DNA diagnostika DNA diagnostika

syndromusyndromu

prodlouženého QTprodlouženého QT

intervaluintervalu

Kadlecová J.1, Ravčuková B.

1,

Grochová D.3, Gaillyová R. 1,

Novotný T. 2 a Semrád B.

2

1odd. lékařské genetiky, FN Brno

2interní kardiologická klinika, FN Brno

3 PřF MU Brno

Long QT syndrom (LQT)

• Dědičná kardiologická choroba charakterizovaná prodloužením repolarizace myokardu, které zvyšuje riziko maligních komorových arytmií a tím i synkop a náhlého úmrtí.

Klinické projevy LQTsy• poruchy srdeční činnosti * ventrikulární tachyarytmie (torsade de points) * ventrikulární fibrilace * synkopy• sy náhlého úmrtí • prodloužení QT intervalu na EKG (obr.1)

Obr.1: EKG z ergometrického vyšetření (50mm/s, 20mm/mV) dokumentující dynamiku chování LQT

vlevo výrazné prodloužení QTc u pacienta, vpravo fyziologická zkrácení QTc u zdravého jedince

Formy LQT sy

• podle dřívějšího rozlišování: - Romano-Ward syndrom s dědičností

autozomálně dominantní - Jerwell a Lange-Nielsen syndrom (JLN) s

dědičností autozomálně recesivní, navíc charakterizovaný poruchou sluchu

• dnes jsou tyto syndromy chápány jako společné fenotypové vyjádření nejméně 9 geneticky odlišných nozologických jednotek ( tab.1)

Tab.1 : Typy LQTs ve vztahu ke genům

a jejich produktům

, - podjednotky iontových kanálů

Mutační analýza genu KVLQT1 a genu HERG

) KVLQT1 gen• lokus - 11p15.5• KVLQT1 gen -350 kbp, 16 exonů

• produkt KVLQT1 genu: K+kanálová podjednotka (IKs), nezbytná pro depolarizaci srdečních iontů. Protein sestává z 6 transmembránových domén S1 - S6 a jedné domény: póry viz schéma 1

B) HERG gen• lokus - 7q35-36• HERG gen - 19 kbp, 16 exonů

• produkt HERG genu: K+kanálová podjednotka (Ikr), sestávající z 6 transmembránovýchsegmentů(S1-S6), jedné oblasti póru (P) a nukleotid vazající domény(cNBD), viz schéma 2

Mutace v genech KVLQT1 (42%) a HERG (45%) představují většinu nalezených mutací u LQT pacientů ( 87 % dosud identifikovaných

mutací)

Schéma 1: KVLQT1: K+kanálová podjednotka

Schéma 2: HERG: K+kanálová podjednotka

(Splawski et al., 2000)

(Splawski et al., 2000)

Schéma 1: Iontový K+kanál složený z proteinu KVLQT1 a minK

Schéma 2: Iontový K+ kanál HERG

Kanál obsahuje 4 KVLQT1 podjednotky z nichž každá má 6 transmembránových segmentů (S1-S6) a oblast póru (P) tvořící funkční kanál

HERG protein obsahuje 6 transmembránových jednotek, oblast póru(P) a nukleotid vázající domény (cNBD)

Převzato z: Wang, Q. et al., 1998, Molecular Medicine Today

P

P

Protokol mutační analýzy KVLQT1/HERG genu u LQT pacientů

• genetická poradna• informovaný souhlas pacienta• odběr krve, izolace DNA• multiplex PCR - syntéza 16 exonů KVLQT1/ HERG

genu ve 4 PCR reakcích• multiplex SSCP analýza (metoda jednořetězcového

konformačního polymorfismu)• SSCP jednotlivých exonů (při nálezu změny

mobility DNA fragmentu v multiplex SSCP)• potvrzení a verifikace sekvenční změny

sekvenováním na ABI Prism 310• detekce potvrzené mutace u ostatních členů

rodiny

Multiplex PCR oblast II ( ex.5, 7, 9 a 10 genu KVLQT1)

legenda: 12% PAGE (40:1), 150V/16hod/ 15°Cdráha 1: marker molekulových hmotností pBR322/Alu1dráha 2-8: multiplex PCR ( LQT pacienti)dráha 9: multiplex PCR (kontrolní DNA)

ex.10ex.9ex.7ex.5

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Multiplex of SSCP(exons 5, 7, 9, 10 of KVLQT1gene)

B) 12% PAGE(40:1), 150V/16h./15°~4oCline 1: control DNAlines 2 -5: DNA of LQT patientsmt ssDNA: single strand mutant DNA

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

+ssDNA(mt)

A) Principle of SSCP

-ssDNA(mt)

15°C 4°C

SSCP exonu 7při nálezu změny mobility v multiplex SSCP

Legenda:12% PAGE (40:1), 150V/16hod./15°Cdráhy 1,2,4,5,8: DNA pacientů LQT v rámci jedné rodinydráhy 3,6,7: DNA zdravých členů rodiny

1 2 3 4 5 6 7 8

+ ssDNA(wt)

- ssDNA(wt)-ssDNA

(mt)

DNA pacienta:nalezená mutace G325R(Gly >Arg) v heterozygotním stavu

sekvenace aberantního DNA fragmentu

ZÁVĚRZÁVĚR• Presymptomatická diagnoza LQTsy je především

založena na prolongaci QT intervalu v EKG. Spektrum QTc intervalů u nemocných a zdravých jedinců se značně překrývá , což může vést k chybné klasifikaci LQTs. Genetický screening je důležitý pro klinickou diagnózu a léčbu LQTs. Přítomnost mutace odliší jedince s rizikem vývoje choroby a identifikuje odpovědný gen jak v LQT rodinách, tak i u sporadických případů.

• Screening mutací KVLQT1 genu v našem souboru 27 jedinců odhalil sekvenční změny ve 46% případů. Nalezené sekvenční změny verifikované sekvenační analýzou shrnuje tabulka 2.

Práce je podpořena grantem IGA MZ NA 5718-3

Tab.2: Spektrum mutací zachycených SSCP analýzou KVLQT1/HERG genů u 27 LQT

pacientů

S6--c: C-terminalní oblast k S6SNP : single nucleotide polymorphism

Gen Exon Oblast genu Mutace Kódující efekt Počet rodin

KVLQT1 3 S2-S3 Y171Y SNP 3

KVLQT1 7 S6 G325R missense mutace 1

KVLQT1 7 Pore T309I missense mutace 1

KVLQT1 11 S6--c F484F SNP 1

KVLQT1 13 S6--c S546S SNP 3

KVLQT1 16B S6--c Y662Y SNP 1

HERG 7 S4 R534C missense mutace 1

HERG 7 S5 L564L SNP 1