Charakterizace materiálů IKFY / P224

Přednáška 3

● SEM (Scanning Electron Microscopy)● TEM (Transmition Electron Microscopy)

Mikroskopy

http://www.paru.cas.cz/lem/book/Podkap/Pic/7.1/1.gif

Konstrukční princip elektronového mikroskopu

Jsou dány vlastnostmi urychlených elektronů

Možnost ovlivnění dráhy elektronů elektromagnetickým nebo elektrostatickým polem.

Elektronový paprsek se může účinně šířit pouze ve vakuu.

Elektronový paprsek je možno pozorovat pouze nepřímo (fluorescenční stínítko, fotografická deska, televizní obrazovka).

Druh elektronového mikroskopu (prozařovací, řádkovací) dán interakcí elektronů s preparátem, která se užívá k zobrazení („prozářené“ elektrony; „vyražené“=sekundární elektrony).

Interakce elektronů se vzorkem

S. Jackson, Metal Oxide Catalyst, ISBN: 978-3-527-62612-0

Mikroskopy - TEM

Simulátor TEMhttp://www.nobelprize.org/educational/physics/microscopes/tem/tem.html

● Hitachi H-9500 300kV Transmission Electron Microscope

JEOL2010F

Proč elektronová mikroskopie

Jakýkoliv mikroskop může maximálně rozlišit (přibližně) pouze 2 body ležící od sebe ve vzdálenosti ½ λ (vlnové délky) zdroje osvětlení.

Viditelné světlo má λ přibližně 550nm = světelný mikroskop má rozlišovací schopnost přibližně 250nm. Maximální užitečné zvětšení je cca 1000x.

Rozlišovací schopnost oka/rozlišovací schopnost mikroskopu=0,25/2,5.10-4 = 1000x

Vlnová délka příslušející urychlenému elektronu (60kV) je přibližně 0,005nm (=stotisíckrát kratší než viditelné světlo).

0,25/2,5.10-7 = 100000000x

Praktická rozlišovací schopnost elektronového mikroskopu je 0,5-0,7 nm, špičkově 0,25-0,3nm, tedy méně než teoretická hodnota (vady elektronoptického systému).

Vlnová délka elektronu

Vlnová délka elektronu● De Brolieho vztah● l = h / p ,

● l – vlnová délka, h – Planckova konstanta , p – hybnost

● p = m v = (2 m Ek)1/2 = (2 m e V)1/2

● m – hmotnost elektronu ● e – náboj elektronu● V – urychlovací napětí

TEM

Transmisní elektronový mikroskop je možné popsat jako složité technické zařízení, které umožňuje pozorování preparátů do tloušťky 100 nm při vysokém zvětšení a s velkou rozlišovací schopností.

Vzhledem k příbuznosti paprskových diagramů lze jej považovat za analogii světelného mikroskopu v procházejícím světle.

Oba přístroje mají společnou i řadu součástí - zdroje světla nebo elektronů, čočky skleněné nebo elektromagnetické a v obou se preparát umísťuje na mechanický stolek.

TEM potřebuje ke své činnosti i mnoho dalších systémů, které u světelného mikroskopu nejsou, např. vysokonapěťové zdroje, elektroniku k řízení mikroskopu a výkonný vakuový systém pro vyčerpání jeho vnitřních prostor mikroskopu na hodnotu, která zabezpečí střední volnou dráhu elektronu alespoň v délce 3 m.

http://www.paru.cas.cz/lem/book/

Interakce elektronového paprsku se vzorkem

Tenkým vzorkem pod 100 nm

část elektronů prochází („prozáření“) beze změny

část elektronů se absorbuje (teplo!)

Prozařovací = transmisní elektronový mikroskop TEM (=“stínový“ obraz)

Tenký vzorek

Při průchodu elektron těsně míjí:

atomové jádro = velká úchylka směru, ztráta rychlosti = elastický (pružný) rozptyl

zasáhne jiný elektron = malá úchylka ve směru, ztráta velké části rychlosti = neelastický (nepružný) rozptyl = změna vlnové délky = chromatická vada = preparát musí být tenký

odstranění uchýlených elektronů = clona mezi preparátem a objektivní čočkou

zvětšování kontrastu preparátu = vnášení atomů těžkých kovů (Pb, U, W, Os,…), které mají větší náboj jádra a snáze působí elastický rozptyl.

Tlustý vzorek

část elektronů se absorbuje (=teplo)

část elektronů vyráží z povrchu jiné elektrony (=sekundární elektronzy) s malou energií. Z těch se rekonstruuje obraz = „řádkovací“ = „skenovací“ = „rastrovací“ elektronový mikroskop = SEM.

Další důležité interakce

= vznik rentgenových paprsků = analýza atomového složení preparátu;

„mikrosonda“: buď délka vlny (spektrometr vlnově disperzní – vždy jej jeden prvek – od Be) nebo velikost energie (spektrometr energiově disperzní –EDAX – všechny prvky od Na)

TEM a optický mikroskop

Oba přístroje mají společnou i řadu součástí - zdroje světla nebo elektronů, čočky skleněné nebo elektromagnetické a v obou se preparát umísťuje na mechanický stolek.

Kde získat elektrony pro měření

Elektronové dělo: funkce: vybavení elektronů, směr, rychlost

● žhavené wolframové vlákno tvaru V (základní typ)

● hrot z boritu lanthanu (LaB6)

● wolframový hrot (autoemisní katoda), nutnost aby elektrony vycházely z co nejmenší plochy

● fokusační elektroda = Wehneltův válec = (elektrostatická čočka) – (stlačuje elektronový svazek do místa těsně před anodou)

● anoda: potenciální rozdíl mezi katodou a anodou 60-100kV (u biologických preparátů obvykle 80 kV). Vysokovoltová elektronová mikroskopie (200-1000kV) = silné objekty, „živé“ objekty

Jak ovládat svazek elektronů

Zobrazovací systém:

elektromagnetické čočky = prstence z velmi čistého, měkkého, železa (= co nejmenší zbytkový magnetismus), zasazené v cívkách napájených stejnosměrným proudem.

Dráha elektronu odchylována po spirálovité trajektorii dané směrem magnetických siločar.

Otvor v čočce: malé rozměry x přesnost.

Nepřesnost: osový astigmatismus.

Další zdroj astigmatismu = vrstva zuhelnatělých uhlovodíků v otvorech čoček a clon.

Osový astigmatismus: hlavní omezení rozlišovací schopnosti. Korekce: vnější přídatné magnetické pole určeného směru = stigmátor.

Vlastnosti elm. čoček

● pracují pouze ve vakuu

● pouze spojky

● lehká fokusovatelnost = změna magnetické hodnoty čočky = změna intenzity proudu v cívce (stabilita proudu v cívce)

● tvořený obraz se otáčí kolem osy čočky

Vady elm. čoček

chromatická = kolísání urychlovacího napětí a tím vlnové délky svazku (stabilita vysokého napětí) = změna rychlosti elektronu při průchodu preparátem (neelastický rozptyl) = nutnost tenkého preparátu (50-100nm)

sférická = okraj čočky láme jinak než její střed.

Řešení = zmenšení úhlové apertury čočky = clony =kovové (Mo, Pt, Au) s otvorem 15- 50 μm

Detekce obrazu

pro TEM stínítko pokryté ZnS

fotografická deska

nebo elektronické zpracování obrazu pomocí snímače CCD a obrazovky (počítače)

Mikroskop TEM

Celková sestava TEM:

válec – kolona, kde se odehrává tvorba obrazu. Jednotlivé části a ovládací mechanické prvky t. Rozvod vakua a systém ventilů.

stůl s elektrickými ovládacími prvky

pomocná zařízení: zdroj vysokého napětí, vakuové pumpy

Příprava vzorků

● preparát musí obsahovat drobné částice nebo může být řezem tkání, ale jeho celková tloušťka nesmí přesahovat 100 nm. (Síla preparátu je kompromis: tenký preparát = dobré rozlišení ale malý kontrast, silný preparát obráceně.

● preparát musí být dostatečně stabilní, aby odolával pobytu ve vakuu a bombardování elektronovým paprskem

● kontrast preparátu – tj. propustnost pro elektrony musí být upravena, aby byla vyhovující

● plošná velikost preparátu je dána rozměrem (průměr 3mm) kovových (obvykle Cu) terčků s otvory („síťky“), na které se objekty umisťují.

Druhy vzorků

Totální (drobné částice a organismy), viry, makromolekuly – např. DNA, buňěčné komponenty (dosažení kontrastu: stínování šikmo napařenou vrstvou kovu, negativní „barvení“)

Repliky (otisky povrchových struktur), dosažení kontrastu: stínování šikmo napařenou vrstvou kovu

Ultratenké řezy, aplikace histologických technik na EM. (kontrast: vnášení atomů těžkých kovů – Pb, U – při histochemických reakcích, kde reakční produk je neprostupný pro elektrony)

Repliky

Metody přípravy otisků patřily k nejvíce užívaným v začátcích elektronové mikroskopie. V poslední době je tato poněkud složitá metoda využívána vzácně, nejčastěji v kombinaci s metodou mrazového leptání.

Otisky se dělí na jednostupňové a dvoustupňové, pozitivní a negativní (obr. 1)

Jednostupňový pozitivní otisk se utvoří tak, že objekt se ve vakuu nejprve šikmo nastínuje kovem a pak se na něj kolmo napaří silnější krycí vrstva uhlíku. Replika se potom splaví nebo sejme pomocí plastické hmoty.

Jednostupňový negativní otisk se připraví tak, že se na objekt kolmo napaří ve vakuu vrstva uhlíku a stínuje se až sejmutá replika.

1- pozitivní jednostupňový otisk, 2- Negativní jednostupňový otisk, 3- Pozitivní nepravý jednostupňový otisk (na opačné straně stínovaný), 4- Negativní dvoustupňový otisk, 5- Pozitivní dvoustupňový otisk, A- objekt, B- stínovaná vrstva kovu, C- tenká uhlíková replika, D- silná primární replika plastické hmoty, E- silná podkladová vrstva plastické hmoty

Preparační technika elektronové mikroskopie

● totální preparáty: zvláště důležité pro molekulární biologii. Dva druhy preparace:

„negativní barvení“: suspenze částic a roztok „barviva“ (fosfowolframan K nebo Na, /NH4/2MoO4, UAC, 0,5 –1%). Při zaschnutí se vytvoří film kontrastující látky kolem částic a částečně i ve strukturách částic-viry

preparáty stínované: napaření těžkého kovu (Pt, Au apod…) = zvýrazňování makromolekul – např. DNA

● repliky: otisky povrchů: dnes hlavně jako součást metody „mrazového lámání a leptání“ – „freeze fracture“ a „freeze-etching“. Jinak použití v biologii jen výjimečné, nyní většinou nahrazeno

● ultratenké řezy tkáněmi: obdoba klasických histologických technik na mnohem jemnější úrovni. Přechod mezi světelnou a elektronovou mikroskopií = polosilné řezy („tlusťáky“)

Všem způsobům preparace je společné nanesení objektů na nosné terčky = síťky (obvykle z Cu) průměr 3mm.

Rozměry ok nepřímo udává „ME-SH“ – obvykle mezi 100Mesh (otvory 200μm) a 400MESH (otvory 40μm). Objekty se obvykle montují na síťky pokryté tenkou vrstvou nosné folie, pouze řezy je možno montovat přímo.

FIB příprava vzorků pro TEM

http://www.fzu.cz/popularizace/mikroobrabeni-fokusovanym-iontovym-svazkem

● pomocí Ga iontového děla lze obrábět a sledovat přímo v SEM

FIB příprava vzorků pro TEM

http://www.fzu.cz/popularizace/mikroobrabeni-fokusovanym-iontovym-svazkem

3D rekonstrukce pomocí TEM

● W kontakt transistoru v 2D a 3D rekonstrukci● vzorek je během měření naklápěn a pak

sestaven model, v 3D zřetelné změny tloušťky

http://www.ifam.fraunhofer.de/2804/analytik/tem/literatur/TEM_2006_AIP-Semiconductor-Tomography_en.pdf

100 nm

3D rekonstrukce - Plazmová polymerace s nanoinkluzemi

0% 1%

AFM1 x 1 μm

TEM0,5 x 0,5 μm

n-hexanecontent

2%, 70WNo ohmic conductivity

J. Matoušek at. all, Vacuum 84 (2010), IF

High resolution TEM - HRTEM

● v současnosti až 0.8A (0.08 nm).

● pozorujeme difrakční obrazce, které jsou Fourierovou transformací periodického potenciálu

● tj. složitá teorie, získání obrázku vyžaduje zpětnou matematickou transformaci měřeného signálu

http://www.tf.uni-kiel.de/matwis/amat/def_en/kap_6/backbone/r6_3_4.html

Ge/Si

Si proměnná tloušťka

Mikroskopy - SEM

Rozdíly

Princip

Elektronový paprsek se vytváří stejně jako v TEM. Fokusuje se soustavou čoček do co nejmenší stopy (průměr 5-10nm), která dopadá na pozorovaný preparát.

Pomocí vychylovacích cívek elektronový paprsek přejíždí po povrchu pozorovaného preparátu v řádcích.

Dopadem primárního paprsku jsou z preparátu vyráženy sekundární elektrony.

Ty jsou přitahovány k detektoru a dopadají na scintilátor s fotonásobičem.

Elektrický signál z fotonásobiče je zesílen a určuje intenzitu elektronového paprsku na obrazovce. Primární paprsek po preparátu a paprsek obrazovky běží synchronně.

Interakce elektronů s povrchy

Typická vzdálenost atomů v pevné látce 0.4 nm = 4 A

SE

● SE mají nízkou energii proto se musí urychlit předpětím cca 10 kV – z bližších míst je jich více než z vzdálenějších – proto topografický kontrast, každý bod 10 až 1000 elektronů.

SE

BSE

● BSE závisí na středním atomovém čísle vzorku. Obraz v odražených elektronech je schopen odlišit oblasti s různým prvkovým složením. Např. uhlík bude tmavý.

BSE

Zrno z FeOx prášku

SE – sekundární elektrony BSE – zpětně odražené elektrony

Tenké vrstvy a povrchové struktury

90o, total gas flow 7 sccm 90o, total gas flow 2.5 sccm

D = 400 - 500 nm

H > 500 nm

Často kombinace SE + BSEPřekrystalizované vlákno žárovky

Biologické vzorky

SE - Křídlo mouchy

Tkaniny a filtry, membrány

Volba urychlovacího napětí

Používá se mnohem nižší urychlovací napětí než u TEM (SEM obvykle 20 kV, TEM obvykle 80kV).

Důvod je, aby se sekundární elektrony uvolňovaly co možná blízko povrchu objektu.

Vzorky

● velikost objektů až několik cm

● objekt musí být dokonale vysušen a preparován tak, aby povrchové struktury byly co nejlépe zachovány

● povrch objektu musí být pokryt vodivou vrstvou, která je souvislá, věrně sleduje detaily povrchu a nemaskuje je

● vodivá vrstva na povrchu preparátu musí umožňovat co největší zisk vyzářených sekundárních elektronů (ne uhlík)

Mrazová fixace

Je stejně jako při použití chemického způsobu přípravy preparátů prvním a velmi důležitým krokem přípravy.

Většina živých organismů obsahuje více než 70 % vody nerovnoměrně rozdělené do membránami ohraničených oblastí. Chceme-li tedy biologický vzorek dobře mrazově zafixovat, musíme vycházet především z vlastností vody, které jej tvoří.

Při zmrazování voda vykazuje řadu anomálií, kterými se odlišuje od ostatních látek a které celý proces znesnadňují:

- její objem ve zmrazeném stavu je zhruba o 9 % větší než v kapalném stavu- její hustota není nejvyšší v bodě tuhnutí, ale v kapalném stavu při teplotě 277 K- má anomálně vysoký bod tání (273 K), bod varu (373 K) a kritickou teplotu (647 K)- má vysoké vypařovací teplo a dielektrickou konstantu, která přispívá k její roli univerzálního rozpouštědla v biochemických reakcích- je známa řada krystalických forem ledu

Tyto anomálie jsou do značné míry způsobeny přítomností intermolekulárních vazeb - vodíkových můstků a van der Waalsových sil. V praxi znamenají nebezpečí poškození ultrastruktury v důsledku potrhání buněk zvětšujícím se objemem nebo tvořícími se krystaly.

Typ ledu v závislosti na rychlosti chlazení

Robards a Sleyter, 1985

Další časté vybavení SEM

Pro určení prvkového složení:● spektrometr vlnově disperzní

nebo● EDAX

Literatura

● http://web.natur.cuni.cz/parasitology/parpages/mikroskopickatechnika/elektronovamikroskopie.doc

● Tescan● JEOL● Wikipedia● http://www.paru.cas.cz/lem/book/

Kdy se podíváme na SEM?

na KBI – Za Válcovnou 1000/8