrix

P-side (positive): do mezimembránového prostoru

POZOR: u submitochondriálních preparátů přípravených sonikací dochází k inverzi!!

Respirující baktérie

Gram-negativní bakterie (velikost cca jako MTCH)

* membrána oddělena od peptidoglykanové stěny periplasmem

Gram-pozitivní bakterie

* membrána přiléhá přímo k vnější buněčné stěně

ROZDÍLY:

- mnoho látek neprochází vnější membránou Gram-negativních

- ADP/ATP a NAD+/NADH neprochází cytoplasmatickou membránou

- obtížné „vyhladovění“ - odstranění vnitřních substrátů

- studium transportu metabolitů komplikováno jejich možnou přeměnou

BENG-membrány

Membrána Gram-negativní baktérie

BENG-membrány

Chloroplasty BENG-

membrány

Chloroplasty - thylakoid

velikost: 4-10 m průměr, 1-2 m tlouštka

BENG-membrány

Membrána thylakoidů

- lumen tvoří oddělený prostor od mezimembránového prostoru

- ATP a NADPH používány ve stroma k fixaci CO2

- „broken chloroplast“ - bez vnější membrány a stromatu

BENG-membrány

Purpurová baktérie Rhodobacter

Nejstudovanější skupina:

a) tvorba „chromatoforů“

b) snadné studium

* malá velikost

* opticky jasné suspenze

c) snadná izolace reakčních center

BENG-membrány

Obecné vlastnosti BENG-membrány

Lipidická dvojvrstva membrán:

A) nepropustná pro většinu iontů včetně H+

vysoký odpor (potenciál 200mV = elektrické pole 3.105 V/cm-

1)

B) propustná pro řadu nenabitých látek

02, CO2, NH3, octanový anion (využito pro studium pH gradientů)

C) polární molekuly vody: aquaporiny

= vodupropustné kanály (Peter Agre – Nobelova cena 2003)

AquaporinyBENG-

membrány

Transport iontů BENG-

membrány

- Transport iontů integrální součást chemi-osmotické teorie

- Membrány přeměňující energii mají obecně shodné vlastnosti jako všechny ostatní buněčné membrány

- Pro transport musí existovat hnací síla

Typy transportu:

1) Difúze lipidickou vrstvou x přenašeč (ionofor, protein)

2) Pasivní přenos x energetické spřažení (aktivní transport)

3) Jediný ion x spřažený přenos 2 a více iontů

4) Dochází k výslednému přenosu náboje ?

Transport iontů 1BENG-

membrány

Transport iontů 2BENG-

membrány

Specifika energetických membrán 1 BENG-membrány

Ad 1) difúze x přenašeč

Proteinové složení

Vnitřní MTCH : 50% plochy integrální proteiny!!

25% periferální proteiny, 25% lipidy

- přenašeče v MTCH krysích játer x nejsou v MTCH srdce

Lipidové složení

* Vnitřní MTCH: 20% kardiolipin (fosfolipid)

- vysoká elektrická izolace, struktura, náboj

x Barthův syndrom

* Thylakoid: 16% kardiolipin

40% galaktolipidy

40% fotopigmenty

kardiolipin

Specifika energetických membrán 2 BENG-membrány

Ad 2) pasivní x spřažený transport

Pro stejný iont existují různé mechanismy !

* sarkoplasmatické retikulum – iontová pumpa Ca2+ - ATPasa

* vnitřní MTCH membrána – uniport pro Ca2+/Na+ poháněný

„Aktivní“ transport –

pouze přenos katalyzovaný

proteiny může být přímo

spřažen s metabolismem

Specifika energetických membrán 3 BENG-membrány

Ad 3) uniport, symport a antiport

Příklady:

Bakteriální membrána: symport H+/metabolity do buňky

Lipidické dvojvrstvy: antiport K+/H+ s nigericinem

Obtížné experimentální rozlišení H+/OH-

např. fosfátový přenašeč je P-/OH- antiport nebo P-/H+ symport ?

Jeden ion se může účastnit více blízce spjatých drah:

Na+ uniport (kanály aktivované membránovým potenciálem)

Na + symport (ko-transport s glukosou)

Na + antiport (přenašeč 3Na+/Ca2+)

Specifika energetických membrán 4 BENG-membrány

Ad 3) elektroneutrální x přenos náboje

Celkově elektroneutrální přenos

x na molekulární úrovni dochází

k neustálému přenosu náboje

Jedna dráha přenosu se může podle podmínek chovat jako:

elektrogenní = vytvářející elektrický potenciál na membráně

elektroforetická = přenos iontů na úkor elektrického potenciálu

Ionofory

Funkce ionoforu = snížení aktivační energie potřebné pro zanoření polární látky do nepolární lipidické vrstvy

a) Přírodní – antibiotika

b) Syntetické – studium vlastností membrán a transportu iontů

látky MW cca 500-2000 Da, hydrofobní povrch a hydrofilní jádro

Mechanismus:

1) mobilní přenašeče: rychlost cca 1000 iontů/s-1, vysoká specifita pro ionty, ovlivněny fluiditou membrány

2) tvorba kanálů: nízká diskriminace mezi ionty x vysoká rychlost cca 107 iontů/s-1

BENG-membrány

Přenos náboje bez přenosu H+

Valinomycin (Streptomyces)

* (L-Val-D-hiVA-D-Val-D-Lac)3

* uniport Cs+, Rb+, K+, NH4+

* přenos Na+ - 104 x menší než K+

* volný Val i nabitý komplex prochází membránou

* katalytická účinnost 10-9 M

Gramicidine

* přechodná tvorbu dimerů - kanály

* nízká selektivita pro jednomocné kationty

* rychlost limitována pouze difúzí

(cca 107 iontů/s-1)

BENG-membrány

HCO-L-Val-Gly-L-Ala-D-Leu-L-Ala-D-Val-L-Val-D-Val-L-Trp-D-Leu-L-Trp-D-Leu-L-Trp-D-Leu-L-Trp-NHCH2CH2OH

Valinomycin a gramicidin – přenos iontů

BENG-membrány

Ionofory pro Ca2+

A23187

* vysoká afinta pro Ca2+

Calcium ionophore IV (Sigma)

BENG-membrány

Přenos H+ bez přenosu

náboje

Nigericin

* tvorba hydrofilní kapsy O-heterocykly

* při vazbě kationtu ztrácí H+

* obě formy prochází membránou

Monensin * preference pro Na+

BENG-membrány

Protonofory - přenos H+ a náboje

FCCP = carbonylcyanide-p-trifluoromethoxyphenyl-hydrazone

BENG-membrány

„rozpojovače, přenašeče H+“

- průchod díky systému -elektronů

- zvýšení propustnosti membrány pro protony vede ke zkratu obvodu a rozpojení tvorby p od syntézy ATP

- zvýšení protonové vodivosti těmito látkami bylo v souladu s chemiosmotickou teorií

- rozpojení může být dosaženo kombinací ionoforů

-např. valinomycin a nigericin

Příklady funkce – nigericin a FCCP

c) Elektroneutrální přenos H+ d) Cyklování protonoforu

BENG-membrány

Lipofilní kationty a anionty

TPP+ = tetrafenylfosfoniový kation

TPB- = tetrafenylborátový anion

Využití schopnosti -elektronů „odstiňovat“ elektrický náboj při průchodu lipidickou dvojvrstvou

VÝZNAM:

- nejsou ionofory, ale akumulují se při existenci membránového potenciálu = experimentální odhad

- fluoreskující lipofilní kationty – sledování MTCH in vitro i v živých buňkách

BENG-membrány

TPP a TPB

TPP+ TPB-

BENG-membrány

Transportní proteiny

Specifika:

1) Analogie enzymům (inhibice, stereospecifita, genetika)

2) Individuální, orgánová a tkáňová odlišnost (např. citrátový přenašeč – pouze jaterní MTCH)

Používání synonym pro transportní proteiny:

„Přenašeče“ x neodpovídá funkci přenašeče definované u ionoforů

„Permeasy“, „Translokasy“

- Většina transportních proteinů tvoří dimery a přenos látek se děje konformačními změnami proteinů

BENG-membrány

BENG-membrány„Kyvadlová doprava MTCH-

CYT“

Osmotické bobtnání MTCH

a) probíhá vždy, pokud nejsou MTCH v isotonickém prostředí, které navíc neobsahuje permeabilní ionty

b) zahrnuje rozvinutí vnitřní membrány až do prasknutí vnější membrány

c) pozoruje se jako změny optických vlastností suspenze MTCH

BENG-membrány

Základní princip: pouze malé odchylky od rovnovážného rozdělení iontů – vznik velkých potenciálů (1 nmol iontu = >200mV)

Bobtnání MTCH – ionofory a metabolity 1

1) nepropustnost Cl-

BENG-membrány

Bobtnání MTCH – ionofory a metabolity 2

1) nepropustnost Cl- 2) propustnost SCN-

BENG-membrány

Bobtnání MTCH – ionofory a metabolity 3

1) nepropustnost Cl- 2) propustnost SCN- 3) reflux H+ po FCCP

BENG-membrány

Bobtnání MTCH – ionofory a metabolity 4-5

4) FCCP nutný pro H+ tok

BENG-membrány

5) srovnej s nigericinem

Bobtnání MTCH – ionofory a metabolity 6-7

6) propustnost pro acetát

BENG-membrány

7) kontrakce po přídavku

nigericinu a substrátu: propustnost pro NO3-

Fyziologický význam bobtnání MTCH

Přídavek TNF- ke kultuře lidských hepatocytů:

1) Tvorba ROS (změna červená – žlutá-zelená barva)

2) Bobtnání MTCH = změny v propustnosti vnitřní membrány

BENG-membrány

Příště:Vzpomínky na fyzikální

chémii