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VOL. 5 No. 1

EDIÇÃO LATINO-AMERICANA VERSÃO EM LÍNGUA PORTUGUESA

JUNHO 2013 WWW.FERTSTERT.ORG

Edição latino-americana, Vol. 5, No. 1, Junho 2013Copyright © 2013 American Society for Reproductive Medicine, Publicado por Elsevier Inc.

1

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PUBLICAÇÃO OFICIAL DA SOCIEDADE AMERICANA PARAMEDICINA DA REPRODUÇÃO, Sociedade de Endocrinologia da Reprodução e Infertilidade, Sociedade de Cirurgiões da Reprodução, Sociedade de Tecnologia Reprodutiva Assistida, Sociedade de Reprodução e Urologia Masculinas e Sociedade de Reprodução da Costa do Pacífico.

2 Edição latino-americana, Vol. 5, No. 1, Junho 2013Copyright © 2013 American Society for Reproductive Medicine, Publicado por Elsevier Inc.

Conselho Editorial de Fertility and Sterility Latino-americano

Fertility and Sterility® (ISSN 0015-0282) é marca registrada da American Society of Reproductive Medicine, publicada mensalmente em dois volumes indexados por Elsevier Inc., 360 Park Avenue South, New York, NY 10010-1710. Escritório Comercial: 1600 John F. Kennedy Blvd., Philadelphia, PA 19103. Escritório Editorial: 360 Park Avenue South, New York, NY 10010-1710. Escritórios de Contabilidade e Circulação: 6277 Sea Harbor Drive, Orlando, FL 32887-4800. Franquia postal dos periódicos paga em Nova York, NY, e em outros escritórios de postagem adicionais

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Dr. Guillermo MarconiEditor-Chefe

Buenos Aires, Argentina

Dr. Alberto Costoya ArrigoniSantiago de Chile, Chile

Dr. Edson Borges Jr., M.D., PhD.São Paulo, Brasil

Dr. Carlos Moran, M.D., M.Sc.Distrito Federal, México

Dr. José Gonçalves Franco JuniorSão Paulo, Brasil

Dr. Alberto ValcarcelBuenos Aires, Argentina

Dr. Luigi DevotoSantiago de Chile, Chile

Dr. Claudio ChillikBuenos Aires, Argentina

Dr. Guillermo Caprario CausaMontevideo, Uruguay

Dr. Arturo Aparicia LacernaBogotá, Colombia

Dr. Wéllington AguirreQuito, Ecuador

Dr. Alfredo CelisLima, Perú

Fertility and Sterility®


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PONTOS DE VISTA E REVISÕES

6 Conceitos básicos de epigenética

Michal Inbar-Feigenberg, M.D., Sanaa Choufani, Ph.D.,

Darci T. Butcher, Ph.D., Maian Roifman, M.D.,

e Rosanna Weksberg, M.D., Ph.D.

Genética e Biologia do Genoma, Hospital for Sick Children, Universidade de Toronto, Toronto, Ontário, Canadá, e Divisão de Genética Clínica e Metabólica, Hospital for Sick Children, Universidade de Toronto, Toronto, Ontário, Canadá; e Instituto de Ciências Médicas, Universidade de Toronto, Toronto, Ontário, Canadá

15 Indução de ovulação e anomalias epigenéticas

Patricia Fauque, M.D., Ph.D.Laboratoire de Biologie de la Reproduction, Hôpital de Dijon, Université de Bourgogne, Dijon, France

24 Distúrbios epigenéticos e subfertilidade masculina

Céline Chalas Boissonnas, M.D., Ph.D.,

Pierre Jouannet, M.D., e Hélène Jammes, Ph.D.

Histologia-Embriologia-Biologia da Reprodução, CECOS, Hôpital Cochin, AP-HP, Universidade Paris Descartes, Paris, França, CERSES (UMR 8137)/CNRS/Universidade Paris Descartes, Paris, França, INRA, UMR1198 Biologia do Desenvolvimento e Reprodução, 78352 Jouy-en-Josas, França

32 Questões epigenéticas na reprodução assistida: atualização e revisão crítica da literatura atual

Yoel Shufaro, M.D., Ph.D. e Neri Laufer, M.D.Unidade de Fertilização In Vitro, Departamento de Ginecologia e Obstetrícia, Hospital Universitário Hadassah, Jerusalém, Israel

34 Distúrbios epigenéticos em gametas e embriões cultivados in vitro: implicações para a reprodução humana assistida

Nady el Hajj, Ph.D., e Thomas Haaf, M.D.Instituto de Genética Humana, Julius Maximilians University, Wuerzburg, Alemanha

44 Distúrbios de imprinting são mais prevalentes após fertilização in vitro humana ou injeção intracitoplasmática de espermatozoide?

Jan P. W. Vermeiden, Ph.D. e Rob E. Bernardus, M.D., Ph.D.Nij Barrahûs Fertility Center, Wolvega, Holanda

BONuS TRAck

PÁGINAS DA ASRM

54 Utilidade clínica do exame de integridade de DNA espermático: uma diretriz

Comitê de Prática da Sociedade Americana de Medicina ReprodutivaSociedade Americana de Medicina Reprodutiva, Birmingham, Alabama

ARTIGO ORIGINAl: AMBIENTE E EPIDEMIOlOGIA

59 Fertilização in vitro e risco de câncer de mama e ginecológico: estudo retrospectivo de coorte de ‘Israeli Maccabi Healthcare Services’

Louise A. Brinton, Ph.D., Britton Trabert, Ph.D.,

Varda Shalev, M.D., Eitan Lunenfeld, M.D., M.H.A.,

Tal Sella, M.D., e Gabriel Chodick, Ph.D.

Seção de Epidemiologia Hormonal e Reprodutiva, Divisão de Epidemiologia e Genética do Câncer, Instituto Nacional do Câncer, Rockville, Maryland, Estados Unidos; Unidade de Epidemiologia e Pesquisa de Banco de Dados, Maccabi Healthcare Services, Tel Aviv, Israel; Escola de Saúde Pública, Faculdade de Medicina Sackler, Universidade de Tel Aviv, Tel Aviv, Israel; Unidade de FIV e Fertilidade, Departamento de Obstetrícia, Soroka Medical Center e Faculdade de Ciências da Saúde, Ben Gurion University of the Negev, Beer Sheva, Israel

EDIÇÃO LATINO-AMERICANA

VERSÃO EM LÍNGUA PORTUGUESAVOLUME 5NÚMERO 1

JUNHO 2013



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Carta do Editor

A nossa revista adotou uma nova modalidade para a publicação dos artigos.

Decidiu-se eleger um tema de relevância e desenvolvê-lo ao máximo, tendo sido escolhido para esta ocasião a epigenética relacionada a esterilidade e seus diferentes tratamentos.

Vale observar que se começa desenvolvendo os conceitos básicos do tema, incompreensível para muitos, e se termina com a relação do fenômeno nos diferentes aspectos da reprodução e seu tratamento.

Na seção bonus track, apresentam-se mais dois artigos considerados de suma importância: um deles aborda as recomen-dações do Comitê de Práticas da Sociedade Americana de Medicina Reprodutiva (ASRM) sobre a utilidade do estudo e tra-tamento da fragmentação do DNA e seu impacto no tratamento do casal estéril; o outro aborda a relação entre os tratamen-tos de esterilidade e o câncer genitomamário.

Acredito que os temas respondam às inquietudes de todos aqueles ligados à reprodução humana.

Dr. Guillermo MarconiDiretor Chefe de Fertility & Sterility

para a América Latina

EDIÇÃO LATINO-AMERICANA

VERSÃO EM LÍNGUA PORTUGUESAVOLUME 5NÚMERO 1

JUNHO 2013



Conceitos básicos de epigenética Michal Inbar-Feigenberg, M.D.,a,b Sanaa Choufani, Ph.D.,a Darci T. Butcher, Ph.D.,a Maian Roifman, M.D.,b

e Rosanna Weksberg, M.D., Ph.D.a,b,c

aGenética e Biologia do Genoma, Hospital for Sick Children, Universidade de Toronto, Toronto, Ontário, Canadá, e bDivisão de Genética Clínica e Metabólica, Hospital for Sick Children, Universidade de Toronto, Toronto, Ontário, Canadá; e cInstituto de Ciências Médicas, Universidade de Toronto, Toronto, Ontário, Canadá

Vários tipos de imprintings epigenéticos facilitam a complexa padronização necessária para o desenvolvimento humano normal. Esses imprintings epigenéticos incluem metilação de DNA nos dinucleotídeos CpG, modificações covalentes de histonas e RNAs não codificantes (ncRNAs, em inglês). Funcionam de maneira bastante organizada, regulando diferenças herdáveis mitoticamente no potencial de expressão gênica sem alterar a sequência primária de DNA. Nas células germinativas e no embrião em desenvolvimento, a reprogramação epigenética do genoma determina o apagamento e reestabelecimento de padrões epigenéticos corretos em períodos críticos do desenvolvimento e em tipos celulares específicos. Dois tipos específicos de regulação epigenética estabelecidos no início do desenvolvimento incluem inativação do cromossomo X e imprinting genômico; eles regulam a expressão gênica de maneira dose-dependente e específica para o progenitor de origem, respectivamente. Fatores tanto genéticos quanto ambientais atuam nos imprintings epigenéticos, gerando variação fenotípica que vai desde uma variação normal até doença humana. A padronização epigenética aberrante pode levar a uma variedade de distúrbios huma-nos, que incluem subfertilidade e distúrbios de imprinting. Fertil Steril® 2013;99:607–15. ©2013 by American Society for Reproductive Medicine.)Palavras-chave: Epigenética; metilação de DNA; modificação de histona; microRNA; reprogramação epigenética; inativação do X; imprinting genômico

Discussão: Você pode discutir este artigo com seus autores e outros membros da ASRM em http://fertstertforum.com/inbar-feigenbergm-basic-concepts-of-epigenetics/

todas as células do corpo huma-no têm o mesmo DNA comple-mentar, que se origina de uma

única célula na concepção. Os meca-nismos epigenéticos altamente orga-nizados facilitam a complexa padroni-zação necessária para assegurar desenvolvimento humano normal e regulação estável de padrões apropria-dos à expressão gênica em vários tipos de células. Os mecanismos epigenéti-cos definem diferenças herdáveis mi-toticamente no potencial de expressão gênica sem alterar a sequência primá-ria de DNA (1). Tais mecanismos são regulados de forma rigorosa por um grande número de proteínas que esta-belecem, leem e apagam modificações epigenéticas específicas, definindo, portanto, onde e quando o maquinário transcricional pode acessar a sequên-cia primária de DNA para determinar

crescimento e diferenciação normais no embrião e feto em desenvolvimen-to. Vários tipos de imprintings epige-néticos atuam em conjunto para con-duzir uma expressão gênica adequada (Fig. 1). Esses imprintings epigenéticos incluem metilação de DNA nos dinu-cleotídeos CpG, modificações covalen-tes de histonas, RNAs não codificantes (ncRNAs, em inglês) e outros mecanis-mos complementares que controlam a organização de cromatina de ordem superior dentro do núcleo da célula.

Dois mecanismos epigenéticos únicos, inativação do cromossomo X e imprinting genômico, serão discutidos como exemplos da importância da re-gulação epigenética na manutenção de padrões corretos de expressão gêni-ca no início do desenvolvimento. A inativação do cromossomo X repre-senta um paradigma para a compen-

sação de dose em mulheres, resultando em expressão monoalélica de grande número de genes ligados ao X em mu-lheres. O imprinting genômico refere-se ao processo pelo qual certos genes, carregando imprintings epigenéticos específicos do progenitor de origem, têm potencial para conduzir a expres-são gênica monoalélica específica do progenitor de origem em certos tipos de células em momentos específicos do desenvolvimento. Nas células ger-minativas e no embrião em desenvol-vimento, a reprogramação epigenética do genoma sustenta a deleção e o reestabelecimento de padrões epigené-ticos corretos. Tais processos que ocorrem naturalmente diferem do pro-cesso de “reprogramação” in vitro re-centemente desenvolvido para induzir células-tronco pluripotentes a partir de células somáticas (2).

Enquanto alguns imprintings epi-genéticos permanecem estáveis ao longo do tempo em determinados teci-dos, outras demonstram plasticidade de desenvolvimento. Alterações epige-néticas ou “epimutações” que surgem através de vários mecanismos diferen-tes podem levar a uma variedade de distúrbios humanos, tais como subfer-

Recebido: 21 de novembro de 2012; revisado: 16 de janeiro de 2013; aceito: 17 de janeiro de 2013; disponível online 26 de janeiro de 2013.

M.I.-F. nega conflito de interesse. S.C. nega conflito de interesse. D.T.B. nega conflito de interesse. M.R. nega conflito de interesse. R.W. nega conflito de interesse.

Solicitação de reimpressões: Rosanna Weksberg, M.D., Ph.D., Division of Clinical and Metabolic Genetics, The Hospital for Sick Children, 555 University Avenue, Toronto, Ontario M5G 1X8, Canada.

Fertility and Sterility® Vol. 99, No. 3, 1 Março, 2013 0015-0282Copyright ©2013 American Society for Reproductive Medicine, Publicado por Elsevier Inc..http://dx.doi.org/10.1016/j.fertnstert.2013.01.117

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tilidade e distúrbios de imprinting. Fatores tanto genéticos quanto ambientais exercem impacto nos imprintings epige-néticos, gerando variação fenotípica que vai desde uma “variação normal” até doença humana (3). Foi demonstrado que fatores ambientais, tais como inanição materna e o uso de tecnologias de reprodução assistida (TRAs), exercem im-pacto no epigenoma do embrião. Algumas das alterações epigenéticas associadas com a inanição materna durante a vida fetal persistem na idade adulta, possivelmente contri-buindo para distúrbios de instalação tardia, tais como dis-túrbios cardiovasculares e diabetes tipo 2 (4, 5, 6, 7, 8).

Imprintings epigenéticosMetilação de DNA, modificações de histonas e ncRNAs são descritos abaixo como mecanismos independentes, mas é importante observar que os diferentes imprintings epigené-ticos se intercomunicam para regular o epigenoma (9, 10). O ENCODE Project Consortium, um grande esforço colaborati-vo desenvolvido para definir todos os elementos funcionais do genoma humano, publicou recentemente um amplo con-junto de dados sobre transcrição, modificações de histonas e ainda ligações de proteínas. Tais dados fornecem caracte-rísticas epigenéticas globais e regionais sobreponíveis, que, combinadas, regulam a expressão gênica (11).

Metilação de dNaAtualmente, um dos mecanismos epigenéticos melhor estu-dados é a metilação de DNA (12). A metilação de DNA está tipicamente associada com o silenciamento gênico através da ligação de proteínas ligadoras de DNA sensíveis à meti-lação e/ou interação com várias modificações de histonas que modulam o acesso de promotores gênicos ao maquiná-rio transcricional (13). Nas espécies eucarióticas, a metila-ção de DNA envolve a transferência de um grupo metila para a citosina do dinucleotídeo CpG (13). A maior parte da metilação de DNA em mamíferos ocorre nos dinucleotídeos CpG (14, 15). Os CpGs são distribuídos no genoma de ma-neira não aleatória. Encontram-se concentrados nas regiões genômicas chamadas ilhas de CpG, cujo tamanho varia de 200 pares de base (pb) a várias quilobases. Essas ilhas de CpG, em geral não metiladas, encontram-se tipicamente lo-calizadas dentro dos promotores gênicos de genes constitu-tivos e genes supressores de tumor transcritos de maneira ativa (16). Por outro lado, as ilhas de CpG de genes silencio-sos são predominantemente metiladas (17).

Proteínas específicas, tais como DNA metiltransferases (DNMTs), podem estabelecer ou manter padrões de metilação de DNA. Estudos em camundongos demonstram que as DNMTs são essenciais para o desenvolvimento embrionário normal (18, 19). A metilação de DNA é estabelecida “de novo” pelas DNMTs, enzimas DNMT3a e DNMT3b, sendo mantida através de mitose primariamente pela enzima DNMT1 (12). Outro membro da família DNMT3, a enzima DNMT3L, não tem atividade catalítica, mas pode ativar a DNMT3A para estabelecer metilação alelo-específica nas re-giões do genoma que sofreram imprinting (20). A enzima DNMT1 é a metiltransferase de manutenção primária com

alta afinidade por DNA hemimetilado (21). Sua função pri-mária é copiar os padrões de metilação durante a replicação. A enzima DNMT1o, uma isoforma de DNMT1 específica do estágio de desenvolvimento, é uma proteína derivada do oócito, que entra no núcleo no estágio de oito células do em-brião e tem um papel essencial na manutenção dos imprintings epigenéticos (22).

A desmetilação do DNA é também crítica durante o es-tágio de célula germinativa primordial (CGP) e de desenvol-vimento inicial do embrião (23). Isso pode ocorrer através de desmetilação passiva, associada com a divisão celular ou através de desmetilação ativa usando mecanismos de reparo por excisão. A via ativa requer hidroxilação de 5-metilcito-sina para 5-hidroximetilcitosina pelas enzimas TET1 e TET2, seguida de desaminação por AID e APOBEC1 antes do repa-ro por excisão de base ou nucleotídeo (23). Todas as enzi-mas nessa via são expressadas nas CGPs do camundongo, sugerindo um papel na reprogramação epigenética de ga-metas (24, 25).

Modificações de HistonasA unidade básica da cromatina é um octâmero de histonas, duas de cada H2A, H2B, H3 e H4. O DNA se enrola em torno desse núcleo, fornecendo estabilidade estrutural e capacida-de de regular a expressão gênica (Fig. 1). Cada núcleo de histona dentro do nucleossomo contém um domínio globu-lar e uma cauda N-terminal altamente dinâmica que se es-

FIGURA 1

HAC

HETEROCROMATINA

EUCROMATINA

UNIDADESDE OCTÂMERO

DE HISTONA

DNMT

H2A

H2B

H3

H4

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

AcAc

AcAc

AcAc

AcAc

AcAc

AcAc

AcAc

AcAc

HDAC

Mecanismos epigenéticos que afetam a expressão gênica. Os pa-drões epigenéticos são estabelecidos através de vários mecanismos. Os imprintings epigenéticos incluem metilação de DNA e modifica-ções covalentes de histonas. A metilação de DNA é estabelecida e mantida pelas enzimas DNA metiltransferases (DNMTs). O DNA é enrolado ao redor dos núcleos de histona compostos de um octâme-ro contendo duas cópias de cada núcleo de histona: H2A, H2B, H3 e H4. Juntos formam a unidade básica da cromatina, o nucleossomo. As modificações na histona são reguladas por várias enzimas, tais como histona acetiltransferases (HATs) e desacetilases (HDACs). A acetilação de histonas por HAT é comumente encontrada na eucro-matina (estado relaxado da cromatina), sendo associada com trans-crição ativa. A desacetilação de histonas por HDAC e a metilação de DNA por DNMTs é uma marca registrada de heterocromatina (estado condensado da cromatina), que se associa à repressão transcricional.Inbar-Feigenberg. Conceitos básicos de epigenética. Fertil Steril 2013.



tende a partir dos domínios globulares (Fig. 1). As histonas apresentam caudas que podem conter várias modificações pós-traducionais, incluindo acetilação, metilação, fosforila-ção, ubiquitinação, sumoilação, ADP-ribosilação, isomeriza-ção de prolina, citrulinação, butirilação, propionilação e gli-cosilação (26). Dados recentemente publicados do ENCODE Project Consortium analisaram 11 dessas modificações pós-traducionais de histona, incluindo acetilação e metilação, que marcam cromatina ativa e reprimida, assim como modi-ficações associadas com a transcrição. Ao avaliar várias mo-dificações de histonas em vários tecidos, aquele conjunto de dados identificou diferentes estados da cromatina, tais como inativa, bimodal e ativa, cada uma das quais apresenta dife-rentes propriedades funcionais (27). Os estados bimodais, nos quais uma combinação de marcas ativas e repressivas estão presentes na cromatina de uma região promotora de um gene, facilitam mudanças rápidas na expressão gênica, como seria esperado durante o desenvolvimento inicial, quando ocorrem diferenciação e especificação (23).

ncrNas reguladoresOs ncRNAs são também necessários para a regulação epige-nética da expressão gênica. Embora os genomas eucarióti-cos transcrevam até 75% do DNA genômico, aproximada-mente 3% dessas transcrições codificam proteínas; a maioria é ncRNAs, que podem ser classificados de acordo com o tamanho e a função (11, 27, 28). Os ncRNAs reguladores, que incluem pequenos RNAs de interferência (siRNAs, em inglês), microRNAs (miRNAs, em inglês) e longos ncRNAs (lncRNAs, em inglês), desempenham importantes papéis na regulação da expressão gênica em todos os níveis: transcri-ção, degradação de mRNA, splicing e tradução (29). Os siR-NAs são RNAs de dupla hélice (dsRNA, em inglês) que me-deiam o silenciamento pós-transcricional, em parte ao induzir a heterocromatina a recrutar complexos histona desacetilase (30).

Os miRNAs compreendem uma nova classe de RNAs de uma só hélice, endógenos e pequenos (18–24 nucleotídeos de comprimento), gerados a partir de um RNA precursor clivado por duas enzimas RNA polimerase III, enzimas DROSHA e DICER, para produzir miRNA maduro. Esses miRNAs podem controlar a expressão gênica ao determinar alvos específicos de mRNAs para degradação e/ou repressão traducional (31, 32). Também podem controlar a expressão gênica ao recrutar para o DNA complexos modificadores de cromatina através da ligação às regiões reguladoras do DNA, alterando, assim, a conformação da cromatina (33, 34). A expressão de miRNA nos blastocistos humanos cor-relaciona-se com a manutenção da pluripotencialidade no desenvolvimento do embrião (35).

Os lincRNAs, um subconjunto de lncRNA, exibem alta conservação nas diferentes espécies. Ficou demonstrado que eles guiam os complexos modificadores de cromatina para loci genômicos específicos, participando assim no estabele-cimento de estados epigenéticos específicos para os tipos de célula (36, 37). No desenvolvimento embrionário, a expres-são de lncRNAs, regulada por fatores de transcrição pluri-potentes, como OCT4 e NANOG, facilita a expressão gênica

específica para a linhagem celular (38). Os lincRNAs tam-bém desempenham um importante papel nos processos de desenvolvimento, tais como inativação do cromossomo X e imprinting genômico (39).

tipos Específicos de regulação Epigenética: inativação do X e Imprinting GenômicoA inativação do X e o imprinting genômico são formas es-pecializadas de regulação epigenética essencial para contro-le da dose correta de expressão gênica para o cromossomo X e para os genes com expressão específica do progenitor de origem. O estudo desses complexos mecanismos regula-dores foi importante na elucidação de como o epigenoma inteiro é regulado.

inativação do XPara compensar as disparidades de dose dos genes ligados ao X, as mulheres silenciam a maior parte de um de seus dois cromossomos X através de um processo denominado inativação do cromossomo X (40). Embriões contendo mais de um cromossomo X (XX, mulheres XXX e homens XXY) sofrem uma inativação aleatória de um cromossomo X no estágio de blastocisto no início da embriogênese (41). A ina-tivação do cromossomo X é regulada por um locus chave, o centro de inativação do X (XIC), que regula em cis a expres-são do lincRNA do gene XIST (transcrito específico do cro-mossomo X inativo) e sua unidade de transcrição antisense TSIX. No camundongo, o XIC percebe o número de cromos-somos X na célula e silencia aleatoriamente todos menos um dos cromossomos X. Isso envolve a cobertura de todos os futuros cromossomos X inativos por Xist RNA, seguido por recrutamento do complexo repressor polycomb 2 e adi-ção de marcas silenciadoras de cromatina, tais como hipoa-cetilação de histonas H3 e H4, metilação da histona H3 lisi-na 27, e metilação de DNA nos promotores ricos em CpG (42, 43). Esse processo, cuja regulação ainda não está total-mente entendida, limita cada célula diploide a uma cópia ativa do cromossomo X.

Imprinting GenômicoO imprinting genômico é um processo epigenético através do qual as linhagens germinativas masculina e feminina conferem imprintings epecíficos a certas regiões cromossô-micas (44). Tais imprints fornecem o potencial para a ex-pressão monoalélica específica do progenitor de origem em certas ocasiões do desenvolvimento ou em tipos celulares específicos.

A expressão gênica a partir de um imprinting normal depende de um número normal relativo de alelos parentais específicos e requer contribuições dos alelos dos dois proge-nitores. Isso significa que a alteração do número ou da pro-porção de alelos parentais leva a desregulação do imprint. O exemplo mais extremo de alteração nas contribuições pa-rentais relativas ocorre nos conceptos que contém contribuições genômicas apenas maternas ou apenas pater-nas. Cromossomos derivados apenas da mãe são encontra-



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dos em teratomas ovarianos císticos maduros (TCM), que se originam de um erro meiótico durante a maturação do oóci-to (embrião ginogenético). O resultado é a formação de um cisto contendo tecidos de cada uma das três camadas de células germinativas embrionárias. Em contraste, um em-brião androgenético, que apresenta dois genomas paternos e nenhum genoma materno em todas as células, não consegue conduzir o desenvolvimento embrionário/fetal, resultando em uma mola hidatiforme (AnCHM). Os TCM e a AnCHM exibem as graves consequências biológicas da herança uni-parental (45), mostrando que os dois genomas parentais são necessários para o desenvolvimento normal de um embrião, sendo o genoma paterno necessário para os tecidos extraem-brionários e o genoma materno necessário para o desenvol-vimento embrionário.

Em geral, a maior parte dos genes autossômicos é ex-pressa a partir dos alelos tanto paternos quanto maternos, enquanto que os genes que sofreram imprinting são expres-sos predominante ou exclusivamente a partir ou do alelo materno ou do alelo paterno de maneira específica do proge-nitor de origem. Isso significa que um gene que sofreu imprinting é expresso a partir do alelo paterno enquanto a có-pia materna é silenciada, ou, ao contrário, é expresso a partir do alelo materno enquanto o alelo paterno é silenciado (46). Os genes que sofreram imprinting não obedecem à genética mendeliana e não predizem especificidade ao progenitor de origem para expressão gênica (47). Há relatos de que cerca de 100 genes humanos são ‘imprintados’ (http://igc.otago.ac.nz/home.html). Muitos desses genes desempenham um papel vital no crescimento embrionário, fetal e placentário, assim como no neurodesenvolvimento (47, 48, 49).

Os genes que sofreram imprinting tendem a se agrupar para formar domínios. Nos seres humanos, foram encon-trados domínios que sofreram imprinting nos cromossomos 6, 7, 11, 14, 15 e 20 (49, 50, 51). Dentro desses domínios, esses genes são regulados por centros de imprinting (CIs). Os CIs caracterizam-se pela presença de regiões diferencial-mente metiladas (RDMs). Tais RDMs apresentam metilação de DNA e modificação de histona específicas do progenitor de origem. Essas RDMs atuantes em cis juntamente com fatores atuantes em trans formam a base da expressão gê-nica específica do progenitor de origem dos genes que so-freram imprinting. Por exemplo, o CI do fator de cresci-mento semelhante à insulina 2 (IGF2/H19) corregula a expressão paterna do IGF2 com a expressão materna do H19, dois genes localizados no mesmo domínio que sofreu imprinting, a uma distância de 90 kb um do outro (52).

reprogramação Epigenética no desenvolvimento de MamíferosNosso conhecimento atual sobre como o epigenoma é re-programado no desenvolvimento humano precoce origina-se principalmente de extensa pesquisa em embriões de ca-mundongos. A reprogramação epigenética do genoma ocorre em dois estágios fundamentais do desenvolvimento: durante a gametogênese e durante o início da embriogêne-se. O primeiro evento ocorre nas CGPs, onde imprintings epigenéticos, específicos tanto dos tecidos quanto do proge-

nitor de origem, são apagados. Novos imprintings epigené-ticos, que incluem imprints específicos do progenitor de origem, são estabelecidos em momentos específicos do de-senvolvimento tanto antes quanto depois da fertilização. Após a fertilização, uma segunda onda de reprogramação de imprintings epigenéticos ocorre no desenvolvimento ini-cial do embrião, incluindo desmetilação global seguida por metilação de DNA “de novo” para permitir a totipotência e subsequente diferenciação celular específica e comprometi-mento de linhagem (Fig. 2). É importante notar que os imprintings epigenéticos nos CIs estão protegidas dessa onda de reprogramação epigenética do genoma.

reprogramação Epigenética nas CGPsA deleção do genoma e a reprogramação de imprintings epi-genéticos são iniciados nas CGPs. O sexo do embrião em desenvolvimento dita qual gameta, oócito ou espermatozoi-de, irá se desenvolver a partir desses precursores tão iniciais. Essa diferenciação específica do sexo inclui o estabelecimen-to de imprints específicos do progenitor de origem no oócito e no espermatozoide.

Estudos em camundongos mostraram que as CGPs co-meçam a migrar para a crista gonadal em desenvolvimento no dia 8,5 da vida embrionária no camundongo (E8,5), atin-gindo seu destino até o dia 11,5 (E11,5) (53). Acredita-se que a desmetilação do genoma das CGPs ocorra principalmente

FIGURA 2

CIs

Dnmt1oDnmt1NLPR2NLPR7Zfp57

Espermatozoide

Met

ilaçã

o

Alta

Baixa

Gametas Desenvolvimento

Oócitosmaduros

Fertilização

Replicação de DNA

Inativação do XTRA

Blastocisto

Reprogramação de metilação de DNA em embriões antes da implan-tação. Logo após a fertilização, os pró-núcleos paterno (azul) e mater-no (rosa) sofrem desmetilação do genoma. Embora a desmetilação do genoma materno ocorra depois daquela do genoma paterno, ambos são remetilados por ocasião da época de implantação (seta amarela). Ao contrário da maioria dos outros genes, os imprintings epigenéti-cos, tais como metilação de DNA, em loci que sofreu imprinting (CIs), são estabelecidas precocemente no desenvolvimento da linhagem germinal, sendo protegidas da onda global de desmetilação no início do desenvolvimento embrionário através da manutenção de isofor-mas DNMT Dnmt1o, Dnmt1, e vários outros genes, tais como NLPR2, NLPR7 e Zfp57. A reprogramação epigenética do embrião antes da implantação também inclui inativação do X. É importante notar que as TRAs ocorrem durante períodos do desenvolvimento que envolvem reprogramação epigenética. Adaptado da referência (109).Inbar-Feigenberg. Conceitos básicos de epigenética. Fertil Steril 2013.



entre E11,5 e E13,5, no local das futuras gônadas (54). A redução na metilação é global; apenas 7% das CpGs perma-necem metiladas em comparação a 70%–80% daquelas pre-sentes em células-tronco embrionárias (ES) e células somá-ticas (25). Promotores de genes específicos para célula germinativa são metilados nas CGPs iniciais e depois des-metilados, sendo expressos durante reprogramação (55). Ainda nessa ocasião, as CGPs de embriões femininos redu-zem a expressão de Xist RNA do cromossomo X inativo (Xi) (56, 57) de modo que dois cromossomos X equivalentes possam participar na meiose para a produção de gametas femininos.

A metilação “de novo” em CGPs é estabelecida pelo re-crutamento de DNMT3a e DNMT3l (58). A proteína dedo de zinco ZFP57 do domínio KRAB também parece desempe-nhar um papel importante especificamente no estabeleci-mento de imprint do oócito (50, 59). É interessante notar que o tempo de desenvolvimento do gameta difere entre os embriões masculinos e femininos. A espermatogênese ocor-re no período pré-natal, e a programação de metilação de DNA específico paterno associada está completa ao nasci-mento (60). A reprogramação epigenética de oócitos ocorre muito mais tarde do que a de espermatozoides. Inicia-se na puberdade, estando quase completa em cada oócito por oca-sião da ovulação (60).

reprogramação Epigenética do desenvolvimento no EmbriãoAntes da fertilização, o espermatozoide e o óvulo são alta-mente especializados, diferindo quanto à sua expressão gê-nica como ditado por distintos padrões de metilação de DNA e organização de cromatina (61). O DNA no esperma-tozoide encontra-se firmemente condensado por protami-nas. A reprogramação do embrião começa com a ‘descon-densação’ do genoma paterno à medida que essas protaminas são substituídas por histonas de origem materna (61). Logo após a fertilização, o genoma pró-nuclear paterno sofre rá-pida desmetilação (Fig. 2) (62, 63, 64, 65, 66, 67, 68). Em seguida ocorre a desmetilação no genoma materno, como aquele do estágio de quatro células do embrião, equalizan-do-se o status de metilação do DNA dos dois genomas pa-rentais (68). O imprinting epigenético em determinados ge-nes são protegidos por proteínas específicas (Fig. 2) a partir da reprogramação epigenética e por todo o desenvolvimen-to do embrião que ocorre antes da implantação (54).

Comprometimento de LinhagemO comprometimento de linhagem já está presente no blas-tocisto, com a formação da massa celular interna (MCI) e trofectoderma (TE), cada um contendo uma assinatura epi-genética única (61). Níveis decrescentes de 5-hidroximetil-citosina (5hmC) e TET oxidases acompanham a diferencia-ção progressiva (69, 70). Como resultado, ocorre reacúmulo de 5-metilcitosina, possivelmente silenciando os genes res-ponsáveis pela regulação do desenvolvimento precoce (69, 70). No momento em que as células se tornam totalmente comprometidas com suas linhagens, elas terão adquirido

uma assinatura epigenética distinta, refletindo seu fenótipo, história de desenvolvimento e influências ambientais (61). É interessante notar que as células placentárias, derivadas do trofectoderma, permanecem relativamente hipometiladas em comparação com os derivados diferenciados da MCI (71), fato adequado ao papel da placenta na invasão endo-metrial e à sua limitada necessidade de diferenciação e lon-gevidade (61).

Manutenção da Marca EpigenéticaUma vez estabelecida, a metilação e outros imprintings epi-genéticos em células tanto somáticas quanto germinativas devem ser mantidos ao longo de futuras divisões celulares. Descobriu-se que vários genes têm um papel maior nesse processo de manutenção, além de DNMT1 e DNMT1o; eles incluem NLPR2, NLPR7 e ZFP57 (59, 72, 73, 74, 75). Como mencionado antes, a proteína ZFP57 atua no estabeleci-mento de novos imprints em oócitos; é também necessária para a manutenção mais global da metilação (59).

desregulação Epigenética e doença HumanaA desregulação epigenética pode resultar de desordens nos mecanismos de controle epigenético ou de alterações nos imprintings genético de determinados genes. O desenvolvi-mento de múltiplos sistemas de órgãos pode ser alterado pela desregulação dos mecanismos de controle epigené-tico. Mutações em proteínas que estabelecem, apagam ou leem imprintings epigenéticos podem afetar negati-vamente o desenvolvimento de múltiplos sistemas de ór-gãos, como pode ser visto em uma variedade de síndromes genéticas humanas, tais como as síndromes ATR-X (OMIM#301040; alfa talassemia, retardo mental) (12), Ru-binstein-Taybi (OMIM#180849; CREBBP/EP300) (76), CHARGE (OMIM#214800; CHD7) (77) e Rett (OMIM#312750; MECP2) (78).

Uma alteração epigenética ou ‘epimutação’ refere-se a uma aberração da metilação de DNA ou do padrão de mo-dificação de histona. Tais alterações ocorrem na ausência ou presença de uma alteração genômica subjacente, sendo cha-madas de epimutações primárias e secundárias, respectiva-mente. Uma epimutação primária pode resultar de aberra-ção na deleção, no estabelecimento ou na manutenção de imprintings epigenéticos (50).

Em genes que não sofrem imprinting, epimutações so-máticas causadas por erros mitóticos na manutenção normal de imprintings epigenéticos podem resultar em regulação anormal do crescimento. Por exemplo, aproximadamente 20% do câncer de mama esporádico apresenta hipermetila-ção do promotor de BRCA1, em geral em combinação com uma mutação herdada ou esporádica no segundo alelo (79). Um potencial de crescimento reduzido também pode resultar de epimutação. Por exemplo, a metilação do promotor de WNT2 (em inglês, Winglesstype MMTV integration site family, member 2) na placenta está associada com baixo per-centil de peso ao nascimento no recém-nascido (80), de-monstrando que uma única alteração epigenética pode ter impacto em fenótipos de crescimento humano.



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Imprinting e doença HumanaGenes que sofreram imprinting estão sujeitos a regulação epi-genética mais complexa do que genes que não sofreram imprinting, fornecendo mais oportunidades para o aparecimento de erros epigenéticos. As contribuições parentais relativas de regiões que sofreram imprinting específicos ao longo do ge-noma podem ser afetadas por vários mecanismos diferentes, incluindo alterações genéticas e/ou epigenéticas (Tabela 1).

Epimutações primárias (aquelas sem associação de alte-rações genômicas) podem surgir a partir de erros estocásti-cos na reprogramação de imprint. Por exemplo, uma falha na deleção de imprints resulta em um gameta de um sexo com imprints do outro sexo. Quando esse gameta participa da fertilização, o zigoto resultante terá imprints uniparen-tais nos dois cromossomos parentais. Uma falha no estabe-lecimento de imprints apropriados no espermatozoide ou oócito pode levar a vários distúrbios de crescimento e de-senvolvimento, incluindo subfertilidade (81).

Alterações genômicas que contribuem para distúrbios de imprinting incluem deleções e duplicações de regiões que so-freram imprinting. Encontra-se também associada com distúr-bios de imprinting a dissomia uniparental (DUP), na qual os dois homólogos da região ou segmento cromossômico são herdados de apenas um progenitor (46, 82), isto é, há duas cópias de uma região que sofreu imprinting de um progenitor e nenhuma do outro. A DUP de regiões genômicas que não sofreram imprinting costuma não estar associada a doença, enquanto que DUP em locais genômicos específicos contendo regiões que sofrerão imprinting pode resultar em distúrbios de imprinting. A extensão da DUP pode variar desde um pequeno segmento genômico até todo o cromossomo (83). Estima-se que a incidência de DUP de qualquer cromossomo seja de cer-ca de 1:3.500 nascidos vivos (84). Como a deleção ou a dupli-cação de uma região genômica que sofreu imprinting altera as contribuições parentais relativas, ela representa um outro me-canismo de regulação de genes que sofreram imprinting.

Muitos genes que sofreram imprinting encontram-se ex-pressos na placenta e também atuam na regulação do cresci-mento fetal e desenvolvimento cerebral (44). Aberrações epi-genéticas e genéticas associadas em genes que sofreram imprinting resultam em doenças humanas que com frequên-

cia refletem crescimento e/ou neurodesenvolvimento aber-rante. Como explicado abaixo, distúrbios individuais de imprinting muito comumente demonstram etiologia heterogênea. Além disso, diferentes etiologias moleculares podem demons-trar correlações do tipo epigenótipo/genótipo-fenótipo.

Distúrbios neurológicos e psiquiátricos envolvendo desregulação de genes que sofreram imprinting e apresen-tando efeitos dos progenitores de origem (85) incluem as síndromes de Prader-Willi (SPW) e de Angelman (SA), duas síndromes do neurodesenvolvimento distintas com grupos de genes que sofreram imprinting no cromossomo 15q11-q13 (86). Essas síndromes servem como um importante exemplo de como a origem parental da lesão genômica/epigenômica define quais distúrbios de imprinting ocorrem. Uma deleção paterna do cromossomo 15q11-13 ou DUP15q11-13 mater-na leva à SPW, enquanto uma deleção materna do cromos-somo 15q11-13 ou DUP15q11-13 paterna leva à SA (50).

Um dos mais conhecidos distúrbios de crescimento pe-diátrico causados por imprinting anormal é a síndrome de Beckwith-Wiedemann (SBW). A SBW caracteriza-se por ma-crossomia, macroglossia e visceromegalia; tumores embrio-nários, como Wilms, hepatoblastoma, neuroblastoma e rab-domiossarcoma; onfalocele, hipoglicemia neonatal, depressão/prega pré-auricular, citomegalia adrenocortical e anomalias renais (46). Uma gestação cujo feto tenha SBW pode ser com-plicada com polidrâmnio, placenta aumentada, cordão umbilical longo e grosso, maior risco de parto prematuro (87), e displasia mesenquimal placentária (88). A etiologia molecu-lar da SBW inclui duas epimutações primárias diferentes: hi-pometilação do CI proximal (CI2) no cromossomo materno e hipermetilação no CI distal (CI1) no cromossomo materno. A hipermetilação no CI2 também pode ocorrer como uma epi-mutação secundária quando há uma deleção subjacente na região CI2 materna. Em casos de SBW com DUP paterna do cromossomo 11p15.5, imprints genômicos em CI1 e CI2 são afetados (51). Pacientes com SBW demonstram importantes correlações do tipo epigenótipo-fenótipo. Por exemplo, os maiores riscos de tumor ocorrem em casos de SBW com anor-malidades moleculares que incluem desregulação do CI1.

A síndrome de Russell-Silver (SRS) caracteriza-se por comprometimento do crescimento pré- e pós-natal, caracte-

TABELA 1

alterações genéticas e epigenéticas na síndrome de Beckwith-Wiedemann.

alterações genéticas alterações de sequência anomalias citogenéticas

Mutação do alelo materno CDKN1C do cromossomo 11p15.5

Mutações no NLRP2 em 19q13.42

Alteração genômica submicroscópica (duplicação/deleção) no cromossomo 11p15.5

Duplicação, inversão ou translocação do 11p15.5

alterações epigenéticas anormalidades na metilação

Perda de metilação no CI2 no cromossomo materno

Ganho de metilação no CI2 no cromossomo materno

Alterações na metilação em múltiplos loci que sofreram imprinting

alteração combinada alterações nas cópias de genes do progenitor de origemDUP paterna do 11p15

Inbar-Feigenberg. Conceitos básicos de epigenética. Fertil Steril 2013.



rísticas dismórficas, presença variável de assimetria de membro/corpo e retardo do desenvolvimento. Até o mo-mento, dois diferentes defeitos epigenéticos foram associa-dos com SRS (89). O primeiro é DUP materna do cromosso-mo 7, que ocorre em cerca de 10% dos casos de SRS (90).

O segundo é hipometilação no CI1 do cromossomo 11p15.5 paterno, que ocorre em cerca de 45% dos casos (89, 91, 92, 93). A última forma é essencialmente oposta, do ponto de vista tanto de fenótipo quanto de epigenótipo, aos casos de SBW com ganho de metilação da mesma região. É interessante notar que alguns homens com oligospermia não apresentam metilação paterna no CI1 IGF2/H19 do cromossomo 11p15.5 em seus espermatozoides (94). Crian-ças que herdam esse cromossomo dos pais apresentam risco de desenvolver SRS (89).

Distúrbios de imprinting podem incluir erros de imprinting em vários domínios. Por exemplo, tanto na SBW quan-to na SRS, alguns pacientes exibem perda de metilação não apenas no CI no cromossomo 11p15 – CI1 para SRS e CI2 para SBW – mas também em outros loci que sofreram imprinting. Não se conhece a base molecular dessa perda de metilação de multilocus para as duas condições. No entanto, a perda de metilação multilocus também ocorre no distúrbio de imprinting diabetes mellitus transitório neonatal (74), onde o defeito primário de imprinting ocorre na RDM PLA-GL1 no cromossomo 6q24; perda de metilação associada a outras RDMs maternas foram relatadas (74, 75). Demons-trou-se que a condição de perda de metilação multilocus é devida a mutações homozigóticas no gene ZFP57. Esse gene normalmente codifica um fator materno derivado do oócito que participa na manutenção de imprints em múltiplos loci antes da implantação.

Mutações nos genes NLRP também podem estar asso-ciadas com erros de imprinting em múltiplos loci genômi-cos. As proteínas NLRP são membros da família das proteí-nas CATERPILLER envolvidas em inflamação e apoptose (50). Mutações de NLRP7 no oócito estão associadas com imprints aberrantes em múltiplos loci (72), causando forma-ção de mola hidatiforme parcial, denominada ‘biparental’ por originar-se do oócito e do espermatozoide.

desregulação Epigenética no desenvolvimento FetalO desenvolvimento embrionário inicial mostrou-se um pe-ríodo crítico de suscetibilidade à desregulação epigenética. Na verdade, estudos com crianças nascidas após inanição materna mostraram que o primeiro trimestre da gestação é um período crítico para alterações epigenéticas (3, 5, 94). É interessante notar que crianças nascidas após o uso de TRAs também apresentaram modificações epigenéticas, que são descritas a seguir (95, 96).

trasAs TRAs são responsáveis por 1%–2% dos nascimentos vi-vos nos países desenvolvidos (95). Em geral, tais tecnologias têm alta taxa de sucesso, com poucos relatos de desfechos adversos. Tem-se observado uma maior incidência de erros

epigenéticos levando a distúrbios de imprinting, tais como SBW, SRS (96), e SA (95), em alguns estudos com crianças concebidas através de TRA. No entanto, nem todos os estu-dos confirmaram tais associações (97). A variabilidade nos desfechos de tais estudos pode ser devida ao grande número de fatores variáveis que poderia afetar a reprogramação epi-genética. Foi demonstrado que a subfertilidade em si pode-ria estar associada com erros epigenéticos no esperma de homens oligospérmicos (81). Dados de camundongos mos-tram que erros epigenéticos também podem resultar da in-dução de ovulação ou cultura de embriões in vitro (98). Es-pera-se que investigações futuras de novas tecnologias reprodutivas elucidem fatores de risco específicos associa-dos com as TRAs. Além disso, espera-se que apenas alguns indivíduos que se submetem às TRAs sejam geneticamente suscetíveis a tais fatores de risco ambientais.

Efeitos ambientaisFatores ambientais podem alterar imprintings epigenéticos primários, exercendo impacto não apenas no embrião em desenvolvimento, mas também na próxima geração de des-cendentes. O delineamento de tais efeitos ambientais através de gerações será um importante assunto de pesquisa no fu-turo. Um exemplo documentado da importância do ambien-te na evolução de doenças de bases epigenéticas é observado nos estudos holandês e chinês sobre inanição (3, 5, 94). Por exemplo, descendentes masculinos expostos à Fome Holan-desa de 1944–45 nas primeiras dez semanas após a concep-ção mostraram alterações persistentes de metilação no gene IGF2 que sofreu imprinting seis décadas mais tarde (6, 100). As fomes históricas constituem-se em poderosos ‘experi-mentos naturais’ em seres humanos, tendo resultado na des-coberta de imprintings epigenéticos que podem ser modifi-cados pelo ambiente pré-natal (99). Exposição pré-natal a fome foi associada com vários fenótipos adversos metabóli-cos e mentais mais tarde na vida, incluindo um maior índice de massa corporal (100, 101, 102), elevação de lípides plas-máticos (103), aumento do risco de esquizofrenia (100, 101, 102, 104, 105) e possível doença cardiovascular (106).

A exposição a fatores nutricionais, poluentes ambientais e medicamentos durante a gestação também pode alterar os imprintings epigenéticos fetais. Por exemplo, foi demonstra-do que a ingestão de colina durante a gestação aumenta a metilação placentária do promotor dos genes de regulação do cortisol CRH e NR31C, levando a uma melhora da respos-ta ao estresse em crianças pela redução dos níveis de cortisol através do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (107). Desco-briu-se que a exposição a substâncias tóxicas, como o pesti-cida vinclozolin, plásticos, dioxina, ou combustível de avião, afeta o desenvolvimento fetal e pós-natal de ratos, resultan-do em alterações consistentes com a biologia de insuficiên-cia ovariana primária e síndrome do ovário policístico em seres humanos (108). Algumas dessas alterações epigenéticas foram transmitidas para a próxima geração (109).

O papel dos imprintings epigenéticos na tradução da sequência genômica primária passou a ocupar a linha de frente dos estudos genéticos humanos. A pesquisa epigené-tica atual avalia vários tópicos que contribuirão para a



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compreensão do papel dos mecanismos epigenéticos tanto na saúde quanto na doença humana, entre os quais desta-cam-se: a caracterização de influências atuantes em cis- e trans- no cenário genético; a delineação de imprintings epigenéticos com especificidade para células e tecidos; a de-terminação de interações entre epigenoma e ambiente, com foco em programação fetal; a descoberta dos efeitos de me-dicação e nutrição; e a avaliação de riscos para os distúrbios com início na vida adulta.

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Milhões de crianças, correspon-dendo a cerca de 1% - 2% de todos os nascimentos nos Es-

tados Unidos e na Europa, são fruto do uso de técnicas de reprodução assistida (TRAs) para casais que apresentam problemas de fertilidade (1). Embora tais técnicas sejam consideradas segu-ras em geral, há evidência sugerindo que seu uso está associado a risco au-mentado de desfecho adverso perinatal e problemas congênitos (2). Além dis-so, a despeito dos achados contraditó-rios (3, 4, 5, 6, 7), há vários relatos in-dicando um aumento do risco de doenças causadas por imprinting ge-nômico anormal, tais como as síndro-mes de Beckwith-Wiedemann (BWS-OMIM #130650) (8, 9, 10, 11, 12) e Angelman (AS-OMIM #105830) (11, 13, 14).

O imprinting genômico é um fenô-meno específico de mamíferos, resul-tando de marcas de imprinting adqui-ridas de maneira sexo-específica nos gametas femininos e masculinos em

sequências reguladoras (regiões dife-rencialmente metiladas, RDMs, tam-bém chamadas de regiões de controle de imprinting, RCIs) de um subconjun-to de genes fundamentais ao desenvol-vimento, denominados de genes que sofreram imprinting (15). Na verdade, descobriu-se que esses genes desempe-nham um papel crucial no crescimento e desenvolvimento embrionário, fun-ções placentárias (16), vias metabóli-cas pós-natais e comportamento asso-ciado com o controle de recursos (17). Ademais, oncogênese também pode estar associada com alterações epige-néticas (18).

Em geral, esses genes estão locali-zados em grupos, marcados de maneira epigenética principalmente por metila-ção de DNA – adição de um grupo me-til (−CH3) no quinto carbono de uma base citosina no dinucleotídeo citosina guanina (CG) (19)-, por modificações de histona (acetilação/desacetilação e me-tilação), estando por vezes associados com RNAs antisense (20, 21). O imprin

ting genômico costuma atuar através do silenciamento de alelos maternos ou paternos de genes que sofreram imprinting, permitindo a expressão de apenas um alelo. Até o momento, a me-tilação de DNA foi a mais amplamente estudada. Até agora, cerca de 150 genes que sofreram imprinting foram identi-ficados em camundongos e seres hu-manos (http://igc.otago.ac.nz; www. geneimprint.com; www.mousebook.org/catalog.php?catalog=imprinting).

A metilação alelo-específica de RDMs primárias (também chamadas RDMs da linhagem germinativa) ocor-re em células germinativas de uma maneira sexo-específica durante a ga-metogênese e fornece uma ‘memória’ herdável que é mantida ao longo da fertilização e desenvolvimento em-brionário. Essa metilação diferencial é preservada durante o desenvolvimen-to anterior à implantação, indepen-dentemente das alterações genômicas na metilação global de DNA que ocor-rem nesses estágios iniciais com a fi-nalidade de expressão alelo-específica (17). Essas RDMs da linhagem germi-nativa atuam em cis para controlar a expressão parental alelo-específica de vários genes que sofreram imprinting.

Devido à sua haploidia funcional e seu determinismo epigenético, a ex-pressão anormal de genes que sofre-

Indução de ovulação e anomalias epigenéticasPatricia Fauque, M.D., Ph.D.

Laboratoire de Biologie de la Reproduction, Hôpital de Dijon, Université de Bourgogne, Dijon, France

Nesta revisão sistemática sobre indução de ovulação e controle epigenético, estudos realizados principalmente no modelo de camundongo ressaltam como os tratamentos hormonais podem ser prejudiciais à reprogramação epigenética de gametas, assim como de embriões em início de desenvolvimen-to. Além disso, os protocolos hormonais usados na reprodução assistida também podem modificar o ambiente fisiológico do útero, uma ligação poten-cial com distúrbios epigenéticos endometriais. No momento, os poucos dados disponíveis em seres huma-nos são insuficientes para permitir que se determine independentemente o impacto da idade feminina, de problemas de infertilidade, de protocolos de tratamento e doses hormonais em processos como o imprinting genômico. (Fertil Steril® 2013;99:616–23. ©2013 by American Society for Reproductive Medicine.)Palavras-chave: epigenética; indução de ovulação; metilação de DNA; imprinting genômico; estimula-ção ovariana

Discussão: Você pode discutir este artigo com seus autores e outros membros da ASRM em http://fertstertforum.com/fauquep-ovulation-induction-epigenétic-anomalies/

Recebido: 31 de outubro de 2012; revisado: 19 de dezembro de 2012; aceito: 26 de dezembro de 2012.

P.F. nega conflito de interesse.Solicitação de reimpressões: Patricia Fauque, M.D., Ph.D., Hôpital de Dijon, Université de Bourgogne,

Laboratoire de Biologie de la Reproduction, 2 Bd Mal De Lattre De Tassigny, 21079 Dijon, France.







ram imprinting pode resultar de distúrbios genéticos (dele-ção ou duplicação, mutação ou dissomia uniparental) e ainda de epimutações (anomalias de metilação). Observações de que pacientes com síndrome de Beckwith-Wiedemann (SBW) apresentavam cerca de nove vezes maior probabilida-de de terem sido concebidos através de TRAs do que pacien-tes sem SBW (10) e de que o defeito observado após TRA é sistematicamente uma epimutação sugerem fortemente que as TRAs poderiam perturbar o controle epigenético do geno-ma durante a gametogênese e/ou início da embriogênese. É importante notar que o defeito epigenético encontrado em todas as crianças com SBW e síndrome de Angelman (AS) nascidas após TRAs é a hipometilação no alelo materno da RDM relevante. Assim, efeitos deletérios inerentes às TRAs podem ocorrer primariamente durante reprogramação epige-nética feminina, que acontece durante o processo de matu-ração de oócitos.

A reprodução assistida, que inclui principalmente ferti-lização in vitro (FIV) e injeção intracitoplasmática de esper-matozoide (ICSI), envolve vários estágios de manipulação do material gamético e embrionário nas etapas iniciais do desenvolvimento, em geral após protocolos de estimulação hormonal. Inseminação intrauterina (IIU), uma outra TRA que costuma ser realizada em combinação com indução de ovulação, também inclui preparação do sêmen.

Até o momento, não está claro quais TRAs estão envol-vidas nas anomalias epigenéticas. No entanto, um dos aspec-tos importantes relacionados a possíveis alterações epigené-ticas é a indução artificial de ovulação. A observação de distúrbios epigenéticos em crianças concebidas após FIV e técnicas de ICSI e de IIU, com/ou sem doador de sêmen, ser-ve de base para essa noção. Além disso, em alguns estudos, identificaram-se pacientes com SBW e AS, em cujas mães o único procedimento de TRA usado foi estimulação ovariana (11, 22, 23). Um outro argumento em favor da disrupção epigenética hormonal é que imprintings de metilação de DNA são depositados de maneira assincrônica nas duas ga-metogêneses. A aquisição de metilação de DNA em RDMs ocorre durante os estágios pré-natais da espermatogênese, sendo completada num estágio pós-natal, enquanto, na oo-gênese, ela se inicia mais tarde, após a puberdade nos oóci-tos em crescimento de folículos primordiais até folículos antrais. A estimulação ovariana realizada através do uso de hormônios exógenos durante esse período pode desorganizar a aquisição de imprints na maturação de oócitos. Além dis-so, nos tratamentos de FIV ou de ICSI, a dose de estimulação ovariana é maior para produzir um maior número de oócitos ovulados do que na ovulação espontânea ou até com os tra-tamentos de IIU. Essa maturação forçada do oócito pode le-var à perda da expressão materno-específica e ao desenvol-vimento de distúrbios de imprinting em alguns oócitos normalmente não ovulados. Além disso, em casos de inferti-lidade feminina com baixa reserva ovariana ou na idade ma-terna avançada, maiores dosagens de hormônios são tipica-mente usadas. É bastante difícil em seres humanos distinguir os efeitos de estimulação ovariana de outros fatores que contribuem para infertilidade no imprinting genômico.

Portanto, efeitos deletérios de tratamentos hormonais podem alterar a reprogramação epigenética durante o pro-

cesso de maturação de oócitos. No entanto, como apresen-tado nesta revisão, a indução ovariana também pode modi-ficar o ambiente fisiológico do útero assim como a implantação e o desenvolvimento do embrião. Em ciclos de FIV, foi demonstrado que os pesos ao nascimento de fetos únicos são menores após transferências de embrião fresco do que após ciclos de congelamento-descongelamento (4, 24, 25, 26, 27). Tal achado levou à sugestão de que, através de processos epigenéticos, o desenvolvimento multifolicular estimulado por gonadotrofina e a produção de níveis supra-fisiológicos de hormônios sexuais esteroides podem ter um papel no momento da implantação do embrião. Podem mo-dular a receptividade endometrial e/ou propriedades invasi-vas do trofoblasto e representar um fator epigenético que contribua para a elevação do risco de baixo peso ao nasci-mento e outros distúrbios de placentação anormal.

rEProGraMação EPiGENétiCa EM oóCitoS dE CaMuNdoNGo E SErES HuMaNoSEm camundongos, a reprogramação epigenética começa com o desenvolvimento da célula germinativa a partir de células epiblásticas por volta do dia embrionário 7,25 (E7,25), conti-nua depois que as células germinativas primordiais (CGPs) tenham atingido a crista gonadal no E10,5, durando até o E13,5 (28) (42 a 44 dias em seres humanos). Após sua subse-quente migração para as gônadas em desenvolvimento, as CGPs exibem uma marcante desmetilação de DNA do geno-ma. Com relação à metilação do genoma, os níveis são altos (73,2% a 85%) em células-tronco embrionárias, enquanto que, nas CGPs femininas, no E13,5, a metilação está presente em menos de 10% das células (29). Essa desmetilação de DNA também afeta loci que sofreram imprinting (30, 31). Apenas um subconjunto específico de elementos repetidos, chama-dos de elementos de partícula A intracisternal (IAP), perma-nece refratário à reprogramação na CGPs (31, 32). Provavel-mente devido ao número restrito de células, houve poucos estudos sobre o status da cromatina do oócito. Entretanto, alterações na cromatina também ocorrem nesse período, acompanhadas por um extenso apagamento de várias modi-ficações de histona (perda das histonas reprimidas H3K9me3 e H3K27me3, assim como perda de marcadores de histonas ativas H3K9ac) e troca de variantes de histona (31). Diferen-temente dos rearranjos de cromatina, que são muito transitó-rios (do E11,5 ao E12,5) (31), o apagamento de desmetilação de DNA diferencial de genes que sofreram imprinting persis-te até que novos imprints sejam impostos mais tarde no em-brião de maneira sexo-específica, o que ocorre em momentos diferentes nas linhagens germinativas masculina e feminina.

Como descoberto no modelo do camundongo na fase neo natal, na linhagem germinativa feminina, marcas de imprint são estabelecidas de maneira gene-específica em deter-minadas ocasiões, desde o estágio de folículo primário até o estágio de folículo antral, enquanto os oócitos estão parados na prófase I (33, 34, 35). A aquisição de metilação aumenta até o estágio de folículo antral nos oócitos; sendo totalmente estabelecida no estágio de folículo antral. A metilase “de novo” Dnmt3a em colaboração com a Dnmt3L é responsável



17

por estabelecer um novo estado de metilação de DNA em se-quências repetidas e genes do desenvolvimento (36, 37) e por reajustar o imprint da RDM da linhagem germinativa sexo-específico (38, 39). Durante o desenvolvimento neonatal do oócito do camundongo, a aquisição do imprint de metilação de um gene que sofreu imprinting Peg1 parece ser o último (33, 40). Entretanto, durante o crescimento do folículo do ca-mundongo adulto, o imprint materno parece ser estabelecido ao mesmo tempo em todos os genes que sofreram imprinting analisados, e a dinâmica da metilação parece ser mais pro-gressiva se comparada com aquela do período neonatal (40).

Na oogênese humana adulta, o tempo de imprinting materno parece ser idêntico ao do modelo do camundongo (40). As RDMs maternas apresentam metilação de DNA em cerca de 50% dos oócitos adultos nos estágios foliculares iniciais (estágios de folículo primordial e primário), estando completamente metiladas nos oócitos em estágios folicula-res antrais tardios (Fig. 1). As RDMs paternas permanecem não metiladas em todos os estágios.

Khoueiry e col. (41) também observaram que a metila-ção “de novo” da RDM KCNQ1OT1 (KvDMR1) ocorreu gra-dualmente com a progressão da meiose II. Cerca de dois terços dos alelos foram metilados nessa RDM em oócitos de vesícula germinal (VG) totalmente crescidos até todos os alelos da maioria dos oócitos de metáfase II (MII) em ciclos estimulados. Entretanto, Geuns e col. (42), analisando uma outra região dentro da KvDMR1, relataram um padrão me-tilado geral para esses genes que sofreram imprinting logo no estágio de VG. A discrepância entre os dois grupos pode-ria ser explicada por uma aquisição de metilação dissociada entre duas regiões dessa RDM.

É interessante notar que a maioria das regiões de con-trole de imprinting (RCIs) é metilada no oócito (17 RCIs maternas de 20 gRDMs/RCIs identificadas) enquanto ape-nas três são metiladas no espermatozoide (gRDMs pater-nas). Logo, devido a esse grande número de RCIs maternas, a frequência de erros de imprinting durante a reprograma-ção epigenética materna é estatisticamente maior do que no sêmen. Além disso, RCIs maternas são promotoras de ilha de CpG, enquanto RCIs paternas são relativamente po-bres em CpG e intergênicas. Como já sugerido, as razões evolutivas para tais discrepâncias sexuais podem estar re-lacionadas à diferente cinética de desenvolvimento das ga-metogêneses masculina e feminina (43, 44). Além disso, os resultados relatados pelos pesquisadores enfatizam o papel crucial da reprogramação materna: RCIs maternas têm um papel dominante no desenvolvimento precoce, regulando as vias biológicas relacionadas ao estabelecimento da in-terface fetomaterna (44).

EFEitoS EPiGENétiCoS da iNdução da ovuLaçãoPeríodo pré-implantaçãoModelo animal. O sistema do modelo animal é interessan-te, uma vez que a subfertilidade não é um aspecto de con-fusão. Até o momento, estudos em animais sobre os efeitos da superovulação no imprinting produziram resultados con-flitantes (Tabela 1). Na verdade, efeitos negativos da supe-rovulação no imprinting genômico foram encontrados por alguns grupos de pesquisa. O grupo de Mann relatou perda de metilação materna de Snrpn, Kcnq1ot1 e Peg3 em embri-

FIGURA 1

NASCIMENTO

APAGAMENTO HIPOMETILAÇÃO METILAÇÃO “de novo”

Período embrionário

Recombinaçãomeiótica

CGPsmigratórias

CGPscolonizadoras

CGPspós-migratórias

Primordial PrimordialL/Z P D

Período adulto

Primária Secundáriapré-antral

Terciáriaantral inicial

Terciáriaantral tardia

MII

Tratamentos hormonais

Dinâmica da metilação durante o crescimento do folículo. A reprogramação epigenética começa com o desenvolvimento da célula germinativa e continua depois que as células germinativas primordiais (CGPs) tenham atingido a crista gonadal. Após sua subsequente migração para as gônadas em desenvolvimento, as CGPs exibem uma acentuada desmetilação de DNA de todo o genoma. A essa fase de apagamento da meti-lação segue-se uma parada meiótica dos gametas (parada em diplóteno da prófase I) dentro dos folículos no estágio primordial. Imprints de metilação maternos são então estabelecidos durante a fase de crescimento pós-natal desde o estágio de folículo primário até o de folículo an-tral, o período em que os tratamentos hormonais são administrados. Os vários estágios de desenvolvimento dos gametas femininos são mos-trados: D = diplóteno; L = leptóteno; MII = metáfase II; P = paquíteno; Z = zigóteno. [adaptado de Bourc’his e Proudhon (77)].Fauque. Indução de ovulação e anomalias epigenéticas. Fertil Steril 2013.



ões no estágio de blastocisto recuperados a partir de mulhe-res cuja ovulação foi induzida em comparação a mulheres que ovularam espontaneamente (45). Tais erros de imprinting ocorreram de maneira dose-dependente, com maior fre-quência de distúrbios após altas doses de hormônio do que baixas doses. Além da perda de metilação materna, os in-

vestigadores observaram um ganho de metilação materna para o alelo H19 materno normalmente não metilado em embriões no estágio de blastocisto. Embora as diferenças entre os grupos não fossem estatisticamente significativas, El Hajj e col. (46) observaram níveis discretamente mais ele-vados de erros de imprinting em embriões individuais de 16

TABELA 1

Efeitos epigenéticos após indução ovariana no modelo de camundongo.

Estudo Superovulação Método amostras Gene resultados

Sato e col., 2007 (40)

3 × 7,5 UI de PMSG, 5 UI de hCG

Análise de restrição combinada com bissulfito e PCR

Pool de 30–50 oócitos de MII

Peg1, Lit1, Zac, H19

Ganho de metilação.

Fauque e col., 2007 (51)

5 UI de PMSG, 5 UI de hCG

Sequenciamento de mutagênese com bissulfito

20 blastocistos individuais

H19 Perfis normais de metilação.

RT-qPCR (tecnologia TaqMan)

Níveis alterados de expressão.

Fortier e col., 2008 (58)



36 embriões individuais e placentas (9,5 dpc)

Snrpn, H19, Igf2, Kcnq1ot1

Perfis normais de metilação.

RT-PCR Perda de expressão ‘imprintada’ para Snrpn, H19, Igf2, Kcnq1ot1 principalmente nas placentas.

Anckaert e col., 2009 (49)



3 pools de 100–150 oócitos de MII

Snrpn, H19, Igf2, Peg3

Perfis normais de metilação.

Market-Velker e col., 2010 (53)

6 ou 10 UI de PMSG, 10 UI de hCG


10 blastocistos individuais

Snrpn, H19, Peg3, Kcnq1ot1

Perda de metilação para Snrpn, Peg3, Kcnq1ot1, H19mat e ganho de metilação para H19pat.

El Hajj e col., 2011 (46)

7,5 UI de PMSG, 7,5 UI de hCG


10 embriões individuais de 16 células

Snrpn, H19 Perda de metilação para Snrpn, H19pat, e ganho de metilação para H19mat. Perfis anormais de metilação observados também em embriões produzidos sem superovulação.

Denomme e col., 2011 (48)

6,25 ou 10 UI de PMSG, 10 UI de hCG


125 oócitos de MII individuais

Snrpn, H19, Peg3, Kcnq1ot1

Perfis normais de metilação com 6,25 UI PMSG.

de Waal e col., 2012 (69)



descendentes juvenis: 4 individuais masculinos e 4 individuais femininos: cérebro e tecido hepático

Snrpn, H19, Peg3 Perda de metilação para H19 em 1/8 dos descendentes juvenis. Perda de metilação para Peg3 em 2/8 dos descendentes juvenis.

RT-PCR Níveis de expressão alterados para H19, Snrpn e Peg3.


Espermatogônias de camundongos derivados de superovulação

H19 Remetilação atrasada de H19 de RDM materna (8% a 25% de metilação) em comparação com aquelas de filhotes machos naturalmente concebidos (46% a 49%).

Nota: dpc = dias pós-coito; RDM = região diferencialmente metilada; hCG = gonadotrofina coriônica humana; MII = metáfase II; PCR = reação em cadeia da polimerase; PMSG = gonadotro-fina coriônica equina; RT-qPCR = reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real.

Fauque. Indução de ovulação e anomalias epigenéticas. Fertil Steril 2013.



19

células de camundongo produzidos in vivo a partir de oóci-tos resultantes de superovulação do que em embriões obti-dos a partir de acasalamentos não estimulados. Além disso, Shi e Haaf (47), usando imunofluorescência com metilcito-sina, relataram padrões anormais de metilação em embriões de mulheres submetidas a superovulação em comparação aos de mulheres não submetidas a superovulação. Mais tar-de, em condições de superovulação idênticas às usadas no primeiro trabalho, o grupo de Mann encontrou padrões de metilação ‘imprintada’ normais dos mesmos genes que so-freram imprinting em oócitos maduros individuais (48). Para Snrpn, Peg3 e Kcnq1ot1, a porcentagem de metilação foi próxima a 100%, sendo H19 não metilado como espera-do para oócitos maduros de MII. Semelhantemente a esses achados, um estudo prévio realizado por um outro grupo também descobriu padrões normais de metilação de vários desses mesmos genes que sofreram imprinting (Snrpn, Peg3 e H19) e também de Igf2r em oócitos maduros obtidos de camundongos femininos submetidos a superovulação (49).

Sato e col. (40) demonstraram um ganho de metilação de H19 em um pool de oócitos de MII superovulados em duas linhagens de camundongos (ICR e BDF). No entanto, os dife-rentes resultados podem ser explicados pela idade das fême-as; além disso, seus procedimentos de superovulação foram completamente diferentes daqueles de outros grupos de pes-quisa. Na verdade, eles coletaram oócitos de fêmeas com 10 semanas de idade após superovulação através de injeção de 7,5 UI de gonadotrofina coriônica equina (PMSG) por 3 dias, seguida 24 horas depois por uma injeção de 5,0 UI de gona-dotrofina coriônica humana (hCG). No entanto, um estudo anterior havia relatado heterogeneidade de metilação para o gene que sofreu imprinting Peg1/Mest materno em oócitos maduros obtidos após superovulação (50). Padrões de Peg1/Mest totalmente metilados, mistos e não metilados foram ob-servados em oócitos de MII superovulados, sugerindo que o imprint de metilação desse gene não está estabelecido em todos os oócitos obtidos após superovulação (50). Um outro estudo mostrou que a superovulação por si só não altera o

estado de metilação de DNA do gene H19, mas afeta seus níveis de expressão em alguns blastocistos individuais (51).

Por fim, a maioria dos resultados baseados em estudos animais realizados no período de pré-implantação sugere que a aquisição de imprint por si só pode não ser afetada pela superovulação, indicando seu papel negativo na manu-tenção de imprint. A superovulação pode produzir modifi-cações nos produtos gênicos de efeito materno (síntese ou armazenamento de fator materno anormal no oócito) que são mais tarde necessários para a manutenção de imprint no embrião em desenvolvimento (52). Pode-se levantar a hipó-tese de que vários fenótipos de oócito e embrião observados após superovulação induzida por hormônio poderiam estar envolvidos nas diferenças da eficiência de implantação e de desenvolvimento fetal (51). Além disso, Market-Velker e col. (53) relataram que a superovulação pode aumentar os efei-tos epigenéticos aberrantes da cultura de embrião, prova-velmente através do comprometimento da habilidade de manter o imprinting genômico.

Modelo humano. Como no modelo do camundongo, Sato e col. (40) relataram que oócitos humanos obtidos após es-timulação ovariana em tratamentos de infertilidade e indi-vidualmente analisados quanto ao sequenciamento de mu-tação com bissulfito apresentaram erros que sofreram imprinting para os genes PEG1 (perda de metilação) e H19 (ganho de metilação) (Tabela 2). No entanto, não consegui-ram distinguir se tais defeitos na metilação de DNA estavam relacionados ao protocolo de superovulação, idade das pa-cientes, ou maturação atrasada do oócito, ou se eram ine-rentes à infertilidade feminina. Khoueiry e col. (41) observa-ram que a RDM KCNQ1OT1 (KvRDM1) é mais metilada em oócitos de VG e metáfase I (MI) de ciclos naturais do que naqueles de ciclos estimulados (62,5% vs. 67,8% para VG e 70,3% vs. 63,6% para MI, respectivamente), sugerindo que a estimulação com gonadotrofina possa modificar a dinâmica da metilação “de novo” durante a maturação do oócito e/ou possa recrutar folículos demasiadamente jovens.

TABELA 2

Efeitos epigenéticos após indução ovariana em seres humanos.

Estudo Superovulação Método amostras Gene resultados

Geuns e col., 2003 (54)

TH Sequenciamento de mutagênese com bissulfito

7 VG individuais, 3 oócitos MI e MII individuais

SNRPN Perfis normais de metilação

Geuns e col., 2007 (42)


6 VG e MI individuais e 4 oócitos MII individuais

KCNQ1OT1 Perfis normais de metilação em 15 de 16 oócitos

Sato e col., 2007 (40)


10 oócitos MI individuais

PEG1, H19 Ganho de metilação para H19 e perda de metilação para PEG1

Khoueiry e col., 2008 (41)


11 pools de 1–3 oócitos MII

KCNQ1OT1 Perda de metilação

Nota: VG = vesícula germinal; TH = tratamento hormonal; MI = metáfase I; MII = metáfase II.

Fauque. Indução de ovulação e anomalias epigenéticas. Fertil Steril 2013.



Esses resultados são consistentes com aqueles previa-mente publicados por Geuns e col. (42), que encontraram padrões de metilação anormalmente baixos para KCNQ1OT1 em metade dos oócitos analisados maturados espon-taneamente (2 de 4 oócitos de MII) obtidos a partir de ciclos de estimulação ovariana. Essas disrupções de imprint po-dem ser causadas pelo atraso do desenvolvimento de oóci-tos, impedindo o estabelecimento de imprint no momento adequado ou por estimulação ovariana ou cultura in vitro, interferindo com a aquisição de imprint em oócitos. No en-tanto, o mesmo grupo de pesquisa já havia demonstrado perfis de metilação normais para outro gene materno que sofreu imprinting (gene SNRPN) em três oócitos espontane-amente maturados in vitro (54).

Períodos de implantação e Pós-implantação Dados obtidos a partir de camundongos superovulados de-monstraram um alto risco de atraso do crescimento fetal e um número aumentado de reabsorções com tratamento hor-monal (55, 56, 57). Três atores principais podem estar en-volvidos nesses processos depois da implantação: células embrionárias, tecido placentário e endométrio.

A disrupção epigenética após superovulação observada no estágio de blastocisto não foi encontrada mais tarde na gestação de embriões de camundongo (56). No entanto, ve-rificou-se expressão bialélica anormal de genes que sofre-ram imprinting maternos e paternos (genes Snrpn e H19) na placenta de camundongo durante aquele mesmo período gestacional. Esses defeitos de imprinting também foram as-sociados com um aumento da expressão do gene Igf2 no tecido placentário. Tais resultados sugerem que a superovu-lação isolada possa comprometer a manutenção do imprinting durante o período de pré-implantação, em especial nos tecidos derivados do trofectoderma. Pode-se facilmente imaginar que tais interferências de imprinting observadas no modelo do camundongo podem ter implicações clínicas humanas na reprodução assistida, tais como falta de im-plantação do embrião, aborto espontâneo ou atraso do cres-cimento fetal devido a placentas disfuncionais.

Outra causa possível da baixa taxa de implantação po-deria ser a reduzida receptividade endometrial em ciclos es-timulados. Sabe-se que, em seres humanos, os tratamentos hormonais modificam a maturação do endométrio (58, 59). A estimulação ovariana leva ao avanço do desenvolvimento endometrial com uma mudança na janela de receptividade endometrial, em média 1 a 2 dias antes do que nos ciclos naturais (59). Nos ciclos estimulados, o endométrio é expos-to a níveis suprafisiológicos de hormônios esteroides duran-te a fase folicular; em alguns casos, isso pode ser responsá-vel por um perfil de expressão de receptor esteroide alterado na fase luteínica inicial (60). A estimulação ovariana tam-bém pode modular o perfil de expressão de vários genes envolvidos em complexos mecanismos de receptividade en-dometrial, incluindo quimiocinas endometriais e fatores de crescimento, como mostrado em abordagens de sequencia-mento profundo (61).

A metilação de DNA pode desempenhar um papel im-portante na regulação das mudanças endometriais associa-

das com indução de ovulação, como recentemente provado por observações de alterações funcionais endometriais ao longo do ciclo menstrual. Na verdade, ficou demonstrado com clareza que a metilação de DNA está envolvida na re-ceptividade endometrial e na decidualização (62, 63). Dois estudos recentes relataram diferentes padrões de expressão de três DNA metiltransferases (Dnmt1, 3a, 3b) dependentes dos períodos do ciclo reprodutivo (64, 65). Na fase secreto-ra do endométrio humano, níveis de mRNA de DNMT1, DNMT3a e DNMT3b são mais baixos do que na fase proli-ferativa. Esses perfis de expressão de mRNA das Dnmts du-rante o ciclo também foram observados no modelo do ca-mundongo (66). Em um estudo, camundongos tratados com um agente desmetilante de DNA, o análogo de nucleosídeo 5-aza-2’-deoxicitidina, apresentaram uma diminuição do-se-dependente no número de sítios de implantação associa-da com expressão alterada de Dnmts endometriais e genes que controlam mudanças endometriais (67).

Todos esses achados sugerem que a metilação de DNA desempenhe um papel potencial nas mudanças endometriais durante a implantação do embrião após tratamentos hormo-nais. Experimentos adicionais são necessários para esclarecer o impacto da estimulação ovariana nas alterações de metila-ção de DNA endometrial e processos de falha de implanta-ção, uma vez que os respectivos papéis dos distúrbios epige-néticos embrionários ou endometriais na falha de implantação permanecem obscuros. Yin e col. (68) tentaram analisar essa questão em um modelo de perda de gravidez precoce. Esses autores observaram que defeitos na metilação de manuten-ção no embrião, e não no útero, poderiam ser causa de im-plantação embrionária e desenvolvimento anormais.

descendentes e Efeitos transgeracionais Waal e col. (69), em um estudo com camundongos, observa-ram que a estimulação com gonadotrofina podia induzir epimutações nos descendentes independentemente de qual-quer procedimento usado durante as TRAs (e.g., ICSI). Des-cobriram que o uso da estimulação com gonadotrofina real-mente levava a disrupções da metilação de DNA e/ou expressão alelo-específica anormal de H19, Snrpn ou Peg3 nos tecidos somáticos de machos e fêmeas derivados de su-perovulação (seis de oito camundongos). Os autores conclu-íram que a superovulação pode contribuir para a indução de epimutações durante procedimentos de TRA.

Sabe-se que, devido ao apagamento de reprogramação, os erros epigenéticos não são transmitidos para a próxima geração (70). Isso foi recentemente demonstrado por Waal e colaboradores no modelo do camundongo após ICSI (71) e tratamentos de superovulação (69). Eles relataram que epimutações induzidas por superovulação ou ICSI são corri-gidas na linhagem germinativa masculina de machos adul-tos. No entanto, para o gene H19, eles observaram atraso da reprogramação nas células espermatogênicas tanto para su-perovulação quanto ICSI, provavelmente devido ao atraso da remetilação da RDM materna em 100% (sete de sete) dos camundongos jovens derivados de superovulação (69).

Stouder e col. (72) já haviam relatado a existência dos efeitos transgeracionais de superovulação. Padrões altera-



21

dos de metilação de genes que sofreram imprinting de ori-gem paterna e materna foram observados no sêmen da pro-le de camundongos derivados de superovulação. Também se sugeriu que, em alguns casos, os defeitos epigenéticos pos-sam ser transgeracionais. Como a exposição de ratas grávi-das a fungicidas endócrinos (interruptores) durante o perío-do de determinação sexual gonadal resulta em perfis alterados de metilação de DNA da linhagem germinativa masculina por pelo menos três gerações (73), não se pode excluir totalmente que tais efeitos transgeracionais também existam após a superovulação.

São limitados os dados disponíveis sobre a prole huma-na com relação aos efeitos epigenéticos do tratamento hor-monal. Recentemente, em uma coorte de nascimentos, Ran-court e col. (7) relataram que os níveis de metilação nas RCIs de GRB10, MEST, H19, SNRPN e KCNQ1, assim como IGF2 RDM0, não foram interrompidos por indução de ovu-lação isolada em sangue de cordão e placenta. No entanto, esses achados não permitem a avaliação do impacto no imprinting genômico.

CoNCLuSãoEm tratamentos de reprodução assistida, é difícil determi-nar se as epimutações encontradas em lactentes concebidos através de TRA são consequência dos procedimentos de TRA ou são inerentes aos problemas de infertilidade per se. Além disso, ainda não está claro em que estágio(s) durante os procedimentos de TRA as alterações epigenéticas apare-ceriam. No entanto, vários fatores parecem indicar que a indução ovariana possa contribuir para um aumento da in-cidência de epimutações. Primeiro, a aquisição de imprints maternos (presentes na maioria das RCIs) ocorre durante um tempo relativamente longo, sendo, portanto, potencial-mente mais exposta a distúrbios. Segundo, as gonadotrofi-nas exógenas usadas para aumentar o número de embriões disponíveis para transferência podem forçar o crescimento de quase todos os oócitos obtidos destinados normalmente à destruição. Por fim, os tratamentos hormonais podem modificar a cinética da maturação do oócito ao induzir crescimento folicular acelerado em alguns casos (74). Como mencionado antes, parece que a aquisição de metilação no oócito é um fenômeno complexo que requer, acima de tudo, crescimento adequado do oócito. Oócitos humanos podem estar mais propensos a erros epigenéticos e/ou po-dem encontrar mais estressores, tais como administração de múltiplos hormônios, idade materna avançada, fatores ambientais, ou infertilidade inerente (75). Estudos em ani-mais excluindo efeitos de infertilidade ressaltaram o im-pacto negativo de indução de ovulação per se nesse perío-do crítico.

O uso de gonadotrofinas em TRA pode causar a libera-ção de alguns oócitos em MII com imprints incompletos ou lábeis. Além disso, vários estudos em seres humanos e ca-mundongos sugeriram que gonadotrofinas exógenas podem induzir alterações moleculares no oócito, tendo um impacto negativo na manutenção de imprints genômicos durante a embriogênese subsequente. Como proposto pelo grupo de Mann, considerando-se a frequência de transtornos epige-

néticos em embriões no estágio de blastocisto em compara-ção a oócitos, a estimulação ovariana pode ter um maior impacto adverso nos fatores maternos necessários para a manutenção do imprint do que na aquisição de imprint (76). Assim, tratamentos hormonais podem ser prejudiciais à re-programação epigenética de gametas, assim como a embri-ões precoces. No entanto, outros fatores epigenéticos, tais como RNAs não codificantes ou modificações de histona, permanecem totalmente inexplorados nesse quesito. Os efeitos deletérios também podem alterar o ambiente fisioló-gico do útero.

A observação de que epimutações podem surgir na pro-le de mulheres submetidas a superovulação e que o defeito pode ser transgeracional causou preocupação de que os tra-tamentos hormonais possam levar a efeitos perniciosos pro-longados. Isso sugere fortemente a necessidade de estudos adicionais sobre a saúde de crianças nascidas após TRA.

Por fim, os poucos dados disponíveis em seres humanos não nos permitem determinar independentemente o impac-to no imprinting genômico de idade materna, problemas de infertilidade, ou protocolos de tratamento e doses de hor-mônios, de modo que estudos humanos adicionais são ne-cessários. Como a superovulação pode ter efeitos deletérios na manutenção do imprinting, pesquisas em seres humanos precisam ser realizadas não só em oócitos, mas também em embriões. Um maior conhecimento pode melhorar, entre os praticantes de TRA, a avaliação de risco do impacto de pro-tocolos de indução ovariana no controle epigenético do ge-noma.

Agradecimentos. O autor agradece a Jaron Sandy pela re-visão do inglês.

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Distúrbios epigenéticos e subfertilidade masculina Céline Chalas Boissonnas, M.D., Ph.D.,a Pierre Jouannet, M.D.,b e Hélène Jammes, Ph.D.c

a Histologia-Embriologia-Biologia da Reprodução, CECOS, Hôpital Cochin, AP-HP, Universidade Paris Descartes, Paris, França, b CERSES (UMR 8137)/CNRS/Universidade Paris Descartes, Paris, França, c INRA, UMR1198 Biologia do Desenvolvimento e Reprodução, 78352 Jouy-en-Josas, França

Objetivo: Estabelecer uma ligação entre a epigenética e a subfertilidade masculina ao nível de DNA, histona-protamina e RNA e suas consequências na fertilização e desenvolvimento embrionário.Desenho: Revisão da literatura relevante.Cenário: Laboratórios clínicos e de pesquisa da Universidade.Pacientes: Homens férteis e inférteis.Intervenção: Nenhuma.Principal Medida de Desfecho: Revisão crítica da literatura.Resultados: Marcadores epigenéticos podem ser modificados em pacientes inférteis. As modificações epigenéticas incluem perda ou ganho de metilação em nível global e em genes que sofreram imprinting, altos níveis de retenção de histona em espermatozoides e deficiências de alguns transcritos en-volvidos na espermatogênese. É interessante notar que tais anormalidades estão todas interligadas, pois a manutenção da metilação de DNA depende da configuração histona-protamina do DNA, que é estabilizada por RNAs de espermatozoides.Conclusões: Por muito tempo o genoma paterno foi considerado silencioso e passivo na formação do embrião. Os processos epigenéticos associados com o DNA do genoma paterno enfatizam sua impor-tância na fertilidade masculina, assim como no desenvolvimento embrionário.(Fertil Steril® 2013;99: 624–31. ©2013 by American Society for Reproductive Medicine.)Palavras-chave: Epigenética, infertilidade masculina, metilação, histona, RNAs de espermatozoide

Discussão: Você pode discutir este artigo com seus autores e outros membros da ASRM em http://fertstertforum.com/boissonnasc-epigenétics-male-infertilidade/

a infertilidade afeta 10%–15% dos casais, sendo uma preocu-pação crescente da sociedade

moderna. Um terço de suas causas é de origem masculina e outro terço, de origem combinada (1, 2, 3). Causas genéticas para a infertilidade mascu-lina foram exploradas (4), sendo que ~10% delas correspondem a anorma-lidades cariotípicas (5). Microdeleção do cromossomo Y (DAZ) foi identifi-cada em 3% dos homens azoospérmi-cos ou gravemente oligozoospérmicos (6). Embora algumas mutações especí-ficas tenham sido observadas, outras responsáveis por defeitos nos esper-

matozoides permanecem desconheci-das (7, 8).

A programação epigenética do es-permatozoide é única. Em primeiro lugar, há uma maior deleção no imprinting epigenético nas células germi-nativas primordiais (CGPs). Em segun-do, os núcleos das células germinativas masculinas sofrem reorganização e condensação de seus genomas durante a maturação pós-meiótica, incluindo metilação de DNA, acetilação de histo-na, implementação de variantes de his-tona e transição histona-protamina durante a espermiogênese. Os sinais epigenéticos são cruciais para o fun-

cionamento adequado do genoma do espermatozoide, e qualquer alteração durante esses processos pode contri-buir para alterar a função do esperma-tozoide e a eficiência da fertilização. Após a fertilização, a descondensação do pró-núcleo masculino passa por uma reprogramação epigenética com desmetilação de DNA, transição prota-mina-histona e modificações de histo-na que contribuem para a ativação do genoma do embrião e desenvolvimen-to embrionário (9).

Evidência de uma ligação entre marcadores epigenéticos e fertilidade masculina foi demonstrada em camun-dongos através da administração de um agente desmetilante, 5-aza-2’-de-soxicitidina. Observou-se redução da produção de sêmen em associação a redução do peso dos testículos e epidí-dimo, redução do tamanho do filhote na ninhada e maior mortalidade neo-natal (10, 11). No entanto, foram neces-sários vários anos até que se demons-trasse claramente que cada nível de

Recebido: 31 de outubro de 2012; revisado: 18 de janeiro de 2013; aceito: 21 de janeiro de 2013C.C.B. nega conflito de interesse. P.J. nega conflito de interesse. H.J. nega conflito de interesse.Com o apoio de Assistance Publique-Hôpitaux de Paris.Solicitação de reimpressões: Céline Chalas Boissonnas, M.D., Ph.D., Service d’Histologie–

Embryologie–Biologie de la Reproduction, CECOS, Hôpital Cochin, AP-HP, Université Paris Descartes, 53 avenue de l’Observatoire, 75014 Paris, France.






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modificação epigenética estava ligado à fertilidade mascu-lina.

aS diFErENtES EtaPaS da ESPErMatoGÊNESEO espermatozoide maduro é uma célula altamente especiali-zada, que possui um flagelo e um núcleo muito compacto. Para atingir sua forma final, dois processos importantes, meiose e espermiogênese, são necessários. Durante a vida fetal, as células-tronco germinativas ocupam os túbulos se-miníferos dos testículos, fornecendo um pool de células di-ploides indiferenciadas chamadas espermatogônias tipo A. Após o nascimento em camundongos e no início da puber-dade em seres humanos, as espermatogônias se diferenciam em espermatócitos tipo I, que sofrem duas divisões meióticas para produzir espermátides. As espermátides, então, passam por um processo único, chamado espermiogênese, que per-mite a uma célula redonda, com transcrição nuclear e ativi-dades de tradução, tornar-se uma célula flagelada contendo um núcleo compacto sem atividade nuclear. A compactação de DNA nas células germinativas masculinas é, em termos evolucionários, um processo altamente conservador (12). Trata-se de processo biológico fundamental e um pré-requi-sito para a transmissão do genoma masculino para a próxi-ma geração. Vários estudos sugerem que essa estrutura de empacotamento do genoma específico do espermatozoide carrega uma importante mensagem epigenética para o em-brião (13, 14). Nas espermátides iniciais, o DNA encontra-se compactado em torno de nucleossomos, as unidades de or-ganização universais do genoma. Um nucleossomo é forma-do por DNA enrolado em torno de um octâmero de histonas H2A, H2B, H3 e H4. A drástica compactação do genoma masculino se caracteriza pela substituição de um grande nú-mero de histonas por pequenas proteínas básicas não histo-nas, primeiro por proteínas de transição (TNP1 e TNP2) e, finalmente, por protaminas (P1 e P2) (15). A compactação da cromatina ocorre através da formação de ligações dissulfeto entre protaminas, produzindo estruturas toroidais (16), criando, portanto, uma estrutura de cromatina 6–20 vezes mais compactada do que o DNA ligado a histona (17, 18). Uma vez atingida essa transição, nenhuma atividade nuclear é mais permitida, e apenas transcritos herdados das esper-mátides iniciais, tais como mRNAs e pequenos RNAs de in-terferência (siRNAs), estão presentes no núcleo.

Considerando-se o estado de silêncio do núcleo com-pactado, pensou-se por um longo tempo que os transcritos de espermatozoide não desempenhassem um papel no de-senvolvimento do embrião e que apenas transcritos mater-nos estivessem envolvidos. Avanços recentes mostraram que a configuração do núcleo paterno e transcritos de es-permatozoide contribuem para o desenvolvimento inicial do embrião (13, 14). Consequentemente, o conhecimento dos processos epigenéticos nas células germinativas masculinas pode contribuir para a compreensão dos efeitos paternos no desenvolvimento embrionário inicial (19, 20).

A presente revisão teve por objetivo focar os marcado-res epigenéticos das células germinativas masculinas, tais como metilação de DNA e variantes e modificações de his-

tonas, em suas interações com cromatina e RNAs não codi-ficantes e explicar como eles interferem na fertilidade mas-culina. Por fim, as consequências potenciais das alterações epigenéticas presentes nas células germinativas masculinas no desenvolvimento do embrião serão discutidas.

MEtiLação E FErtiLidadE MaSCuLiNaA metilação de DNA, descrita pela primeira vez nos anos 1970 (21), consiste na adição de um grupo metila de S-ade-nosil-metionina na quinta posição do anel citosina (5meC) em dinucleotídeos CpG: 3%–5% dos resíduos de citosina no DNA genômico de mamíferos aparecem na forma de 5meC (22). As ilhas CpG são definidas de maneira algorítmica como sequências com taxa de CpG observada-para-esperada > 0,6 e com comprimento > 500 pb (23). A distribuição das se-quências de CpG no genoma de mamíferos é não aleatória. Os fortes promotores de ilha de CpG são principalmente não me-tilados (tais como promotores de genes constitutivos). Em contraste, as ilhas de CpG localizadas nas regiões promotoras e/ou reguladoras de elementos transponíveis são metiladas, inibindo a replicação dos elementos parasitários transponí-veis e repetitivos. Os promotores deficientes em CpG são, com frequência, hipermetilados em células somáticas. Os padrões de metilação de DNA em regiões reguladoras são, em geral, estáveis, mas a dinâmica metilação “de novo” de regiões re-guladoras pode ocorrer durante o desenvolvimento para evi-tar sua reexpressão (24). Dados indicam que a metilação de DNA também pode ocorrer em células embrionárias nos resí-duos de citosina dos dinucleotídeos CpA ou CpT (25, 26). Recentemente, o grupo de Sasaki relatou acúmulo e perda de metilação não-CpG assimétrica durante o desenvolvimento da célula germinativa masculina. Entretanto, a função bioló-gica da metilação não-CpG permanece desconhecida (27).

O estabelecimento de metilação em células germinativas é um processo único e necessário para a adequada esperma-togênese e produção de espermatozoides (19). Nas células germinativas de camundongos, ficou bem demonstrada a presença de processo de desmetilação-remetilação global en-volvendo ampla deleção de padrões do tipo somático de me-tilação de DNA seguido pelo estabelecimento de padrões sexo-específicos pela metilação “de novo” de DNA (22, 28, 29, 30, 31). A desmetilação ocorre em CGPs do embrião em desen-volvimento entre os dias 8,0 e 13,5 pós-coito (dpc), apagando todos os marcadores de metilação (32, 33, 34). Uma remetila-ção específica começa por volta do dpc 15,5 (35, 36, 37) (Fig. 1). Esse processo de deleção diz respeito especificamente ao imprinting parental. O imprinting parental é um fenômeno epigenético que medeia a expressão monoalélica de genes específica do progenitor de origem (38). Os imprintings são apagados nas CGPs e uma remetilação específica ocorre na espermatogônia e nos espermatócitos tipo I, antes de sua en-trada em meiose, de modo que todos os espermatozoides transmitam o correto imprint paterno (28). A maior parte da metilação é adquirida durante a vida fetal, mas níveis com-pletos de metilação de DNA não são atingidos até o estágio de paquíteno do espermatócito, portanto, após o nascimento e antes da meiose (39). Apenas quatro loci que sofreram imprinting são metilados na linhagem germinativa masculina,



sendo eles Igf2/H19, Rasgrf1, Dlk1Gtl2 e Zdbf2 (40). A me-tilação de DNA depende de uma família de enzimas chama-das de DNA metiltransferases (DNMTs). A DNMT1 garante a manutenção da metilação (41), e as DNMT3A, 3B e 3L espe-cificamente permitem o processo de metilação nas células germinativas (Tabela 1). As DNMT3A e 3B possuem atividade catalítica, enquanto a DNMT3L é desprovida dessa atividade catalítica, atuando como um cofator para a DNMT3A (42, 43). Suas atividades são absolutamente essenciais à completação normal da espermatogênese. Na verdade, o knockout (KO) de Dnmt3a condicional nas células germinativas compromete a espermatogênese através de apoptose de células germinati-vas, sendo associado com perda de metilação de genes que sofreram imprinting paternalmente (44). O KO de Dnmt3l in-duz parada meiótica em espermatócitos devido à falta de em-parelhamento de cromossomos homólogos. Observa-se ainda uma desregulação do processo de metilação de genes que sofreram imprinting e sequências repetidas (45).

Esse processo foi exaustivamente estudado em camun-dongos, nos quais a cinética precisa de deleção e remetilação é conhecida; em seres humanos, no entanto, ainda não foi bem descrito. Apenas dois estudos relataram metilação de genes que sofreram imprinting em células germinativas de homens adultos. Esses dois estudos confirmaram a meti-lação da região diferencialmente metilada (RDM) H19 em espermatogônias e o esperado estado desmetilado de MEST/PEG1 em espermatogônias e espermatócitos tipo I (46, 47). Costuma-se considerar que, em seres humanos, assim como em camundongos, os marcadores de metilação são adquiri-dos antes do início da meiose. No entanto, ainda não se sabe se o processo ocorre durante a vida fetal, no período perina-tal e/ou no início da puberdade.

Vários estudos exploraram a relação entre níveis de me-tilação de DNA e fertilidade masculina nos seres humanos. Através do uso de imunocoloração de metilação de DNA, um primeiro estudo ligou altos níveis de metilação global de

FIGURA 1

RNAs doespermatozoide

Vida fetal

Diferenciação gonadal

Nascimento

Puberdade

Fertilização

Proliferação

Meiose I

Meiose II

PGC

PGC

Espermatogônia (2n)

Espermatócitos I(2n)

Espermatócitos II(n)

Espermátides (n)

Espermatozoides (n)

Interrelações para aquisição de marcação epigenética durante a espermatogênese

Metilação de DNA

Manutenção da metilação de DNA

Desmetilação

Metilação progressiva

Ação de DNMT3A, 3B e 3L

Acetilaçãode histona

Desacetilação de H3 e H4

Acetilação de H3 e H4

Metilaçãode histona

Desmetilação de H3K4

Metilação de H3K4

Desmetilaçãode H3K9e H3K27

Metilaçãode H3K9

Desmetilaçãode H3K9

Variantesde histona

Incorporaçãode variantesde histona

Substituiçãode protaminas

Substituiçãode histonas

por protaminas

Retençãode histonas

Produçãode RNA

Genes específicos desmetilados

Contribuição do genoma paternal para o desenvolvimentoembrionário

Retenção de histonaMarcação de histona específicaMarcação bivalente H3K4Me-H3K27Me

Resumo da metilação de DNA, modificações da cromatina e regulação do RNA do espermatozoide durante a espermatogênese. Um processo de desmetilação-remetilação ocorre nas células germinativas antes do início da meiose. Os marcadores de metilação são então mantidos até a fertilização. Modificações de histonas, tais como metilações e acetilações, condicionam o bom processamento da espermatogênese. A esper-miogênese caracteriza-se pela transição histona-protamina, exceto para algumas histonas especificamente conservadas. Alguns RNAs do pro-cesso permanecem nos espermatozoides finais. Esses marcadores epigenéticos interagem de modo que os espermatozoides obtenham os marcadores epigenéticos corretos.Boissonnas. Distúrbios epigenéticos e subfertilidade masculina. Fertil Steril 2013.



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DNA de sêmen ejaculado a altas taxas de gravidez, asso-ciando defeitos de metilação com infertilidade (48). O estu-do de Houshdaran e col., baseado na técnica de Methylight com 36 genes-alvo e plataforma Illumina, mostrou níveis impropriamente elevados de metilação de DNA de genes que sofreram imprinting e que não sofreram imprinting e elementos repetidos em amostras de sêmen de baixa quali-dade (49). Os autores propuseram que tais níveis elevados de metilação resultavam de uma deleção inadequada de mar-cas de metilação em casos de oligoastenoteratozoospermia (OAT) mais do que de metilação “de novo” seguindo repro-gramação epigenética. Sugeriram ainda que não apenas ge-nes que sofreram imprinting, mas também vários defeitos epigenéticos, estavam associados com defeitos de esperma-tozoide. Utilizando o ensaio Illumina Infinium Human Me-thylation 27 Beadchip, Aston e col. descreveram um padrão de alteração de metilação de DNA do genoma em homens com alteração dos parâmetros do sêmen (50), ligando níveis de metilação global do sêmen com fertilidade. Consideran-do-se a importância da aquisição de imprint durante a es-permatogênese, Marques e col. estudaram alguns genes que sofreram imprinting em diferentes populações de esperma-tozoide (51, 52). Compararam a RDM H19 paternalmente metilada e a RDM MEST não metilada em espermatozoides de homens férteis e inférteis. Perda de metilação da RDM H19 foi vista em homens com OAT, sendo observada uma associação entre diminuição de metilação da RDM H19 e diminuição da contagem de espermatozoide (51, 52). Um estado inesperado e anormal de metilação da RDM MEST também foi observado no sêmen de pacientes oligozoospér-micos (52). Tais achados foram confirmados por um grupo de japoneses em vários outros genes que sofreram imprinting exibindo perda de metilação das RDMs H19 e GTL2 e aquisição de metilação imprópria nos loci PEG1, LIT1, ZAC, PEG3 e SNRPN em casos de oligozoospermia modera-da a grave (53). Descobriu-se uma associação entre imprinting anormal em espermatozoides e aborto espontâneo após TRA com os mesmos erros de imprinting relatados no sêmen

e no produto do aborto (53, 54). No entanto, naqueles estu-dos, realizou-se análise de metilação usando-se a técnica de conversão, clonagem e sequenciamento pelo bissulfito. Tal técnica permite a análise de metilação alelo-específica, mas representa mal o estado de metilação da amostra estudada. Usando conversão pelo bissulfito acoplada com pirosequen-ciamento, Boissonnas e col. realizaram uma análise quanti-tativa dos níveis de metilação em cada posição CpG incluída nas RDMs IGF2 e H19 (47 CpGs diferentes) em uma popu-lação de homens normozoospérmicos e oligozoospérmicos (55). Confirmaram que a drástica perda de metilação restrita à DMR2 IGF2 (RDM IGF2 primária) e à RDM H19 correla-cionava-se com a gravidade da oligozoospermia. Esses da-dos podem sugerir que algumas RDMs são mais sensíveis aos defeitos de metilação do que outras. Isso poderia depen-der dos diferentes estados de compactação de DNA desses sites (55). Erros de metilação (hipermetilação ou desmetila-ção) associados com OAT foram confirmados em seguida por outros grupos usando várias técnicas (50, 56, 57, 58).

Por fim, alguns grupos estudaram o estado de metilação de alguns genes promotores envolvidos no processo de es-permatogênese. Metilação anormal do promotor DAZL (59) e do promotor CREM (60, 61) foi relatada em homens com OAT. Ainda mais interessante, o estado de metilação do pro-motor do gene da metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR) foi estudado (62). Esse gene codifica uma enzima-chave da via do folato, que mantém a biodisponibilidade da metioni-na. A metionina pode ser convertida a S-adenosilmetionina, o doador de metil universal para muitos substratos, incluin-do o DNA. Hipermetilação do promotor de MTHFR foi obser-vada em 53% dos casos de azoospermia não obstrutiva (63) e em alguns casos de infertilidade idiopática (64).

Todos esses estudos dão suporte à hipótese de que os padrões de metilação do DNA do espermatozoide de genes que sofreram imprinting e que não sofreram imprinting são essenciais para a função normal do espermatozoide, fertili-dade e desenvolvimento embrionário. No entanto, as causas desses erros de metilação, assim como o momento de sua ocorrência, permanecem desconhecidos. Esses erros de meti-lação são adquiridos durante o desenvolvimento fetal ou logo após o nascimento? Estão ligados à manutenção de me-tilação anormal durante a espermatogênese? Parece pouco provável que a expressão alterada de DNMT, particularmen-te 3A ou 3L, pudesse ser responsável por tais desordens, pois metilação e desmetilação anárquicas são observadas em ho-mens oligozoospérmicos. Uma possível explicação poderia ser que anormalidades de metilação estão ligadas à configu-ração anormal de DNA durante a espermiogênese, onde his-tonas e protaminas desempenham um papel na manutenção dos marcadores de metilação dos gametas masculinos (65).

ModiFiCaçõES dE HiStoNa E FErtiLidadE MaSCuLiNaAs histonas estão sujeitas a modificações pós-traducionais em suas caudas, tais como fosforilação, metilação, acetilação e ubiquitinação de diferentes resíduos. Cada uma dessas mo-dificações atua isoladamente ou em conjunto, sob o nome de ‘código de histona’, para influenciar a ativação ou inibição da

TABELA 1

Funções das principais enzimas modificadoras de dNa e seus momentos de ação durante a espermatogênese.

Momento Enzima Modificação de dNa

Mitose DNMT1 manutenção da metilação de DNA

DNMT3A metilação “de novo” de DNA

DNMT3B metilação “de novo” de DNA

DNMT3L cofator DNMT3a

HAT acetilação de H3 e H4

MII2 (HMT) metilação de H3K4

Meiose HDAC desacetilação de H3 e H4

LSD1/KDM1 (HDM)

desmetilação de H3K4

HMT metilação de H3K9 e H3K27

Espermiogênese HAT hiperacetilação de H4

JHDM2A (HDM) desmetilação de H3K9Boissonnas. Distúrbios epigenéticos e subfertilidade masculina. Fertil Steril 2013.



transcrição gênica (66). A ativação de genes está, em geral, associada com a ocorrência de acetilação no resíduo de lisina (K), em particular em H3 e H4. O estabelecimento e a remoção de acetilação são realizados por histona acetiltransferases (HATs) e desacetilases (HDACs), respectivamente (66) (Tabe-la 1). A acetilação da histona relaxa a cromatina e a disponi-biliza para os fatores de transcrição, enquanto a desacetilação está associada com o silenciamento gênico (66). A acetilação de resíduos de lisina H3 e H4 é alta em células-tronco mascu-linas, sendo removida durante a meiose; a reacetilação de H4K nas espermátides alongadas é um pré-requisito para a troca de histona por protamina (67) (Fig. 1). O uso de um inibidor de HDAC, tricostatina A, resultou em uma significa-tiva redução do número de espermátides e infertilidade mas-culina grave (68, 69). A metilação de resíduos de lisina H3 e H4 pode promover ativação ou repressão gênica, sendo regu-lada pelas famílias de histona metiltransferase (HMT) e des-metilase (HDM) (70) (Tabela 1). A metilação H3K4 encontra-se em geral associada com a expressão gênica, enquanto a metilação de H3K9 e H3K27 encontra-se ligada ao silencia-mento gênico e heterocromatina. O momento de estabeleci-mento e remoção de marcadores de metilação é crítico para a espermatogênese: modificações de mono-, di- e trimetilação de H3K4, H3K9 e H3K27 são essenciais para a progressão da espermatogênese (71, 72). Por exemplo, o nível de metilação de H3K4 atinge seu pico em células-tronco espermatogoniais, sendo necessária para que células-tronco iniciem a diferen-ciação e continuem a se tornar espermatócitos. Há redução durante a meiose. Em contraste, o nível de metilação de H3K9 e H3K27 aumenta durante a meiose, mas a remoção de H3K-9me ao final da meiose é essencial para o início da espermio-gênese. Enzimas específicas participam da organização des-sas modificações. Em camundongos, a redução da atividade MII2 de histona H3K4 metiltransferase resultou em uma re-dução dramática do número de espermatócitos através de processo apoptótico, induzindo um bloqueio de desenvolvi-mento na diferenciação espermatogênica (73). A perda de LSD1/KDM1, uma HDM de H3K4, durante a meiose resultou em apoptose de célula germinativa e esterilidade (74, 75) (Ta-bela 1). A disrupção de JHDM2A em camundongos resultou em uma completa perda de TNP1 e expressão de P1, conden-sação defeituosa de cromatina e infertilidade (76) (Tabela 1). A JHDM2A é uma HDM de H3K9 que atua durante a esper-miogênese. A JHDM2A liga-se às regiões core do promotor de TNP1 e P1 para induzir sua ativação transcricional pela re-moção de metilação de H3K9. Recentemente, uma nova mo-dificação de histona, crotonilação, foi descrita. Consiste na adição de um grupo crotonil (C4H5O) no resíduo de lisina de todas as histonas centrais (77). A crotonilação marca o cro-mossomo sexual, mas também os gonossomos, conferindo resistência gênica aos repressores de transcrição (78).

Tais estudos mostram que as modificações na cauda da histona têm um papel crucial na espermatogênese.

traNSição HiStoNa-ProtaMiNa E iNFErtiLidadE MaSCuLiNaA transição de histonas canônicas para protaminas é uma etapa importante da espermiogênese favorecida pela hipera-

cetilação de histona (79). Em seres humanos, a relação P1/P2 normal varia de 0,8 a 1,2 (80). Relações P1/P2 anormais e baixos níveis de protamina estão associados com aumento da fragmentação de DNA, sugerindo que a compactação incorre-ta de DNA é mais exposta a lesão de DNA e estresse oxidativo (81, 82, 83, 84). Protaminação aberrante também foi relacio-nada a infertilidade masculina, pois as alterações da relação P1/P2 são muito raras em homens férteis, mas comuns em inférteis (15, 82, 85). Infertilidade pode ser associada com uma relação P1/P2 tanto elevada quanto reduzida, demons-trando que uma subexpressão de P1 e P2 está ligada à infer-tilidade masculina (82, 83). Baixos níveis de protamina, resul-tando em retenção de histona anormalmente elevada no sêmen, também foram relacionados a infertilidade e à habili-dade fertilizante dos espermatozoides (86). Em seres huma-nos, uma reduzida qualidade do embrião e pobres resultados de FIV foram relatados com o uso de sêmen com relações P1/P2 alteradas (81, 83). No sêmen de camundongos, baixas con-centrações de P2 foram correlacionadas com fragmentação de DNA e morte embrionária (87). Isso pode ser a consequência de uma falha geral da transição de histonas para protaminas durante a espermiogênese. Essa hipótese é corroborada pela detecção de maiores taxas de histonas e protaminas de tran-sição no sêmen de pacientes com reduzidos níveis de protami-na ou relações P1/P2 alteradas. Entretanto, é importante notar que a transição histona-protamina nunca se completa no sê-men normal e que uma fração representando 5% a 15% do genoma permanece ligada aos nucleossomos compostos por histonas canônicas e variantes de histona (17, 88, 89) (Fig. 1).

Por muito tempo, o significado dessa retenção de histo-na permaneceu desconhecido e havia especulação de que seria um remanescente da transição histona-protamina in-completa. No entanto, Hammoud e col. demonstraram re-centemente em espermatozoides humanos que o enriqueci-mento com histona não era aleatório, mas presente em loci importantes para o desenvolvimento embrionário (13). Esses loci incluíam clusters de genes que sofreram imprinting, miRNA, clusters de genes HOX, promotores do desenvolvi-mento e fatores de sinalização. Arpanahi e col. também rela-taram que as regiões de DNA ligadas a histona do esperma-tozoide humano estavam associadas com regiões reguladoras do genoma (14). Observou-se uma marcação epigenética dessas histonas retidas: genes fundamentais para o desen-volvimento estavam marcados de maneira bivalente com H3K4me3 e H3K27me3, como observado em células-tronco embrionárias. Além disso, H3K4me2 estava enriquecido em promotores de gene do desenvolvimento e H3K4me3 estava enriquecido em regiões HOX, RNAs não codificantes e loci que sofreram imprinting paternalmente (13). É interessante notar que retenção de histona também foi encontrada em genes que apresentavam um estado desmetilado, e tais genes com frequência codificavam transcrição e fatores de sinali-zação necessários ao desenvolvimento embrionário (13).

As precisas retenção e marcação de histona e o estado desmetilado de DNA associado sugerem que o genoma pater-no contém marcadores específicos que contribuem para o desenvolvimento embrionário logo após a fertilização (Fig. 1). Isso fornece uma outra regulação epigenética, na qual o DNA paterno é preparado para ativação em locais específicos ne-



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cessários ao desenvolvimento embrionário. O estudo recente de Hammoud e col. analisou a retenção de histona e o estado de metilação do DNA em sete amostras de sêmen: quatro homens inférteis com uma relação P1/P2 anormal e três ho-mens para os quais o desenvolvimento embrionário foi para-do após FIV (90). Cinco deles apresentavam elevada retenção de histona em seus genomas, variando de 5% a 32%. Utili-zando-se experimentos ChIP, dois marcadores de histona, H3K4me3 e H3K27me3, foram analisados nessa população. Houve uma redução na quantidade de H3K4me3 e H3K27me3 ao nível de genes de fator de transcrição do desenvolvimento e alguns genes que sofreram imprinting. A análise do estado de metilação dos genes que sofreram imprinting mostrou me-tilação anormal em dois pacientes. Tudo isso pode ter um efeito prejudicial cumulativo na habilidade fertilizante dos espermatozoides e no concepto (90).

rNaS doS ESPErMatozoidES E FErtiLidadE MaSCuLiNaDevido à sua extrema compactação, há muito o núcleo do espermatozoide foi considerado inerte. Na verdade, o esper-matozoide contém muitos RNAs específicos, mRNAs, miRNAs e sistema piwi-interativo de RNAs (piRNAs), que poderiam ser úteis ao desenvolvimento embrionário através da modifica-ção da expressão gênica na fertilização (91, 92) (Fig. 1). Trans-crição reversa e reação em cadeia da polimerase, hibridização in situ e microarranjos de oligo DNA permitiram a identifica-ção de mRNAs específicos em espermatozoides humanos ma-duros, alguns dos quais codificando protaminas e receptores hormonais (93). Os RNAs de espermatozoides são marcadores de infertilidade masculina particularmente no que se refere à espermiogênese. Na verdade, retenção de mRNA com alto teor de protamina no sêmen ejaculado associa-se com desregula-ção da tradução da protamina, deficiência de protamina no espermatozoide e infertilidade (94). Níveis de transcritos P1 e P2 mais baixos também foram relatados no sêmen ejaculado de homens astenozoospérmicos (95). Além disso, um papel dinâmico dos RNAs de espermatozoide foi recentemente pro-posto. Os RNAs poderiam contribuir para estabilizar o enve-lope nuclear e a interação entre DNA-histonas durante a tran-sição para protamina. Poderiam ter um papel na marcação de sequências de DNA que permanecem ligadas a histonas, o que é importante para o desenvolvimento embrionário, como pre-viamente descrito (92) (Fig. 1). Além disso, as tecnologias de microarranjos revelaram diferentes padrões de mRNA entre homens férteis e inférteis, que foram associados com taxas de gravidez nas tecnologias de reprodução assistida (TRA) (96, 97, 98, 99). A comparação dos perfis de microarranjos entre homens férteis e inférteis mostrou expressão tanto aumentada quanto reduzida de vários transcritos. Em homens oligozoos-pérmicos, observou-se uma expressão reduzida de genes es-pecificamente envolvidos na espermatogênese e na função do espermatozoide (99).

CoNCLuSãoInicialmente, marcadores epigenéticos em células germinati-vas masculinas foram analisados de acordo com vários des-

fechos. Hoje, sabe-se que metilação de DNA, modificações de histona e RNAs do espermatozoide apresentam uma relação com infertilidade masculina. Parece cada vez mais evidente que várias modificações epigenéticas associadas com inferti-lidade encontram-se interligadas. Níveis anormais de metila-ção estão associados com o desequilíbrio histona/protamina, assim como com retenção de RNA. A soma dessas alterações epigenéticas tem consequências não apenas na fertilidade masculina, mas também no embrião, primeiro na formação e no desenvolvimento do embrião (13) e segundo na saúde da prole. Ainda que controverso (100, 101), tem-se observado um aumento dos distúrbios de imprinting em crianças conce-bidas por TRA, em particular as síndromes de Beckwith-Wie-demann e Silver Russel (102). Algumas das doenças causadas por imprinting observadas após TRA poderiam resultar do uso de gametas masculinos com defeitos de imprinting e/ou relações P1/P2 anormais e relações histona-protamina alte-radas. Entretanto, não se trata apenas de todo o processo de TRA, da estimulação hormonal até a recuperação do oócito e cultura do embrião, mas também da própria infertilidade que poderia afetar o desenvolvimento embrionário ou resultar em doenças de imprinting. Mais pesquisas são necessárias para a avaliação do risco de transmissão de anormalidades epigené-ticas por gametas de homens e mulheres inférteis, para que se possa medir claramente o risco para o concepto.

Agradecimentos. Os autores agradecem Astrid de Bantel e Veronique Drouineaud pela revisão do manuscrito.

rEFErÊNCiaS

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Questões epigenéticas na reprodução assistida: atualização e revisão crítica da literatura atual Yoel Shufaro, M.D., Ph.D. e Neri Laufer, M.D.

Unidade de Fertilização In Vitro, Departamento de Ginecologia e Obstetrícia, Hospital Universitário Hadassah, Jerusalém, Israel

Mais de 4 milhões de crianças nasceram a partir do uso de fertilização in vitro (FIV) humana, uma tecnologia que surgiu há apenas 35 anos e ainda se encontra em franca evolução. A despeito de seu excelente perfil de segurança inicial, há cada vez mais relatos sobre a prevalência de problemas perinatais humanos. A evidência obtida a partir de experimentos animais levanta a questão de que a ocorrência de anomalias epigenéticas possa estar aumentada como resultado das etiologias de infertilidade, da estimulação ovariana, e da manipulação extracorpórea e cultura de gametas e em-briões. A seção Pontos de Vista e Revisões dessa publicação tem por objetivo descrever os mecanismos básicos da epigenética e resumir o conhecimento atual obtido a partir de experimentos animais e a prática de FIV humana, para esclarecer a possível associação entre distúrbios epigenéticos e tecnologias de reprodução assistida. (Fertil Steril® 2013;99:605–6. ©2013 by American Society for Reproductive Medicine.)

Discussão: Você pode discutir este artigo com seus autores e outros membros da ASRM em http://fertstertforum.com/shufaroy-epigenetics-assisted-reproduction-ivf/

os mecanismos epigenéticos go-vernam o desenvolvimento e regulam a expressão gênica em

diversos tipos de células do organismo, que carregam a mesma sequência ge-nômica de DNA. Metaforicamente, os nucleotídeos da sequência de DNA são as letras de um texto complexo, e as etiquetas epigenéticas são os espaços, a pontuação, as sentenças, os parágra-fos e o estilo que fazem da sequência um texto com significado (1). Os prin-cipais tipos de marcadores epigenéti-cos que controlam a expressão gênica são a metilação do DNA nos dinucleo-tídeos CpG, as modificações covalentes das histonas e os RNAs não codifican-tes (2, 3). Eles são estabelecidos, lidos e apagados por complexos proteicos es-pecíficos, que controlam o maquinário transcricional de cada célula para

manter diferenças herdadas mitotica-mente no potencial de expressão gêni-ca sem alterar a sequência de DNA. O processo de imprinting, marcação es-tável de alelo de acordo com a origem parental para garantir correta expres-são monoalélica, ocorre durante a ga-metogênese em domínios específicos (4). Tais mecanismos epigenéticos es-tão sujeitos a influências ambientais e do desenvolvimento (5, 6). A gameto-gênese e o desenvolvimento embrioná-rio inicial são eventos de importantes alterações epigenéticas globais, de modo que, quando danificados, altera-dos, ou realizados in vitro, os proces-sos epigenéticos que se seguem podem ser facilmente comprometidos. A natu-reza, a extensão e o significado de tais alterações, assim como a sua relevân-cia para as tecnologias de reprodução

assistida (TRA) humana são o foco des-ta seção.

Até onde se sabe, a realização de TRA humana não está associada a um aumento claro de distúrbios epigenéti-cos nos embriões e crianças resultan-tes. Tais alterações epigenéticas são mais frequentes do que as mutações de DNA, mas sua contribuição para a variação fenotípica humana e as con-dições patológicas ainda é pouco en-tendida. A raridade de distúrbios fran-cos de imprinting (como as síndromes de Prader-Willi e Angelman) e a ex-pressão tardia de condições mais sutis associadas com distúrbios epigenéti-cos (como obesidade e diabetes tipo II) dificultam provar a associação com TRA. A única exceção á a maior pre-valência da síndrome de Beckwith-Wiedemann em crianças nascidas após o uso de TRA (7), mas, mesmo nesse caso, é mais provável que a etio-logia seja o histórico familiar de infer-tilidade do que o procedimento (8, 9).

Estudos em animais, no entanto, indicam que pode haver diferenças nos padrões de metilação de vários genes como consequência do processo de re-

Recebido: 21 de janeiro de 2013; aceito: 22 de janeiro de 2013.Y.S. nega conflito de interesse. N.L. nega conflito de interesse.Solicitação de reimpressões: Yoel Shufaro, M.D., Ph.D., IVF Unit, Department of Obstetrics and

Gynecology, Hadassah University Hospital, POB 12000, Jerusalem 91120, Israel.






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produção assistida e/ou da etiologia da infertilidade (10). Al-guns modelos mostraram que a superovulação e a cultura in vitro de oócitos têm influência no epigenoma dos embriões/descendentes resultantes (11). Por outro lado, epimutações nos espermatozoides podem estar associadas com subfertili-dade masculina (12). Em modelos animais, as condições de cultura de embrião in vitro também apresentam um efeito epigenético estabelecido nos embriões cultivados (13, 14). Ainda que a FIV humana tenha melhorado significativa-mente desde a primeira vez em que foi realizada, é difícil pressupor que as atuais condições de cultura padronizadas e otimizadas imitem com perfeição o ambiente endógeno.

No momento, é difícil avaliar a existência de uma asso-ciação entre TRA humana e desordens epigenéticas. É também atualmente impossível determinar a relativa contri-buição da biologia preexistente para as desordens epigené-ticas versus aquela adicionada por TRA. Todos esses aspec-tos devem ser considerados ao se contemplar os tratamentos de infertilidade. Nesta seção Pontos de Vista e Revisões, os dados animais disponíveis no momento são ampla e exaus-tivamente revisados pelos principais autores da área de es-pecialidade. Os princípios e conceitos básicos da epigenética são apresentados de maneira clara para facilitar a discussão dos tópicos mais complexos. Apresenta-se a evidência sobre os distúrbios epigenéticos na gametogênese (in vivo) no contexto clínico (indução de ovulação e espermatogênese anormal), assim como o impacto da cultura in vitro no epi-genoma de gametas e embriões, sendo discutida a relevân-cia para TRA humana. Embora não se possa no momento estabelecer nenhuma associação significativa entre anoma-lias epigenéticas e TRA humana, a soma das evidências jus-tifica cautela futura e observação continuada.

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Muitos experimentos em ca-mundongos e modelos de grandes animais, assim como

estudos epidemiológicos em seres hu-manos, sugerem que a utilização de tecnologia de reprodução assistida (TRA) possa interferir na regulação epigenética de genes, levando a fenó-tipos anormais (1, 2, 3, 4). A supero-vulação de oócitos com gonadotrofi-nas, a fertilização in vitro (FIV), a

injeção intracitoplasmática de esper-matozoide (ICSI) e a cultura in vitro (CIV) de embriões (em especial até o estágio de blastocisto) são amplamen-te utilizadas nos países desenvolvidos para tratamento de infertilidade hu-mana. A CIV e a maturação de oócitos são componentes integrais da produ-ção in vitro de gado bovino e ovino, mas, até o momento, têm apenas limi-tada utilidade clínica para seres hu-

manos. Como e até que ponto essas diferentes manipulações in vitro de gametas e embriões interferem com os processos in vivo normais ainda é mo-tivo de controvérsia. A coincidência temporal de TRA com eventos cruciais da reprogramação genômica (5, 6, 7) é consistente com a visão de que a des-regulação epigenética na linhagem germinativa e nos estágios iniciais de do desenvolvimento embrionário con-tribui para os variados problemas mé-dicos que foram associados com TRA.

Os mecanismos epigenéticos con-trolam a expressão gênica espacial, temporal e específica do progenitor. Diferentes tipos celulares usam dife-rentes padrões de genes silenciados e expressados, que são estabelecidos du-rante o desenvolvimento e diferencia-


Distúrbios epigenéticos em gametas e embriões cultivados in vitro: implicações para a reprodução humana assistida Nady el Hajj, Ph.D., e Thomas Haaf, M.D.

Instituto de Genética Humana, Julius Maximilians University, Wuerzburg, Alemanha

Recebido: 16 de outubro de 2012; revisado: 21 de dezembro de 2012; aceito: 26 de dezembro de 2012; publicado online: 26 de janeiro de 2013.

N.e.H. nega conflito de interesse. T.H. recebeu bolsa de German Research Foundation.Solicitação de reimpressões: Thomas Haaf, M.D., Institute of Human Genetics, Julius Maximilians

University, Biozentrum, Am Hubland, 97074 Wuerzburg, Germany (E-mail: [email protected]).


Embora a tecnologia de reprodução assistida (TRA) tenha se tornado uma prática rotineira para o tratamento da infertilidade humana, a etiologia do aumento dos riscos de problemas perinatais em crianças concebidas através de TRA é ainda pouco clara. Dados experimentais de camundongos e a produção in vitro de gado fornecem forte evidência de que o estabelecimento de imprint nos estágios mais tardios do oócito e a reprogramação dos genomas das duas linhagens germinativas para desenvolvimento somático após fertilização são vulneráveis às condições ambientais. Cultura e maturação in vitro de oócitos, superovulação e cultura de embrião representam intrusões artificiais no desenvolvimento natural, sendo possível que influenciem o epigenoma da prole resultante. Entretanto, nesse contexto, é difícil definir a normalidade da variação epigenética em seres hu-manos desde a concepção e ao longo da vida. Com exceção de umas poucas mutações de imprinting de alta penetrância, as consequências fenotí-picas de qualquer diferença epigenética observada entre grupos de TRA e não-TRA permanecem inconclusivas. O período periconcepcional não é apenas crítico para os desenvolvimentos embrionário, placentário e fetal, assim como para o desfecho ao nascimento, mas condições sub-ótimas de cultura in vitro também podem levar a alterações persistentes no epigenoma, influenciando a susceptibilidade a doença mais tarde na vida. O epigenoma parece ser mais plástico nos estágios mais tardios do desenvolvimento oocitário e nos estágios iniciais do desenvolvimento embrionário; essa plasticidade diminui gradativamente durante a vida pré-natal e a pós-natal. Logo, ao se considerar a segurança da TRA humana de um ponto de vista epigenético, nossa maior preocupação não deve ser se há aumento ou não de alguns raros distúrbios de imprinting, mas precisamos estar cientes da existência de uma ligação funcional entre uma interferência na reprogramação epigenética em fases muito precoces do desenvolvimento e a ocorrência de doença na vida adulta. (Fertil Steril® 2013;99:632–41. ©2013 by American Society for Reproductive Medicine.)Palavras-chave: Tecnologia de reprodução assistida (TRA); hipótese de origem fetal das doenças; me-tilação de DNA; início do desenvolvimento embrionário; efeitos epigenéticos; reprogramação do ge-noma; imprinting; cultura in vitro; oócito

Discussão: Você pode discutir este artigo com seus autores e outros membros da ASRM em http://fertstertforum.com/elhajjn-epigenetic-effects-in-vitro-culture-art/





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ção, sendo então herdados de maneira estável durante as divisões celulares. Em geral, uma célula do corpo não tem acesso a toda a informação armazenada em seu genoma, mas apenas a um pequeno subconjunto (5%–10%) de genes. À semelhança de senhas de computadores, os mecanismos epigenéticos, em particular a metilação de DNA, regulam o acesso a essa informação genética. Ao contrário de regiões não codificantes do genoma, onde a maioria dos sítios cito-sina-fosfato-guanina (CpG) é metilada para evitar atividade de retrotransposição (8), as ilhas CpG em regiões 5’cis-regu-ladoras de genes são, em geral, não metiladas. A metilação dessas ilhas CpG durante os processos de desenvolvimento ou doença está associada com modificações de histonas pós-traducionais que levam a uma estrutura de cromatina inativa localmente condensada e silenciamento gênico (9, 10).

Pela sua própria natureza, a TRA muda significativa-mente o ambiente no qual o oócito e o embrião se desenvol-vem. A epigenética fornece um mecanismo molecular para interações gene-ambiente (11, 12), que podem alterar de modo permanente a regulação da expressão gênica em cé-lulas germinativas e embriões expostos. Na presente revi-são, salientamos como tais mudanças ambientais, em parti-cular a CIV de oócito e embrião, afetam padrões de metila-ção de DNA e de expressão gênica, assim como processos de desenvolvimento e possivelmente a saúde de longo prazo da prole. A despeito das consideráveis diferenças no desenvol-vimento da célula germinativa e do embrião existentes en-tre as espécies, em particular entre seres humanos e camun-dongos, os achados experimentais em diferentes modelos animais devem ser considerados com seriedade.

a Civ iNtErFErE NaS jaNELaS CrítiCaS Para a rEProGraMação EPiGENétiCaDurante a gametogênese e embriogênese precoce, os geno-mas parentais sofrem duas ondas de desmetilação e remeti-lação. São janelas de tempo vulneráveis, onde defeitos epi-genéticos induzidos de maneira aleatória e/ou pelo ambiente (por exemplo, TRA) podem ocorrer. A primeira rodada de reprogramação genômica ocorre na linhagem germinativa. Quando as células germinativas primordiais entram na crista gonadal no feto, todos os padrões de meti-lação são essencialmente apagados, restaurando-se a toti-potência e um estado epigenético equivalente nas células germinativas de ambos os sexos. Os padrões de metilação sexo-específicos são então estabelecidos durante a diferen-ciação da célula germinativa (6, 13). Na linhagem germina-tiva masculina do camundongo, a remetilação é iniciada após a parada mitótica pré-natal em pró-espermatogônia, prosseguindo de maneira gene-específica até o final do es-tágio de espermatócito do paquíteno (14, 15, 16, 17, 18). Na linhagem germinativa feminina, os padrões de metilação também são estabelecidos de maneira gene-específica; en-tretanto, isso ocorre durante estágios mais tardios do desen-volvimento do oócito (19, 20, 21, 22). A maioria dos imprints maternos parece ser estabelecida até a metáfase II (MII) da meiose. No entanto, em seres humanos, alguns imprints maternos podem não se completar até após a fertilização, logo antes da fusão pró-nuclear (23). Essas diferenças na

cronologia de aquisição de imprints paternos versus mater-nos têm importantes implicações para a TRA. O isolamento e a manipulação das células germinativas masculinas para FIV/ICSI ocorrem após a reprogramação da metilação espe-cífica para o sexo masculino. Em consequência, é plausível assumir que os padrões aberrantes de metilação observados em espermatozoides de FIV/ICSI (24, 25, 26, 27, 28) possam ser devidos principalmente a problemas de fertilidade (por exemplo, comprometimento da espermatogênese) dos doa-dores, e não à própria TRA. Por outro lado, CIV de oócitos, superovulação e FIV/ICSI podem bem interferir com a aqui-sição adequada de imprints de metilação maternos durante a oogênese.

Na segunda rodada de reprogramação genômica após a fertilização, os padrões de metilação somáticos para desen-volvimento normal são criados, subjacentes à ativação e ao silenciamento de genes específicos (5, 7). A desmetilação de todo o genoma no zigoto e no embrião em estágios precoces do desenvolvimento ocorre de maneira progenitor-específica, afetando diferentes classes de sequências repetitivas e de có-pia única. As regiões dife rencialmente metiladas (RDMs) da linhagem germinativa de genes que sofreram imprinting ser-vem como regiões de controle de imprinting (RCIs), sendo protegidas, por um mecanismo desconhecido, contra as on-das de desmetilação pós-zigótica. Em contraste com a grande maioria (99%) dos genes, que são reprogramados após fertili-zação para desenvolvimento somático e em geral expressos a partir dos dois cromossomos parentais, os genes que sofre-ram imprinting mantêm suas marcas de metilação da linha-gem germinativa e atividades específicas dos progenitores ao longo de todo o desenvolvimento posterior. Genes que sofre-ram imprinting são essenciais para a regulação do crescimen-to fetal e placentário, a diferenciação somática e funções neurológicas e comportamentais após o nascimento (29, 30). Além dos 100–200 genes que sofreram imprinting estimados, certos retrotransposons, como sequências intercaladas de partícula A intracisternal (IAP) do camundongo, parecem ser relativamente resistentes à desmetilação pós-zigótica, prova-velmente para evitar instabilidade do genoma por retrotrans-posição excessiva (31). Metilação “de novo” de todo o geno-ma ocorre de maneira preferencial na massa celular interna do blastocisto de camundongos, estabelecendo padrões de metilação somática nas células precursoras das diferentes li-nhagens embrionárias. As células trofoblásticas que originam as linhagens extraembrionárias tornam-se menos metiladas (32). Quando a fertilização e o desenvolvimento embrionário inicial ocorrem in vitro, pode haver maior risco de defeitos de reprogramação de metilação associados com desenvolvimen-to somático anormal (1, 2, 3, 4).

EFEitoS dE tra EM SErES HuMaNoSCrianças concebidas através de TRA apresentam um discreto aumento da taxa de defeitos ao nascimento (33) e um aumen-to de duas a três vezes na taxa de baixo peso ao nascer (34). Possuem ainda maior risco de parto prematuro e complica-ções perinatais, necessitando mais frequentemente de cuida-dos intensivos neonatais (35, 36) (Fig. 1). O baixo peso ao nascimento é um marcador substituto de desenvolvimento



intrauterino sub-ótimo. De acordo com a hipótese da origem do desenvolvimento da doença, um ambiente periconcepcio-nal e/ou pré-natal adverso pode estar associado com desfe-chos de saúde negativos mais tarde na vida, em particular taxas aumentadas para muitas doenças metabólicas e cardio-vasculares (37, 38). Baixo peso ao nascimento é um fator de risco para obesidade no adulto, diabetes tipo 2 e hipertensão (39, 40). A grande maioria de crianças concebidas por TRA parece ser saudável. No entanto, como ainda não há grandes estudos longitudinais sobre a saúde de adolescentes ou adul-tos, não se pode excluir a possibilidade da existência de efei-tos epigenéticos sutis oriundos da modulação exercida por TRA sobre susceptibilidade a várias doenças complexas.

Em seres humanos, é difícil distinguir entre os efeitos das próprias tecnologias e os fatores parentais associados com infertilidade. Um outro problema é relacionar desfe-chos adversos da gestação com manipulações específicas do oócito, como estimulação ovariana com altos ou baixos ní-veis hormonais, e do embrião, como cultura em diferentes meios e por diferentes períodos de tempo. Um estudo (41) relatou uma tendência a baixo peso ao nascimento após FIV com estimulação ovariana comparada a FIV sem estimula-ção e concepção natural. Ainda há controvérsia se o sistema de cultura do embrião pode afetar o peso ao nascer (42, 43) ou não (44, 45). Principalmente por extrapolação a partir de experimentos animais, acredita-se que a superovulação e a cultura de embrião sejam responsáveis pelo aumento dos riscos de alguns distúrbios raros de imprinting em crianças concebidas através de TRA.

Um dos achados mais interessantes em crianças concebi-das através de TRA é um aumento de várias vezes na preva-lência de defeitos de imprinting que causam as síndromes de

Beckwith-Wiedemann (SBW) (46, 47) e de Angelman (SA) (48). No entanto, o risco absoluto de uma criança concebida por FIV/ICSI apresentar distúrbio de imprinting permanece. Inicialmente, a maioria dos casos publicados eram relatos de casos únicos ou pequenas séries de casos. Estudos epidemio-lógicos maiores realizados na Dinamarca (49), Suécia (50), Reino Unido (51) e Holanda (52) questionaram o aumento do risco de distúrbios de imprinting em crianças concebidas através de TRA. É importante observar que tanto a SBW quanto a SA em crianças concebidas através de TRA estão associadas com hipometilação anormal de RDMs maternal-mente metiladas, como LIT1 (BWS ICR2) no cromossomo 11p15 e SNRPN no 15q11–13, respectivamente. Algumas crianças concebidas através de TRA com SBW até apresentam perda de metilação em múltiplos loci que sofreram imprinting (LIT1, SNRPN, PEG1 e PLAGL1) e que não sofreram imprinting (IGF2R) (53, 54). Isso é consistente com um problema no estabelecimento de padrões maternos de metilação no oócito ou sua permanência no embrião em início de desenvolvimen-to. Interessante notar que a síndrome de Prader-Willi, um distúrbio de imprinting oposto à SA e caracterizado por hiper-metilação anormal da RDM de SNRPN, e outros distúrbios de imprinting não parecem ocorrer com mais frequência em crianças concebidas através de TRA. No entanto, como os distúrbios de imprinting humanos são muito raros, a interpre-tação de tais pesquisas populacionais ainda tem por base um número relativamente pequeno de pacientes.

Vários estudos que analisam padrões de metilação gene-específicos (principalmente aqueles que sofrem imprinting) em abortos e recém-nascidos derivados de TRA e de con-cepção espontânea não encontraram taxas de epimutação mais altas nas amostras derivadas de TRA (55, 56, 57, 58,

FIGURA 1

• Hiperatividade (115)• Ansiedade reduzida (117)• Memória espacial deficiente

(117)• Atraso do pré-desmame e do

neurodesenvolvimento (118)

Sere

s h

um

ano

sR

um

inan

tes

Cam

un

do

ng

os

Parâmetros físicos

• Baixo peso ao nascimento (34,41,42)

• Parto prematuro (35,36)

• Peso fetal aumentado (119)• Duração da gestação

aumentada (119)

• Baixo peso gestacional (109,112)• Elevado peso corporal (118)

Doenças

• Síndrome de Beckwith-Wiedeman (46,47)

• Síndrome de Angelman (48)• Elevada taxa de malformação (33)

• Síndrome do filhote grande (121)• Dificuldades respiratórias

ao nascimento (119)• Morte pré- ou perinatal (119)

• Baixa viabilidade do embrião (98)• Organomegalia (115)• Diabetes tipo 2 (115)• Subfertilidade (115)

Comportamento

Efeitos fenotípicos das tecnologias de reprodução assistida em seres humanos e modelos animais.el Hajj. Epigenetics in human reproduction. Fertil Steril 2013.



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59, 60). Outros estudos revelaram diferenças substanciais em vários loci, incluindo LIT1 (BWS ICR2), H19 (BWS ICR1) e IGF2R (61, 62, 63). Imprints de metilação H19 anormais também foram observados em embriões humanos derivados de TRA no período anterior à implantação (64, 65). Tais re-sultados conflitantes podem dever-se aos números limita-dos de amostras analisadas e às diferentes técnicas utiliza-das para análise da metilação. Além disso, não está claro se os padrões anormais de metilação surgiram na linhagem germinativa ou durante o desenvolvimento anterior à im-plantação. Um estudo (24) relatou anormalidades epigenéti-cas semelhantes em abortos após TRA e no esperma do pai. Análises do genoma por microarranjos obtiveram diferen-ças de metilação pequenas, mas significativas, entre recém-nascidos derivados de TRA e não-TRA, afetando os dois genes que sofreram imprinting e que não sofreram imprinting (66). Uma maior taxa de inativação de X não aleatória foi observada no sangue do cordão de crianças concebidas por FIV; entretanto, a diferença com os controles natural-mente concebidos não foi significativa (67).

EFEitoS EPiGENétiCoS da CuLtura E Maturação do oóCitoOócitos humanos de FIV/ICSI são em geral maturados in vivo após estimulação ovariana com gonadotrofinas. Nume-rosos estudos em camundongos demonstraram que a supe-rovulação está associada com uma qualidade reduzida do oócito, atraso do desenvolvimento embrionário e fetal (68, 69), distúrbios na reprogramação do genoma pós-zigótica (70), e alteração da metilação de DNA e de padrões de ex-pressão em oócitos, embriões, fetos e placentas (71, 72, 73). Efeitos adversos da superovulação semelhantes podem ocorrer em seres humanos (48, 74, 75, 76). Aqui vamos fo-car nos efeitos da cultura de oócitos. Embora ainda não se tenha relatado nenhum problema médico maior em crianças nascidas após maturação in vitro (MIV), no momento os números em todo o mundo ainda são muito pequenos para que se tirem conclusões quanto aos riscos genéticos e epige-néticos dessa técnica (77, 78).

Oócitos humanos de MIV são em geral recuperados no estágio de vesícula germinal (VG), na metáfase I (MI), sendo então cultivados para completar as etapas finais da matura-ção (MIV de curto prazo). Os oócitos imaturos são expostos ao meio de cultura contendo gonadotrofinas, que não podem substituir o fluido folicular e o equilíbrio hormonal naturais. Flutuações ambientais que desviam da homeostase, como as inconsistências na temperatura, não podem ser completa-mente eliminadas. Genes que sofreram imprinting são um modelo conveniente para o estudo de efeitos epigenéticos de diferentes TRAs (4). Como eles escapam da reprogramação pós-zigótica, os padrões aberrantes de metilação do oócito em loci que sofreram imprinting não podem ser corrigidos após fertilização, podendo, assim, interferir diretamente com o desenvolvimento normal. Metilação anormal da RDM em geral maternamente não metilada H19 (BWS ICR1) e desme-tilação da RDM em geral maternamente metilada LIT1 (BWS ICR2) (76, 79, 80, 81), assim como níveis reduzidos de histo-na desacetilase (HDAC1) e desacetilação insuficiente de his-

tona-3 lisina-9 (H3K9) (82), foram encontrados em oócitos humanos cultivados (Fig. 2). Outros estudos (83, 84) relata-ram imprints de metilação normal GTL2 e SNRPN após MIV de curto prazo. No entanto, de uma forma geral, o número analisado de oócitos humanos de MIV é demasiado pequeno para permitir conclusões seguras.

Os resultados conflitantes em estudos com camundongos podem ser parcialmente explicados pelas diferenças de proto-colos e de cepas de camundongos utilizados. A CIV curta versus prolongada de oócitos ovulados aumentou e diminuiu a metilação de Mest, respectivamente, sugerindo que o esta-belecimento de imprint materno é um processo bastante di-nâmico (85). Vários estudos usaram MIV de longo prazo, que se inicia com os folículos pré-antrais. A cultura de folículos em gotículas por 12 dias sob uma espessa camada de óleo mineral resultou em perda de metilação nos loci Igf2r e Mest e em ganho de metilação na RDM H19 (19) (Fig. 2). Baixos níveis do doador de metila no meio de cultura folicular leva-ram a um aumento no número de sítios CpG não metilados no gene Mest, enquanto os padrões de metilação Snrpn, Igf2r e H19 permaneceram não afetados (86). O ambiente de cul-tura (por exemplo, compostos metabólicos tóxicos produzi-dos por células foliculares ou alterações de pH) pode afetar o imprinting. O melhoramento das condições de cultura em micropoços sob uma fina camada de óleo com altas doses de FSH resultou em competentes oócitos em MII com padrões de imprinting aparentemente normais de Snrpn, Igf2r e H19 (87, 88). Utilizando condições de cultura similares, outro es-tudo (89) relatou baixos níveis de alelos Snrpn anormalmen-te hipometilados em oócitos de camundongo em CIV.

Há evidência experimental em camundongos (90) e bo-vinos (91, 92, 93) de que o meio, seus suplementos e outros fatores (por exemplo, oxigênio atmosférico) usados para cultura e maturação de oócitos possam influenciar a expres-são de mRNA e o desenvolvimento dos embriões resultan-tes. Devido às acentuadas semelhanças com o oócito e o desenvolvimento embrionário humanos, oócitos bovinos podem ser um modelo melhor do que o murino para a ava-liação dos riscos epigenéticos das TRA humanas. Cerca de 30% dos oócitos bovinos de MIV atingem o estágio de blas-tocisto a partir de FIV, comparado a taxas de blastocisto de até 60% com oócitos bovinos maturados in vivo (94). É claro que as condições de maturação têm um papel crítico na aquisição de competência de desenvolvimento. Um estudo (95) comparou os padrões de metilação de três genes que sofreram imprinting (PEG3, SNRPN e H19) em oócitos bo-vinos maturados in vivo e in vitro (Fig. 2). Dois protocolos diferentes de MIV (usando meio de cultura de tecido 199 e meio de fluido sintético do oviduto modificado) não tiveram efeitos significativos nesses imprints de metilação. Da mes-ma forma, cultura de folículo pré-antral ovino não pareceu interferir com imprinting IGF2R, H19 e BEGAIN (96).

Há várias limitações que devem ser consideradas quan-do se estudam epimutações em oócitos. Um problema fre-quentemente negligenciado é a possibilidade de contamina-ção dos oócitos coletados com DNA somático (por exemplo, de células do cumulus danificadas), que imitariam padrões aberrantes de metilação no oócito. Uma dificuldade adicio-nal é o número limitado de células-alvo que estão tipica-



mente disponíveis para análise. Em geral, mutações de imprinting são eventos raros, comparáveis a agulhas num palheiro, que bem podem passar despercebidas em pequenos pools de células. A maioria dos protocolos para análise de metilação usa o DNA convertido pelo bissulfito de cem ou ainda menos células como material inicial, seguido por am-plificação, clonagem e (piro)sequenciamento de RDMs. A degradação e a baixa complexidade do DNA convertido pelo bissulfito são importantes desafios, pois a amplificação preferencial de moléculas de DNA metilado ou não metila-do, ou a amplificação aleatória de uma única molécula ou apenas algumas na amostra inicial, pode distorcer os resul-tados. Uma possibilidade para evitar tais vieses é o (piro)sequenciamento por bissulfito com diluição limitante, que permite a análise dos padrões de metilação de múltiplos ge-nes em oócitos ou embriões isolados (89, 95, 97).

EFEitoS EPiGENétiCoS da CuLtura dE EMBriãoGeneticistas que trabalham com camundongos há muito sa-bem que embriões cultivados in vitro têm reduzida viabilida-de quando transferidos para as mães de criação (98) (Fig. 1). A coloração com metilcitosina de embriões de duas células de camundongo revelaram que meios de cultura sub-ótimos e/ou a presença de compostos tóxicos no meio podem levar a distúrbios em todo o genoma de reprogramação de metila-ção pós-zigótica, parada do desenvolvimento e perda precoce do embrião (70) (Fig. 3). Estudos semelhantes no rato (99, 100) e no coelho (101) também demonstraram efeito da CIV na reprogramação da metilação de DNA durante o desenvolvi-mento pré-implantacional, embora a cronologia e o grau de desmetilação pós-zigótica sejam diferentes entre as espécies. A imunofluorescência não detectou diferenças nos padrões

FIGURA 2

(79)(81)(76)(81)(83)(84)(82)

(95)(96)

(87)(88)(86)

(19)(89)

MII

MII

MII

VG

Seres humanos

Ruminantes

Camundongos

CIV de longo prazo MIV

Espermatozoide

O PL L Z P NC C VG MII

S PL L Z P D SR

CGP

H19H19-LIT1LIT1LIT1SNRPNGTL2H3K9Ac global

H19-PEG3-SNRPNIGF2R-H19-BEGAIN

H19-Igf2r-Peg3-SnrpnH19-Igf2r-SnrpnH19-Igf2r-Mest

H19-Igf2r-MestH19-Igf2r-Snrpn

Anormalidades epigenéticas associadas com cultura in vitro (CIV) e maturação in vitro (MIV) de oócitos humanos, bovinos e murinos. O esquema acima indica a dinâmica de metilação de DNA durante o desenvolvimento da célula germinativa feminina (linha vermelha) e masculina (linha azul). Os genes com padrões aberrantes de metilação de DNA em oócitos cultivados são destacados em vermelho, e os genes com imprints de metilação normal são destacados em preto. H3K9Ac refere-se a insuficiente desacetilação global de histona-3 lisina-9. As setas indicam MIV de longo prazo iniciando com folículos pré-antrais e MlV de curto prazo iniciando com oócitos de VG. CGP = célula germinativa primordial; S = es-permatogônia; O = oogônia; PL = pré-leptóteno; L = leptóteno; Z = zigóteno; P = paquíteno; D = diplóteno; NC = oócito que não cresce; SR = espermátide redonda; C = oócito em crescimento; VG = oócito de vesícula germinal; MII = oócito em metáfase II.el Hajj. Epigenetics in human reproduction. Fertil Steril 2013.



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de acetilação global de histona-H4 (H4Ac), metilação de H3 lisina-9 (H3K9Me) ou fosforilação H3 serina-10 (H3S10Ph) entre embriões de camundongo cultivados in vitro e in vivo (102). No entanto, é difícil quantificar os sinais de imuno-fluorescência, de modo que alterações locus-específicas e menores globais não podem ser excluídas. Na verdade, a imunoprecipitação de cromatina mostrou que imprinting H19 anormal em células-tronco embrionárias derivadas de embriões de camundongo cultivados in vitro associou-se com um aumento na metilação de H3 lisina-4 (H3K4Me2) na cromatina paterna e na metilação de H3 lisina-9 (H3K9Me3) na cromatina materna (103).

O exemplo mais impressionante dos efeitos epigenéti-cos e fenotípicos da cultura de embrião no desenvolvimento posterior é o modelo do camundongo amarelo viável Agou-ti (Avy). A inserção de um elemento IAP transponível no locus Agouti cria um epialelo metastável que é ligado ou desligado de maneira probabilística durante o início da em-briogênese. Esse lábil estado epigenético pode causar mu-dança fenotípica (expressividade variável) na ausência de heterogeneidade genética. Dependendo do grau de metila-ção, que pode ser influenciado por fatores ambientais, o descendente Avy/a apresenta um fenótipo do tipo selvagem (não-Agouti), intermediário (mosaico) ou Agouti, caracteri-zado por pelagem de cor amarela e susceptibilidade a doen-ças metabólicas (104). Cultura em um meio de FIV humana

comercial, que pode ser sub-ótimo para embriões de ca-mundongo, aumentou a frequência de alelos Avy hipometi-lados e consequentemente do fenótipo Agouti (105). De ma-neira semelhante, condições sub-ótimas de cultura de embrião podem ativar o epialelo Axin1(Fu), que também contém inserção de IAP na região 5’ cis-reguladora, e causa um fenótipo de cauda enrolada (106). Uma vez estabeleci-dos, os estados epigenéticos das IAPs parecem ser mais re-sistentes à reprogramação do genoma do que os outros loci, podendo, portanto, fornecer um mecanismo para herança transgeracional de fenótipos epigenéticos (31).

Há mais de 15 anos foi demonstrado que a cultura de embrião de camundongo pode alterar a atividade progenitor-específica do locus H19 que sofreu imprinting (107). Estu-dos de seguimento confirmaram que condições diferentes de cultura de embrião de camundongo, em particular a adição de soro fetal de bezerro (FCS), podem levar a metilação e expressão gênica aberrante (108, 109) (Fig. 3). Perda de imprinting pareceu ocorrer após o estágio de 2 células de ca-mundongo, mas antes do estágio de blastocisto, tendo per-sistido de maneira tecido-específica, sendo os tecidos placentários (derivados do trofectoderma) mais sensíveis às perturbações do que o próprio embrião (110, 111). Embora todos os meios de cultura comerciais testados parecessem causar a perda de metilação nos dois loci que sofreram imprinting paterna (H19) e maternamente (Snrpn e Peg3), em

FIGURA 3

Axin1(Fu): metilação de DNA, H3K4Me2, H3K9Me3, H3K9Ac, H4K20Me3 (106)H19 (71)

H19 (108)H19-Snrpn (110)

H19-Snrpn-Peg3 (112)H19-Snrpn (114)

H19-LIT1 (111)

H19 (64)

H19 (65)

Blastocisto Blastocisto Pró-núcleos 2 células 4 células 8 células Compactação inicial tardio

Sere

s h

um

ano

sC

amu

nd

on

go

s

Reprogramação de metilação (70)

H4Ac global, H3K9Me3 global, H3S10pH global (102)

Anormalidades epigenéticas (metilação de DNA e modificação de histona) associadas com a cultura de embrião humano e murino. O esquema acima indica a dinâmica de metilação do DNA do genoma materno (linha vermelha) e paterno (linha azul) durante o desenvolvimento pré-im-plantacional. Os genes com padrões aberrantes de metilação de DNA em embriões cultivados são destacados em vermelho, e os genes com imprints de metilação normal são destacados em preto. De maneira semelhante, modificações aberrantes de histona são destacadas em verme-lho. As setas contínuas indicam o início e o final da cultura de embrião. As setas interrompidas indicam cultura de embrião em diferentes está-gios no mesmo estudo.el Hajj. Epigenetics in human reproduction. Fertil Steril 2013.



certos sistemas, os estados epigenéticos dos embriões culti-vados apresentavam maior semelhança com a situação in vivo (112). As condições de CIV também afetam o cresci-mento e a diferenciação do embrião. Uma redução da ex-pressão de Igf2 (associada com hipometilação H19) pode explicar o menor peso fetal após CIV, como o meio M16 com FCS (109) ou o meio de Whitten (112). É importante notar que tais alterações epigenéticas induzidas pela cultura dependem do background genético. Por exemplo, embriões derivados de uma fêmea B6 e um macho Mus castaneus foram mais resistentes às alterações de metilação do que cruzamentos Cast × B6 (108). Um estudo abrangente (113) comparando respostas de embriões de camundongo com 13 diferentes protocolos de cultura de TRA humana mostraram significativas diferenças nas taxas de blastocisto e de de-senvolvimento fetal. Embora isso confirme o impacto do sistema de cultura no desenvolvimento posterior, certamen-te não é possível (e não foi essa a intenção) otimizar as condições de cultura de embrião humano utilizando-se en-saios de embrião de camundongo. Os efeitos epigenéticos da cultura de embrião não estão restritos aos genes que sofre-ram imprinting. Um estudo recente (114) demonstrou altera-ções na expressão do imprinting genômico (H19 e Snrpn) e de genes metabólicos (Atp1a1, Slc2a1 e Mapk14) em em-briões de CIV de rápido desenvolvimento, em comparação a embriões com taxas mais lentas de desenvolvimento ante-rior à implantação. Outro estudo (115) associou CIV sub-ó-tima (em meio suplementado com FCS) com alterações de expressão de mRNA no estágio de blastocisto em cinco de onze genes testados (Dnmt1, Dnmt3a, Hdac1, Kap1 e Sox2) envolvidos em reprogramação epigenética e regulação transcricional, além de alterações fenotípicas adversas (or-ganomegalia, intolerância à glicose e subfertilidade).

Em concordância com a hipótese da origem fetal das doenças, o acúmulo de evidência experimental sugere que a CIV possa ter consequências de longo prazo, talvez até transgeracionais, no neurodesenvolvimento e comporta-mento de camundongos adultos (116) (Fig. 1). Em um estudo (117), a cultura de embrião em meios diferentes (KMSO ou Whitten) sem FCS mostrou associação com alterações com-portamentais específicas (redução de ansiedade e memória espacial deficiente) em camundongos adultos. Outro estudo (118) relatou que CIV sub-ótima, em particular em meio com FCS, atrasou o pré-desmame e o neurodesenvolvimen-to, reduziu a atividade locomotora e levou a alterações comportamentais específicas e deficiências de memória. Ca-mundongos adultos originários de CIV também apresenta-ram aumento do peso corporal (mais pronunciado em fê-meas) e organomegalia.

Bezerros e ovelhas produzidos in vitro com frequência apresentam anormalidades de excesso de crescimento fetal e placentário, que estão associados com uma maior taxa de perda de gravidez e maior mortalidade perinatal (119) (Fig. 1). Tal síndrome do filhote grande (LOS, sigla em inglês) em ruminantes, que até certo ponto lembra a SBW em seres hu-manos, foi associada a condições de MIV (120) e cultura prolongada de embrião, particularmente meios contendo FCS (121). Embriões de bezerros e ovelhas produzidos in vitro versus in vivo diferem quanto aos seus padrões de meti-

lação de DNA e expressão gênica (122, 123). Tanto os efeitos fenotípicos quanto epigenéticos parecem ter especificidade de protocolo e tecido (120). Em particular, hipometilação aberrante e expressão reduzida do gene IGF2R que sofreu imprinting foram associadas com LOS em ovelhas (124). Nesse contexto, é interessante notar que o IGF2R não sofreu imprinting em seres humanos (125) e, portanto, pode ser me-nos suscetível à má programação epigenética. Essa é uma possível explicação para o baixo risco absoluto de SBW em crianças oriundas de TRA em comparação ao problema de LOS em ruminantes. Hipometilação de LIT1 em BWS ICR2 bovina foi também observada em bezerros com LOS (126). Assim, à semelhança de SBW e SA em crianças oriundas de TRA, a LOS em ruminantes pode ser devida à perda anormal de metilação em RDMs da linhagem germinativa materna. Diferentemente do epigenoma paterno, o epigenoma mater-no parece ser mais suscetível a TRA. Um estudo (127) relatou uma maior expressão de genes ligados ao X em embriões bovinos produzidos in vitro, sugerindo que a CIV possa in-terferir com o processo epigenético de inativação do X.

CoNCLuSão E PErSPECtiva Até onde vai o conhecimento atual, a TRA humana não está associada a um aumento dramático de epimutações rele-vantes do ponto de vista médico nem a distúrbios de imprinting nas crianças resultantes. Entretanto, pode haver diferenças estatisticamente significativas nos padrões de metilação entre os grupos oriundos de TRA e aqueles não oriundos de TRA. Embora as diferenças observadas estives-sem em geral dentro da variação normal de metilação entre os indivíduos, a TRA ou fatores associados com infertilidade parental podem afetar o epigenoma da prole (56, 66). Como se espera que alterações epigenéticas ocorram de cem a mil vezes mais frequentemente do que mutações genéticas de DNA (128, 129), sua contribuição para a variação fenotípica e suscetibilidade a doença é bastante subestimada.

Atualmente, há pelo menos duas caixas pretas na TRA humana. A primeira, não sabemos quantas tentativas de TRA fracassam devido a problemas epigenéticos das células germinativas ou embrião em estágios iniciais do desenvol-vimento. Está claro que anomalias cromossômicas não são a única causa de perda embrionária precoce e fetal. A se-gunda, está cada vez mais claro que as condições iniciais de vida podem ter um efeito duradouro na saúde do indivíduo. Indivíduos concebidos durante um período de inanição apresentaram alterações de metilação no fator de cresci-mento IGF2 e em outros genes relevantes do ponto de vista médico mais de 60 anos depois (130, 131). Ao mesmo tem-po, esses indivíduos apresentaram maiores riscos de obesi-dade, doença arterial coronariana, envelhecimento cogniti-vo acelerado e esquizofrenia (132, 133, 134). Se a dieta alimentar materna no período periconcepcional tem tais consequências fenotípicas duradouras, não podemos negli-genciar possíveis efeitos da TRA na suscetibilidade a doença mais tarde na vida. Há grande urgência quanto à realização de estudos epidemiológicos de longo prazo sobre fenótipos e doenças metabólicas, cardiovasculares, do neurodesenvol-vimento, comportamentais e outras mais complexas em



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crianças, adolescentes e adultos concebidos por TRA. É im-portante que os dados médicos também incluam informa-ções sobre infertilidade dos progenitores, modo de concep-ção e, no caso de TRA, os protocolos utilizados.

É difícil estimar, em seres humanos, a contribuição da infertilidade parental versus TRA para os riscos conhecidos (por exemplo, baixo peso ao nascimento) para crianças/re-cém-nascidos concebidos através de TRA. É ainda mais di-fícil definir especificamente quais técnicas e condições de cultura são melhores ou piores. Os vários estudos com dife-rentes modelos animais e a coincidência temporal com o estabelecimento de imprint materno sugerem que a CIV de oócitos e a superovulação possam afetar o epigenoma dos embriões e da prole derivados. Por outro lado, epimutações no espermatozoide podem estar associadas com comprome-timento da fertilidade paterna. Novamente, experimentos animais e coincidência com processos cruciais de reprogra-mação após a fertilização falam a favor de efeitos adversos de cultura de embrião sub-ótima. Do ponto de vista epige-nético, a manipulação do oócito e do embrião deve ser res-trita ao mínimo, ou a vantagem de uma certa técnica (como seleção durante cultura de embrião e transferência de blas-tocisto) deve superar seus efeitos epigenéticos negativos (como durante a cultura prolongada de embrião). Infeliz-mente, até o momento, muitas decisões em TRA humana não podem ser baseadas em evidência, devido à falta de estudos conclusivos.

E por último, mas não menos importante, é importante mencionar que muito do nosso conhecimento atual baseia-se em estudos sobre apenas uns poucos genes que sofreram imprinting, que são candidatos óbvios ao desenvolvimento embrionário, placentário e fetal (4). Entretanto, alterações em genes que não sofrem imprinting podem ser igualmente importantes e frequentes (66). Um recente estudo ao nível do genoma (135) usando sequenciamento com bissulfito de representação reduzida demonstrou que, exceto pelos genes que sofreram imprinting, o oócito contribui com um con-junto bem maior de RDMs maternas, incluindo muitos pro-motores de genes, para o zigoto e que, durante o desenvol-vimento anterior à implantação, os padrões de metilação embrionários mais lembram o epigenoma do oócito do que aquele do espermatozoide. Espera-se que métodos para a análise de metilação envolvendo todo o genoma, baseados em uma próxima geração de sequenciamento e microarran-jos, também forneçam uma melhor ideia da extensão e im-plicações das alterações induzidas por TRA.

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Há relatos de que fertilização in vitro (FIV) e injeção intracito-plasmática de espermatozoide

(ICSI) estejam associadas a distúrbios de imprinting, inclusive supondo que FIV ou ICSI possam causar doenças que envolvem imprinting genômico. O presente artigo teve o objetivo de ava-liar a evidência publicada sobre esses problemas.

Genes que sofreram imprinting são transcritos de apenas um alelo parental específico, a cópia derivada da mãe ou a cópia derivada do pai. Tal expressão monoalélica dos genes que sofreram imprinting encontra-se associada com modificações epigenéticas e metilação de DNA, sendo específica do progenitor de origem. Esse padrão de modificação específica do progenitor presente nas

linhagens germinativas leva a regiões diferencialmente metiladas (RDMs) após a fertilização. Elas permanecem mais ou menos intactas após a fertili-zação e escapam da desmetilação de todo o genoma que ocorre no zigoto, assim como da metilação “de novo” durante a diferenciação de células so-máticas através de mecanismos ainda não conhecidos por completo. No de-senvolvimento da célula germinativa no período embrionário precoce, os pa-drões parentais são apagados, para se-rem estabelecidos “de novo” na vida adulta. O padrão de imprinting paterno é estabelecido durante a espermatogê-nese. O padrão materno é estabelecido

Distúrbios de imprinting são mais prevalentes após fertilização in vitro humana ou injeção intracitoplasmática de espermatozoide?Jan P. W. Vermeiden, Ph.D. e Rob E. Bernardus, M.D., Ph.D.

Nij Barrahûs Fertility Center, Wolvega, Holanda

Objetivo: Revisar a literatura e apresentar dados originais para responder à seguinte pergunta: a fertilização in vitro (FIV) ou a injeção intracitoplas-mática de espermatozoide (ICSI) está associada com um aumento de doenças que envolvem imprinting genômico na prole? Em caso de resposta positiva, investigar se existe uma relação causal entre FIV ou ICSI e doenças que envolvem imprinting genômico.Desenho: Estudo de revisão.Resultado: Oito estudos epidemiológicos prestaram-se ao cálculo de risco relativo ponderado para o nascimento de uma criança com síndrome de Beckwith-Wiedemann após FIV ou ICSI em comparação com o risco na população normal. Esse risco relativo foi de 5,2 (95% IC: 1,6–7,4). Em um estudo, o risco relativo foi corrigido para problemas de fertilidade dos pais, e nenhuma associação significativa foi identificada. Dados sobre a síndro-me de Silver-Russell são demasiadamente raros para a obtenção de conclusões, mas é provável que exista uma associação positiva com tratamento por FIV ou ICSI. Não foram encontradas associações significativas das incidências das síndromes de Angelman e Prader-Willi com tratamentos por FIV ou ICSI. Crianças com síndrome de Prader-Willi ou síndrome de Angelman têm maior probabilidade de nascer de pais com problemas de fertili-dade. Todos os retinoblastomas de crianças nascidas após FIV ou ICSI puderam ser explicados por mutações “de novo” no gene RB1 e não foram associados com genes que sofreram imprinting. Doenças que envolvem imprinting genômico resultam de erros de metilação já presentes nos esper-matozoides ou oócitos. Não há relação causal comprovada entre doenças que envolvem imprinting genômico e tratamentos de FIV ou ICSI.Conclusão: Distúrbios de imprinting são mais prevalentes após FIV ou ICSI humana. Futuros estudos devem fazer a correção para problemas de fertilidade nos grupos ‘afetado’ e ‘de comparação’. É pouquíssimo provável que tecnologias de reprodução assistida causem doenças que envolvem imprinting genômico em seres humanos. (Fertil Steril® 2013;99:642–51. ©2013 by American Society for Reproductive Medicine.)Palavras-chave: síndrome de Beckwith-Wiedemann; síndrome de Silver-Russell; síndrome de Angel-man; síndrome de Prader-Willi; retinoblastoma; FIV; ICSI

Discussão: Você pode discutir este artigo com seus autores e outros membros da ASRM em http://fertstertforum.com/vermeidenjp-FIV-icsi-imprinted-diseases/

Recebido: 21 de novembro de 2012; revisado: 15 de janeiro de 2013; aceito: 22 de janeiro de 2013J.P.W.V. nega conflito de interesse. R.E.B. nega conflito de interesse.Solicitação de reimpressões: Jan P. W. Vermeiden, Ph.D., Nij Barrahûs Fertility Center,

Heerenveenseweg 99b, 8471 ZA Wolvega, the Netherlands.

Fertility and Sterility® Vol. 99, No. 3, 1 Março, 2013 0015-0282Copyright ©2013 American Society for Reproductive Medicine, Publicado por Elsevier Inc.. http://dx.doi.org/10.1016/j.fertnstert.2013.01.125





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antes, durante ou após a fertilização. Essa cronologia é gene-específica. As RDMs que se originam da linhagem germina-tiva são chamadas RDMs primárias. Se os genes paternos são silenciados devido às RDMs primárias, os genes maternos são predominante ou exclusivamente expressados, ou vice-versa. Isso distingue as RDMs primárias das RDMs secundárias, que surgem apenas após a metilação “de novo” no embrião após a implantação. As RDMs secundárias são específicas do está-gio de desenvolvimento, da célula e do tecido, não apresen-tando, em geral, metilação alelo-específica (1).

Nas doenças que envolvem imprinting genômico, a ex-pressão monoalélica é alterada por metilação aberrante da região de controle do imprinting de um gene específico, causando a doença. Pode ser hipometilação ou hipermetila-ção. A situação pode ser complexa. Por exemplo, há reci-procidade entre o imprinting de H19 (maternamente ex-pressado) e o imprinting de IGF2 (paternamente expressado). Hipermetilação de H19 encontra-se associada com a síndro-me de Beckwith-Wiedemann (SBW), enquanto hipometila-ção, com a síndrome de Silver-Russell (SSR).

A FIV e a ICSI são técnicas de reprodução assistida (TRA) bem aceitas por casais subférteis. A TRA não concer-ta as causas de subfertilidade, mas possibilita que casais subférteis concebam. O primeiro bebê de FIV nasceu em 1978, e agora, 35 anos depois, condições ótimas de cultura ainda não foram determinadas e não se conhece o efeito do tratamento nas crianças; não se sabe se e nem como os tra-tamentos afetam o epigenoma. Estudos de seguimento sobre a saúde de crianças nascidas após FIV ou ICSI são animado-res, mas os valores médios de várias variáveis diferem da-queles da população geral: níveis discretamente elevados de glicemia de jejum e maiores de pressão arterial foram obser-vados em comparação àqueles encontrados em crianças concebidas espontaneamente. A maioria dos valores indivi-duais dessas variáveis está dentro dos padrões de normali-dade, indicando discreta diferença entre crianças de FIV/ICSI (2). Crianças concebidas e nascidas em períodos de ina-nição e estresse também apresentaram glicemia de jejum mais elevada e aumento da pressão arterial. Antes que se delineassem os mecanismos por trás desses fenômenos, o termo ‘programação’ era usado (3, 4). Hoje, a programação pode ser explicada por adaptações do epigenoma, como de-monstrado por metilação diferenciada de várias RDMs de IGF2/H19(5). Essas adaptações epigenômicas são variações fisiológicas normais e não doenças que envolvem imprinting genômico.

As doenças que envolvem imprinting genômico são doenças de verdade, ao contrário das adaptações fisiológi-cas a um ambiente em modificação. O primeiro encontro de TRA com doenças que envolvem imprinting genômico foi a síndrome do filhote grande. Devido a certas condições de cultura (alta concentração de soro e cocultura com células somáticas), maturação in vitro de oócitos bovinos e fertili-zação in vitro desses oócitos resultaram em bezerros gran-des (comparados com peso normal de 45 kg, os bezerros grandes pesaram até 90 kg). Parecia que o centro de contro-le do imprinting de Igf2r havia sido hipometilado, resultan-do em crescimento excessivo dos bezerros (6). A partir de 2002, artigos alarmantes foram publicados sobre um au-

mento de doenças que envolvem imprinting genômico devi-do a FIV e ICSI (7), levantando a questão de se FIV e ICSI causariam doenças que envolvem imprinting genômico, como SBW, SSR, síndrome de Angelman (SA), síndrome de Prader-Willi (PWS) e retinoblastoma. Entretanto, as asso-ciações entre doenças que envolvem imprinting genômico e TRA não são claras devido aos seguintes fatores: raridade de tais doenças na população em geral, assim como em crian-ças concebidas por FIV ou ICSI; confusão na compreensão das implicações de programação e de doenças que envol-vem imprinting genômico; e, finalmente, os estudos foram realizados com metodologias diferentes, produzindo resul-tados conflitantes.

SíNdroME BECkWitH-WiEdEMaNN E traA SBW é um excesso de crescimento fetal. O diagnóstico baseia-se em características físicas do paciente; em 80% de todos os casos, a confirmação por exames de genética mo-lecular é possível. Os erros genéticos encontram-se no cro-mossomo 11. As principais causas são: dissomia uniparental (DUP) de H19 (20% dos casos; DUP envolve ambos os cen-tros de imprinting 1 e 2); hipometilação de LIT1 (materna-mente metilado, 50% dos casos); hipermetilação de H19 (paternamente metilado, 5% dos casos); e microdeleções, translocação, inversão e duplicações (cada <1% dos casos). Em 20% dos casos, a causa é desconhecida (8). Nos casos associados a TRA, quase todos os casos de SBW foram devi-dos a hipometilação de LIT1. A SBW é uma doença rara, com prevalência estimada na população de 1:14.500–13.700 na Europa Ocidental e América do Norte (8, 9). Uma preva-lência de 1:287.000 foi relatada no Japão (10).

Na literatura, a expressão padrão para hipometilação de genes que sofreram imprinting como LIT1 é a perda de me-tilação. A perda refere-se a um gene previamente metilado que subsequentemente perde tal metilação. No entanto, pode ser que o gene nunca tenha sido metilado. Logo, ter-mos neutros, como ausência de metilação ou hipometilação, são preferidos. Tal ausência pode ser causada por perda ou falha de metilação. O termo hipometilação é aplicado após avaliação do índice de metilação e indica que tal índice é baixo. Hipometilação é um termo neutro que descreve o concreto estado de metilação de um gene em um tecido ou uma suspensão de células.

Estudos epidemiológicos sobre SBW e traVários estudos foram publicados com dados originais sobre SBW e FIV/ICSI. A maioria deles utilizou dados de registros voluntários. Apenas três foram baseados em registros com-pletos (11, 12, 13). As diferenças de metodologia não permi-tiram uma meta-análise adequada, mas calculamos um ris-co relativo (RR) ponderado baseado nos dados disponíveis.

DeBaun e col. (14) usaram os dados de dois registros voluntários de SBW. Estimaram que a SBW é pelo menos 6 vezes (95% intervalo de confiança [IC]: 2,0 X–18,2 X) mais prevalente em crianças nascidas após FIV/ICSI do que na população geral. Descreveram a base molecular de sete crianças com SBW nascidas após TRA: cinco tinham hipo-



metilação de LIT1, uma tinha LIT1 normal e H19 normal, e uma tinha erros de metilação em LIT1 e H19. Não informa-ram a incidência de SBW em outras formas de TRA, como inseminação intrauterina (IIU), inseminação com sêmen de doador e uso de medicamentos para fertilidade.

No Reino Unido, vários artigos com dados novos foram publicados sobre a relação de SBW e FIV/ICSI (9, 15, 16, 17). Todos esses artigos basearam-se em registros voluntários e repetiram alguns dados dos mesmos pacientes. Por essa ra-zão, apenas um deles foi selecionado para o cálculo do RR ponderado (16).

Um questionário foi enviado para 213 famílias, sendo que 83 delas responderam. Dessas, 79 tinham SBW esporá-dica, tendo seis (7,6%) desses indivíduos sido concebidos por FIV ou ICSI. Após correção para os não respondedores, pelo menos 2,9% (95% IC: 1,4%–6,3%) das crianças com SBW haviam nascido após FIV ou ICSI (taxa esperada de 0,8%; RR 3,6 (95% IC: 1,6–7,8). Portanto, mesmo após cor-reção para os não respondedores, houve uma significativa associação entre SBW e FIV/ICSI. Utilizando os dados origi-nais, calculamos um RR de 9,5 (95% IC: 4,3–20,1). Usamos esse valor para calcular o RR ponderado de todos os estudos epidemiológicos, pois em todos os demais estudos não hou-ve correção para os não respondedores. O artigo citado (16) relatou os dados moleculares de 8/11 pacientes. Todos os oito tinham hipometilação de LIT1, mas o tipo de tratamen-to (FIV/ICSI ou apenas medicamentos para fertilidade) não era especificado. O mesmo grupo também relatou os seguin-tes dados moleculares de pacientes com SBW (13 pós ICSI e 12 pós FIV) (17): 24/25 tinham hipometilação de LIT1. Acredita-se que os dados do estudo de Sutcliffe e col. com seis pacientes com SBW após FIV/ICSI tenham sido incor-porados àqueles dados (16).

Bowdin e col. (9) enviou um questionário para 2.492 famílias com crianças concebidas por FIV/ICSI que viviam na Irlanda e na região central da Inglaterra; 1.542 respon-deram, sendo relatada uma criança com SBW. Calculando-se o número esperado de pacientes, utilizando-se tanto RR de 9,5 e o RR corrigido de 3,6 (16), a incidência de SBW nesse grupo seria de 1:4.000–1.500, esperando-se 0,4–1,0 criança com SBW. Portanto, tais resultados encontram-se dentro do esperado, mas o estudo não teve poder suficiente para uma conclusão sólida.

Gicquel e col. (11) basearam seu trabalho em um regis-tro completo de toda a França com todos os pacientes com SBW. O período do estudo não foi definido, mas seis pacien-tes com SBW haviam nascido após FIV ou ICSI; em todo o país, 149 crianças com SBW haviam nascido no mesmo pe-ríodo, o que significa que 4% das crianças com SBW ha-viam nascido após FIV/ICSI, representando um RR de 3,2 (95% IC: 1,4–6,8) em comparação à população normal.

Rossignol e col. (do mesmo grupo de Gicquel) publica-ram os resultados moleculares de novos pacientes com SBW após TRA (18). No total, publicou-se o resultado de 12 pa-cientes com SBW após TRA. Todos os 12 pacientes apresen-tavam hipometilação de LIT1, sendo que dois deles também tinham hipometilação de H19.

Halliday e col. (19) publicaram os resultados de SBW e FIV/ICSI no estado de Vitória, na Austrália. Dos ~1.316.500

nascidos vivos naquele estado de 1983 a 2003, detectaram-se 37 pessoas com SBW, correspondendo a uma prevalência geral de SBW de ~1:35.580 nascidos vivos no período. Nes-se mesmo período, 14.894 crianças nasceram com FIV/ICSI no estado de Vitória. A incidência de SBW nessas crianças foi de 4 em 14.894 (1:3.723; RR 9,6, 95% IC: 3,8–24,1). Não foram fornecidos os números para outros tratamentos de fertilidade.

Källén e col. (12) revisaram registros de SBW na Suécia. Na coorte de crianças nascidas após FIV/ICSI, uma criança tinha SPW e outra tinha SSR. Nesse período (1982–2001), 16.280 crianças nasceram após FIV/ICSI. Concluiu-se que, na Suécia, FIV/ICSI não se associava com uma maior inci-dência de doenças que envolvem imprinting genômico. Não havia dados epidemiológicos sobre nascimentos de SBW na população sueca, mas 1 (±2) em cada 16.280 poderia ser esperado, admitindo-se para a Suécia a mesma incidência da Europa Ocidental (1:13.700).

Lidegard e col. (13) revisaram os registros na Dinamar-ca. Todas as crianças concebidas por TRA e todos os defeitos de nascimento congênitos são registrados de maneira cen-tralizada na Dinamarca. Nas 6.052 crianças nascidas após FIV/ICSI, não há relato de nenhuma com SBW. Concluiu-se que TRA não se associou com aumento da incidência de doenças que envolvem imprinting genômico na Dinamarca. Na verdade, não houve relato de nenhum caso de SBW no banco de dados de todas as crianças nascidas naquele país. Como pelo menos 21 crianças com SBW poderiam ser espe-radas (número de crianças nascidas [442.349] dividido pela incidência de SBW [13.700], menos 2×DP = 32 − 11 = 21), tais achados são de difícil compreensão.

Doornbos e col. (20) publicaram os números das doen-ças que envolvem imprinting genômico e TRA na Holanda durante o período de 1983–2003. O estudo baseou-se em um registro voluntário. Considerando-se a incidência calcu-lada de SBW na Holanda, 24% das famílias com crianças com SBW participaram do estudo, correspondendo a 71 fa-mílias. Quatro dessas crianças haviam nascido após FIV ou ICSI. O RR foi de 6,1 (95% IC: 2,5–0,9) comparando-se com a população normal. Quinze dessas 71 famílias relataram problemas de fertilidade (21,1%, em comparação com 5,6% na população holandesa; RR 4,6, 95% IC: 2,3–5,6). Após correção para problemas de fertilidade no grupo de pais de crianças com SBW e para crianças nascidas em famílias com problemas de fertilidade de qualquer tipo na população normal, não houve aumento significativo de nascimentos de SBW no grupo de crianças concebidas por FIV/ICSI.

Hiura e col. (10) publicaram um artigo sobre a associação entre TRA e doenças que envolvem imprinting genômico no Japão. Tal artigo relatou uma incidência de SBW de 1:287.000. Tal número teve por base um questionário enviado para 3.158 departamentos de pediatria no Japão. A incidên-cia publicada de SBW na Europa Ocidental varia de 1:14.500 a 1:13.700. Isso significaria uma incidência de SBW cerca de 20 vezes menor no Japão do que na Europa Ocidental. No entanto, os autores ressaltaram na discussão do artigo que a taxa de resposta ao questionário não foi ótima (10). Eles re-lataram seis pacientes com SBW de 70 concebidos por FIV/ICSI (8,6%). Como 0,64%–0,98% do total de crianças nasci-



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das no Japão resultaram de FIV e ICSI, o RR de SBW após TRA foi estimado em 12,5 (95% IC: 4,9–31,8).

Para calcular o RR da associação entre FIV/ICSI e a in-cidência de SBW, admitimos que, na Dinamarca e na Suécia, a incidência de SBW seria igual àquela de outros países da Europa Ocidental (1:13.700). Fizemos isso porque não hou-ve relato de SBW relacionada a TRA naqueles países, e não queríamos superestimar o RR. O RR ponderado dos oito es-tudos epidemiológicos foi 5,2 (95% IC: 1,6–7,4), indicando uma significativa associação positiva entre tratamento com FIV/ICSI e incidência de SBW.

outros estudos sobre tra e SBWKobayshi e col. (21) analisaram 78 conceptos abortados con-cebidos por FIV ou ICSI e 38 conceptos abortados concebi-dos espontaneamente ou por IIU. A idade dos conceptos va-riou de 6 a 9 semanas. Avaliaram o índice de metilação de LIT1, tendo baixos índices de metilação sido encontrados em todos os grupos. O grupo FIV/ICSI não diferiu dos demais.

A noção de que FIV/ICSI causa doenças que envolvem imprinting genômico em seres humanos é corroborada por diferenças na proporção das variadas causas moleculares de SBW observadas na população normal e na população de crianças concebidas por FIV/ICSI. Os dados moleculares de 46 crianças com SBW concebidas por FIV/ICSI são relata-dos nos artigos discutidos acima: 44/46 apresentaram hipo-metilação de LIT1, e em 3/44 observou-se também metilação anormal de H19, ou seja, em 95,7% (44/46) das crianças com SBW nascidas após FIV/ICSI, a doença associou-se com hi-pometilação de LIT1. Na população geral, essa porcentagem é ~50%. Reductio ad absurdum levou à conclusão de que o tratamento com FIV/ICSI seria a causa. No entanto, uma porcentagem de hipometilação de LIT1 igualmente alta (89,5%; 17/19) foi encontrada em gêmeos monozigóticos discordantes para SBW concebidos de maneira natural (22, 23, 24). Logo, a alta proporção de hipometilação de LIT1 em crianças com SBW nascidas após FIV/ICSI não corrobora uma relação de causalidade.

A gemelaridade monozigótica encontra-se aumentada na população de FIV/ICSI (25). Pode-se argumentar que as crianças com SBW e hipometilação de LIT1 são os gêmeos que sobreviveram enquanto os outros foram classificados como os gêmeos que desapareceram. No entanto, a maioria dos gêmeos monozigóticos discordantes para SBW são do sexo feminino. Em relatos de crianças com SBW e concebidas por TRA, a relação masculino-feminino pareceu equilibrada. Na concepção espontânea, gemelaridade monozigótica com SBW tem que ser explicada por um mecanismo diferente da-quele de crianças com SBW nascidas após TRA. Supõe-se que, em gêmeos monozigóticos discordantes, a hipometilação de LIT1 ocorra após a clivagem do gêmeo com SBW (24).

Geuns e col. (26) avaliaram a metilação de LIT1 em 16 oócitos humanos e relataram a presença de um oócito humano sem metilação de LIT1. Os outros 15 eram normal-mente metilados. Essas observações sugerem que a SBW possa ser explicada pela ausência de metilação de LIT1 no oócito. Trabalho experimental com transferência de núcleos de oócito murino imaturo para oócitos murinos enucleados

maduros resultou em filhotes com hipometilação de genes de imprinting em Igf2r, Snrp e Mest, demonstrando que hi-pometilação pode originar-se em oócitos (27). Metilação aberrante também pode ser explicada por disfunção das en-zimas de metilação. Bestor (28) sugeriu que função aberran-te da DNMT1 (DNA metiltransferase 1) esteja associada com SBW. Kobayashi e col. (21) relataram variações na se-quência de DNA no gene que codifica DNMT3L (DNA metiltransferase 3L), que foi associada com metilação de DNA paterno anormal.

Há vários argumentos a favor da ideia de que FIV/ICSI pode induzir doenças que envolvem imprinting genômico em seres humanos. Um dos argumentos mais fortes baseia-se em resultados de FIV de bovinos e ovinos. A FIV de oó-citos dessas espécies pode originar a síndrome do filhote grande. Um sistema de cultura rico foi usado (excesso de soro e cocultura com fibroblastos). Após mudar o sistema de cultura, a síndrome do filhote grande desapareceu. Essa síndrome pode ser explicada por hipometilação do gene Igf2r ovino (6). Acreditamos que o raciocínio análogo seja uma metodologia robusta para desenhar experimentos, mas o achado de que a síndrome do filhote grande seja causada por cultura in vitro, FIV e crescimento in vitro de embriões não é prova de que a SBW tem que ser causada por FIV. É importante notar que a cronologia da metilação difere nes-sas espécies (29).

Outra questão é saber se outras TRA além de FIV/ICSI, como IIU em um ciclo estimulado ou o uso de medicamen-tos para fertilidade e concepção natural, encontram-se as-sociadas com um aumento da incidência de SBW. Doornbos e col. (20) relataram um RR não significativo de 2,4 (95% IC: 0,6–9,4). Sutcliffe e col. (16) relataram cinco crianças com SVW nascidas após tratamento com medicamentos para fertilidade e sem FIV/ICSI. O número de crianças nas-cidas em tal período no Reino Unido após outro tratamento com TRA que não FIV/ICSI não foi relatado. Para estimar o risco, supomos que no Reino Unido o número desses trata-mentos seja pro rata semelhante ao da Holanda. Na nossa estimativa, o RR foi 5,6 (95% IC: 2,4–13,3). Os dados com-binados de Doornbos e col. (20) e de Sutcliffe e col. (16) apresentaram um RR de 4,0 (95% IC: 2,0–8,3). Tais resulta-dos indicam uma associação positiva entre a SBW e outros tratamentos de fertilidade que não FIV/ICSI. Aparentemente a fase in vitro não é necessária para aumentar a incidência de SBW. Pesquisa adicional se faz necessária para a investi-gação dessa questão.

Outro aspecto levantado pelos estudos acima é o uso de um grupo de comparação adequado. Em quase todos os es-tudos, a população normal é usada como grupo controle. No entanto, na população normal, apenas uma pequena pro-porção de crianças nasce de pais com problema de fertilida-de (5,6% na população holandesa [20]), enquanto 100% das crianças concebidas após FIV/ICSI nascem de pais com pro-blema de fertilidade. O controle para problemas de fertilida-de resultaria em um quadro mais verdadeiro da associação entre problemas de fertilidade, tratamentos de fertilidade e doenças que envolvem imprinting genômico.

Outra dificuldade apresentada pelas doenças raras é o tamanho necessário da amostra para alcançar conclusões



significativas. Rancourt e col. (30) compararam a diferença na metilação de seis RDMs em placentas ou sangue de cor-dão de 61 crianças concebidas espontaneamente, 57 crian-ças concebidas por FIV e 21 crianças concebidas por in-dução de ovulação. Não foram observadas diferenças significativas. Puumala e col. (31) compararam imprinting em linfócitos e esfregaços bucais de 67 crianças concebidas por TRA e 31 crianças concebidas espontaneamente, não tendo encontrado diferenças significativas. Se assumirmos que a prevalência de SBW no grupo de crianças nascidas após FIV/ICSI seja 1:2.700 e que na população normal seja 1:13.700, grupos de estudo de mais de 45.000 indivíduos seriam necessários para demonstrar uma diferença estatis-ticamente significativa com um a de 5% e b de 20% (ver: www.biomath.info/power/chsq.htm).

associação entre SBW e tra: ConclusõesHá uma associação positiva significativa entre tratamento com FIV/ICSI e SBW, com um RR de 5,2 (95% IC: 1,6–7,4). Com a prevalência na população de 1:13.700, isso sugere que, de cada 2.700 nascimentos após FIV/ICSI, uma criança terá SBW. Um estudo relatou que, após correção para proble-mas de fertilidade entre os pais de crianças com SBW e no grupo controle, a associação deixou de ser significativa. Isso indica que o tratamento com FIV/ICSI por si só não deve ser a causa do aumento da incidência de SBW nessas crianças, mas sim o background (epi)genético dos pais. Muitas relações de causalidade são possíveis, mas nenhuma delas foi com-provada em seres humanos. Entre as causas possíveis, citam-se: o sistema de cultura; a hiperestimulação ovariana; a ge-melaridade monozigótica; o background genético dos pais, como variação genética em DNMT1 e DNMT3L; e a metila-ção aberrante em oócitos e espermatozoides.

SíNdroME dE SiLvEr-ruSSELL E traA SSR é uma doença associada com genes que sofreram imprinting. Suas principais características são a grave res-trição de crescimento intrauterino e pós-natal, macrocefalia relativa e uma pequena face triangular (32). Aproximada-mente metade das crianças com SSR têm significativo com-prometimento cognitivo (33). Em ~50% dos pacientes com diagnóstico clínico de SSR, não se encontrou confirmação ou explicação molecular para a doença. Taxas de prevalên-cia entre 1:392.000 e 1:3.000 foram relatadas, corroborando a afirmação de que a prevalência de SSR é desconhecida (32). Isso dificulta as discussões sobre um aumento da inci-dência de SSR após TRA.

A SSR é a única doença envolvendo imprinting genômi-co conhecida que pode ser causada por dois mecanismos genéticos distintos em dois cromossomos diferentes: hipome-tilação de H19 (cromossomo 11) e DUP do cromossomo 7 materno (mUDP7). Com frequência a hipometilação de H19 é associada a outras epimutações. A hipometilação de H19 pa-rece representar formas mais severas de SSR do que a mUPD7, embora isso seja questionado por alguns pesquisadores (32).

Discutiremos os resultados de quatro estudos de caso (34, 35, 36, 37) e quatro estudos epidemiológicos. Os se-

guintes estudos relataram o nascimento de crianças com SSR: estudo da Dinamarca, nenhum nascimento com SSR na coorte de TRA (13); estudo da Suécia, uma criança (12); o do Japão, cinco crianças (10); e o da Holanda, três crian-ças com SSR após FIV/ICSI (38). Em conjunto, tais estudos relataram 13 crianças com SSR nascidas após FIV/ICSI. Os dados moleculares de 11 pacientes foram apresentados: dez hipometilações de H19 e uma metilação normal de H19, mas com hipermetilação na RDM de PEG1/MEST (37).

Estudos de casoTrês dos estudos de caso relataram o nascimento de uma criança com SSR, e todas as três após ICSI. Duas crianças apresentavam hipometilação de H19 (34, 36). Os dados mo-leculares da terceira criança não foram informados (35).

O quarto estudo de caso despertou especial interesse (37). Tratava-se de uma menina com SSR de gêmeos dizigó-ticos concebidos por FIV. O diagnóstico de SSR baseou-se em características clínicas. O diagnóstico genético e mole-cular não revelou nenhuma mUPD7, metilação normal de H19 e hipermetilação parcial na RDM de PEG1/MEST. Seu pai também apresentava hipermetilação aberrante na RDM de PEG1/MEST, embora em um grau menor do que o da menina, sugerindo que a metilação aberrante do pai fosse herdável. Não sabemos a relevância de PEG1/MEST na SSR, mas a observação de que padrões aberrantes de imprinting podem ser herdados é importante para a nossa discussão sobre a associação entre TRA e doenças que envolvem imprinting genômico.

Estudos epidemiológicosNa Suécia, houve relato de uma criança com SSR (12), que nasceu após um tratamento com ICSI. Os dados moleculares não foram informados.

Lidegard e col.(13) concluíram a partir dos dados ho-landeses que não houve aumento de doenças que envolvem imprinting genômico em associação com TRA. Um estudo incluindo todas as crianças dinamarquesas nascidas entre 1 de janeiro de 1995 e 31 de dezembro de 2001 informou um total de 442.349 nascimentos únicos não resultantes de FIV e 6.052 nascimentos após FIV/ICSI. No grupo não-FIV, re-gistraram-se dois casos de SSR e três de SPW. No grupo FIV/ICSI, não foram observadas crianças com doenças que en-volvem imprinting genômico. Se presumirmos que na Euro-pa Ocidental e na América do Norte cada uma das quatro doenças que envolvem imprinting genômico tenha uma in-cidência média de ≥1:16.000, a incidência combinada seria de 1:4.000. Isso significaria que pelo menos 90 crianças com SBW, SSR, SA ou SPW deveriam ter sido registradas no grupo não-FIV. Os resultados do estudo do registro dina-marquês são, portanto, confusos.

Hiura e col. (10) relataram cinco pacientes com SSR, todos nascidos após FIV. Em um questionário de abrangência nacional, observou-se o nascimento de 42 crianças com SSR, das quais, quatro após FIV ou ICSI. Se a taxa média de nascimento por TRA é de 0,75% no Japão, o RR de SSR associada a TRA seria de 12,6 (95% IC: 5,0–32,2). Ao inter-



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pretarmos tais dados, devemos levar em consideração que os autores alegaram que a taxa de resposta ao questionário não foi ótima.

Lammers e col. (38) tiveram acesso a um registro holan-dês completo de SSR contendo 38 crianças com a síndrome. Os pais dessas crianças foram solicitados a participar de um estudo, tendo 23 concordado. Três tinham mUPD7 e 20 ti-nham hipometilação de H19. Duas dessas 23 crianças ha-viam nascido após FIV e uma após ICSI. No período em questão, 2% de todas as crianças na Holanda haviam nasci-do após FIV/ICSI. Isso dá um RR de 6,7 (95% IC: 2,3–19,1).

Esses dois artigos (10, 38) indicam uma associação po-sitiva significativa entre TRA e SSR.

Estudos sobre metilaçãoO índice de metilação de H19 pode nos informar o momen-to em que a (des)metilação ocorreu. Um índice de metilação de 0% indica nenhum ganho de desmetilação em algum momento, ou que a desmetilação ocorreu antes da fertiliza-ção (34, 39). Hiura e col. (10) não informaram os valores dos índices de metilação, mas relataram que 4/5 dos pa-cientes com SSR e concebidos por TRA apresentavam um padrão de mosaico para metilação de H19, sugerindo que os erros de metilação eram estabelecidos após fertilização e divisões de clivagem.

Kobayashi e col. (21) analisaram a metilação de sete loci autossômicos que sofreram imprinting e o locus XIST de 78 fetos abortados concebidos por TRA e 38 fetos abor-tados concebidos espontaneamente. Embora não relatado, complicações sérias ou doenças dos conceptos tinham que estar envolvidas para que se fizesse o aborto em mulheres que haviam concebido através de TRA; portanto, questio-na-se até que ponto tais conceptos eram representativos das crianças nascidas vivas após TRA. Análises moleculares foram realizadas nos tecidos fetais, tendo o tecido placen-tário sido cuidadosamente removido. Hipometilação de H19 foi observada em seis fetos concebidos por TRA (índice de metilação de 4%–23,5%). Nenhum dos conceptos conce-bidos espontaneamente apresentou valores tão baixos do índice de metilação de H19. Isso pode sugerir que hipome-tilação de H19 tenha ocorrido após fertilização. No entan-to, Kobayashi e col. (21) também descobriram, com o uso de polimorfismos de DNA nos loci H19 e GTL2, sete casos com exatamente o mesmo erro de metilação de DNA no espermatozoide dos pais e em seus conceptos, sugerindo que os erros de metilação fossem pré-existentes e não uma consequência de TRA. Em outras palavras, o procedimento de TRA não havia afetado o estado de metilação daqueles genes. Concluímos que as doenças que envolvem imprinting genômico podem ser causadas por metilação aberrante dos genes no espermatozoide.

Obata e col. (27) relataram que, em oócitos murinos, padrões aberrantes de metilação podem estar presentes e ser passados para a prole, como julgado a partir de sua presen-ça em filhotes. Embora isso não prove que o mesmo possa ocorrer em seres humanos, é prova do princípio de que pa-drões aberrantes de metilação estão presentes nos gametas e podem ser transferidos para os conceptos.

associação entre SSr e tra: ConclusõesDas 13 crianças com SSR concebidas através de TRA, cinco nasceram após ICSI e oito após FIV. Pareceu não haver pre-valência de FIV ou ICSI, mas os números são muito peque-nos para outras conclusões.

Dois estudos epidemiológicos, de baixo poder, não mostraram associação entre TRA e incidência de SSR. Dois outros estudos epidemiológicos relataram uma associação positiva significativa entre a incidência de SSR e FIV/ICSI (RRs 12,6 [95% IC: 5,0–32,2] [10] e 6,7 [95% IC: 2,3–19,1] [38]). Gostaríamos de concluir que deve haver uma associa-ção positiva significativa entre a incidência de SSR e o tra-tamento com FIV/ICSI, mas o número de casos publicados é pequeno.

Muitas das crianças com SSR, concebidas tanto espon-taneamente quanto através de FIV/ICSI, eram mosaicos, su-gerindo que, nessas crianças, os padrões aberrantes de me-tilação foram estabelecidos no início da fase de diferenciação dos embriões (10, 39). Devido ao reduzido número de obser-vações, não sabemos se o padrão de metilação de mosaico está associado com FIV/ICSI.

Padrões aberrantes de metilação detectados no esper-matozoide também foram observados na prole. Isso indica que metilação aberrante pode ocorrer durante a espermato-gênese, sugerindo que procedimentos in vitro, tais como ICSI e FIV, facilitam a transferência de espermatozoide aber-rante, mas não são a causa intrínseca dos erros de metilação nem das doenças que envolvem imprinting genômico.

SíNdroME dE aNGELMaN E traA SA é um distúrbio neurogenético caracterizado por grave retardo mental, atraso do desenvolvimento motor, deficiên-cia de equilíbrio acompanhada por movimentos espasmódi-cos, incapacidade de falar e aparência feliz. É causada pela falta de função do alelo materno do gene UBE3A no cro-mossomo 15, resultando de deleção, mutação pontual, DUP ou defeito de imprinting. Apenas em ~5% dos casos há ausência de imprinting do alelo materno. Em 5%–10% dos casos que possuem as principais características clínicas fe-notípicas, não se identificam anormalidades genéticas. Tra-ta-se de doença rara. Relata-se uma incidência que varia de 1:20.000 a 1:12.000 no Ocidente (41) e de 1:134.000 no Japão (10). Dagli et al. publicaram uma revisão recente-mente (40).

Estudos de casoNos anos 2002–2012, dois estudos de caso (7, 41) e quatro estudos epidemiológicos com dados originais (10, 16, 20, 42) foram publicados sobre essa doença e sua associação com subfertilidade e tratamentos para fertilidade. Cox e col. (7) descreveram dois pacientes, ambos nascidos após ICSI. Os dois pacientes apresentavam ausência de metilação do alelo materno. De acordo com Cox e col. (7), ausência de metilação ocorre apenas em 1:300.000 pacientes com SA. Esses dois casos (probabilidade de 1:300.0002) mostram que metilação materna no cromossomo 15 é estabelecida na ou durante a fertilização, e que a ICSI e a cultura de embrião



são processos externos ao corpo. As observações de Young e col. (4) de que a FIV de oócitos ovinos pode resultar em hipometilação do elemento de controle do imprinting do alelo materno Igf2r levaram Cox e col. (7) a concluir que há indícios de que ICSI possa interferir no estabelecimento de imprint materno (comprometimento do ganho de metilação) no oócito ou pré-embrião e aumente o risco de defeitos de imprinting. Ørstavik e col. (41) relataram um terceiro pa-ciente com SA e hipometilação após tratamento com ICSI, reforçando as conclusões de Cox e col. (7).

Estudos epidemiológicosLudwig e col. (42) realizaram um amplo estudo nacional na Alemanha. Os autores contataram todos os membros do Grupo Alemão de Suporte à SA. Setenta e nove questioná-rios válidos foram recebidos de 270 membros. Das 79 crian-ças, 20 haviam nascido de casais com problemas de fertili-dade (25,3%). Na Alemanha, a proporção de crianças nascidas em famílias com problemas de fertilidade de qual-quer tipo é de 5,3% (44). Isso resultou em um RR de 4,8 (95% IC: 3,3–7,0). Concluímos que a incidência de SA acha-se significativamente associada a problemas de fertilidade. Três das 79 crianças com SA haviam nascido após ICSI, e nenhuma após FIV. Ao compararmos isso com a população alemã, assumindo que 0,9% das crianças nasceram após FIV/ICSI no período em questão, chega-se a um RR de 4,1 (95% IC: 1,4–12,4). Concluímos que, na Alemanha, no pe-ríodo anterior a 2005, a SA associou-se de maneira signifi-cativa com TRA. Concluímos também que a incidência de SA encontra-se significativamente associada com proble-mas de fertilidade dos pais.

Ludwig e col. (43) publicaram os dados genéticos de 16 pacientes. Encontraram três pacientes com defeitos de imprinting, dez com deleções e três com defeitos desconhecidos. Os três pacientes com defeitos de imprinting haviam nascido após tempo para engravidar >2 anos, tempo para engravidar >2 anos + tratamentos hormonais, e tempo para engravi-dar >2 anos + tratamentos hormonais + ICSI. Um paciente com SA apresentava ausência de metilação do alelo materno após ICSI, e dois pacientes com SA e sem tratamento de ICSI também apresentavam ausência de metilação do alelo mater-no. A forma rara de SA (ausência de metilação), incidência de 1:300.000, observada por Cox e col. (7) em cada dois pacien-tes concebidos por ICSI, também foi aqui observada em crianças com SA não concebidas por ICSI. Isso parece indicar que a ausência de metilação do alelo materno encontra-se associada com problemas de fertilidade e não com o trata-mento de fertilidade. Esses números são extremamente bai-xos para que se tirem conclusões finais, mas a explicação mais simples e provável é que os pais com problemas de fertilidade têm maior chance de ter um filho com SA do que aqueles sem problemas de fertilidade. Concluiu-se ainda que hiperestimulação ovariana é uma variável positiva e inde-pendentemente associada com SA (43). Mas, mais uma vez, tal conclusão baseia-se em números pequenos.

Sutcliffe e col. (16) enviaram questionários para 384 fa-mílias com crianças com SA, tendo recebido 81 respostas utilizáveis: seis crianças apresentavam SA familiar e 75, SA

esporádica. Três dessas 75 (4%) crianças haviam nascido de famílias com problemas de fertilidade, mas sem o envolvi-mento de FIV ou de ICSI. Supondo que a porcentagem de famílias com problemas de fertilidade e crianças fosse se-melhante àquelas da Alemanha e da Holanda (5,3% e 5,6%, respectivamente), não houve associação entre problemas de fertilidade e SA no Reino Unido.

Em 2007, Doornbos e col. (20) também realizaram um estudo baseado nos resultados de questionários enviados a membros de grupos de apoio à SA. Receberam 63 questioná-rios válidos. Obtiveram resultados semelhantes aos de Lu-dwig e col. (43). Embora nenhuma das 63 crianças tivesse nascido após FIV ou ICSI, houve uma associação significati-va entre problemas de fertilidade dos pais e a incidência de SA (RR 3,4; 95% IC: 1,9–5,4). No grupo de SA, quatro (6,3%) crianças haviam nascido após o uso de alguma forma de TRA. Essa porcentagem foi de 2,1% na população holandesa (RR 3,1; 95% IC: 1,2–7,9), representando uma associação sig-nificativa entre alguma forma de TRA e a incidência de SA.

Hiura e col. (10) relataram os resultados de um estudo epidemiológico sobre doenças que envolvem imprinting ge-nômico e FIV/ICSI. Não encontraram associação entre SA e FIV/ICSI.

Os quatro estudos epidemiológicos discutidos relataram cinco casos de SA nascidos após FIV ou ICSI, num total de 340 casos (10, 16, 20, 42). Considerando-se o número de nascimentos após FIV/ICSI e o número total de nascimentos nos quatro países nos períodos em questão, o RR ponderado foi de 1,7 (95% IC: 0,7–4,2). Concluímos não ter havido nenhuma associação significativa entre SA e tratamentos com FIV ou ICSI.

Sa e tra: ConclusõesConsiderando-se todas as evidências publicadas, concluí-mos ser provável a existência de uma associação positiva entre problemas de fertilidade e a incidência de SA. Como consequência, espera-se uma associação positiva entre FIV/ICSI e SA, mas isso não ficou demonstrado.

O imprinting do centro de imprinting da SA (AS-IC) é estabelecido durante ou após fertilização (7). Supôs-se que devido a isso, o AS-IC seria vulnerável a erros de metilação associados com ICSI ou FIV. Na literatura aqui discutida, houve sete casos de SA com erros de metilação: quatro nas-cidos após tratamento com ICSI e três nascidos após trata-mento hormonal ou em famílias com uma história de pro-blemas de fertilidade. Devido a essas observações e à ausência de associação entre SA e FIV/ICSI, concluímos ser bastante improvável que ICSI ou FIV impeçam a metilação adequada de AS-IC. Estudos que investiguem (micro)dele-ções em enzimas de metilação de genes, tais como o gene DNMT3L, serão muito mais úteis para explicar esses erros de metilação (21). Do ponto de vista clínico, a SA não tem impacto em TRA devido à sua baixa incidência.

SíNdroME dE PradEr-WiLLi E traA SPW é um complexo distúrbio do neurodesenvolvimento resultante de erros no imprinting genômico com ‘perda’ de



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metilação de genes que sofreram imprinting que são paterna-mente expressados na região cromossômica 15q11–q13, a mesma responsável pela SA. A SPW é caracterizada por grave hipotonia e dificuldade de alimentação logo no início da vida, seguida mais tarde, no início da infância, por alimentação excessiva e gradual desenvolvimento de obesidade mórbida. Todos os indivíduos têm o mesmo grau de comprometimento cognitivo. A prevalência mundial é de 1:30.000–10.000. Cer-ca de 70% dos casos de SPW originam-se de deleção “de novo” na região cromossômica paternalmente derivada 15q11–q13. Cerca de 25% dos casos podem ser explicados por dissomia materna do cromossomo 15. Em cerca de 3% dos casos, a SPW pode ser explicada tanto por defeitos de imprinting genômico devidos a microdeleções ou epimutações do centro de imprinting localizado na região 15q11–q13 quanto por translocações ou rearranjos do cromossomo 15 (44, 45).

Há apenas alguns estudos relatando os dados originais sobre a associação entre FIV/ICSI e SPW (10, 12, 16, 20). Todos os estudos concluíram que não havia associação en-tre TRA e SPW.

No período 1982–2001, relatou-se o nascimento de 16.280 crianças após FIV/ICSI na Suécia, e uma delas tinha SPW (12).

Sutcliffe e col. (16) contataram 522 famílias de crianças com SPW, e, das 169 que responderam, seis tinham história de SPW. Duas crianças (1,2%) haviam nascido após ICSI e nenhuma após FIV. Esses números não diferiram daquele da população normal. Sete crianças (4,3%) nasceram após o uso de medicamentos para fertilidade. Os autores indicaram que 2% das crianças no Reino Unido nascem após algum tipo de tratamento para fertilidade. Na população com SPW, 5,5% tinham nascido após tratamento para fertilidade (RR 2,8; 95% IC: 1,02–5,21). Esse número indica a existência de associação entre problemas de fertilidade dos pais e aumen-to na incidência de SPW.

Doornbos e col. (20) conduziram um estudo similar. Re-ceberam respostas de 86 famílias de crianças com SPW. Des-sas famílias, 12 apresentavam algum tipo de problema de fertilidade (RR 2,5; 95% IC: 1,5–4,2, comparado com a popu-lação normal). Não houve associação significativa entre FIV/ICSI e a incidência de SPW (RR 2,5; 95% IC: 0,9–10,0).

Hiura e col. (10) relataram o nascimento de quatro crianças após FIV/ICSI em um grupo de 261 crianças com SPW (1,5%). Essa proporção não diferiu daquela de crianças nascidas após FIV/ICSI na população normal.

SPW e tra: ConclusõesHá maior probabilidade de que crianças com SPW tenham nascido de pais com problema de fertilidade (RR 2,5–2,8); no entanto, não há associação significativa entre SPW e FIV/ICSI. O mesmo paradoxo foi observado no grupo de crianças com SA.

rEtiNoBLaStoMaRetinoblastoma é um câncer originado na retina de um ou ambos os olhos de crianças jovens. Há vários relatos de as-sociação entre FIV/ICSI e retinoblastoma. Moll e col. (46)

estudaram a incidência no período 2000–2002 e calcularam um RR de 4,9 (95% IC: 1,6–11,3) ou 7,2 (95% IC: 2,4–17,0) (4,9 se assumido que 1,5% das crianças na Holanda nasce-ram após FIV/ICSI, e 7,2 se essa porcentagem assumida fosse 1,0%). O mesmo grupo publicou um novo estudo em 2009, no qual a incidência de retinoblastoma foi estudada no pe-ríodo 2002–2007 (47). O RR nesse período foi 1,29 (95% IC: 0,10- 4,66), tendo-se concluído que não houve associação significativa entre FIV/ICSI e retinoblastoma. O resumo de outro estudo informou um RR de 4,5, sem intervalo de con-fiança; não se publicou seguimento desse resultado (48).

O retinoblastoma é herdável, podendo ser causado por duas mutações no gene RB1 ou por hipermetilação do pro-motor do gene RB1. Se o retinoblastoma observado em crianças nascidas de FIV/ICSI for causado por hipermetila-ção desse promotor, não se pode excluir a existência de uma relação entre tratamento de fertilidade e a ocorrência de retinoblastoma. Em 2012, publicou-se um artigo que deli-neava a origem molecular dos tumores. Para todos os tumo-res, duas mutações causadoras no RB1 foram encontradas. Nenhum dos tumores mostrou hipermetilação do promotor de RB1. Isso demonstrou ser altamente improvável a exis-tência de associação entre FIV ou ICSI e retinoblastoma através desse mecanismo epigenômico (49).

diSCuSSãoEstudos alarmantes sobre a associação entre doenças que envolvem imprinting genômico e FIV/ICSI foram publica-dos recentemente. A incidência de SBW foi relatada como até 12 vezes maior em crianças nascidas após FIV/ICSI do que na população normal. Além disso, o nascimento de be-zerros e cordeiros com a síndrome do filhote grande após FIV com gametas tanto bovinos quanto ovinos, e a observa-ção de que isso poderia ser explicado por desmetilação do gene Igf2r, levantou a questão se a cultura in vitro de oóci-tos e embriões poderia causar erros de metilação e doenças que envolvem imprinting genômico.

As doenças que envolvem imprinting genômico são ra-ras, apresentando uma incidência relatada de 1:30.000–10.000. Uma incidência tão baixa quanto 1:392.000 para SSR foi observada no Japão (10), embora tal estudo tenha sido baseado em questionários enviados para os departa-mentos de pediatria com taxas sub-ótimas de reposta. Pode-se esperar que a prevalência relatada no Japão será ajusta-da. No entanto, não foi estabelecido se a prevalência de doenças que envolvem imprinting genômico difere entre os distintos backgrounds humanos étnicos. Uma consequência da raridade de tais doenças é a dificuldade de se realizar estudos com poder suficiente. Pressupondo que no grupo de crianças nascidas após FIV/ICSI a taxa de SBW possa atin-gir 1:2.700 em comparação a 1:14.000 na população nor-mal, grupos de estudo com mais de 45.000 pessoas são ne-cessários para demonstrar uma diferença estatisticamente significativa com um a de 5% e um b de 20%.

Estudos da associação entre TRA e retinoblastoma ilus-tram o problema das doenças que envolvem imprinting genômico e estudos com poder estatístico insuficiente. A as-sociação ‘altamente significativa’ relatada a princípio desa-



pareceu com o tempo à medida que maiores números foram coletados. Subsequentemente, relatou-se que para todos os tumores duas mutações causadoras no RB1 foram encontra-das e nenhum dos tumores mostrou hipermetilação do pro-motor de RB1. À luz desses dados adicionais, concluiu-se ser improvável uma associação entre FIV ou ICSI e retinoblasto-ma através desse mecanismo epigenético (49).

Tendo em mente essas dificuldades, examinamos a existência de uma relação estatística entre a incidência de uma doença que envolve imprinting genômico e tratamen-tos para fertilidade. Se tal relação existe, a possível etiologia deve ser investigada antes que se possa concluir que há uma relação causal entre doenças que envolvem imprinting ge-nômico e TRA. No entanto, como seria altamente anti-ético tentar induzir doenças que envolvem imprinting genômico em estudos experimentais em embriões humanos, será mui-to difícil responder essa questão da causalidade.

Com base na literatura existente, foi possível calcular o RR ponderado para SBW. Incluímos oito estudos: dois em que não se encontrou associação (12, 13) e seis (10, 11, 14, 16, 19, 20) com uma associação positiva. O RR ponderado foi 5,2 (95% IC: 1,6–7,8). Concluímos pela existência de uma associação positiva significativa entre tratamento com FIV/ICSI e risco de SBW.

Quatro estudos epidemiológicos examinaram a relação entre SSR e FIV/ICSI. Dois estudos com baixo poder não encontraram associação, enquanto dois outros incluindo oito crianças com SSR após tratamento com FIV/ICSI rela-taram uma associação positiva significativa (RRs 12,6 [95% IC: 5,0–32,2] [10] e 6,7 [95% IC: 2,3–19,1] [38]). A incidên-cia de SSR não é conhecida. Muitas crianças nascidas pe-quenas para a idade gestacional podem ter alguma forma de SSR. Aprimoramento desse diagnóstico será essencial para se estudar a associação putativa entre SSR e FIV/ICSI.

Não encontramos uma associação positiva entre o risco de SA e FIV/ICSI. Dois estudos encontraram uma associação positiva entre SA e outros tratamentos de fertilidade (20, 42).

Também não encontramos uma associação positiva en-tre a incidência de SPW e FIV/ICSI. No entanto, concluímos que há um risco significativamente maior de uma criança com SA ou SPW ter nascido de pais com problemas de fer-tilidade (16, 20). O aparente paradoxo de aumento dos pro-blemas de fertilidade, mas não do número de tratamentos com FIV/ICSI, pode ser explicado pela raridade das doenças.

Outra dificuldade da investigação sobre a relação esta-tística entre TRA e doenças que envolvem imprinting genô-mico é o grupo de comparação. Em todos os estudos exceto um (20), a população normal foi usada como grupo de com-paração. Casais submetidos a FIV ou ICSI têm problemas de fertilidade, enquanto na população geral a vasta maioria das crianças são concebidas espontaneamente. Uma compa-ração válida entre crianças concebidas através de FIV/ICSI e sujeitos-controle deve considerar problemas de fertilidade nos dois grupos. Ao aplicar tal princípio, a relação estatísti-ca entre doenças que envolvem imprinting genômico e FIV/ICSI desapareceu no estudo mencionado antes. Assim, a maior incidência de doenças que envolvem imprinting ge-nômico após FIV/ICSI pode ser explicada pelo problema de fertilidade dos pais.

Aparentemente, a maior incidência de doenças que en-volvem imprinting genômico em crianças nascidas após tratamento com FIV ou ICSI não é um efeito intrínseco dos tratamentos recebidos, e outras causas devem ser procura-das. Várias publicações relataram erros de metilação em es-permatozoides e oócitos que podiam ser encontrados na prole, explicando SBW ou SSR (21, 26, 36). A ausência de metilação e a presença de padrões de mosaico de metilação em pacientes com SSR podem ser atribuídas a deficiências nas funções da enzima de metilação DNMT3L causadas por microdeleções (21, 36). Isso indicaria que o erro de imprinting não é causado pelo sistema de cultura, mas o sistema in vitro apenas permite a transferência e propagação de genes aberrantemente metilados.

Em conclusão, retinoblastoma, SA e SPW não estão as-sociados com FIV/ICSI, SBW é significativamente associada com FIV/ICSI, e o número de casos de SSR é pequeno, mas uma associação positiva é provável. As incidências de SA e SPW estão positivamente associadas com famílias com pro-blemas de fertilidade, mas não com FIV/ICSI. Esse paradoxo pode ser explicado pelo baixo poder dos estudos devido à raridade das doenças. Não há indicações para uma relação causal entre TRA e doenças que envolvem imprinting genô-mico em seres humanos. Isso não implica que os procedi-mentos de FIV/ICSI não afetem o epigenoma (31). Crianças concebidas durante situações estressantes podem apresentar diferenças na tolerância à glicose e pressão sanguínea. Isso se associa com diferenças pequenas, mas significativas, na metilação de RDMs (5), e pressupõe-se que as diferenças na tolerância à glicose e no peso ao nascimento em crianças nascidas após FIV ou ICSI possam ser explicadas por tais mecanismos. Essas adaptações do epigenoma são reações fisiológicas normais e não doenças (1, 5, 50).

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Bonus TrackPáGINAS DA ASRM

A presença de dano em DNA espemático é mais comum em homens inférteis e pode contribuir para um mau desempenho reprodutivo. Os atuais métodos para avaliar a integridade do DNA espermático, no entanto, não predizem de maneira confiável os desfechos de tratamento e não podem ser recomendados rotineiramente para uso clínico. (Fertil Steril® 2013; n: n - n. ©2013 by American Society for Repro-ductive Medicine.)Ganhe créditos de FMC para este documento em www.asrm.org/elearn

Discussão: Você pode discutir este artigo com seus autores e outros membros da ASRM em http://fertstertforum.com/goldsteinj-clinical-utility-sperm-dna-integrity-testing-guideline/

Utilidade clínica do exame de integridade de DNA espermático: uma diretriz Comitê de Prática da Sociedade Americana de Medicina Reprodutiva

Sociedade Americana de Medicina Reprodutiva, Birmingham, Alabama

a distinção entre homens férteis e inférteis e a predição do des-fecho de procedimentos para

infertilidade são muito necessárias na prática clínica. Os parâmetros da aná-lise convencional do sêmen não predi-zem de maneira confiável a fertilidade masculina nem a gravidez após trata-mento de infertilidade. Portanto, os pesquisadores têm procurado métodos para predizer fertilidade masculina de uma maneira mais útil do ponto de vista clínico.

A fertilização em mamíferos e o subsequente desenvolvimento embrio-nário dependem, em parte, da integri-dade do DNA espermático (1, 2). A maior parte desse DNA existe ligada à protamina em um estado denso e inso-lúvel, mais compacto do que aquele observado no DNA de células somáti-cas (3). Nesse estado compacto, o DNA está protegido de efeitos potencial-mente deletérios que podem ocorrer

durante o transporte do espermatozoi-de. Apenas umas poucas das muitas causas de fragmentação do DNA es-permático foram identificadas, in-cluindo deficiência de protamina (4), estresse oxidativo (5) e falha na repa-ração das rupturas das fitas de DNA (6). A associação entre DNA fragmen-tado e comprometimento do desfecho reprodutivo levou à introdução dos exames de integridade do DNA esper-mático na avaliação clínica da fertili-dade masculina.

Exames de integridade do DNA fo-ram desenvolvidos e aplicados na prá-tica clínica. Os mais comumente es-tudados são o ensaio de estrutura de cromatina espermática (SCSA) (7), a marcação de terminações dUTP pela deoxinucleotidil transferase (ensaio de TUNEL) (8), a eletroforese em gel de uma única célula (ensaio COMET) (9), e o exame de dispersão da cromatina es-permática (SCD) (10). Cada um desses

testes fornece uma estimativa semi-quantitativa do estado geral do DNA, mas não fornece uma indicação das sequências específicas de DNA que possam estar afetadas. Por exemplo, o SCSA usa citometria de fluxo de esper-ma marcado com fluorescência para determinar a proporção de espermato-zoides suscetíveis à fragmentação de DNA (fluorescência vermelha) em comparação com os espermatozoides normais (fluorescência verde). O en-saio de TUNEL usa citometria de fluxo de esperma marcado com fluorescên-cia nas rupturas das fitas de DNA para determinar o grau de fragmentação do DNA onde a intensidade da fluores-cência é proporcional ao número de rupturas das fitas. No ensaio COMET, espermatozoides marcados por fluo-rescência são incluídos em gel de aga-rose, lisados para relaxar o DNA e sub-metidos a eletroforese. A fragmentação de DNA é proporcional ao desloca-mento entre o material nuclear e o ma-terial da cauda. O exame SCD utiliza microscopia de fluorescência para dis-tinguir células com DNA intacto (halo grande) de espermatozoides com dano de DNA (halo pequeno ou ausente).

Inúmeros estudos utilizando as técnicas descritas acima para avalia-

Recebido: 21 de dezembro de 2012; aceito: 21 de dezembro de 2012Reimpressões não estão disponíveis.Correspondência: Practice Committee, American Society for Reproductive Medicine, 1209 Montgomery

Hwy., Birmingham, Alabama 35216 (E-mail: [email protected]).

Fertility and Sterility® Vol. n, No. n, n 2013 0015-0282Copyright ©2013 American Society for Reproductive Medicine, Publicado por Elsevier Inc..http://dx.doi.org/10.1016/j.fertnstert.2012.12.049



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ção da integridade do DNA espermático corroboram a exis-tência de uma associação significativa entre fragmentação de DNA espermático e desfechos de gravidez tanto em seres humanos (11) quanto em espécies não humanas (12). Ho-mens férteis com parâmetros de sêmen normais em geral apresentam altos níveis de integridade de DNA, enquanto homens inférteis, em especial aqueles com parâmetros de sêmen anormais, com frequência apresentam diminuição da integridade de DNA. Além disso, um número significati-vo de homens inférteis apresentará anormalidade de inte-gridade de DNA a despeito de parâmetros de sêmen nor-mais (13, 14, 15). Essa Diretriz do Comitê de Prática foi preparada para avaliar a evidência relacionada à utilidade clínica do exame de integridade de DNA espermático e as áreas-alvo que requerem mais estudo. De maneira ideal, a validação do exame deve determinar estatisticamente valo-res-limite, excluir fatores femininos, e utilizar um número suficiente de pacientes que permita conclusões válidas do ponto de vista estatístico.

MétodoS dE rEviSãoRealizou-se uma busca sistemática da literatura com a se-guinte estratégia: sperm AND (DNA OR chromatin) AND (fragmentation OR damage OR integrity) AND (pregnancy [title/abstract] OR embryo [title/abstract]) AND (Humans [mesh] AND English [language]) (204 citações). A busca fi-cou restrita às citações da MEDLINE publicadas em língua inglesa de 1966 a novembro de 2011. Os estudos eram ele-gíveis se atendessem a um dos seguintes critérios: evidência primária (ensaios clínicos) que avaliasse o potencial prediti-vo usando estatística preditiva, meta-análises e artigos rele-vantes das bibliografias dos artigos identificados.

A qualidade da evidência foi avaliada como se segue:

Nível l: Evidência obtida de pelo menos um ensaio con-trolado randomizado e propriamente desenhado.

Nível ll-1: Evidência obtida de ensaios controlados bem desenhados, mas não randomizados.

Nível ll-2: Evidência obtida de coortes ou estudos de caso-controle bem desenhados, preferencialmente originários de mais de um centro ou grupo de pes-quisa.

Nível ll-3: Evidência obtida de múltiplas séries tempo-rais com ou sem a intervenção. Resultados surpre-endentes de ensaios não controlados também po-dem ser considerados como esse tipo de evidência.

Nível lll: Opiniões de autoridades respeitadas, baseadas em experiência clínica, estudos descritivos ou rela-tos de comitês de especialistas.

A força da evidência foi avaliada como se segue:

Nível A: Há boa evidência para dar suporte às recomen-dações, tanto a favor quanto contra.

Nível B: Há razoável evidência para dar suporte às re-comendações, tanto a favor quanto contra.

Nível C: Não há suficiente evidência para dar suporte a uma recomendação, tanto a favor quanto contra.

avaLiação da EvidÊNCia Para EXaMES diaGNóStiCoS E PrEditivoSRequisitos dos exames:

• Os exames devem ser comparados a um desfecho padrão-ouro universalmente aceito, nesse caso, gravidez clínica.

• A população estudada deve ser tal que o exame possa ser aplicado na prática clínica, nesse caso, infertilidade mas-culina.

• O exame deve ser passível de replicação precisa em labo-ratório.

• Valores-limite ótimos devem ser determinados conside-rando-se as características do exame e otimizando-se sensibilidade e especificidade através de curvas receiver operator characteristic (ROC).

• Na interpretação de exames, as razões de verossimilhan-ça (LRs) são muito úteis, pois indicam quanto um dado exame vai aumentar ou reduzir a probabilidade pré-teste de um certo distúrbio.

• Diferentemente dos valores preditivos, as LRs são calcu-ladas a partir de sensibilidade (sens) e especificidade (es-pec) e não variam com a prevalência da doença.

• Razão de verossimilhança positiva (LR+) = razão verda-deiro-positivo/falso-positivo (sens/1−espec).

• Razão de verossimilhança negativa (LR−) = razão verda-deiro-negativo/falso-negativo (1−sens/espec).

As LRs de 5-10 e 0,1-0,2 criam alterações moderadas nas probabilidades pré-teste e pós-teste e podem ser importantes.

avaLiação da LitEratura SoBrE o EXaME dE iNtEGridadE dE dNa ESPErMátiCo Uma busca abrangente da literatura identificou 74 citações elegíveis para uma revisão completa. Artigos de revisão fo-ram excluídos, e meta-análises incluídas na revisão. Vinte estudos usaram o ensaio de TUNEL para avaliar a integridade de DNA, enquanto 28 empregaram o SCSA. O ensaio COMET foi usado em 9 artigos, enquanto o SCD foi usado em 5. En-saios usados menos comumente foram avaliados em 5 ou menos publicações. Não existem estudos Nível l, como seria de se esperar para um teste clínico diagnóstico preditivo. Além disso, há poucos estudos prospectivos de alta qualidade recrutando pacientes consecutivos e validando pontos de corte previamente estabelecidos com desfechos padrão-ouro para fertilidade. A maioria dos estudos apresenta evidência Nível ll-2 ou menor e encontra-se prejudicada pelos seguin-tes fatores: pequeno tamanho da amostra; recrutamento não consecutivo dos pacientes; populações variáveis de pacien-tes; falta de controle para fatores femininos (particularmente idade); fraca metodologia estatística para calcular valores-li-mite e capacidade preditiva dos testes; e uso de vários dife-rentes métodos para avaliar fragmentação de DNA.

aSSoCiação dE iNtEGridadE dE dNa ESPErMátiCo CoM dESFECHoS rEProdutivoSPara que um teste diagnóstico seja útil do ponto de vista clínico, os resultados devem ser reproduzíveis, aplicáveis a

PáGINAS DA ASRM


Bonus Track Bonus Track

um certo paciente e mudar a conduta com um certo pacien-te. Para que os testes de integridade de DNA sejam clinica-mente importantes, deve haver uma associação de fragmen-tação de DNA espermático com desfechos reprodutivos. Realizou-se uma revisão da literatura para responder as se-guintes perguntas:

Perguntas específicaso exame de integridade de dNa prediz fertilidade masculina com concepção natural? Alguns estudos ava-liaram o tempo para gravidez (14) e o potencial de fertilida-de de doadores de esperma (16) enquanto outros compara-ram a fragmentação de DNA entre homens férteis e inférteis (7, 17, 18, 19). No geral, com base nesses estudos, há uma associação entre aumento da fragmentação de DNA e redu-zida fertilidade em homens. No entanto, o número de estu-dos é limitado e os disponíveis apresentam evidência Nível ll-2 e Nível III. O valor preditivo desses exames depende da prevalência de testes anormais em uma população, sendo que ainda não se estabeleceu a população apropriada para a testagem. Concluindo, há evidência razoável (Nível B) de que o aumento da fragmentação de DNA esteja associado com redução da fertilidade; no entanto, não há evidência suficiente (Nível C) para que se use o teste para predizer fertilidade, pois os pontos de corte não foram claramente estabelecidos e validados.o exame de integridade de dNa prediz gravidez com inseminação intrauterina (iiu)? Vários estudos analisa-ram o exame SCD (20), o ensaio SCSA (17, 21, 22) e o ensaio de TUNEL (23) em conjunto com IIU. Um estudo Nível II-1

(22) mostrou um valor preditivo positivo do ensaio SCSA com índice de fragmentação de DNA (IFD) > 30% associado com mais baixa taxa de gravidez e parto. No entanto, outros estudos não confirmaram o ponto de corte para IIU e outro estudo não encontrou associação de integridade de DNA e gravidez com IIU. Concluindo, não há evidência suficiente (Nível C) para se recomendar o uso de exames de integrida-de de DNA para predição de gravidez com IIU.a identificação da fragmentação do dNa prediz gra-videz com fertilização in vitro (Fiv)? Realizou-se uma revisão estatística extensa dos estudos que analisam o efeito da fragmentação de DNA na gravidez com FIV (Tabela 1) (22, 24-40). Uma meta-análise (41) mostrou que a fragmen-tação de DNA estava associada com uma modesta, porém significativa, redução nas taxas de gravidez com FIV (OR 1,7 [IC: 1,3–2,23], mediana de VPP 77%, mediana de VPN 34%). Uma maior fragmentação de DNA encontra-se leve-mente associada com sucesso de FIV em geral; no entanto, a capacidade preditiva dos testes específicos é baixa e não foi validada. Três estudos com alto LR+ (>5) incluíram ape-nas um limitado número de indivíduos, não tinham grupos-controle e não validaram os valores-limite para o teste (29, 30, 38). Concluindo, não há evidência suficiente (Nível C) para se recomendar o uso rotineiro de exames de integrida-de de DNA para pacientes submetidos a FIV.a identificação da fragmentação do dNa prediz gravi-dez com Fiv e injeção intracitoplasmática de esperma-tozoide (iCSi)? Realizou-se uma extensa revisão estatística dos estudos que testam o efeito da fragmentação de DNA em pacientes submetidos a FIV/ICSI (Tabela 2) (22, 24, 25, 27-36, 38, 40, 42-44). Dois estudos com alto LR+ (>5) incluíram

TABELA 1

valor preditivo do exame de integridade de dNa espermático para gravidez com Fiv (22, 24-40).

referência Exame Sens Espec Lr+ Lr− or 95% iC

Boe-Hansen e col., 2006 SCSA 0,06 0,97 2,00 0,97 2,04 0,38–11,0

Borini e col., 2006 TUNEL 0,17 0,89 1,55 0,93 1,57 0,38–6,51

Bungum e col., 2007 SCSA 0,17 0,85 1,13 0,98 1,24 0,69–2,26

Check e col., 2005 SCSA 0,30 0,83 1,76 0,84 1,90 0,61–5,89

Host e col., 2000 TUNEL 0,34 0,80 1,70 0,83 1,91 0,93–3,91

Huang e col., 2005 TUNEL 0,22 0,83 1,29 0,94 1,30 0,66–2,56

Larson e col., 2000 SCSA 0,58 0,94 9,67 0,45 10,17 1,77–58,4

Larson-Cook e col., 2003 SCSA 0,17 0,98 8,50 0,85 5,08 1,24–20,8

Payne e col., 2005 SCSA 0,16 0,71 0,55 1,18 0,44 0,15–1,27

Seli e col., 2004 TUNEL 0,46 0,61 1,18 0,89 1,32 0,43–4,1

Virro e col., 2004 SCSA 0,35 0,81 1,84 0,80 2,27 1,3–3,96

Henkel e col., 2003 TUNEL 0,35 0,81 1,84 0,80 2,24 1,09–4,58

Lin e col., 2008 SCSA 0,15 0,83 0,88 1,02 0,88 0,35–2,19

Benchaib e col., 2007 TUNEL 0,07 0,86 0,50 1,08 0,46 0,11–2,0

Frydman e col., 2008 TUNEL 0,58 0,68 1,81 0,62 2,97 1,39–6,32

Tarozzi e col., 2009 CMA 0,22 0,97 7,33 0,80 10,86 0,62–191,5

Simon e col., 2011 COMET 0,95 0,80 4,75 0,06 76,00 8,69–1,714,44

Simon e col., 2010 COMET 0,82 0,50 1,64 0,36 4,50 1,79–11,92Observação: Sens = sensibilidade; Espec = especificidade; LR+ = verossimilhança positiva; LR− = verossimilhança negativa; OR = razão de chance; IC = intervalo de confiança; SCSA = teste de estrutura da cromatina espermática; TUNEL = marcação de terminações dUTP pela deoxinucleotidil transferase; CMA = cromomicina A3; COMET = eletroforese em gel de uma única célula.

Comitê de Prática. Exame de integridade de DNA espermátic. Fertil Steril 2013.



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apenas um número limitado de indivíduos, não tinham gru-pos-controle e não validaram os valores-limite para o teste (30, 31). Uma meta-análise (11) concluiu que a fragmentação de DNA espermático achava-se significativamente associada com gravidez em ciclos de FIV/ICSI (OR 1,44 [IC: 1,03–2,03]). No entanto, a associação era discreta e a capacidade prediti-va dos exames de integridade de DNA era fraca (LR+ = 1,23, LR− = 0,81). Ainda, pontos de corte do exame não foram claramente estabelecidos. Em uma meta-análise mais recente (41), as taxas de gravidez mostraram-se independentes dos resultados do exame de integridade de DNA (OR 1,15 [IC: 0,9–1,55]). A análise revelou uma diferença de 11% nas taxas de gravidez entre os dois grupos. Com base nesses re-sultados, os autores sugerem que casais em que o parceiro masculino tenha altos níveis de fragmentação de DNA esper-mático prossigam diretamente para FIV/ICSI. Entretanto, a melhor evidência para essa recomendação deveria originar-se de um estudo randomizado controlado, onde o desfecho de interesse é a taxa de nascimento. A fragmentação de DNA não está significativamente associada com sucesso de FIV/ICSI global. Concluindo, não há evidência suficiente (Ní-vel C) para se recomendar o uso rotineiro do exame de inte-gridade de DNA para pacientes submetidos a FIV/ICSI.a identificação da fragmentação do dNa prediz per-da de gravidez? Alguns poucos estudos examinaram a associação entre fragmentação de DNA e perda de gravidez. Uma meta-análise (45) encontrou uma associação significa-tiva entre fragmentação de DNA e perda de gravidez após FIV ou ICSI (OR 2,48 [IC: 1,52–4,04]). Entretanto, não há evidência suficiente (Nível C) para se recomendar o uso ro-tineiro do exame de integridade de DNA para predição de perda de gravidez.

rESuMo• Os dados existentes não confirmam uma relação consis-

tente entre anormalidade da integridade de DNA e desfe-chos reprodutivos.

• No momento, os resultados do exame de integridade de DNA espermático isoladamente não predizem taxas de gravidez alcançada através de concepção natural ou atra-vés de IIU, FIV ou ICSI. No entanto, pesquisa adicional pode levar à validação da utilidade clínica desse exame.

rECoMENdaçãoNão há evidência suficiente (Nível C) para se recomendar o uso rotineiro do exame de integridade de DNA espermático na avaliação e tratamento do casal infértil (Nível C).

Agradecimentos. Esse relatório foi desenvolvido sob a direção do Comitê de Prática da Sociedade Americana de Medicina Reprodutiva (ASRM) como um serviço para seus membros e outros clínicos. Embora este documento reflita um manejo apropriado de um problema encontrado na prá-tica da medicina reprodutiva, não se pretendeu que fosse o único padrão aprovado da prática ou que ditasse um curso exclusivo de tratamento. Outros planos de conduta podem ser apropriados, considerando as necessidades de um pa-ciente individual, recursos disponíveis e limitações institu-cionais ou da prática clínica. O Comitê de Prática e o Con-selho de Diretores da ASRM aprovaram este relatório.

Este documento foi revisado pelos membros da ASRM, sendo suas contribuições consideradas na preparação do documento final. Os seguintes membros do Comitê de Prá-tica da ASRM participaram do desenvolvimento deste docu-

TABELA 2

valor preditivo do exame de integridade de dNa espermático para pacientes submetidos a Fiv/iCSi (22, 24, 25, 27-36, 38, 40, 42-44).

referência Exame Sens Espec Lr+ Lr− or 95% iC

Boe-Hansen e col., 2006 SCSA 0,36 0,57 0,84 1,12 0,76 0,21–2,73

Borini e col., 2006 TUNEL 0,71 0,75 2,84 0,39 6,55 1,77–24,3

Bungum e col., 2007 SCSA 0,30 0,63 0,81 1,11 0,74 0,42–1,31

Host e col., 2000 TUNEL 0,58 0,38 0,94 1,11 0,84 0,29–2,43

Gandini e col., 2004 SCSA 0,38 0,44 0,68 1,41 0,52 0,10–2,74

Huang e col., 2005 TUNEL 0,64 0,50 1,28 0,72 1,78 0,76–4,16

Zini e col., 2005 SCSA 0,17 0,81 0,89 1,02 0,87 0,24–3,19

Larson e col., 2000 SCSA 0,58 0,94 9,67 0,45 10,17 1,77–58,4

Larson-Cook e col., 2003 SCSA 0,17 0,98 8,50 0,85 5,08 1,24–20,8

Payne e col., 2005 SCSA 0,16 0,71 0,55 1,18 0,44 0,15–1,27

Seli e col., 2004 TUNEL 0,46 0,61 1,18 0,89 1,32 0,43–4,1

Virro e col., 2004 SCSA 0,35 0,81 1,84 0,80 2,27 1,3–3,96

Henkel e col., 2003 TUNEL 0,68 0,63 1,84 0,51 3,67 1,12–12

Lin e col., 2008 SCSA 0,26 0,77 1,13 0,96 1,21 0,45–3,23

Benchaib e col., 2007 TUNEL 0,19 0,87 1,46 0,93 1,55 0,70–3,41

Micinski e col., 2009 SCSA 0,40 0,85 2,67 0,71 3,73 0,74–18,77

Tarozzi e col., 2009 CMA 0,49 0,27 0,67 1,89 0,34 0,09–1,29

Simon e col., 2010 COMET 0,47 0,55 1,04 0,96 1,97 0,81–4,77Observação: Sens = sensibilidade; Espec = especificidade; LR+ = verossimilhança positiva; LR− = verossimilhança negativa; OR = razão de chance; IC = intervalo de confiança; SCSA = teste de estrutura da cromatina espermática; TUNEL = marcação de terminações dUTP pela deoxinucleotidil transferase; CMA = cromomicina A3; COMET = eletroforese em gel de uma única célula.

Comitê de Prática. Exame de integridade de DNA espermátic. Fertil Steril 2013.

PáGINAS DA ASRM


Bonus Track

mento. Todos os membros do comitê informaram relações comerciais e financeiras com fabricantes e distribuidores de bens e serviços usados para tratar pacientes. Os membros do comitê que tinham conflitos de interesse com base na rela-ção informada não participaram da discussão nem do de-senvolvimento deste documento.

Samantha Pfeifer, médica; Jeffrey Goldberg, médico; Roger Lobo, médico; Michael Thomas, médico; Margareta Pisarska, médica; Eric Widra, médico; Mark Licht, médico; Jay Sandlow, médico; John Collins, médico; Marcelle Ce-dars, médica; Mitchell Rosen, médico; Michael Vernon, mé-dico; Owen Davis, médico; Daniel Dumesic, médico; Clarisa Gracia, médica, M.S.C.E.; William Catherino, médico, Ph.D.; Randall Odem, médico; Kim Thornton, médico; Robert Re-bar, médico; Andrew La Barbera, Ph.D.

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59

Bonus Track ARTIGO ORIGINAL: AMBIENTE E EPIDEMIOLOGIA

a relação entre infertilidade e medicamentos associados e o risco de câncer tem despertado

interesse. Embora estudos iniciais te-nham sugerido um grande aumento no risco ovariano relacionado com os medicamentos para fertilidade (1, 2),

tal relação não foi confirmada pelos estudos subsequentes (3). A possibili-dade de haver menores riscos resi-duais, em particular entre subgrupos de usuários, como nuligestas ou nulí-paras (2, 4, 5, 6, 7), ainda é uma ques-tão em aberto. Algumas das dificulda-

des para esclarecer os efeitos de medicamentos para fertilidade podem refletir sua alta correlação com muitos outros parâmetros que afetam o risco de câncer, incluindo causas de inferti-lidade e a capacidade de conceber e dar à luz.

Considerando que a primeira criança resultante de fertilização in vitro (FIV) nasceu em 1979, dispõe-se ainda de pouco tempo para a avalia-ção do risco de câncer em uma coorte de mulheres com idade suficiente para apresentar risco de desenvolver cân-cer. Portanto, o número de estudos epidemiológicos que avaliam os efei-

Fertilização in vitro e risco de câncer de mama e ginecológico: estudo retrospectivo de coorte de ‘Israeli Maccabi Healthcare services’Louise A. Brinton, Ph.D.,a Britton Trabert, Ph.D.,a Varda Shalev, M.D.,b,c Eitan Lunenfeld, M.D., M.H.A.,d

Tal Sella, M.D.,b,d e Gabriel Chodick, Ph.D.b,d

a Seção de Epidemiologia Hormonal e Reprodutiva, Divisão de Epidemiologia e Genética do Câncer, Instituto Nacional do Câncer, Rockville, Maryland, Estados Unidos; b Unidade de Epidemiologia e Pesquisa de Banco de Dados, Maccabi Healthcare Services, Tel Aviv, Israel; c Escola de Saúde Pública, Faculdade de Medicina Sackler, Universidade de Tel Aviv, Tel Aviv, Israel; d Unidade de FIV e Fertilidade, Departamento de Obstetrícia, Soroka Medical Center e Faculdade de Ciências da Saúde, Ben Gurion University of the Negev, Beer Sheva, Israel

Recebido: 15 de outubro de 2012; revisado: 29 de novembro de 2012; aceito: 18 de dezembro de 2012

L.A.B. nega conflito de interesse. B.T. nega conflito de interesse. V.S. nega conflito de interesse. E.L. nega conflito de interesse. T.S. nega conflito de interesse. G.C. nega conflito de interesse.

Parcialmente patrocinado pelo Programa de Pesquisa Intramural dos National Institutes of Health.Solicitação de reimpressões: Louise A. Brinton, Ph.D., National Cancer Institute, 6120 Executive

Blvd., Rockville, Maryland 20852.

Fertility and Sterility® Vol. n, No. n, n 2013 0015-0282Copyright ©2013 American Society for Reproductive Medicine, Publicado por Elsevier Inc..http://dx.doi.org/10.1016/j.fertnstert.2012.12.029

Objetivo: Avaliar os riscos em longo prazo de câncer associado com fertilização in vitro (FIV).Desenho: Método de recordlinkage.Cenário: Organização de atenção gerenciada em saúde em Israel.Pacientes: Um total de 87.403 pacientes femininas avaliadas e/ou tratadas para infertilidade em ou após 25 de setembro de 1994 foram acompa-nhadas para o desenvolvimento de câncer até 22 de junho de 2011, tendo os seguintes tipos sido identificados: mama, 522; endometrial, 41; ova-riano, 45; cervical in situ, 311; e cervical invasivo, 32.Intervenção: Nenhuma.Desfecho principal: Razões de chance (HRs) para tipos específicos de câncer.Resultado: Não encontramos relações significativas entre exposições a FIV e os riscos de câncer de mama, endometrial ou ovariano. No entanto, ao comparar com pacientes não submetidas a tratamento de fertilidade, a HR para câncer ovariano associado com FIV foi de 1,58 (95% intervalo de confiança [IC]: 0,75–3,29), sendo o risco maior entre aquelas que receberam quatro ou mais ciclos (HR 1,78; 95% IC: 0,76–4,13). Houve também um risco não significativamente elevado de câncer endometrial entre pacientes que receberam um a três ciclos de FIV (HR 1,94; 95% IC: 0,73–5,12), mas ciclos adicionais foram associados com menor risco. Em contraste, o risco de câncer cervical in situ foi significativamente reduzido e o câncer cervical invasivo não significativamente reduzido entre pacientes submetidas a FIV assim como a ou-tros tratamentos de fertilidade.Conclusão: Nossos resultados sobre os efeitos em longo prazo foram bastante tranquilizadores, mas pacientes submetidas a FIV devem continuar a ser monitoradas, uma vez que tais procedimentos en-volvem potentes estimuladores da ovulação e repetidas punções ovarianas. (Fertil Steril® 2013; n: n - n. ©2013 by American Society for Reproductive Medicine.)Palavras-chave: Fertilização in vitro (FIV); câncer; risco

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BONUs TRACk

ARTIGO ORIGINAL: AMBIENTE E EPIDEMIOLOGIA



tos dos medicamentos para fertilidade usados junto com FIV é relativamente limitado, estando a vasta maioria focada nos medicamentos da era pré-FIV. Esses estudos iniciais avaliaram principalmente os efeitos relacionados ao citrato de clomifeno, enquanto os avanços mais recentes envolve-ram exposição a gonadotrofinas, análogos de GnRH (ago-nistas ou antagonistas) e suplementação com progesterona.

Além da informação imprecisa sobre o uso de correlatos de medicamentos que pudessem afetar o risco de câncer de maneira independente, muitos dos estudos iniciais foram baseados nos relatos de pacientes sobre exposição a medi-camentos. Para obter informação detalhada sobre tal expo-sição, realizamos uma investigação em uma grande organi-zação de atenção gerenciada em saúde (HMO, sigla em inglês) em Israel que havia documentado tratamentos para fertilidade. Israel se constitui em um cenário único para o estudo dos efeitos da FIV, pois suas mulheres têm direito garantido por lei a tratamento quase grátis para concepção e parto de seus primeiros dois filhos. Na HMO onde identi-ficamos os sujeitos de estudo, uma grande proporção (87%) tinha comprado seguro complementar para cobrir tratamen-tos para a concepção de um terceiro e quarto filho. Portan-to, foi possível avaliar o risco de câncer entre algumas mu-lheres que haviam sofrido exposição pesada a FIV, e simultaneamente controlar para outros importantes fatores preditivos de risco de câncer.

MétodoSEstudo de coorteO presente estudo retrospectivo de coorte foi realizado em Maccabi Healthcare Services (MHS), uma HMO com 2 mi-lhões de inscritos e que fornece serviços de saúde para 25% de toda a população de Israel. De acordo com a Lei Nacional de Saúde de Israel, MHS não pode recusar candidatos por nenhum motivo, incluindo idade ou estado de saúde. Portan-to, todas as subpopulações israelenses encontram-se repre-sentadas entre os membros de MHS. Além disso, seus pacien-tes têm uma distribuição de idade similar àquela da população geral. As atividades de MHS envolvem 2.700 médicos inde-pendentes e assalariados, 250 centros de diagnóstico e 600 farmácias. Além disso, MHS tem vários hospitais contratados.

A central de informação de MHS mantém um registro histórico completo dos pacientes com dados demográficos e dos médicos, resultados de laboratório e arquivo de prescri-ções, usando o número de identificação nacional único dos pacientes. Tal central inclui todas as mulheres adultas filia-das a MHS que receberam um diagnóstico de dificuldade de concepção e que se submeteram a tratamentos para fertili-dade em hospital ou clínicas comunitárias, ou compraram medicamentos para problemas de fertilidade.

determinação dos casos de câncerApós liberação apropriada pelo Conselho de Revisão Insti-tucional, a nossa população de estudo foi conectada ao Re-gistro de Câncer de Israel (RCI), que foi estabelecido em 1960 e coleta continuamente informação sobre os diagnós-ticos de câncer em todas as instituições médicas do país.

Desde 1981, a notificação para o RCI sobre todos os casos incidentes de câncer é obrigatória. A cobertura para tumo-res sólidos no registro é >90%, considerando-se todo o país (8). Todos os casos de câncer são classificados de acordo com a Classificação Internacional de Doenças e inclui acha-dos histológicos. Além dos dados do RCI, também examina-mos os prontuários médicos de MHS de cada participante do estudo para garantir que a informação sobre diagnósticos de tumores malignos fosse completa.

informação sobre exposiçãoDos prontuários médicos eletrônicos das pacientes, tenta-mos obter os dados demográficos (data de nascimento, dis-trito de residência, área de enumeração), os potenciais fato-res de risco para câncer (status de paridade por ocasião de entrada na coorte, status de paridade por ocasião de saída da coorte, número de filhos quando da saída, peso, altura, cigarros já fumados e indicação de infertilidade) e os trata-mentos para fertilidade realizados. O nível socioeconômico foi categorizado de acordo com o índice de pobreza da área de enumeração da paciente, como definido no censo nacio-nal de 1995 (9) baseado em vários parâmetros, incluindo renda domiciliar, qualificações educacionais, aglomeração, condições materiais e propriedade de carro. A partir da in-formação sobre peso e altura, calculou-se o índice de massa corporal (IMC), definido como peso (kg)/altura(m)2, sendo as participantes categorizadas como se segue: abaixo do peso (IMC <18,5 kg/m2); com peso normal (18,5–24,9 kg/m2); com sobrepeso (25–29,9 kg/m2); e obesa (≥ 30 kg/m2).

A infertilidade foi classificada em seis categorias não mutuamente excludentes: 1) infertilidade masculina; 2) au-sência de ovulação; 3) causas mecânicas; 4) síndrome do ovário policístico (SOP); 5) endometriose; e 6) problemas do eixo hipoitalâmico-hipotálamo. A infertilidade masculina foi definida por diagnósticos no prontuário médico eletrôni-co da mulher ou um dos seguintes diagnósticos no prontuá-rio médico eletrônico do marido: azoospermia; infertilidade devido a aplasia de célula germinativa; interrupção comple-ta da espermatogênese; oligozoospermia; infertilidade devi-do a descamação de célula germinativa; hipoespermatogêne-se; interrupção incompleta da espermatogênese; infertilidade devido a causas extratesticulares; infertilidade devido a tera-pia medicamentosa; infecção; obstrução dos ductos deferen-tes; radiação; doença sistêmica; infertilidade masculina não especificada; e oligoastenoteratozoospermia. Infertilidade mecânica incluiu problemas mecânicos, como tubos ocluí-dos ou um diagnóstico relacionado (adesões, fibroides, póli-pos, ou anormalidade uterina). Na ausência de informação que permitisse a consideração de outros critérios, a SOP foi definida por um diagnóstico ou indicação de relação LH/FSH ≥2,5 e máximo E2 testado <250 pg/mL.

Informação sobre a possibilidade de exposição da pa-ciente a tratamento para fertilidade foi classificada confor-me a paciente já houvesse sido exposta a tratamento de FIV (mesmo que incluindo apenas exposição hormonal sem re-sultar em recuperação de oócito), número de ciclos de FIV e sua exposição a citrato de clomifeno, análogos de GnRH ou progestágenos.



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População analisadaA partir da central de informação de MHS, montamos uma coorte de 87.418 pacientes femininas que receberam trata-mento para problemas de fertilidade ou foram registradas como tal em ou após 25 de setembro de 1994. Consideramos inelegíveis para o estudo seis pacientes que saíram antes ou no mesmo dia da entrada (uma devido a morte) e nove diag-nosticadas com câncer antes da entrada na coorte, resultan-do em 87.403 sujeitos de estudo elegíveis. Até 22 de junho de 2011, identificamos um total de 1.509 casos de câncer incidente primário.

análise estatísticaIniciamos o acompanhamento na data do primeiro trata-mento ou, para as pacientes não tratadas, da primeira ava-liação para infertilidade e mantivemos o acompanhamento até a morte, data de saída de MHS, data do diagnóstico de câncer primário, ou 23 de junho de 2011, o que ocorresse primeiro. Usamos a regressão de riscos proporcionais de Cox (10), com os anos de acompanhamento como escala de tempo e com uma completa enumeração da presença nos dois bancos de dados, para estimar as razões de chance (HRs) e intervalos de confiança (ICs) a 95% do desenvolvi-mento de câncer em mulheres expostas a certos fatores (como FIV) em comparação às não expostas. Para avaliar a possibilidade de riscos residuais de câncer em subgrupos de usuárias de FIV, como nulíparas, as análises foram estratifi-cadas de acordo com a exposição a valores de P, sendo to-das as comparações bilaterais, e um alfa <0,05 indicou sig-nificado estatístico. O programa estatístico SAS, versão 9.1.3, foi usado para todas as análises.

rESuLtadoSAs pacientes elegíveis ao estudo contribuíram com 704.241 pessoas-anos de acompanhamento (média de 8,1 anos de acompanhamento, DP de 3,8). Na entrada da coorte, a idade média das pacientes foi de 31,1 anos (DP 6,4), enquanto na ocasião do diagnóstico de câncer foi de 38,9 anos (DP 7,0).

Algum tipo de tratamento para fertilidade foi observa-do em 77,4% das pacientes (Tabela 1). As pacientes tratadas apresentavam maior probabilidade de serem nulíparas do que as não tratadas por ocasião da entrada na coorte, en-quanto na saída da coorte, elas tinham mais probabilidade de terem dado à luz. As pacientes tratadas também apresen-tavam maior probabilidade de terem múltiplos filhos. A des-peito da razoável falta de informação sobre IMC, as pacien-tes tratadas pareceram mais pesadas do que as não tratadas. Não houve diferenças substanciais entre pacientes tratadas e não tratadas com relação a distrito de residência, nível socioeconômico, ou cigarros fumados. Embora a informa-ção sobre indicações de infertilidade não estivesse disponí-vel para a grande maioria das pacientes, naquelas em que estava, as indicações mais comuns foram fatores masculi-nos e problemas anovulatórios, como previamente docu-mentado (11).

Registraram-se os seguintes números de câncer de mama e ginecológico: mama, 522; endometrial, 41; ovaria-

no, 45; cervical in situ, 311; e cervical invasivo, 32. Os fato-res de risco identificados para câncer de mama e ginecoló-gico em geral foram semelhantes aos encontrados em outros estudos epidemiológicos. Por exemplo, descobrimos que IMC mais alto é preditivo de câncer endometrial (HR 2,52; 95% IC: 1,14–5,60, para obeso vs. normal), que paridade está inversamente associada com risco de câncer ovariano e endometrial (HR 0,39; 95% IC: 0,19–0,80; e HR 0,29; 95% IC: 0,14–0,59; respectivamente) e que o hábito de fumar cigarro está diretamente associado com câncer cervical in-vasivo (HR 2,06; 95% IC: 0,90–4,72). Como resultado dessas relações, ajustamos as análises subsequentes para os efeitos de idade na entrada na coorte (contínua), IMC, paridade na saída da coorte, hábito de fumar cigarro e nível socioeconô-mico (categorização dessas variáveis na Tabela 1).

As análises iniciais focaram na relação do risco com diferentes tipos de tratamento de fertilidade, incluindo qualquer tratamento, FIV (e número de ciclos de FIV) e ex-posição a análogos de GnRH, clomifeno e progestágenos. A despeito da forte correlação entre FIV e análogos de GnRH (correlação de Pearson: 0,82), a com outros medicamentos foi relativamente fraca (0,29 para clomifeno e 0,40 para progestágenos).

Não houve alteração no risco de câncer de mama entre pacientes submetidas a tratamento de fertilidade e aquelas que não receberam nenhum tratamento (HR 0,87; 95% IC: 0,71–1,06). Além disso, exposições mais específicas não se relacionaram com o risco, incluindo FIV (HR 0,90; 95% IC: 0,71–1,15), análogos de GnRH (HR 0,82; 95% IC: 0,64–1,05) e clomifeno (HR 0,87; 95% IC: 0,71–1,08; Tabela 2). No en-tanto, uma redução significativa no risco foi vista nas expo-sições a progestágenos (HR 0,80; 95% IC: 0,65–0,99).

Nenhum tratamento de infertilidade se associou com risco de câncer endometrial (HR 1,25; 95% IC: 0,55–2,84). Observou-se risco não significativamente elevado para aquelas submetidas a um a três ciclos de FIV (HR 1,94; 95% IC: 0,73–5,12), mas ciclos adicionais associaram-se a menos risco, embora isso tenha sido baseado em pequeno número de pacientes. Não houve relação substancial do risco de câncer endometrial com exposição a análogos de GnRH (HR 1,39; 95% IC:0,54–3,55), clomifeno (HR 1,01; 95% IC:0,42–2,42), ou progestágeno (HR 1,24; 95% IC: 0,53–2,87).

Exposição a qualquer tratamento de fertilidade não se relacionou a risco de câncer ovariano (HR 0,90; 95% IC: 0,45–1,79), assim como a maioria dos tratamentos indivi-duais, incluindo análogos de GnRH (HR 0,93; 95% IC: 0,40–2,16), clomifeno (HR 0,75; 95% IC: 0,36–1,58) e progestáge-nos (HR 0,77; 95% IC: 0,37–1,60). Comparando com pacientes sem tratamento de fertilidade, a HR associada com FIV foi 1,58 (95% IC: 0,75–3,29); o risco foi maior para as pacientes submetidas a pelo menos quatro ciclos de FIV (HR 1,78; 95% IC: 0,76–4,13) do que para aquelas submeti-das de um a três ciclos de FIV (HR 1,40; 95% IC: 0,59–3,32), embora o valor de P para a tendência não tenha sido signi-ficativo (P=0,18).

Ao contrário dos outros tipos de câncer, o risco do car-cinoma cervical in situ mostrou-se significativamente dimi-nuído em pacientes expostas a qualquer tratamento de fer-tilidade (HR 0,48; 95% IC: 0,38–0,61) ou FIV (HR 0,41; 95%




IC: 0,29–0,56), embora não se tenha observado qualquer diminuição no risco com o aumento do número de ciclos de FIV. De maneira similar, exposição ao clomifeno ou proges-tágenos associou-se com significante redução de risco. Uma redução não significativa no risco associado com o trata-mento de fertilidade foi também observada para o câncer cervical invasivo (HR 0,57; 95% IC: 0,27–1,19). A maioria

das exposições individuais também mostrou riscos reduzi-dos, embora não tenha havido redução no risco de pacientes que receberam pelo menos quatro ciclos de FIV (HR 1,09; 95% IC: 0,40–2,96).

Examinamos ainda os riscos de acordo com a paridade das pacientes (nulíparas ou multíparas) por ocasião da saída da coorte (Tabela 3). Ainda que tendo por base números

TABELA 1

Características da coorte do estudo relacionadas a dados demográficos e outros potenciais fatores de risco para câncer.

tratamento de infertilidade

toda a coorte (n = 87.403) Sim (n = 67.608) Não (n = 19.795)

n % n % n %Idade de entrada na coorte, anos

< 25 15.081 17,3 12.842 19,0 2.239 11,325–29 26.366 30,2 20.974 31,0 5.392 27,230–34 22.367 25,6 16.521 24,4 5.846 29,535–39 14.907 17,1 10.812 16,0 4.095 20,740–44 7.082 8,1 5.468 8,1 1.614 8,2≥ 45 1.600 1,8 991 1,5 609 3,1

Paridade quando da entrada na coorteNulípara 70.365 80,5 55.921 82,7 14.444 73,0Paridade ≥1 17.038 19,5 11.687 17,3 5.351 27,0

Paridade quando da saída da coorteNulípara 23.291 26,7 17.532 25,9 5.759 29,1Paridade ≥1 64.112 73,4 50.076 74,1 14.036 70,9

No. de filhos na saída0 23.291 26,7 17.532 25,9 5.759 29,11 22.935 26,2 17.725 26,2 5.210 26,32–3 36.562 41,8 28.567 42,3 7.995 40,4≥ 4 4.615 5,3 3.784 5,6 831 4,2

Índice de massa corporal, kg/m2

< 18,5 2.155 2,5 1.642 2,4 513 2,618,5–24,9 25.793 29,5 19.830 29,3 5.963 30,125–29,9 15.665 17,9 12.319 18,2 3.346 16,9≥ 30 13.290 15,2 10.947 16,2 2.343 11,8Informação indisponível 30.500 34,9 22.870 33,8 7.630 38,6

TabagismoJá 9.633 11,0 7.130 10,6 2.503 12,6Nunca 56.527 64,7 44.063 65,2 12.464 63,0Informação indisponível 21.243 24,3 16.415 24,3 4.828 24,4

DistritoNorte de Israel 15.098 17,3 11.631 17,2 3.467 17,5Centro de Israel 59.690 68,3 46.160 68,3 13.530 68,4Sul de Israel 12.615 14,4 9.817 14,5 2.798 14,1

Nível socioeconômico0–10 (mais baixo) 24.396 27,9 19.215 28,4 5.181 26,211–14 21.969 25,1 16.767 24,8 5.202 26,3≥15 (mais alto) 22.097 25,3 16.737 24,8 5.360 27,1Informação indisponível 18.941 21,7 14.889 22,0 4.052 20,5

Indicação de infertilidadea

Infertilidade masculina 18.721 21,4 17.982 26,6 739 3,7Ausência de ovulação 13.394 15,3 12.201 18,1 1.193 6,0Mecânica 5.748 6,6 4.595 6,8 1.153 5,8SOP 2.439 2,8 2.428 3,6 11 0,1Eixo hipófise-hipotálamo 261 0,3 229 0,3 32 0,2Endometriose 1.628 1,9 1.392 2,1 236 1,2Não especificada 44.457 50,9 29.542 43,7 14.915 75,4

Observação: SOP = síndrome de ovário policístico.a Categorias não mutuamente excludentes.

Brinton. IVF and female cancers. Fertil Steril 2013.



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relativamente pequenos, os riscos associados com FIV tanto para câncer endometrial quanto ovariano foram maiores entre as pacientes que deram à luz do que entre as nulípa-ras; as primeiras também apresentaram taxas mais elevadas de exposição a múltiplos ciclos de FIV (por exemplo, entre pacientes com câncer ovariano, 33,3% daquelas que deram à luz tinham sido submetidas a pelo menos quatro ciclos, comparado a 18,5% das nulíparas). Para o câncer de mama, os riscos associados com tratamento de fertilidade foram discretamente mais altos para as pacientes que deram à luz do que para as nulíparas, que apresentaram riscos significa-tivamente reduzidos relacionados com qualquer tratamento de fertilidade (HR 0,69; 95% IC: 0,49–0,95) ou tratamentos individuais (por exemplo, exposição a clomifeno: HR 0,66; 95% IC: 0,46–0,95).

Avaliou-se ainda a influência das causas de infertilida-de nas associações de tratamento. Os resultados não foram afetados por ajuste adicional para essas causas, nem foram modificados quando examinados dentro de subgrupos de causas (dados não apresentados). Essas análises, no entanto, foram limitadas pela falta de informação sobre as causas para muitas pacientes.

Conduzimos análises de sensibilidade para determinar o impacto da exclusão de casos de acordo com variados intervalos entre o momento em que o câncer se desenvol-veu e o início do tratamento de fertilidade. Isso resultou na eliminação dos seguintes casos de câncer: mama: 3 casos em um ano, 31 em dois anos; endometrial: 0 e 0; ovariano: 0 e 3; cervical in situ: 3 e 17; e cervical invasivo: 2 e 5. Tais eliminações não alteraram substancialmente a interpreta-ção dos riscos associados com diferentes tratamentos de fertilidade. De fato, o risco de câncer ovariano associado com FIV foi levemente fortalecido pela eliminação de casos diagnosticados nos dois anos de tratamento de fertilidade, embora permanecesse não significativo (HR 2,13; 95% IC: 0,93–4,87).

diSCuSSãoEsta investigação fornece esclarecimentos adicionais refe-rentes às relações em longo prazo de medicamentos para fertilidade e risco de câncer. A maioria das investigações prévias focou nos efeitos dos medicamentos que estimulam a ovulação dados fora do contexto de FIV, tendo os achados sido discrepantes. Embora os achados iniciais de coorte te-nham aumentado a preocupação com os efeitos no câncer ovariano (1, 2), os mais recentes foram bastante tranquiliza-dores (4, 12, 13, 14). Os resultados de câncer de mama são de difícil interpretação, pois nos estudos maiores os riscos variaram de relações inversas (15) a aumento de risco (12, 16) até nenhuma associação (17, 18, 19, 20, 21, 22). Alguma consistência foi obtida para o câncer endometrial, com al-guns estudos sugerindo possível aumento de risco (12, 18, 19, 23, 24).

Embora muitas mulheres submetidas a FIV tenham também recebido medicamentos que estimulam a ovulação (em geral, clomifeno) como abordagem de primeira linha, os protocolos de tratamento para FIV são mais complexos, envolvendo, em geral, gonadotrofinas para estimular a

TABELA 2

razões de chance ajustadas para câncer de mama e ginecológico associado com tratamentos de fertilidade.

Casos, n

Pessoa-ano Hra 95% iC

MamaSem tratamento

de fertilidade133 137.702 1,00 referência

Qualquer tratamento de fertilidade

389 566.539 0,87 (0,71–1,06)

FIV 140 187.820 0,90 (0,71–1,15)1–3 ciclos 77 106.206 0,89 (0,67–1,18)≥4 ciclos 63 81.615 0,92 (0,68–1,24)

Análogos de GnRH 118 174.493 0,82 (0,64–1,05)Clomifeno 284 426.797 0,87 (0,71–1,08)Progestágeno 278 450.928 0,80 (0,65–0,99)

EndometrialSem tratamento



34 564.934 1,25 (0,55–2,84)



OvarianoSem tratamento de

fertilidade11 137.074 1,00 referência


34 564.275 0,90 (0,45–1,79)



Cervical in situSem tratamento



202 566.539 0,48 (0,38–0,61)



Cervical invasivoSem tratamento de

fertilidade11 137.702 1,00 referência


21 566.539 0,57 (0,27–1,19)



Observação: IC = intervalo de confiança; HR = razão de chance.a: Ajustada para idade na entrada na coorte, índice de massa corporal, tabagismo, paridade na saída da coorte e nível socioeconômico; os modelos incluíram um termo para tratamen-to de fertilidade que não o tipo listado (por exemplo, o modelo de tratamento com FIV in-cluiu o termo tratamento com FIV e um termo para outro tratamento de fertilidade que não FIV, de modo que a referência sempre foi ausência de tratamento de fertilidade).





ovulação, análogos de GnRH para inibir a hipófise e evitar ovulação espontânea, e suplementação com progestágeno para neutralizar a diminuição de GnRH da hipófise e a in-terferência com o corpo lúteo da fase luteínica. O impacto desses tratamentos precisa ser considerado em separado, embora muitas investigações anteriores tenham avaliado os medicamentos de fertilidade como uma exposição com-binada.

Consideramos o número de ciclos de FIV assim como os medicamentos individuais que possam ter sido adminis-trados antes (por exemplo, clomifeno como abordagem de primeira linha ou para aumentar os efeitos das gonadotro-finas) ou que variaram para as pacientes submetidas a FIV (progestágenos). Nossos achados foram bastante tranquili-zadores com relação ao câncer de mama e ginecológico, embora tenha havido algumas poucas observações de au-mentos não significativos para câncer ovariano e endome-trial.

Apenas um número limitado de estudos anteriores ha-via avaliado a relação de FIV com risco de câncer ovariano. A maioria dos estudos, como o nosso, teve relativamente poucos eventos, devido à relativa raridade daquele tumor. Isso incluiu estudos de coorte da Austrália (dois estudos, envolvendo 13 e 16 casos, respectivamente) (14, 25), Israel (18 casos) (18), Finlândia (12 casos) (26) e Suécia (26 casos) (22). No maior estudo, envolvendo 77 casos de uma coorte holandesa, riscos significativamente elevados (excluindo eventos no primeiro ano de acompanhamento) foram obser-vados para o câncer ovariano invasivo (HR 2,14; baseado em 28 casos) e borderline (HR 4,23; 27 casos) (27).

Embora vários estudos de medicamentos pré-FIV te-nham relatado um aumento do risco de câncer borderline associado com o uso de medicamento (1, 7, 28, 29, 30), pos-tulado por alguns como sendo o reflexo da influência de viés de vigilância (31), isso não pareceu explicar o aumento de riscos observado na investigação holandesa (27). Não conse-

TABELA 3

razões de chance ajustadas para câncer de mama e ginecológico associado com tratamentos de fertilidade, estratificado para paridade na saída do estudo.

Nulípara na saída (n = 23.291) Não nulípara na saída (n = 64.112)

Casos, n Hra 95% iC Casos, n Hra 95% iC

Mama

Sem tratamento de fertilidade 55 1,00 referência 78 1,00 referência

Qualquer tratamento de fertilidade 115 0,69 (0,49–0,95) 274 0,97 (0,75–1,25)

FIV 43 0,72 (0,48–1,08) 97 0,98 (0,73–1,32)

1–3 ciclos 21 0,68 (0,41–1,13) 56 0,99 (0,70–1,39)

≥4 ciclos 22 0,76 (0,46–1,26) 41 0,98 (0,67–1,43)

Análogos de GnRH 33 0,64 (0,41–0,99) 85 0,89 (0,65–1,21)

Clomifeno 73 0,66 (0,46–0,95) 211 0,98 (0,75–1,27)

Progestágeno 83 0,63 (0,45–0,90) 195 0,90 (0,69–1,17)

Endometrial



FIV 7 0,81 (0,27–2,43) 8 6,03 (0,75–48,35)

1–3 ciclos 4 0,90 (0,25–3,22) 6 7,80 (0,94–64,88)

≥4 ciclos 3 0,71 (0,17–2,86) 2 3,59 (0,32–39,68)

Análogos de GnRH 5 0,67 (0,20–2,21) 7 5,47 (0,67–44,53)

Clomifeno 10 0,62 (0,22–1,75) 10 3,19 (0,41–24,98)

Progestágeno 17 0,91 (0,35–2,34) 10 3,14 (0,40–24,66)

Ovariano



FIV 11 1,15 (0,45–2,89) 10 2,55 (0,70–9,33)

1–3 ciclos 6 1,23 (0,42–3,58) 4 1,77 (0,40–7,95)

≥4 ciclos 5 1,06 (0,34–3,29) 6 3,65 (0,90–14,78)

Análogos de GnRH 5 0,61 (0,20–1,89) 6 1,60 (0,40–6,43)

Clomifeno 9 0,50 (0,19–1,32) 11 1,28 (0,35–4,60)

Progestágeno 11 0,52 (0,21–1,31) 12 1,37 (0,38–4,88)Observação: IC = intervalo de confiança; HR = razão de chance a Ajustada para idade na entrada na coorte, índice de massa corporal, tabagismo, paridade na saída da coorte e nível socioeconômico; os modelos incluíram um termo para tratamento de fertilidade que não o tipo listado (por exemplo, o modelo de tratamento com FIV incluiu o termo tratamento com FIV e um termo para outro tratamento de fertilidade que não FIV, de modo que a referência sempre foi ausência de tratamento de fertilidade).




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guimos avaliar o risco de câncer borderline, uma vez que eles não são relatados de rotina pelo RCI. Nossos achados relati-vos à exposição a FIV para câncer ovariano invasivo não apresentaram elevação estatisticamente significativa; entre-tanto, dados os riscos significativamente elevados do grande estudo holandês (que persistiram até entre os pacientes acompanhados por 15 anos), o nosso achado de tendência de aumento de risco relacionado ao número de ciclos de FIV, ainda que não significativo, pode ser digno de nota. A ne-cessidade de acompanhamento adicional é corroborada pelo aumento, embora não significativo, do risco de câncer ova-riano associado com FIV em um recente estudo finlandês (26) e achados significativos relacionados ao uso de gonado-trofinas em uma investigação sueca (32). Tais achados posi-tivos parecem discordar de alguns dos maiores estudos de medicamentos pré-FIV e câncer ovariano (4, 12, 13, 18), mas os resultados divergentes podem refletir variação de proto-colos de tratamento. Portanto, a FIV, que envolve o uso de gonadotrofinas, pode aumentar o número de ovulações em cerca de seis a nove vezes em relação a mulheres não trata-das (33), em comparação a apenas dobrar com clomifeno (34, 35). Além disso, a FIV com frequência envolve repetidas punções ovarianas e consequente trauma para as células epi-teliais da superfície ovariana (33, 36).

Vários estudos relataram que os riscos de câncer ovaria-no associados com o uso de medicamento de fertilidade são maiores entre as mulheres com infertilidade resistente (i.e., aquelas que permanecem nuligrávidas ou nulíparas) (2, 4, 5, 6, 7, 14), mas encontramos exatamente a relação oposta: maiores riscos (embora não significativos) associados com FIV entre mulheres que deram à luz em comparação a nulí-paras. Logo, nossos achados fornecem base mais forte para os efeitos dos medicamentos ou procedimentos (punção fo-licular) do que para as indicações de uso, embora informa-ção incompleta sobre a última tenha impedido que pudésse-mos esclarecer especificamente as relações.

Ao contrário do câncer ovariano, não encontramos evi-dência de qualquer aumento no risco de câncer de mama, achado alinhado com a maioria dos recentes estudos de coorte de exposição pré-FIV (12, 17, 18, 19, 21, 37) e FIV (22, 25, 38, 39, 40, 41). De fato, observamos um risco signi-ficativamente reduzido associado com exposição a proges-tágeno. Isso foi de certa forma surpreendente, pois uma coorte dinamarquesa sobre infertilidade achou um risco au-mentado associado com exposição a progesterona (21). Além disso, a adição de progestágeno à terapia com estró-geno para aliviar os sintomas da menopausa foi consisten-temente ligada a maior risco de câncer de mama do que o uso de estrogênio sozinho (42). Entretanto, na FIV, o pro-gestágeno usado é progesterona natural, e não progestáge-nos sintéticos como os usados para terapia da menopausa, o que pode explicar os efeitos discrepantes.

Com base em vários estudos sobre exposição pré-FIV e risco de câncer endometrial (12, 18, 19, 23, 24), levantamos a hipótese de que deveríamos observar aumento de risco, mas as associações que observamos foram bem modestas e não estatisticamente significativas. Os maiores riscos foram encontrados em mulheres submetidas de um a três ciclos de FIV; mulheres submetidas a pelo menos quatro ciclos não

apresentaram aumento de riscos, embora pequenos números estivessem envolvidos. Estudos anteriores que relataram elevados riscos de câncer endometrial em relação aos medi-camentos de fertilidade focaram principalmente no clomife-no, um modulador seletivo do receptor de estrogênio com propriedades químicas similares às do tamoxifeno (43), um medicamento ligado ao aumento de risco de câncer endo-metrial (44). Na nossa investigação, entretanto, a maior par-te da exposição a medicamento deveu-se às gonadotrofinas rotineiramente usadas para FIV.

Ao contrário dos outros cânceres, os tratamentos de fer-tilidade (incluindo FIV) foram consistentemente associados com significativas reduções no risco de câncer cervical in situ; a maioria dos tratamentos também levou a diminuição não significativa de câncer cervical invasivo. Ainda que apenas um limitado número de estudos tenha avaliado a relação entre medicamentos de fertilidade e câncer cervical, as reduções de risco observadas pelo nosso são consistentes com achados prévios (19, 26, 45, 46, 47). Isso poderia signi-ficar que mulheres que procuram tratamento para infertili-dade apresentam baixo risco para câncer cervical (como, alto nível social, limitado número de parceiros sexuais). Al-ternativamente, os riscos reduzidos poderiam dever-se a uma maior triagem de esfregaço de Papanicolau entre as mulheres rotineiramente examinadas por ginecologistas para avaliações de infertilidade (48). Ao contrário de nossas observações de que a maior parte do tratamento de fertili-dades está associada com reduzidos riscos de câncer cervi-cal, tal padrão não foi observado para o câncer invasivo em mulheres submetidas a pelo menos quatro ciclos de FIV. Embora tal risco tenha sido baseado em pequenos números e não tenha se elevado em mulheres não submetidas a tra-tamentos de fertilidade, cada vez mais a importância de fa-tores hormonais é reconhecida na progressão e persistência da infecção pelo papiloma vírus humano (49), o agente cau-sal do câncer cervical.

Nosso estudo apresentou pontos fortes e também algu-mas limitações. Essas últimas incluíram o acompanhamento relativamente curto, resultando em um reduzido número de casos em uma população de mulheres em geral jovens. Além disso, como tomamos por base os dados disponíveis nos prontuários médicos, não tivemos informação completa sobre todos os potenciais fatores de confusão. Importante notar que a causa da infertilidade foi informada para ape-nas metade da população estudada. Com relação ao câncer ovariano, ficou bem documentado que a endometriose pode ter um efeito independente no risco (50, 51, 52), embora não tenhamos visto evidência de riscos diferenciados da FIV de acordo com a causa da infertilidade. A informação sobre alguns fatores de risco foi incompleta (como, IMC) ou até mesmo ausente para outros fatores de risco reconhecidos (por exemplo, história familiar de câncer, uso de contracep-tivo oral), o que poderiam ter afetado nossos resultados. No entanto, o fator mais importante a se controlar é a paridade (3), aqui documentada (e não autorrelatada) a partir de in-formação da conexão dos registros.

Em resumo, nesse estudo a partir de uma grande HMO israelense, nossos achados relativos à relação entre medica-mentos de fertilidade e risco de câncer foram bastante tran-




quilizadores. Importante notar que não encontramos rela-ção convincente de tratamento de fertilidade com câncer de mama ou endometrial. Para o câncer ovariano, assim como em vários estudos anteriores, notamos evidência de aumen-to de risco com o número de ciclos de FIV, mas nossa rela-ção não apresentou significado estatístico, possivelmente devido ao pequeno número de pacientes. Devido ao acom-panhamento relativamente curto da maioria dos estudos, inclusive o nosso, avaliação adicional dos efeitos em longo prazo de FIV deve ser realizada. Isso tem especial importân-cia para o câncer ovariano, uma vez que o período de indu-ção associado com a maioria dos fatores de risco pode ex-ceder 25 anos (53).

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Revisión científica: Dr. Guillermo MarconiRevisión médica: Dra. Ona Jurksaitis Lukauskis

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MEN AN 112 Maio 2012

Menopur® (menotropina - LH 75 U.I. + FSH 75 U.I.).

USO ADULTO. INDICAÇÕES Mulheres: Esterilidade com insufi ciência ovariana hipo – ou normogonadotrófi ca: estimulação do crescimento folicular, incluindo mulheres com síndrome de ovário policístico que não responderam ao tratamento com citrato de clomifeno. Homens: Esterilidade com hipogonadismo hipo – ou normogonadotrófi co: em combinação com HCG, para estimular a espermatogênese. CONTRAINDICAÇÕES Em Mulheres: tumores na glândula pituitária ou no hipotálamo e no útero, ovários e mamas; gravidez e lactação; sangramento ginecológico de etiologia desconhecida; hipersensibilidade aos componentes da fórmula. aumento dos ovários ou cistos que não tenham sido causados por síndrome de ovário policístico; níveis altos de LH e FSH indicando uma insufi ciência ovariana primária. Menopur® não deve ser administrado nos casos de: falência primária ovariana; má-formação de órgãos sexuais incompatíveis com a gravidez; tumor fi broide do útero incompatível com a gravidez. Em Homens: câncer de próstata; tumores no testículo. As seguintes condições devem ser tratadas antes do início da terapia: disfunções da glândula tireoide e do córtex da glândula supra-renal; hiperprolactinemia; tumores na glândula pituitária ou no diencéfalo (hipotálamo). CUIDADOS E ADVERTÊNCIAS Não deve ser utilizado para induzir a ovulação em mulheres cujos ovários foram involuntariamente hiperestimulados. A terapia requer monitorização da resposta ovariana verifi cada apenas pela ultrassonografi a ou em combinação com a mensuração do nível de estradiol sanguíneo. Alguns pacientes podem apresentar baixa resposta. Pacientes que estão sob estímulo do crescimento folicular para técnicas de reprodução assistida podem apresentar aumento ovariano ou desenvolver hiperestimulação. Uso em idosos e crianças Menopur® é um medicamento de uso adulto. Gravidez e Lactação Menopur® não deve ser utilizado por mulheres grávidas ou lactentes. INTERAÇÕES MEDICAMENTOSAS O uso concomitante de Menopur® com o citrato de clomifeno pode aumentar a resposta folicular. Quando for utilizado um agonista de GnRH, uma dose mais alta de Menopur® deve ser necessária para atingir uma resposta folicular adequada. REAÇÔES ADVERSAS dores abdominais, náusea, aumento do abdômen, dor e reação no local da injeção, cefaleia, hiperestimulação dos ovários, dor pélvica, febre, ascite, hidrotórax, oligúria, hipotensão e fenômenos tromboembólicos. Em casos muito raros, pode causar a formação de anticorpos tornando o tratamento inefi caz. POSOLOGIA Para indução do crescimento folicular em procedimentos de baixa complexidade (coito programado e inseminação intrauterina) em mulheres normo ou hipogonadotrófi cas a dose depende da reação ovariana, a qual deve ser defi nida através de exames ultrassonográfi cos dos ovários e mensuração dos níveis de estradiol. Se a dosagem de Menopur® for muito alta, podem ocorrer crescimentos foliculares uni e bilaterais múltiplos. Em geral, a terapia é iniciada dentro dos 7 primeiros dias do ciclo menstrual com uma dosagem inicial diária correspondente a 75 - 150 U.I. de FSH. Se os ovários não respondem, a dosagem pode ser gradativamente aumentada até surgirem evidências de aumento da secreção de estradiol e de crescimento folicular. O ajuste na dose não deve ser feito em frequência maior que 7 dias. O tratamento com a mesma dosagem de Menopur® é continuado até atingir-se um nível sérico de estradiol pré-ovulatório. Se o nível aumentar muito rapidamente, a dosagem deve ser reduzida. A dose máxima diária não deve ultrapassar 225 U.I. Caso a paciente não responda após 4 semanas de tratamento, o tratamento deve ser reiniciado com uma dosagem inicial maior do que a do ciclo anterior. Para induzir a ovulação, após uma resposta ótima do tratamento com Menopur®, utiliza-se 5.000 ou 10.000 U.I. de HCG injetado por via intramuscular, 1 dia após a última administração de Menopur®. Importante: recomenda-se que a paciente tenha relação sexual no dia e no dia seguinte da administração do HCG. Como alternativa, a inseminação intrauterina pode ser realizada.OBSERVAÇÃO: Após a administração de uma dose muito alta de Menopur®, a administração subsequente de HCG pode causar uma hiperestimulação involuntária dos ovários. Neste caso, o tratamento deve ser interrompido tanto com Menopur® ou com HCG e a paciente deverá utilizar um método anticoncepcional ou evitar relações sexuais até o início da próxima menstruação. A dosagem de Menopur® em programas de fertilização assistida (FIV/ICSI) pode variar de pessoa para pessoa. De um modo geral recomendam-se os seguintes esquemas posológicos: Quando for utilizado agonista de GnRH em depósito, a terapia com Menopur® deve ser iniciada aproximadamente 2 semanas após o início do tratamento com o agonista. A dose inicial recomendada de Menopur® é 150 – 225 U.I. por, pelo menos, 5 dias iniciais do tratamento. Baseado na monitorização clínica (ultrassonografi a do ovário em combinação ou não com a mensuração do nível de estradiol sanguíneo) as doses subsequentes devem ser ajustadas de acordo com a resposta individual e não devem exceder a quantidade de 150 U.I. por ajuste. A dosagem máxima diária não deve exceder 450 U.I. por dia e na maioria dos casos não é recomendada a utilização acima de 20 dias. Caso não seja utilizado o agonista de GnRH, a terapia com Menopur® deve ser iniciada no 2° ou 3° dia do ciclo menstrual. É recomendada a utilização de esquemas de variação de doses acima citadas. Quando um número adequado de folículos atingir um tamanho apropriado, uma única injeção de 10.000 U.I. de HCG deve ser administrada para induzir a maturação folicular fi nal, na preparação da aspiração de oócitos. As pacientes devem ser cuidadosamente monitoradas por, pelo menos, 2 semanas após a administração de HCG. Caso seja obtida uma resposta em excesso de Menopur®, deve-se interromper o tratamento e descontinuar o uso de HCG e as pacientes devem utilizar um método contraceptivo de barreira (por exemplo: camisinha) ou evitar relações sexuais até iniciar-se a próxima menstruação. No Homem: Inicialmente, 1.000 – 3.000 U.I. de HCG são administrados 3 vezes por semana, até atingir-se um nível sérico de testosterona normal. Então, 75 - 150 U.I. de Menopur® são administradas 3 vezes por semana, por alguns meses e de acordo com o critério médico. Orientar a/o paciente quanto ao protocolo de uso, para que não haja comprometimento do sucesso terapêutico.Venda sob prescrição médica. Material de uso exclusivo à classe médica. A persistirem os sintomas, o médico deverá ser consultado. Reg. MS: 1.2876.0011 Farm. Resp.: Helena Satie Komatsu - CRF/SP: 19.714 - Laboratórios Ferring Ltda. Praça São Marcos, 624 - 05455-050 - São Paulo – SP / CNPJ: 74.232.034/0001-48 / SAC: 0800 772 4656.

Contraindicação: Para mulheres com tumores no útero, nos ovários e nas mamas. Interações medicamentosas: O uso concomitante com o citrato de clomifeno pode aumentar a resposta folicular.

Referências: 1 Ziebe, S. et al. Infl uence of ovarian stimulation with HP-hMG or recombinant FSH on embryo quality parameters in patient undergoing IVF. Human Reproduction, 22(9): 2404-2413, 2007. 2 Weghofer, A. the impact of LH-containing gonadotropin on diploidy rates in preimplantation embryos: long protocol stimulation. Human Reproduction, 23(3): 499-503, 2008. 3 Al-Inany HG, et al. Effi cacy and safety of human menopausal gonadotrophins versus recombinant FSH: a meta-analysis.Reprod Biomed OnLine.16:81-88, 2008. 4 Coomarasamy, A. Urinary hMG versus recombinant FSH for controlled ovarian hyperstimulation following an agonist long down-regulation protocol in IVf or ICSI treatment: a systematic review and meta-analysis. Human Reproduction, 23(2): 310-315, 2008. 5 Wely, V. et al. Recombinant versus urinary gonadotrophin for ovarian stimulation in assisted reproductive technology cycles. Cochrane Database Syst Rev. 16(2):CD005354. Review, 2011. 6 Al-Inany HG. et al. Highly purifi ed hMG achieves better pregnancy rates in IVF cycles but not ICSI cycles compared with recombinant FSH: a meta-analysis. Gynecol Endocrinol.25(6):372-8, 2009. 7 Platteau P. et al. Highly purifi ed HMG versus recombinant FSH for ovarian stimulation in IVF cycles. Reprod Biomed Online17(2):190-8, 2008. 8 Andersen, AN. et al. Clinical outcome following stimulation with highly purifi ed hMG or recombinant FSH in patients undergoing IVF: a randomized assessor-blind controlled trial. Human Reproduction, 21(12): 3217-3227, 2006. 9 Bosch, E. et al. Highly purifi ed hMG versus recombinant FSH in ovarian hyperstimulation with GnRH antagonists - a randomized study. Human Reproduction, 23(10): 2346-2351, 2008. 10 Jee BC. et al. Clinical effi cacy of highly purifi ed hMG versus recombinant FSH in IVF/ICSI cycles: a meta-analysis. Gynecol Obstet Invest., 70(2):132-7, 2010.

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Laboratórios Ferring - BrasilPça. São Marcos, 624 - 05455-050 - São Paulo - BrasilPABX - 55 11 3024.7500

MEN AN 112 Maio 2012

Menopur® (menotropina - LH 75 U.I. + FSH 75 U.I.).

USO ADULTO. INDICAÇÕES Mulheres: Esterilidade com insufi ciência ovariana hipo – ou normogonadotrófi ca: estimulação do crescimento folicular, incluindo mulheres com síndrome de ovário policístico que não responderam ao tratamento com citrato de clomifeno. Homens: Esterilidade com hipogonadismo hipo – ou normogonadotrófi co: em combinação com HCG, para estimular a espermatogênese. CONTRAINDICAÇÕES Em Mulheres: tumores na glândula pituitária ou no hipotálamo e no útero, ovários e mamas; gravidez e lactação; sangramento ginecológico de etiologia desconhecida; hipersensibilidade aos componentes da fórmula. aumento dos ovários ou cistos que não tenham sido causados por síndrome de ovário policístico; níveis altos de LH e FSH indicando uma insufi ciência ovariana primária. Menopur® não deve ser administrado nos casos de: falência primária ovariana; má-formação de órgãos sexuais incompatíveis com a gravidez; tumor fi broide do útero incompatível com a gravidez. Em Homens: câncer de próstata; tumores no testículo. As seguintes condições devem ser tratadas antes do início da terapia: disfunções da glândula tireoide e do córtex da glândula supra-renal; hiperprolactinemia; tumores na glândula pituitária ou no diencéfalo (hipotálamo). CUIDADOS E ADVERTÊNCIAS Não deve ser utilizado para induzir a ovulação em mulheres cujos ovários foram involuntariamente hiperestimulados. A terapia requer monitorização da resposta ovariana verifi cada apenas pela ultrassonografi a ou em combinação com a mensuração do nível de estradiol sanguíneo. Alguns pacientes podem apresentar baixa resposta. Pacientes que estão sob estímulo do crescimento folicular para técnicas de reprodução assistida podem apresentar aumento ovariano ou desenvolver hiperestimulação. Uso em idosos e crianças Menopur® é um medicamento de uso adulto. Gravidez e Lactação Menopur® não deve ser utilizado por mulheres grávidas ou lactentes. INTERAÇÕES MEDICAMENTOSAS O uso concomitante de Menopur® com o citrato de clomifeno pode aumentar a resposta folicular. Quando for utilizado um agonista de GnRH, uma dose mais alta de Menopur® deve ser necessária para atingir uma resposta folicular adequada. REAÇÔES ADVERSAS dores abdominais, náusea, aumento do abdômen, dor e reação no local da injeção, cefaleia, hiperestimulação dos ovários, dor pélvica, febre, ascite, hidrotórax, oligúria, hipotensão e fenômenos tromboembólicos. Em casos muito raros, pode causar a formação de anticorpos tornando o tratamento inefi caz. POSOLOGIA Para indução do crescimento folicular em procedimentos de baixa complexidade (coito programado e inseminação intrauterina) em mulheres normo ou hipogonadotrófi cas a dose depende da reação ovariana, a qual deve ser defi nida através de exames ultrassonográfi cos dos ovários e mensuração dos níveis de estradiol. Se a dosagem de Menopur® for muito alta, podem ocorrer crescimentos foliculares uni e bilaterais múltiplos. Em geral, a terapia é iniciada dentro dos 7 primeiros dias do ciclo menstrual com uma dosagem inicial diária correspondente a 75 - 150 U.I. de FSH. Se os ovários não respondem, a dosagem pode ser gradativamente aumentada até surgirem evidências de aumento da secreção de estradiol e de crescimento folicular. O ajuste na dose não deve ser feito em frequência maior que 7 dias. O tratamento com a mesma dosagem de Menopur® é continuado até atingir-se um nível sérico de estradiol pré-ovulatório. Se o nível aumentar muito rapidamente, a dosagem deve ser reduzida. A dose máxima diária não deve ultrapassar 225 U.I. Caso a paciente não responda após 4 semanas de tratamento, o tratamento deve ser reiniciado com uma dosagem inicial maior do que a do ciclo anterior. Para induzir a ovulação, após uma resposta ótima do tratamento com Menopur®, utiliza-se 5.000 ou 10.000 U.I. de HCG injetado por via intramuscular, 1 dia após a última administração de Menopur®. Importante: recomenda-se que a paciente tenha relação sexual no dia e no dia seguinte da administração do HCG. Como alternativa, a inseminação intrauterina pode ser realizada.OBSERVAÇÃO: Após a administração de uma dose muito alta de Menopur®, a administração subsequente de HCG pode causar uma hiperestimulação involuntária dos ovários. Neste caso, o tratamento deve ser interrompido tanto com Menopur® ou com HCG e a paciente deverá utilizar um método anticoncepcional ou evitar relações sexuais até o início da próxima menstruação. A dosagem de Menopur® em programas de fertilização assistida (FIV/ICSI) pode variar de pessoa para pessoa. De um modo geral recomendam-se os seguintes esquemas posológicos: Quando for utilizado agonista de GnRH em depósito, a terapia com Menopur® deve ser iniciada aproximadamente 2 semanas após o início do tratamento com o agonista. A dose inicial recomendada de Menopur® é 150 – 225 U.I. por, pelo menos, 5 dias iniciais do tratamento. Baseado na monitorização clínica (ultrassonografi a do ovário em combinação ou não com a mensuração do nível de estradiol sanguíneo) as doses subsequentes devem ser ajustadas de acordo com a resposta individual e não devem exceder a quantidade de 150 U.I. por ajuste. A dosagem máxima diária não deve exceder 450 U.I. por dia e na maioria dos casos não é recomendada a utilização acima de 20 dias. Caso não seja utilizado o agonista de GnRH, a terapia com Menopur® deve ser iniciada no 2° ou 3° dia do ciclo menstrual. É recomendada a utilização de esquemas de variação de doses acima citadas. Quando um número adequado de folículos atingir um tamanho apropriado, uma única injeção de 10.000 U.I. de HCG deve ser administrada para induzir a maturação folicular fi nal, na preparação da aspiração de oócitos. As pacientes devem ser cuidadosamente monitoradas por, pelo menos, 2 semanas após a administração de HCG. Caso seja obtida uma resposta em excesso de Menopur®, deve-se interromper o tratamento e descontinuar o uso de HCG e as pacientes devem utilizar um método contraceptivo de barreira (por exemplo: camisinha) ou evitar relações sexuais até iniciar-se a próxima menstruação. No Homem: Inicialmente, 1.000 – 3.000 U.I. de HCG são administrados 3 vezes por semana, até atingir-se um nível sérico de testosterona normal. Então, 75 - 150 U.I. de Menopur® são administradas 3 vezes por semana, por alguns meses e de acordo com o critério médico. Orientar a/o paciente quanto ao protocolo de uso, para que não haja comprometimento do sucesso terapêutico.Venda sob prescrição médica. Material de uso exclusivo à classe médica. A persistirem os sintomas, o médico deverá ser consultado. Reg. MS: 1.2876.0011 Farm. Resp.: Helena Satie Komatsu - CRF/SP: 19.714 - Laboratórios Ferring Ltda. Praça São Marcos, 624 - 05455-050 - São Paulo – SP / CNPJ: 74.232.034/0001-48 / SAC: 0800 772 4656.

Contraindicação: Para mulheres com tumores no útero, nos ovários e nas mamas. Interações medicamentosas: O uso concomitante com o citrato de clomifeno pode aumentar a resposta folicular.

Referências: 1 Ziebe, S. et al. Infl uence of ovarian stimulation with HP-hMG or recombinant FSH on embryo quality parameters in patient undergoing IVF. Human Reproduction, 22(9): 2404-2413, 2007. 2 Weghofer, A. the impact of LH-containing gonadotropin on diploidy rates in preimplantation embryos: long protocol stimulation. Human Reproduction, 23(3): 499-503, 2008. 3 Al-Inany HG, et al. Effi cacy and safety of human menopausal gonadotrophins versus recombinant FSH: a meta-analysis.Reprod Biomed OnLine.16:81-88, 2008. 4 Coomarasamy, A. Urinary hMG versus recombinant FSH for controlled ovarian hyperstimulation following an agonist long down-regulation protocol in IVf or ICSI treatment: a systematic review and meta-analysis. Human Reproduction, 23(2): 310-315, 2008. 5 Wely, V. et al. Recombinant versus urinary gonadotrophin for ovarian stimulation in assisted reproductive technology cycles. Cochrane Database Syst Rev. 16(2):CD005354. Review, 2011. 6 Al-Inany HG. et al. Highly purifi ed hMG achieves better pregnancy rates in IVF cycles but not ICSI cycles compared with recombinant FSH: a meta-analysis. Gynecol Endocrinol.25(6):372-8, 2009. 7 Platteau P. et al. Highly purifi ed HMG versus recombinant FSH for ovarian stimulation in IVF cycles. Reprod Biomed Online17(2):190-8, 2008. 8 Andersen, AN. et al. Clinical outcome following stimulation with highly purifi ed hMG or recombinant FSH in patients undergoing IVF: a randomized assessor-blind controlled trial. Human Reproduction, 21(12): 3217-3227, 2006. 9 Bosch, E. et al. Highly purifi ed hMG versus recombinant FSH in ovarian hyperstimulation with GnRH antagonists - a randomized study. Human Reproduction, 23(10): 2346-2351, 2008. 10 Jee BC. et al. Clinical effi cacy of highly purifi ed hMG versus recombinant FSH in IVF/ICSI cycles: a meta-analysis. Gynecol Obstet Invest., 70(2):132-7, 2010.

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Laboratórios Ferring - BrasilPça. São Marcos, 624 - 05455-050 - São Paulo - BrasilPABX - 55 11 3024.7500

CONTRIBUINDO PARA MELHORES RESULTADOS1-7

O TRATAMENTO COM MENOPUR® PROMOVE:

Maior proporção de embriões de alta qualidade quando comparado ao rFSH1,2

Menores níveis de progesterona ao final da estimulação vs. rFSH, o que pode resultar em melhor receptividade endometrial para a implantação do embrião8,9

Taxas de gravidez em curso e de nascidos vivos significativamente maiores comparado com rFSH3-7,10

urofolitropina

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