CVIČENÍ Z MIKROBIOLOGIE

LS 2011/2012, předmět BOT/OBMSB

Vyučující:Zuzana Trojanová (24.-26.2.2012)Michaela Sedlářová (9.-11.3.2012)Barbora Mieslerová (23.-25.3.2012)+ Anna Zedková (laborantka)

Podmínky k udělení zápočtu:Protokoly Zápočtový test– termíny dle domluvy s vyučujícími

Mikrobiologické předměty a vybavení mikrobiologické laboratoře Katedry botaniky PřF UP v Olomoucijsou inovovány v rámci projektu OPVK

„Zvyšování konkurenceschopnosti studentů oboru botanika a učitelstvíbiologie“

CZ.1.07/2.2.00/15.0316

http://isb-up.cz

Sobota HodnoceníMikrobiologický rozbor pitné vody –přeočkování

Hodnocení neděle Přeočkování neděle

Srovnání účinnosti dezinfekčních prostředků

Neděle

Mikroorganismy v půdě

Stanovení citlivosti mikroorganismů na antibiotika

Neděle

Průkaz bakterií na povrchu kůže člověka - vyhodnocení

Kultivace mikroorganismů ve „visícíkapce“

odpoledne

Izolace mikroorganismů – křížový roztěr Neděle

Barvení mikroorganismů, mikroskopickésledování mikroorganismů

-

Bakterie mléčného kvašení -

filtrace 100 ml vody přes membránový filtr

přenos 1 ml vody na agarovou plotnu

MIKROBIOLOGICKÝ ROZBOR PITNÉ VODY

TTC agar s tergitolem 7

36-37°C (24- 48 hod)

Slanetz-Bartleyagar 37°C

(44-48 hod)

MasoPeptonovýAgar 22°C(do 72 h)

MasoPeptonovýAgar

36-37°C(24-48 h)

MEZOFILNÍ B.PSYCHROFILNÍ B.ENTEROKOKY KOLIFORMNÍ B.a E. COLI

Tryptofan-Sojový Agar36°C, až 24 h

žluč-aeskulin-azidovýagar (BEA), 44°C 48 h

oxidázovýtest

průkaz E. coliindol

přeočkováníčervenohnědých

kolonií

přeočkovánížlutých kolonií

3. ÚKOL - MIKROBIOLOGICKÝ ROZBOR PITNÉ VODYCíl úkolu:

Prokázat přítomnost bakterií obecného a fekálního znečištění pitné vody

Pomůcky:

TSA a TSB médium

Provedení:

1. Vyhodnocení koliformních bakterií na TTC agaru s tergitolem 7 (počet žlutých KTJ na 1 ml). Narostlé kolonie přeočkujeme:

A. na neselektivní TSA (36°C, až 24 hodin) - oxidázový test

B. do neselektivního TSB (36°C, až 24 hodin) - test na E. coli

2. Vyhodnocení mezofilních a psychrofilních bakterií (tvar a počet KTJ v 1 ml vody)

4. TTC půda s tergitolem 7 - kultivace při teplotě 36+2°C 24 hod

- stanovení KOLIFORMNÍCH BAKTERIÍ a ESCHERICHIA COLIHodnotíme počet žlutých (okrových) kolonií (KTJ/ml) a jejich tvar

Po kultivaci membránového filtru se jako laktóza pozitivní bakterie počítajívšechny charakteristické kolonie (bez ohledu na velikost), které vykazujítvorbu žlutého zbarvení média pod membránovým filtrem.

Koliformní bakterie na TTC agaru s Tergitolem

Pokud vyrostly nějaké kolonie, jsou přeneseny křížovým roztěrem na neselektivní Tryptofan-Sojový agar (TSA), kultivace při 36°C 24-48h

Bacillus

Vegetativní buňky rodu Bacillus jsou aerobní, peritrichní tyčinky, rovnés oblým nebo hranatým zakončením a poměrně velkých rozměrů: (0,5 x 1,2μm) až (2,5 x 10μm). Tvorba katalasy.

Je to rod grampozitivní

Buňky se mohou vyskytovat samostatně nebo tvoří řetízky o počtu jednotek až stovek

Významný taxonomický znak celé čeledi Bacilliaceae - tvorba jednéendospory, která se vyznačuje velkou odolností k vysokým teplotám, jedům, zářením a jiným nepříznivým podmínkám.

Pro tvorbu endospor u rodu Bacillus je absolutně nezbytná přítomnost kyslíku. Spory jsou obvykle cylindrické, elipsoidní nebo sférické, ale je možnése u některých kmenů určitých druhů setkat i s tvarem ledvinovitým. Umístěníspory v mateřské buňce (sporangiu) a zda mají spory vegetativní buňky většíšířku než vegetativní buňka (tj. zda je sporangium zduřelé) či ne je typické pro každý druh.

Charakteristika rodu

Kingdom: BacteriaPhylum: FirmicutesClass: BacilliOrder: BacillalesFamily: BacillaceaeGenus: Bacillus

Rod Bacillus je rozsáhlý a v přírodě velmi rozšířený.Zástupci mohou rozkládat nejrůznější organické sloučeniny, mají bohatou enzymatickou výbavu

- aktivní amylolytické enzymy, které štěpí škrob- pektolytické enzymy, které štěpí rostlinné pektiny- velmi aktivní proteolytické enzymy, takže se uplatňuje při aerobním a anaerobním rozkladu bílkovin.

Bacillus cereus - Gramovobarvení

Řada druhů produkuje antibiotika polypeptidové povahy, z nichž některáse pomocí těchto bakterií vyrábějí průmyslově (např. bacitracin).

Určité druhy slouží pro průmyslovou přípravu enzymů. Bakteriální amylasyzískané z Bacillus subtilis se uplatňují v pivovarství a v textilním průmyslu proteinasy se používají především do pracích prostředků.

Významné druhy rodu BacillusBacillus anthracisJe známá především jako původce onemocnění anthrax, v přírodě je to však půdní bakterie, která tvoří spory. Primárně je tato bakterie patogenem býložravých savců, nákazy u člověka jsou zaznamenávány především v rozvojových zemích, ve vyspělých zemích pak hrozí použitítéto bakterie v bioterorismu.

Anthrax na obarvenémikrofotografii v slezinové tkáni

Bacillus cereusβ- haemolytická bakterie, která může způsobovat onemocnění z potravin. Onemocnění vzniká po požití kontaminovaných potravin enterotoxinogenním kmenem a z kontaminovaných kosmetických přípravků, či očních kapek. Průjmová forma (8-24 hpi) se spojuje s konzumací masových pokrmů a omáček a je podobná otravě, kterou vyvolal Clostridium perfringens.Emetická fáze začíná 1 – 6 hodin po požití kontaminované potravy a je dávána do souvislosti s požitím rýžových pokrmů a těstovin. Podobnost s otravou, kterou způsobil Staphylococcus aureus.

Kolonie Bacillus cereus na krevním agaru

Převážně se vyskytuje v půdě, ve vodě a na rostlinách.

Bacillus thuringiensisobsahuje tzv. cry toxiny, které mají insekticidní účinky na některé skupiny hmyzu a proto se užívá k produkci pesticidů a také geneticky modifikovaných (transgenních) rostlin.

Bacillusthuringiensis

Bacillus subtilisběžně nacházený v půdě. Není považován za humánního patogena; může kontaminovat potravu, ale zřídka způsobuje jedovatost potravin.

B. subtilis produkuje proteolytický enzym subtilisin. Spory mohou přežívat teplo, které se používá při úpravě potravin, je zodpovědný za vznik provázkovitosti v chlebovém těstě – pevná, provázkovitá konzistence kteráje dána produkcí dlouhořetězových polysacharidů.

Kolonie Bacillus subtilis na médiu

Bacillus subtilisbarvený na endospory

B. subtilis, syn. B. atrophaeus – cíleně používaný ke zkoušenídesinfekčních přípravků .

7. ÚKOL - Srovnání účinnosti dezinfekčních prostředkůCÍL: Určit nejúčinější dezinfekční prostředek

POMŮCKY: roztok desinfekčního prostředku, suspenze sporulujícíchmikroorganismů – Bacillus subtilis, Pasteurova pipeta, zkumavky, tekutémédium /Masopeptonová půda/, termostat, skleněné pipety 10 ml, násadec na pipety

PROVEDENÍ: Zkumavky popíšeme pořadovými čísly 1-5, poslednízkumavka je označena K jako kontrola.

Ředění provedeme podle schématu

A1 1% (9ml média a 1 ml 10% roztoku desinfekce)A2 0,1% (9 ml média a 1 ml protřepaného roztoku A1)A3 0,01% (9 ml média a 1 ml protřepaného roztoku A2)A4 0,001% (9 ml média a 1 ml protřepaného roztoku A3)A5 0,0001% (9 ml média a 1 ml protřepaného roztoku A4)K kontrola (10 ml média)

Desinfekční prostředky: 10% Ajatin, 10% SAVO, 10% Incidur, 10% Chloramin

Každou zkumavku naočkujeme 5 kapkami sporové suspenze Bacillussubtilis a zkumavky umístíme do termostatu při 37°C po dobu 24 hod.

Mikroorganismy v půdě, celulolytické bakterie

MIKROORGANISMY V PŮDĚ

Půda je jedním z přirozených stanovišť mikroorganismů. Bakterie se vyskytují v půdě ve velkém množství i počtu jedinců.

Mikroorganismy jsou rozhodujícím faktorem při vzniku půdy, ovlivňuji půdní strukturu, účastní se rozkladu organické hmoty. Produkuji řadu látek prospěšných pro rostliny (vitamíny, růstovélátky), některé fixují vzdušný dusík.

Jsou důležitými články v koloběhu uhlíku (Myxococcus, Pseudomonas, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium), dusíku (Azotobacter, Clostridium), síry (Thiobacillus), železa, manganu.

Výskyt bakterii v půdě je dán množstvím živin a ostatními faktory prostředí (vlhkost, teplota, kyselost).

Některé mikroorganismy se vyskytují v půděpřirozeně, jiné pouze v přítomnosti dostatečného množství živin.

1. Autochtonní – přirozené půdní organismy, jsou po celý rok zastoupeny v relativně konstantním počtu

Pseudomonas

Agrobacterium

Corynebacterium

Mycobacterium

Nocardia

KLASIFIKACE PŮDNÍCH BAKTERIÍ

Autochtonní druhy - druhy mikroorganismů osídlující dané stanoviště od počátku.Zymogenní druhy - druhy, jejichž přítomnost závisí na aktuálně zvýšenékoncentraci živin nebo dodání zvláštních látek (taky se označují jako allochtonní).

2. Zymogenní – metabolicky aktivní druhyVyskytují se ve vyšším počtu jen tehdy, je-li dostatečná zásoba živin. Vyznačují se mohutnou metabolickou aktivitou a podílejí se na procesech mineralizace půdy, zajišťují koloběh jednotlivých prvků v biosféře.

Bacillus

Mycobacterium

Pseudomonas – některé druhy

Flavobacterium – některé druhy

Enterobacter - některé druhy

Aeromonas

sinice – Nostoc, Anabaena

3. Patogenní bakterie – baktérie patogenní pro rostliny nebo živočichy včetně člověka, do půdy se dostávají sekundárně z různých zdrojů a mohou v půdě přežívat značnou dobu. Kontaminují půdu, nemnoží se zde, přežívají ve formě endospory.

Bacillus anthracis

Pseudomonas aeruginosa

Erwinia

Clostridium tetani

Agrobacterium

PseudomonasBakterie tyčinkovitého tvaru, gram-negativní, jeden nebo více polárních bičíků, aerobní nebo fakultativně anaerobní, nesporogenní, pozitivníkatalázový test. Některé z nich jsou fluoreskující. Nejznámější druhy jsou P. aeruginosa (příležitostný lidský patogen); P. syringae (rostlinný patogen); P. putida (půdní druh); P. fluorescens (promotor růstu rostlin).

Pseudomonas aeruginosa – oportunní lidský patogen. Pouze ojediněle vyvolává primární infekce, může však napadnout jakoukoliv tkáň nebo orgán (způsobuje infekce močových nebo dýchacích cest, gastrointestinálnía oční infekce atd).

Pseudomonas aeruginosa může vyvolávat infekce ran

Agrobacterium

Rod gram negativních bakterií, které používají horizontálního přenosu genů, a tvoří nádory na rostlinách. V současné době mnoho druhů je reklasifikovánodo rodu Rhizobium. Nejznámější je druh A. tumefaciens tvořící nádory na kořenech rostlin. Zástupci tohoto rodu mohou způsobovat humánní infekce u pacientů s oslabenou imunitou.

Corynebacterium

Rod gram-pozitivních aerobních nebo fakultativně anaerobních bakterií, nepohyblivé, nesporulující, tyčinkovitého tvaru. Většinou nejsou patogennípro člověka, ale jsou součástí běžné mikroflóry kůže. Vyskytují se na různých nikách, jako je půda, odpadky, rostliny, kůže. Např. Corynebacterium diphtheriae (původce záškrtu) je významný patogenčlověka.

Mycobacterium (mykobakterie)rod nepohyblivých a nesporulujících bakterií ze samostatné čeledi Mycobacteriaceae, řazené k aktinomycetám. Jsou většinou považovány za grampozitivní. Mají však komplexní buněčnou stěnu, předpona –mykoodkazuje na fakt, že jejich buněčná stěna obsahuje vosky. Mykobakterierostou obecně poměrně pomalu, jsou acidorezistentní („acid fast“), tzn. zbarvení vyvolané činidly se nedá vymýt kyselinami.

Mykobakterie jsou široce rozšířené organismy, typicky žijící ve vodě (i chlorované vodě) a zdrojích potravy. Někteří zástupci způsobují těžkáonemocnění (tuberkulóza – Mycobacterium tuberculosis, tuberkulóza skotu – M. bovis a lepra – Mycobacterium leprae), jsou obligátními patogeny a nemohou žít volně.

Nocardia (nokardie)

rod grampozitivních aerobních bakterií, tyčinkovitého tvaru, z kmene aktinobakterií. Často však tvoří vláknité vzdušné mycelium. Jejich buněčnástěna je podobná stěně mykobakterií.Řadíme k nim asi 85 druhů. Nokardie se vyskytují po celém světě především v půdě bohaté na humus.Některé z nokardií jsou oportunisticky patogenní (původci nokardióz). Nokardie, které infikují člověka, se do těla dostávají z půdy. V ohroženíonemocnění jsou zejména pacienti se sníženou imunitou (infekce HIV, transplantace kostní dřeně, atp.)

Bacillus

rovné grampozitivní sporulující tyčinkovité bakterie o velikosti 1x4 um, z čeledi Bacillaceae. Bakterie rodu Bacillus se využívají hlavně v medicíně, kde produkují antibiotika. Tvoří bělavé až hnědavé nepravidelné kolonie buněk. Tyto bakterie jsou aerobní, nebo fakultativně aerobní. Určité druhy slouží pro průmyslovou přípravu enzymů. Bakteriální amylasy získanéz Bacillus subtilis se uplatňují v pivovarství a v textilním průmyslu proteinasy se používají především do pracích prostředků.

Bacillus anthracis

Je známá především jako původce onemocnění anthrax, v přírodě je to však půdní bakterie, která tvoří spory. Primárně je tato bakterie patogenembýložravých savců, nákazy u člověka jsou zaznamenávány především v rozvojových zemích, ve vyspělých zemích pak hrozí použití této bakterie v bioterorismu.

Anthrax na obarvenémikrofotografii v slezinové tkáni

FlavobacteriumGram-negativní, nepohyblivá, tyčinkovitá bakterie. Flavobakterie jsou nacházeny ve vodě a v půdě na rozličných stanovištích. Některé druhy mohou způsobovat choroby sladkovodních ryb.

Flavobacteriumpsychrophilum

Clostridiumrod bakterií volně žijících hlavně v mírně kyselých půdách. Je to anaerobní, sporulující, mezofilní, grampozitivní tyčinka. Fixuje vzdušný dusík a energii získává máselným kvašením. Využívá se při průmyslové produkci kyseliny máselné, na druhou stranu produkuje toxiny (Clostridium botulinum, Clostridium tetani - Bakterie produkuje neurotoxin tetanospasmin, což je podstatou procesu, v důsledku kterého dochází u infikovaných lidí k onemocnění tetanem.

Clostridium pasteurianumžije v půdě, má schopnost vázati volný dusík

Erwinia

Rod gramnegativních, fakultativně anaerobních tyčinkovitých bakterií z čeledi Enterobacteriaceae. Žijí saprofyticky, popřípadě jako paraziti zejména na rostlinách. Z více než 20 druhů jsou nejznámější Erwinia amylovora, Erwiniacarotovora a Erwinia herbicola.

Erwinia carotovorazpůsobující měkkou hnilobu hlíz bramboru

Podstatnou součástí buněčných stěn rostlinných buněk je celulosa (velmiodolný, nerozpustný polysacharid). V rostlinném materiálu je obvykle doprovázena dalšími obtížně odbouratelnými látkami, např. hemicelulosami, pektiny, ligniny, tuky a pryskyřicemi.

Na rozkladu celulózy se podílí řada mikroorganismů, které ji štěpíexoenzymem celulázou na celobiosu a potom na glukosu. Zastoupeni aerobnich celulolytických bakterií je ukazatelem úrodnosti půdy.

V intenzivně obdělávaných půdách se vyskytují zástupci rodů Cellvibrio, Cellfalcicula, Cytophaga, SporocytophagaVe středně obdělávaných myxobakterieVe slabě obdělávaných půdách a v kyselých půdách převládajímikroskopické houby.

Celulóza může být rozkládaná také za anaerobních podmínek.

Cytophaga

Sporocytophaga

MYXOBAKTERIE Význam v případech, kdy je třeba určit původ fekálního znečištění.

Myxobakterie –jako významnécelulolytické druhy se vyskytují mimo jinév zažívacím traktu býložravců.

Jejich zvýšený výskyt ve vodě tak může prokázat znečištění pocházející ze zemědělských provozů.

Životní cyklus je specifický – vyznačuje se tvorbou makroskopicky zřetelných plodniček.

Ve vodě mohou přežívat poměrně dlouho (až rok), jejich počty zde klesají, neboť se zde rozmnožují jen v omezené míře.

8. ÚKOL - Mikroorganismy v půdě

A. Celulolytické bakterie v půdě

Cíl úkolu:Zjistit, zda se ve vzorcích půdy vyskytují celulolytické bakterie

Pomůcky:půdní vzorky proseté sítem o velikosti ok asi 2 mm, nastříhané proužky

filtračního papíru velikosti 4 x 1 cm, pinzeta, stříkačka s destilovanou vodou

Provedení:Vzorky proseté zeminy dáme do Petriho misek, povrch zarovnáme. Mírně

provlhčíme a na rovný povrch uložíme pinzetou paralelně vedle sebe několik proužků filtračního papíru. Kultivujeme při teplotě 26°C.

Vyhodnocení:Hnědé, oranžové nebo zelené skvrny na povrchu papírků signalizují přítomnost

celulolytických bakterií. Jejich účinkem se papír rozpadá a mizí

Porovnáváme jednotlivé typy zemin. Humusem bohaté zeminy obsahují více celulolytických bakterií než půdy humusem chudé a bezstrukturní. V písčitých půdách se vyskytují málo.

B. Průkaz bakterií v půdě/zemině

Cíl úkolu:Prokázat přítomnost mikroorganismů ve vzorcích půdy

Pomůcky: Vzorky půdy, sterilní fyziologický roztok, zkumavky, dělené pipety

na 10 ml, mikropipety, hokejky, agarová plotna MPA.

Provedení: 1 g zeminy suspendujeme v 10 ml fyziologického roztoku a důkladně

protřepeme. Ze suspenze přeneseme:

0,1 ml na povrch agarové plotny /MPA/ a rozetřeme hokejkou

1 ml roztoku z první zkumavky přeneseme do 9 ml fyziologického roztoku, protřepeme, přeneseme 0,1 ml na povrch agarové plotny /MPA/ a rozetřeme hokejkou (ředení možno opakovat)

Naočkované plotny inkubujeme v bioinkubátoru při teplotě 26°C 24-48 hod

9. ÚKOL - Stanovení citlivosti mikroorganismů na antibiotika Stanovení účinnosti antibiotik – difuzní disková metoda

Cíl úkolu:

Stanovení citlivosti/rezistence bakterií k vybraným antibiotikům terčíkovou metodou, určení účinného antibiotika

Pomůcky:

zkumavky s tekutou půdou (MP bujón) a namnoženými kmeny bakterií(E. coli), kotoučky filtračního papíru Sensi-La-Dish (nasyceny antibiotiky dané koncentrace), sterilní MPA, sterilní hokejka, sterilní pinzety

Provedení:

Povrch agarové plotny MPA naočkujeme suspenzí bakteriálního kmene (100 μm) /např. S. aureus, E. coli, B. atrophaeus/ nebo roztokem vlastních bakterií a položíme barevné kotoučky Sensi disků v pravidelných vzdálenostech do kruhu. Petriho misku obrátíme dnem vzhůru a inkubujeme 24 h při teplotě 37°C.

Stanovení účinnosti přírodních antibiotik – česnek

Princip:Česnek obsahuje ALLIIN (S-allyl-L-cystein sulfoxid)Alliin je prekurzorem fytoanticipinu s názvem ALLICIN (diallylthiosulfinát), který vzniká po porušení pletiv působením enzymu alliinasy

Pomůcky:

sterilní MPA, bakteriální kultury na pevném nebo v tekutém médiu, klička nebo dávkovač, sterilní hokejka, sterilní pinzety, třecí miska, váhy, česnek

(Allium sativum - český, čínský)

Provedení:

MPA očkujeme známými postupy /E. coli/, 0,5 g česnekového extraktunaneseme na svrchní víčko Petriho misky (allicin se odpařuje), přiklopíme naočkovaným agarem a dnem vzhůru inkubujeme 24 h při teplotě 37°C.

Normální mikroflóra sliznic a pokožky člověka

Normální bakteriální flóra kůže a sliznic

Každý jedinec je po narození postupně osídlen mikroorganismy ze zevního prostředí

Za normální se považují jen bakterie, even. plísně, (nikoliv viry pro jejich obligatorní intercelulární parazitismus)

Povrch těla, který zahrnuje kůži, sliznice gastrointestinálního, urogenitálního a respiračního traktu, je trvalé kolonizován jen omezeným počtem druhů, jejich výběr je pro danou lokalitu charakteristický. V této lokalitě se tyto druhy jako patogeny vůči hostiteli nechovají.

Vzájemný kvantitativní vztah mezi druhy je udržován v rovnováze = normálníflóra, residentní flóra. Normální flóra ovlivňuje fyziologické funkce (vstřebávání, peristaltiku), produkuje vitamíny.

Flóra transientní (přechodná), kdy sliznice je krátkodobě kolonizována druhem, který nevyvolává patologické změny

Žádný z druhů patřících k normální flóře není primární patogen, ale v jiných lokalitách se může uplatnit jako podmíněný patogen

Význam normální flóry v protekci kůže a sliznic před invazí druhů s vyššípatogenitou je výsledkem souhry rozličných mechanismů, z nichž se nejvíce uplatňuje obsazení buněčných receptorů, kompetice o živiny, produkce bakteriocinů, vznik metabolických produktů inhibujících růst (kys. mléčná), změny prostředí (pH).

U bezmikrobních jedinců se vyvíjí imunitní systém podstatně obtížněji a je proto zranitelnější zevní infekcí. Naopak trvalá přítomnost mikrobů na sliznicích představuje významné riziko infekce endogenní. U imunosupresíje větší riziko infekce endogenní než ohrožení infekcí z vnějšího prostředí.

Před transplantacemi a u radikální imunosupresívní léčby obecné se toto riziko omezuje dekontaminací, tj. vyhubením veškeré residentní flóry. Po ukončení období hluboké imunosuprese se pak normální flóra obnovuje rekolonizací s využitím známých kmenů těch druhů, které se podílejí na normální flóře

Normální flóra kůže

Normální osídlení je ovlivněno vlastnostmi kůže (vlhkost, umístění mazových a potních žláz) a kontaminací ze sousedních sliznic.

Hlavní bakteriální druhy na kůži Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus hominis, Staphylococcus aureus, Propionibacterium acnes. S. aureus nejčastěji na perineu, ale i na sliznici nosu.

V oblastech s vyšším výskytem mazu – propionibacteria, lipofilníkorynebakterie

Hlavní houbové druhy: Candida, Torulopsis, Pityrosporum

Největší osídlení je v uzavřených oblastech (axila, meziprstní prostory na nohou, perineum), kde při vlhké zapářce je možný snazší průnik do hloubky.

Staphylococcus epidermidis

Staphylococcus aureus

Patogenní pro člověka a další teplokrevnéživočichy. K onemocnění dochází při oslabení organismu. Zánětlivá ložiska v ranách, průnik do krve a další infekce – v plicích, osrdečníku, mozkových blanách, kostech. Toxinózy. Mastitida. Napadenístřev.

Oportunní patogen, napadá oslabené pacienty. Dostane se do těla s předměty z umělé hmoty, velmi dobře adheruje na jejich povrch.

Propionibacterium acnes

Je spjata s výskytem akné.

Candida

Torulopsis

Přemnožení způsobuje oslabený imunitní systém, užíváníantikoncepčních pilulek, antibiotik, stres, špatná výživa, nadměrnémnožství cukru, alkoholu . Výtoky z pochvy, ekzémy, povleklý jazyk, onemocnění kůže, nehtů.

Respirační traktMá více ekosystémů s charakteristickou flórou

Nos, orofarynx (ústní část hltanu) a tonsily (mandle) jsou velmi hustěkolonizovány.

V nosní dutině – Staphylococcus epidermidis, méně často Coryneformníbakterie, v 10% Staphylococcus aureus

Farynx, tonsily – různé druhy ústních streptokoků a nepatogenní druhy neisserií

Z druhů s vyšším patogenním potenciálem se tu přechodně mohou vyskytovat v závislosti na roční době a prostředí – Streptococcuspneumoniae, Neisseria meningitidis a Haemophilus influenzae.

V podmínkách jednotek intensivní péče a při změnách fyziologické funkce sliznice mohou kolonizovat horní cesty dýchací gramnegativní tyčky, zejména enterobakterie (klebsielly, escherichie), ale i pseudomonády.

Tyto druhy mohou přecházet na sliznice dolních cest dýchacích, které jsou za normálních okolností sterilní.

Staphylococcus aureus kolonizuje horní cesty dýchací s výjimkou nosu obvykle jen přechodně. Často se vyskytuje spolu s virovou infekcí.

Corynebacterium sp. Streptococcus pneumoniae

Může způsobovat infekce plic (pneumonie), středouší (otidismedia).

Neisseria meningitidis

Haemophilus influenzae

Běžně se nazývá meningokokzpůsobuje zánět mozkových plen (meningitidu), probíhá velmi rychle a bez léčby zabíjí do několika dnů druhotné záněty dýchacích cest,

prvotní poškození sliznice způsobí jiný patogen především vir, často provází chřipku

Zažívací trakt Dutina ústní – ústní streptokoky (Streptococcus albus), Streptococcuspneumoniae, nesporulující anaeroby (koky, Actinomyces)

Povrch zubů – bakterie tvoří podstatnou část zubního plaku. Kyseliny vznikající při bakteriálním metabolismu poškozují zubní sklovinu a vedou tak ke vzniku zubního kazu. Nejčastěji – Streptococcus mutans.

V jícnu se obvykle normální flóra neprokazuje, což je dáno patrně velmi rychlou pasáží obsahu do žaludku.

V žaludeční dutině – výrazné uplatnění HCl, výrazně omezuje výskyt bakterií v žaludečním obsahu. Dále mohou přejít acidoresistentní bakterie, plísně. Převažují druhy, které svým metabolismem neutralizují kyselé prostředí.

Střevo – osídlení střeva je odlišné podle způsobu výživy (vegetariáni), podle geografických oblastí (tropy).

V tenkém střevě – velmi nízká koncentrace bakterií (do 105 na 1 g). Malý obsah bakterií je způsoben rychlou peristaltikou a vlivem žluče. Ústnístreptokoky, enterokoky (Enterococcus faecalis, E. faecium), enterobakterie(Enterobacteriaceae) a laktobacily.

Streptococcus mutans

Lactobacillus sp.

Enterococcus (Streptococcus) faecalis

Jsou podmíněně patogenní, původci infekcí močových cest, žlučových cest, gynekologických zánětů , pooperačních komplikací.

Enterobacter sp.

Mohou být původci akutních i chronických zánětů močových cest.

V tlustém střevě a stolici se hodnoty bakterií pohybují mezi 109-1011 bakteriív 1 g.

Identifikováno více než 400 druhů bakterií, které je možno považovat za normální flóru tlustého střeva. 95% jsou striktní anaerobové – Bacteroides, Fusobacterium, Eubacterium, Bifidobacterium, Clostridium. – tyto svými metabolickými produkty inhibují růst jiných bakteriálních druhů (tvorbou kys. octové, máselné, mléčné).

Enterokoky (Enterococcus faecalis, E. faecium).

Dále Enterobacteriaceae – Escherichia coli a laktobacily

U kojenců v dobrých hygienických podmínkách je střevní sliznice kolonizována převážně laktobacily.

Fusobacterium

Eubacterium

Bifidobacterium

Clostridium difficle

Escherichia coli

Enterotoxikogenní kmeny mohou vyvolávat průjmy

Urogenitální trakt

Z močových cest je normálně osídlena pouze sliznice přední části močovétrubice – Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis, koryneformnítyčky, přechodně se může vyskytnout Escherichia coli a Proteus.

Z patogenních druhů Neisseria gonorhoae (kapavka), Treponema palidum(syfilis)

Na zevním genitálu žen se normálně vyskytuje flóra obdobná jako na kůži, převládají grampozitivní koky (Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis, Sarcina) a také Candida.

Flora ve vagíně je ovlivněna hormonálně. Po porodu přetrvává osídlenílaktobacily, v dětství až do puberty je ve vagině flóra podobná jako na zevním genitálu. S pubertou nastupuje osídlení laktobacily, které snižují pH a tím se snižuje možnost osídlení jinými bakteriálními druhy.

Kromě laktobacilů – nesporulující anaerobi, grampozitivní koky a fungi (Candida).

Někdy ve vagině – Streptococcus agalactiae – riziko pro novorozence.

Proteus

Sarcina

Streptococcus agalactiae

Může ohrozit zejména novorozence (nakazí se v průběhu porodu), -způsobuje meningitidy, sepse, pneumonie

ZUBNÍ PLAK

= PŮVODCE ZUBNÍHO KAZU

5. ÚKOL - Průkaz bakterií na povrchu kůže člověka -

vyhodnocení minulého cvičení

Vyhodnocení:

1. Na agarové plotně spočítáme počet vyrostlých kolonií a popíšeme jejich morfologické vlastnosti.

2. Srovnáme počet kolonií vyrostlých z otisků neumytých rukou a umytých rukou po použití desinfekce

3. Z vybraných kolonií si připravíme nativní preparát, který prohlédneme velkým zvětšením mikroskopu a popíšeme. Tvar kolonií, tvar buněk pod mikroskopem.

TYPY BAKTERIÁLNÍCH KOLONIÍ

Bakterie kultivované z otisku prstu

10. ÚKOL - Izolace mikroorganismů – křížový roztěr

Cíl: seznámit studenty se způsobem získávání čistých kultur mikroorganismů

Pomůcky: Bakteriologická klička, Petriho misky s živnou půdou, lihový kahan

Postup: Ze suspenze mikrobů ve fyziologickém roztoku nebo přímo z vyrostlé kolonie na agaru odebereme bakteriologickou kličkou část populace a rozetřeme do několika /3-4/ vodorovných čar po povrchu agarové plotny. Kličku vyžíháme a po vychladnutípřiložíme na konec rozetřených čar a znovu rozetřeme do několika čar. Tento postup opakujeme několikrát a zakončíme vlnitou čarou. Kultivujeme v inkubátoru při příslušné teplotě.

Kultivace bakterií ve visící kapce

= suspenze mikroorganismů visící na krycím skle, která se nedotýkápodložního skla (s vybroušenou jamkou)

používá se pro kultivaci a pozorování živých bakterií – zejména k určenípohyblivosti (taxonomie)

vytvoření malé „vlhké komůrky“ – kapka s bakteriemi je uzavřená mezi dvěma skly - to zabraňuje kontaminaci organismy z okolí a umožňuje kultivaci (vzorek nevyschne jako obyčejný vodní preparát)

11. ÚKOL - Barvení mikroorganismů, mikroskopickésledování mikroorganismůA. Zhotovení nativního preparátu

Cíl: Pozorování bakterií pod mikroskopem

Pomůcky: Odmaštěné podložní sklo, agarová miska s koloniemi bakterií, bakteriologická klička, voda, sterilní párátko, Lugolův roztok, lihový kahan, imerzní olej a objektiv.

Provedení:Sterilním párátkem sejmeme vzorek hlenu z krčku povrchu zubu, resp. bakteriologickou kličkou přeneseme narostlé mikroorganismy z Petriho misky na podložní sklíčko s malou kapkou destilovanévody nebo Lugolova roztoku. Rozmícháme a přímo párátkem rozprostřeme do kruhové plochy/průměr asi 15 mm/

Výsledky:Při velkém zvětšení mikroskopu pozorujeme bakterie různých tvarů(koky, tyčinky). Zakreslíme jednotlivé mikroorganismy.

Tyčinkovitý tvar bakterií(otisk prstu)

Kokální tvar bakterií

B. Kultivace bakterií ve visící kapce

Cíl: Pozorování živých bakterií

Pomůcky: Odmaštěné podložní sklo s výbrusem, krycí sklo agarovámiska s koloniemi bakterií (Bacillus subtilis), bakteriologická klička, kapátko destilovaná voda, vlhká komůrka, imerzní olej a objektiv.

Provedení:Doprostřed krycího skla přeneste bakteriologickou kličkou suspenzi bakterií. Kapátkem do každého rohu krycího sklíčka kápněte malou kapku destilované vody a přiklopte podložním sklem s výbrusem. Otočte, přeneste do vlhké komůrky a kultivujte několik hodin při 37°C. Po kultivaci pozorujte pod mikroskopem.

C. Negativní barveníCíl:

mikroskopické stanovení pouzder a slizů bakterií

Pomůcky:

odmaštěná podložní skla, černá tuš, bakteriologická klička, sporulující kultura bakterie Bacillus atrophaeus

Provedení :

Na odmaštěné podložní sklo kápneme malé množství tuše zředěnédestilovanou vodou 1:2. V této kapce dobře rozmícháme malémnožství bakterií. Hranou dalšího podložního skla rozetřeme suspenzi po celé ploše a necháme volně na vzduchu zaschnout.

NEFIXUJEME!

Pozorujeme pod imerzí při zvětšení 1000x

Výsledek: zapíšeme a zakreslíme do protokolu

Spirillum volutans

Negativní barvení(Burriho metoda)

Bakterie mléčného kvašení

Bakterie mléčného kvašení

Jsou schopny enzymatické přeměny sacharidů na kyselinu mléčnou (a současně další produkty jako kys. máselná, propionová, octová, aceton, ethanol, oxid uhličitý aj.) .

Vyskytují se jak volně v přírodě (např. odpadní vody, ovoce a ovocnéšťávy), tak jsou záměrně součástí produktů potravinářského průmyslu –mléčné a obilné výrobky, maso a rybí výrobky, pivo, víno, nakládanázelenina, kysané zelí, siláž, kynuté těsto, slad a další. Jsou složkou přirozené mikroflóry v ústech, intestinálním traktu a vagíně mnohých živočichů včetně člověka.

Základním tvarem mléčných bakterií je tyčinka, která může být různědeformovaná v závislosti na rodu a druhu bakterie.

Mléčné kvašení je jeden z nejvýznamnějších fermentačních procesů v potravinářské biotechnologii.

Probíhá-li za vzniku pouze kys. mléčné, označuje se jako homofermentativní,vznikají-li vedle kys. mléčné i vedlejší produkty, nazývá se heterofermentativní.

Homofermentativní mléčné kvašení probíhá dle rovnice: C6H12O6 → CH3 – CHOH – COOH

Heterofermentativní mléčné kvašení probíhá dle rovnice: C6H12O6 → CH3 – CHOH – COOH + CH3COOH + C2H5OH + CO2 + H2

Mléčné bakterie se na základě jejich enzymatického vybavení rozdělují do třískupin:

1) Obligátní homofermentativní bakterie

2) Obligátní heterofermentativní bakterie

3) Fakultativní homofermentativní bakterie

Čeleď Lactobacillaceae

Čeleď Lactobacillaceae řadíme do domény Bacteria, kmenu Firmicutes, třídy Bacilli, řádu Lactobacillales.

Čeleď Lactobacillaceae zahrnuje v současnosti tři rody klasických bakteriímléčného kvašení: Lactobacillus, Paralactobacillus, Pediococcus.

Tato čeleď byla vyčleněna na základě sekvencování genomu pro 16S rDNA ze skupiny grampozitivních bakterií s nízkým procentuálním obsahem G + C.

Jsou tvořeny pravidelnými, nesporulujícími, grampozitivními tyčinkami nebo koky. Patří sem nepigmentující, mezofilní, chemoorganotrofní druhy, které rostou pouze na kompletním médiu.

Jsou náročné na výživu – vedle sacharidů jako zdroj energie a uhlíku vyžadují nukleotidy, aminokyseliny, vitamíny a jiné org. sloučeniny.

Některé heterotrofní laktobacily se vyskytují jako nežádoucí kontaminace ve vinařství, pivovarnictví, drožďářství a při zpracování masných výrobků.

Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii

Pediococus acidilactici Pediococcus pentosaceus

Lactobacillus plantarum

Do rodu Lactobacillus patří zejména tyto druhy: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus casei subsp. casei, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis (Lactobacillus lactis), Lactobacillus helveticus, Lactobacillus plantarum a další druhy.

Lactobacillus acidophilus

Buňky mají tvar pravidelných tyčinek, občas také koků. Vyskytují se jednotlivě i v řetízcích, někdy tvořívláknité formy. Jsou grampozitivní, nesporulující, fakultativně anaerobní, občas mikroaerofilní

Čeleď StreptococcaceaeČeleď Streptococcaceae zahrnuje rody Streptococcus, Lactococcus a Lactovum.

Patří sem patogenní, saprofytické i biotechnologicky využívané druhy. Buňky jsou kulovité nebo oválné, vyskytují se po dvou nebo v řetízcích rozmanitédélky. Jsou grampozitivní, většinou fakultativně anaerobní, nepohyblivé a netvoří endospory.

V mlékařském průmyslu jsou používány streptokoky: Streptococcus salivarius subsp. thermophilus (synonymum Streptococcus thermophilus), Lactococcus lactis, Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetilactis,Lactococcus lactis subsp. cremoris

Streptococcus salivarius subsp. thermophilus,

Lactococcus lactis

Lactococcus lactis subsp. cremoris

Bifidobakterie náleží do třídy - Actinobacteria (Aktinomycety), podtřída Actinobacteridae, řád Bifidobacteriales, čeleď Bifidobacteriaceae.

Od ostatních bakterií mléčného kvašení se odlišují odlišnou metabolickou dráhou fermentace cukrů. Vedle kys. mléčné a octové produkují vitamíny jako thiamin a laktoflavin.

Tvoří přirozenou součást střevní mikroflóry savců a prostřednictvím svých metabolitů se podílejí na potlačení nežádoucích mikroorganismů v zažívacím traktu, čehož se využívá při léčení zažívacích potíží. Jsou součástímlékárenských výrobků na bázi jogurtů.

Nejčastěji využívaní zástupci r. Bifidobacterium – B. animalis (syn. B. lactis) –součást trávicího traktu, Bifidobacterium bifidum - nachází se zejména v tlustém střevě a v pochvě.

Čeleď Bifidobacteriaceae

Bifidobacterium bifidum

Bifidobacterium lactis

Kysané mléčné výrobky (též fermentované mléčné výrobky) je soubor všech mléčných produktů připravených z mléka za přídavku kysacích kultur neboli fermentujících bakterií. Nejčastěji se používají bakterie rodu Lactobacillus, Bifidobacterium, či Lactococcus. Mezi kysané mléčné výrobky patří jogurty, kysaná, acidofilní nebo jogurtová mléka, kysaná smetana.

Kysané mléčné výrobky- jemná sraženina mléčných bílkovin- delší trvanlivost, rychlá stravitelnost- kysací kultury ze sterilního mléka a čistých kultur- anaerobní přeměna laktosy na kys. mléčnou, pH 3,8 - 4,6

Rozdělení dle mikrobiálních druhů:- mesofilní bakterie mléčného kvašení

(smetanový zákys, podmáslí . . .)- termofilní bakterie mléčného kvašení

(jogurt, acidofilní mléko . . .)- bakterie mléčného kvašení a kvasinky

(kefír, kumys . . .)

Kysané mléčné výrobky

Bakterie mléčného kvašení se využívají také v průmyslu masném, tukovém, konzervárenském a pekárenském.

Jako monokultury se v mlékárenské výrobě používají mikroorganizmy, kteréobsahují jen jeden kmen jednoho druhu mikroorganizmů, popř. jestliže obsahují více kmenů jednoho druhu mikroorganizmů

Jako směsné bakteriální kultury, - obsahují více druhů a kmenů bakterií

Směsné kultury bakteriální a kvasinkové - obsahují více druhů a kmenůbakterií i kvasinek zkvašujících laktózu

Některé monokultury jsou využívány k sestavování směsných kultur. Tyto směsné kultury se pak většinou nazývají podle výrobku, k jehož výrobě sloužíkultura jogurtová (Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus acidophilus, Streptococcus salivarius subsp. thermophilus, Bifidobacterium bifidum)kefírová (Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactobacillus casei, Candida kefir) smetanová (Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetilactis, Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris)

Probiotika

Probiotika jsou bakterie a to převážně bakterie mléčného kvašení. Ne všechny mléčné bakterie však mají probiotické vlastnosti.

Bylo navrženo přes dvacet kriterií, která by měla charakterizovat mikroorganizmy s probiotickými vlastnostmi. Odborníci se shodli na pěti z nich:

- jsou humánního (lidského) původu- nejsou patogenní- neničí se v kyselém prostředí a v přítomnosti žluči (nesmí být během průchodu zažívacím traktem zničeny nebo oslabeny)- neničí se během výrobního procesu a zůstávají životaschopné po celou dobu trvanlivosti potraviny- je prokázán jejich pozitivní vliv na zdravotní stav

Příklad prokázaných účinků probiotik:- snižují účinek některých karcinogenních látek z mikroorganizmů- zvyšují odolnost vůči průniku infekcí (např. proti průjmovým onemocněním)

- posilují intestinální mikroflóru při tlumení alergických reakcí- zlepšují kvalitu života pacientů se zánětlivým onemocněním střev

11. Úkol – Barvení mikroorganismů, mikroskopické sledovánímikroorganismů

D. bakterie mléčného kvašení

Cíl úkolu:Zaznamenat výskyt bakterií mléčného kvašení

Pomůcky:Kysané mléčné výrobky/podmáslí, kyška…/, jogurt, zředěný karbolfuchsin, Pasteurova pipeta, bakteriologická klička, kahan, odmaštěná podložní skla, imerzní objektiv a olej

Provedení:Na odmaštěné podložní sklo přeneseme kapku mléčného výrobku /podmáslí, kyška…/, nebo vyžíhanou bakteriologickou kličkou malémnožství jogurtu a rozetřeme po povrchu sklíčka. Preparát necháme zaschnout, opatrně fixujeme nad plamenem a barvíme 5 minut zředěným karbolfuchsinem. Barvivo slejeme, opláchneme vodou a po osušení na vzduchu prohlížíme imerzním objektivem.

Výsledek:Zaznamenáme v podobě obrázku do protokolu.