Chromatografie

chromatografické metody

adsorpce - fyzikální, chemická

chromatografie - soubor metod sloužících k oddělování a

analýze složek ze směsí

rozdělení směsi bílkovin

rozdělení listových barviv

rozdělení reaktantů po reakci (produkty

odbourávání pesticidů)

lze rozdělovat velmi podobné sloučeniny (proteiny lišící se jednou aminokyselinou)chromatografie - citlivá metoda, nepoškozuje dělený materiál

složky směsi rozdělovány mezi dvě fáze:•stacionární fáze•mobilní fáze = eluční činidlo

složky s větší afinitou k mobilní fázi postupují rychleji než složky s větší afinitou ke stacionární fázi

stacionární fáze: náplň kolony tenká vrstva speciální papír

mobilní fáze: směs rozpouštědel - kapalinová chromatografie plyn - plynová chromatografie

základní část chromatografické sestavy: kolonakolona: skleněná , kovovározměry - podle aplikace

na koloně probíhá vlastní separace složek

Základní operace:

• nástřik vzorku do mobilní fáze - ručně, pumpou

(nastřikované objemy: ml, HPLC - 20 l)

• separace komponent směsi na koloně

• postupná eluce komponent z kolony

• detekce složek v eluátu - kontinuální nebo ve frakcích (absorbance UV, VIS; vodivost; index lomu)

závislost detekované veličiny na čase nebo na elučním objemu - chromatogram

plocha píků - úměrná koncentracikvalitativní analýza - pomocí standarů

typy chromatografie podle principu

(podle interakcí zodpovědných za dělení složek):

• adsorpční chromatografie

• rozdělovací chromatografie

• gelová chromatografie

• ionexová chromatografie

• afinitní chromatografie

• “chelátová chromatografie” - chromatografie

využívající tvorby komplexů

adsorpční chromatografie:

nejstarší chromatografie (Michail Semjonovič Cvět - 1903)

dělení na základě rozdílné pevnosti fyzikální sorpce na pevnou fázi

mobilní fáze: kapalina nebo plyn

stacionární fáze: polární (Al2O3, silikagel)

nepolární (aktivní uhlí)

rozdělovací chromatografie:

stacionární i mobilní fáze kapalná

stacionární fáze zakotvena na nosiči

papírová chromatografie: nosič = chromatografický papír stacionární fáze = voda (vzdušná vlhkost) mobilní fáze = směr organických rozpouštědel s vodou nemísitelných

dělení na základě Nernstova rozdělovacího koeficientu

gelová chromatografie:

látky se dělí podle velikosti částic (molekul)

stacionární fáze: gel s póry do určité velikosti

velké molekuly se do pórů nevejdou,

nejsou bržděny v pohybu

čím menší molekuly, tím více pórů, kam

mohou zapadat - tím větší zpožďování

směs molekul tří velikostí

zrnko gelu s póry

dělení na zrnkách gelutvořících stacionární fázi

rozdělená směs, velké molekuly vytékají jako první

ionexová chromatografie (iontově výměnná):

separuje molekuly podle náboje

stacionární fáze: iontoměnič nabitými skupinami

anex - schopen vázat a vyměňovat anionty (obsahuje kladně nabité skupiny)

katex - schopen vázat a vyměňovat kationty (obsahuje záporně nabité skupiny)

v elučním činidle 1 navázányionty na iontoměnič (anex)

elučním činidlem B - postupné uvolňování navázaných aniontůpodle velikosti náboje

povaha matrice určuje fyzikální vlastnosti ionex

mechanickou pevnost

rychlost průtoku

chování k biologickým sloučeninám

první iontoměniče - určeny pro aplikace související s úpravou vody (demineralizace, úprava vody na pitnou, “recovery” iontů z odpadů) pro takové účely: syntetické iontoměniče, matrice = hodně zesíťovaný hydrofobní polymer (vysoká kapacita pro malé ionty)

pro biologické polymery - pŕy malé pro průchod, denaturace

pro biologické materiály - celulosové měniče (hydrofilní) AE celulosa DEAE celulosanedenaturují bílkoviny, ale dovolují jen malé průtokya mají nízkou nábojovou kapacitu (jinak by se celulosa rozustila )

afinitní chromatografie:

metoda k dělení biologických molekul,

využívá specifických interakcí mezi dělenými molekulami a molekulami zakotvenými na nosiči

potřebujem 2 eluční činidla: jedno k navázání složky s afinitou, druhé pro její eluci z kolony

silné navázání - více vazezebných interakcí

slabé navázání - málo vazebných interakcí

žádná vazba - nemůže tvořit interakces molekulou kovalentně vázanou na nosiči

eluce:první odcházejí nejslaběji vázané složky

poslední vytékají nejsilněji interagujícísložky

chromatografie využívající tvorby komplexů:

v proteinech - aminokyseliny schopné tvořit komplexy

(histidin, cystein, tryptofan)

na matrici nosiče navázány kovy tvořící komplexy

než se v systému objeví protein, je koordinační sféra vysycena molekulami vody

dvě eluční činidla: A: pro nanesení vzorku a vymytí nekomplexujících složek B: pro eluci oddělených složek z kolony

plynová chromatografie:

každá chromatografie, kde mobilní fází je plyn

(gas chromatography- GC)

kapalinová chromatografie:

každá chromatografie, kde mobilní fází je kapalice

(liquid chromatography - LC)

HPLC - High Performance Liquid Chromatography

kolony: speciální náplně (jemné, stejná velikost zrn)

práce za vysokého tlaku (až 600 atm)

dávkování: cca 10 - 50 l

GC - MS, HPLC – MS (MS – mass spectrometry)

MS – princip metody

1. ionizace elektrony o E = 70kV

ABCD + e- → ABCD+ + 2 e-

2. fragmentace:

ABCD+ AB + CD+

AB+ + CD

ACD+ + B

3. separace (v magnetickém a elektrickém poli)

odchýlení podle m/z