Beličková1, J Veselá1, E Stará1, Z Zemanová2, A Jonášová2, J Čermák1 1 Ústav hematologie a krevní transfuze, Praha 2 Všeobecná fakultní nemocnice, Praha

Myelodysplastický syndrom (MDS) je heterogenní skupina klonálních

onemocnění s neefektivní hematopoézou (porucha diferenciace a

nekontrolovaná proliferace) a dysplastickými změnami buněk.

neefektivní hematopoéza periferní cytopenie (postihující jednu či více vývojových linií)

zvýšená buněčnost KD

MDS

• Incidence onemocnění : 2-5 na 100 000 obyvatel

u osob starších 70 let : 15-40 na 100 000 obyvatel

• 1/3 všech pacientů přechází neoplastickou transformací v akutní myeloidní

leukemii.

• postupná malignizace mutované kmenové buňky

vhodným in vivo modelem vzniku leukemie

MDS

patogeneze MDS není doposud objasněna

• defekt hematopoetické buňky není dostatečně charakterizován

• nepravděpodobné, že by jediná odchylka způsobila poruchu

• postupné hromadění genetických a epigenetických změn spolu s

alterovaným buněčným mikroprostředím

• vícestupňový proces

MDS

1. Transplantace kostní dřeně nebo hematopoetických kmenových buněk 2. Lenalidomid: imunomodulační lék, který může měnit či regulovat činnost

imunitního systému

• pacienti s MDS s del (5q)

3. Demetylační léky: Vidaza, Decitabin • inhibují DNA methyltransferázu a májí přímý cytotoxický účinek na

abnormální hematopoietické buňky KD

4. Podpůrná léčba: růstové faktory, chelatační léčba

LÉČBA

MDS

17p13.1

11 exonů (z nichž první se nepřekládá), 10 intronů

Funkční molekula je tetramer

Transkripční faktor řady genů ovlivňující proliferaci, apoptózu, reparaci DNA

nebo angiogenezi

FCE: TP53 monitoruje poškození DNA ANO spustí transkripci genu p21 zastaví dělení buňky, dokud není poškozené místo reparováno Pokud to nelze APOPTÓZA

Protein p53 se za normálních okolností v buňkách vyskytuje jen v nízké

koncentraci, jeho hladina je kontrolována negativní autoregulační smyčkou

skrz MDM2

Za stresových podmínek je aktivovaný a jeho koncentrace se zvyšuje

TP53 často podléhá bodovým mutacím

TP53

MUTACE: nejčastěji v DNA-vazebné doméně (exony 5-8)

nejčastější mutace jsou bodové substituce typu missense , méně časté frameshift či

non-sense

MDM2 není schopna degradovat mutantní TP53 zvyšování koncentrace

Důsledek mutace: zkrácené a nefunkční formy proteinu nebo konformačně pozměněný protein

bodové

MUTACE :

• Loss of function: ztráta tumor-supresorových vlastností (schopnosti vazby na

promotor cílových genů a následnou regulaci)

• Gain of function : získaná odolnost vůči chemoterapeutikům

TP53

10 % pacientů s MDS

17% MDS s del5q

72% MDS s komplexním karyotypem a -5/5q-

Negativní prognostický faktor (detekce rizikových pacientů)

Rezistence na léčbu, zvýšená progrese do AML

MDS a TP53

BJH; 2013; Kulasekararaj

Běžně používanými laboratorními technologiemi ( Sangerovo sekvenování,

Fassay analýza) nelze detekovat minoritní klony mutovaných buněk

„Ultra deep“ sekvenování pomocí 454 GS Junior od firmy Roche

Amplikonové sekvenování , plata s primery pro 11 pacientů

Studie v rámci ELN (The European LeukemiaNet )

Sekvenovali jsme nejčastěji mutovanou oblast (exony 4-11)

K přípravě amplikovonové knihovny je nutno PCR produkt 3x přečistit:

Biomek® 3000 od firmy Beckman Coulter

PACIENTI + METODY:

47 low-risk MDS pacientů s del(5q) v době diagnózy nebo v počátcích

choroby.

Median věku pacientů: 69.5 let (48-82).

19 pacientů bylo léčeno lenalidomidem.

TP53 byla analyzována z DNA izolované z CD34+ a CD34- buněk KD a

CD3+ a CD14+ buněk z PK pomocí MACS separátoru.

Průměrná coverage genu získané sekvence byla 900 čtení.

> 20% mutantních klonů, mutace potvrzena Sangerovým sekvenováním

VÝSLEDKY :

TP53 mutace byly zjištěny u 6 (z 47) pacientů (12,8%), 1 pacient měl dva mutované klony.

Velikost mutovaného klonu byla v rozmezí 3.5 do 49.6%.

6 mutací typu missense, 1 typu nonsense.

Zjistili jsme signifikantní rozdíly ve velikosti mutovaného klonu mezi buňkami KD a PK .

Leukemické transformace byla pozorována u 4 (z 6) pacientů nesoucích mutaci TP53.

Jeden pacient vykazoval značný pokles ve velikosti mutovaného klonu (23,9 - 2,3%) po léčbě lenalidomidem. Druhý pacient vykázal mírný nárůst mutantní klon (14,7 - 17,5%) v průběhu léčby.

Nezjistili jsme signifikantní rozdíl v expresi mRNA genů TP53, MDM2, MYC a CDKN1A mezi pacienty s mutací a pacientů bez mutace.

TP53 mutace byly spojeny s zvýšeným rizikem transformace

MDS pacientů do AML.

Identifikovaná velikost mutovaného klonu závisí na typu

buněk. Analýzu provádět z buněk kostní dřeně.

Uvažuje se zavést vyšetřování mutací v TP53 genu do

mezinárodní prognostického skórovacího systému MDS.

ZÁVĚRY: