1Ембриология Том 4 Книжка 1 ISSN 1312-7349

История на асистираните репродуктивни технологии 3Д. Баров

Диагностични методи за изследване на семенна течност в помощ на 7асистираната репродукция В. Николова, Р. Станиславов

Витрификацията – ефективен метод за криоконсервация на ооцити 13П. Тодоров

Българска асоциация по регенеративна медицина (БАРМ) 18Р. Конакчиева

Новини от световната мрежа 19П. Тодоров, Г. Николов

History of assisted reproductive technologie 3D. Barov

Diagnostic methods for investigation of seminal fluid in aid of assisted 7reproduction technologyV. Nikolova, R. Stanislavov

Vitrification – effective method for oocytes cryopreservation 13P. Todorov

Bulgarian Association for Regenerative Medicine (BARM) 18R. Konakchieva

News from the Internet 19P. Todorov , G. Nikolov

Редакционна КолегияД-р Георги Николов - главен редакторДоц. Пламен Тодоров, дб - зам. гл. редактор

СЪДЪРЖАНИЕ:

CONTENTS:

Членове:Доц. д-р Иван Николов, дмДоц. Росица Конакчиева, дбДоц. Янчо Тодоров, дбДимитър Баров

д-р Иво Тодоров, дмДесислава Тачева, дбд-р Георги ВакриловДиана Гуленова

Чуждестранни членове:д-р Владимир Исаченко - Германияд-р Кристина Магли - Италияпроф. Вилфред Файхтингер - Австрия

2 Ембриология Том 4 Книжка 1

Уважаеми колеги и читатели,

Изтеклата 2009 г. не бе лесна за никого под сянката на развихрилата се Световна

икономическа криза (поредната). В известен смисъл това не подмина и нас. Но

все пак през тази година се случи и нещо много положително – след

безпрецедентен натиск от страна на неправителствени организации на лекари и

пациенти, за пръв път, у нас Държавата се ангажира с финансирането на

безплодните двойки при провеждане на процедури за ин витро оплождане – до

3 безплатни опита в рамките на 5000 лв. Това неминуемо доведе до увеличаване

броя на преминалите двойки и на осъществените цикли на асистирана

репродукция в нашите специализирани центрове. Ясно е, че значението на

обмена на информация в рамките на колегията и обучението на млади и

перспективни специалисти добива особено голямо значение.

В този ред на мисли считаме, че списание “Ембриология” ще бъде все по-полезно

и апелираме към Вашата активност за предлагане на повече обзорни и

оригинални статии в областта на ембриологията, асистираната репродукция,

репродуктивната биохимия и молекулярна биология, клетъчните култури,

стволовите клетки и други.

Пожелаваме на всички колеги по-здрава, успешна и ползотворна 2010 г.

Д-р Георги Николов,(главен редактор)

3Ембриология Том 4 Книжка 1

ИСТОРИЯ НА АСИСТИРАНИТЕ РЕПРОДУКТИВНИ ТЕХНОЛОГИИ

Д. БаровГлавен ембриолог, САГБАЛ “д-р Щерев”, София

Самовъзпроизводството (репродукцията) е осно-вно свойство на живата природа. Чрез него сезапазва оцеляването на вида. Човекът, като най-висше творение, съществуващо на земята, не правиизключение от това правило. Невъзможността да сесъздаде потомство нанася дълбоки психологични иемоционални травми на брачната двойка.

Асистираните репдуктивни технологии (АРТ) саедно от най-великите постижения на човешкатамисъл в областта на биологията и медицината. Теимат не толкова многогодишна, колкото богатаистория. Първото ‘ин витро’ бебе се ражда през1978 г. и е резултат на упорито научно търсене.

Още през 1786 г. Хънтър извършва първатаизкуствена инсеминация на жена, чийто съпруг е билнеспособен за осъществяване на полов акт порадианатомичен дефект, а през 1866 г. Симс осъществилинсеминация с донорски сперматозоиди.

Проучванията върху животинското и човешкотооплождане започват едва през втората половина на20 век. През 1954 г. Тибо успешно извършвапървата фертилизация при зайци. На следващатагодина Чанг получава ембриони на зайци чрез ‘инвитро’ оплождане, а през 1959 г. трансфериралоплодена заешка яйцеклетка и получилбременност, завършила с естествено раждане.

От този момент датира и интересът нагинеколозите към въпросите на безплодието. През1959 г. се провежда първият конгрес по безплодиев Ню Йорк, а през 1961 г. Клайн и Палмър описватпървата аспирация на човешки ооцит чрезлапароскопия. Едуардс съзира, че изкуственотооплождане, използвано при животните, би моглода се приложи и при хората. По това време тойупорито работи върху ‘ин витро’ оплождане намиши яйцеклетки. Заедно с негови колеги отГлазгоу получава и първите в света ембрионалнистволови клетки от заешки ембрион. Разбирайкитерапевтичния потенциал на тези клетки, тойзадълбочава проучванията си върху матурацията и

фертизацията на човeшки ооцити ‘ин витро’, катоизточник на стволови клетки и за други научницели. В тази връзка отива на 6 седмиченинтензивен курс в Johns Hopkins Hospital –Baltimore, където открива, че на човешките ооцитиса необходими 37 часа, за да завършат напълноматурацията си.

Скоро след това, Едуардс среща Коен наконференция по имунология на репродукцията вБългария през 1967 г., а след това и през 1972 г. наконгрес в Токио, където разговарят върхувъзможностите за ‘ин витр’о оплождане причовека. По време на тази среща те пророческиразговарят и за бъдещето на човешкатарепродукция – ‘ин витро’, криоконсервацията нагамети и ембриони, предимплантационнатагенетична диагностика и др.

Първоначално Едуардс прави неуспешни опити дасе колаборира с гинеколози от Кеймбридж иЛондон, които да го снабдяват с човешки ооцити.Обезкуражен, той заминава отново в САЩ приДжорджена и Хауард Джоунс, където могат леснода му осигуряват овариална тъкан от клиновиднирезекции. Връщайки се в Англия, продължаватопитите му за колаборация с гинеколози, докато наконференция в Лондон съдбата го среща с ПатрикСтептоу, който работи в малък северен град –Олдхам и вече има голям опит в прилагане налапароскопята.

Стептоу веднага се съгласява да работи с Едуардс итака през 1968 г. те създават първият в света екип порепродуктивна медицина. Стартират извършванена ‘ин витро процедури през 1971 г., но засъжаление всичките са безуспешни до 1975 г.,когато за разочарование постигат ектопичнабременност. Чак през 1978 г., след 32 неуспешниембриотрансфера осъществяват първото успешнозабременяване и раждането на първото “ин витробебе - Луиза Браун.

Интересно е, че тази бременност се постига от

HISTORY OF THE ASSISTED REPRODUCTIVE TECHNOLOGIES

D. BarovSenior embryologist, Ob/Gyn Hospital ‘Dr Shterev’, Sofia, Bulgaria

4 Ембриология Том 4 Книжка 1

яйцеклетка, получена при спонтанен цикъл. ТакаЕдуардс и Стептоу остават в историята катопионерите в създаването на АРТ методите. Следтях много екипи в света започват да работят в тазиобласт, основавайки клинични центрове за IVF.

В Австралия Wood създава комбиниран наученекип, в който гинеколози са Leeton и Тalbot, абиолози Lopata и Trounson. Тази група започваработа с хормонално стимулирани цикли с целдобиване на повече от една яйцеклетка, а Trounsonподобрява качеството на културалните среди.Австралийците постигат първата си бременностпрез 1980 г.

В САЩ Geordgeanna и Howard Jones започватсвоята АРТ програма през 1981 г. в Norfolk, но следкато извършват 41 лапароскопии с добив наяйцеклетки, успяват да постигнат разделяне наембриони само при 13 пациентки, които незабременяват. Те предлагат да се използва hMG застимулация на циклите за получаване на повечеяйцеклетки и пораждат дискусия за и противстимулирания цикъл. Постигат първият си успехот стимулиран цикъл през 1981 г.

Във Франция гинекологът Frydman и биологаTestar се фокусират върху изучаване на LH пика,което е предсказание за акуратното насрочване нафоликуларната пункция. В Sevres, внеуниверситетска болница, работят биолозитеMandelbaum и Plachot, заедно с Cohen итранспортират ооцитите в термос до лабораторияв друга болница на 30 мин. път с такси. Там Cohenи Pez получават неоценима помош от Menezo,работещ във ветеринарен институт, койторазработва средата В-2 – “френската среда”.Първите две френски бебета, плод на двете групи,се раждат през 1982 г. Същата година групи вШвеция, Филандия, Холандия и Германиясъобщават за раждане на IVF деца.

Във Виена, Австрия - Feichtinger (един отчуждестранните членове на БАРЧЕ) и Kemeterсъздават първата двуплодна бременност през 1982г. До тази година в света има родени 11 “бебета отепруветка”. Следва бурно умножаване на IVFцентровете.

През следващите години успехите и откритията неспират своя ход:• 1982 г. - първата аспирация на яйцеклетки

чрез трансвагинална пункция (Lenz);• 1983 г. - първото замразяване на човешки

ембрион;• 1984 г. - първата бременност след GIFT;• 1986 г. - първата бременност след ZIFT

и след ооцитно замразяване;

• 1989 г. - първата витрификация на човешкиооцити;

• 1990 г. - първото раждане след преимпланта-ционно генетично диагностициране и първото описание на асистиран хетчинг.

• 1992 г.- извършване на първото ICSI от Palermo и Van Stretenhaim – най-успешната техника,въведена досега за елиминиране на неуспехите при мъжки фактор.

През 1986 г. в света има вече 2000 родени ‘ин витро‘бебета, като половината от тях са заченати вцентъра на Edwards. През 1989 г. бебетата са вече18,000.

Днес, годишно в света се раждат около 2,000,000деца, които са плод на АРТ и с тези методиуспешно се лекуват почти всички форми настерилитет. До момента ‘ин витро’ заченатитебебета са над 6,000,000.

Какво е развитието на АРТ методите в България?

У нас първи опити за ‘ин витро’ фертилизацияправи д-р Ватев от катедрата по биология набившата Медицинска Академия. В края на 70-те иначалото на 80-те г. на миналия век заедно сдоц. Живков и доц. Еврев извършват проучваниявърху миши яйцеклетки. През 1984 г. д-р Иво ид-р Стефан Тодорови успяват да осъществятоплождане при човешки ооцити, полученилапароскопски и от отворени гинекологичниоперации. За съжаление, въпреки извършенитеембрио-трасфери, не постигат бременност.

През 1985 г. в Института по ендокринология наМА, екип под ръководството на доц. Щерев илекарите д-р Й. Димитров, д-р В.Лачев и д-р В.Янков започват експерименти за ‘ин витро’оплождане на човешки яйцеклетки. Те секолаборират с доц. Ватев, който извършвабиологичната част на процедурата. Колекцията наооцитите се осъществява трансвезикално и следтова се пренасят в термос до лабораторията на доц.Ватев за оплождане и развитие. Така се стига до1987 г., когато екипът на доц. Щерев успява вечетрансвагинално (под трансвагинален ехографскиконтрол) да аспирира яйцеклетки при двестимулирани пациентки. Доц. Ватев постига доброоплождане на яйцеклетките и развитие наембрионите и след ембриотрансфер и двете женизабременяват. Първото ‘ин витро’ бебе се раждапрез м. януари 1988 г., а две седмици по-късно серажда и второто.

За съжаление ползотворното сътрудничествомежду екипа на доц. Щерев и доц. Ватев след товасе преустановява. Няколко месеца по-късно със

5Ембриология Том 4 Книжка 1

заповед на тогавашния председател на МА акад. А.Малеев се създава официално първият ‘ин витро’екип в България под ръководството на доц. Щереви се пребазира от Института по ендокринология вДУБ “Майчин дом”. В него са включени лекаритед-р Йосиф Димитров, д-р Валентин Лачев ид-р Владимир Янков.

По това време пишещият тези редове работеше вМайчин дом и от няколко години се занимаваше сопределяне оплодителната способност на човешкисперматозоиди чрез пенетрацията им в хамстеровияйцеклетки (хамстеров тест). С вътрешна заповедна директора на Майчин дом и аз бях прикрепенкъм ‘ин витро’ екипа.

Въпреки че не бяхме оборудвани с необходиматаапаратура, с голям ентусиазъм започнахме работапрез м. ноември 1988 г. Трябва да се поясни, че неразполагахме с голямо количество литература повъпроса (имахме компютър с ДОС програма, но заИнтернет не бяхме и чували). Тогава в Българиянямаше и фирми, които да ни внасят хранителнисреди. Както се знае, неволята учи и с многотрудности започнахме да си ги прави сами от средина прах, разтворени в дейонизирана вода, която смного молби и с приятелски връзки взимахме отИнститута по заразни и паразитни болести. За всякапациентка се приготвяха по 6 индивидуални среди,като за източник на белтък се използваше кръвенсерум от самата нея. Това беше една много трудо- ивремеемка дейност и много често приготвянето насредите продължаваше до малките часове на деня.

Понякога съдбата помага на новаците, а иентусиазмът ни беше много голям, така че само 2месеца по-късно (през януари 1989 г.) и след малкона брой опити получихме първата си бременност.Забременяването на тази жена, името ифизиономията на която никога няма да забравя, есвързано с един куриозен инцидент по време наембриотрансфера. Като всеки млад екип, вжеланието си постигнем бързо бременност, тогававръщахме в матката по много ембриони. За тазипациентка имахме 5 ембриона, които трябваше давърнем в присъствието на няколкоспециализиращи лекари. За изненада обаче,ембрионите не бяха попаднали в матката и впоследващата ревизия на катетъра се озовахаотново в петрито примесени с кръв. След краткаинкубация направихме последващ ембрио-трансфер, които беше успешен.

По това време, в края на социалистическия период,много се шумеше около ‘ин витрото’, така че наследващия ден същата пациентка беинтервюирана от журналисти и тя им заяви, че есигурна, че ще забременее. Така се получи първото

бебе от официално създаденият ни екип, което сероди през м. септември в Майчин дом.Родоразрешението беше чрез Цезарово сечение,което извършиха доц. Щерев и доц. Налбански.Около месец след това раждане се роди и второто нибебе. В първата година от съществуването на екипауспяхме да създадем 9 бременности. До този моментлекарствата за стимулацията и извършване на цялатапроцедура се поемаше от държавата. За съжалениеобаче, имаше дълъг списък на чакащи жени завключване в програмата за ин витро. След 10ноември 1989 г. гонадотропните хормоналнипрепарати практически изчезнаха от България.Работата намаля чувствително и на процедурата сеподлагаха жени, които се снабдяваха по неведомипътища с лекарства от чужбина.

По същото време, през 1988 г. се сформира ивторият ин витро екип и първото специализираноотделение по ин витро оплождане в България сръководител д-р Табакова в бившата АГ болница“Тина Киркова”. В екипа участват и д-р В.Йорданов, д-р Т. Янакиева, д-р В. Нецов.Първоначално като ембриолог работи доц. Ватев, амалко след това е заместен от д-р Г. Вакрилов. Презм. септември 1989 г. се ражда първото им бебе,заченато след IVF, а до края на годината още тридеца. Този екип постига и първата триплоднабременност у нас след ‘ин витро’ оплождане.

Нашият екип в първоначалния му вариантпросъществува до 1997 г. и в следствие развитиетона ‘Български синдром’ (неспособност да се работидълго време в екип) се разпадна. Доц. Шеревсъздаде частен медицински център“Репродуктивно здраве”, в който аз останах катоембриолог. Д-р Й. Димитров сформира свойчастен център, в които като ебриолог бешепривлечен доц. П. Тодоров, а малко по-късно идоц. Я. Тодоров.

Малко преди това, след като преминахаспециализация при нас, д-р М. Монастирска и д-рМ. Сариев основаха ин витро център “Олимед” въвВарна.

В следвашите години започна създаването на новиекипи и ‘роене’ на старите. До 1998 г. центровете заасистирани репродуктивни технологии се брояхана пръстите на едната ръка, но след това започвабурното им размножение.

Доц. Ватев създаде център ”Технобиоасист”, ад-р Табакова - “Репробиомед’, в който отсъздаването му през 1997 година като ембриологработи д-р Г. Николов.Основават се и центрове в Пловдив, Варна иПлевен. Може и да звучи нескромно, но голяма

6 Ембриология Том 4 Книжка 1

част от новосформираните екипи вкл. и такива отМакедония, получиха обучение в нашия център инаправиха първите си стъпки под нашетометодично ръководство. В момента в България има около 17 официалнорегистрирани “ин витро екипа”. Времето наконфронтацията между нас отдавна отшумя и вмомента, като цяло, цари колегиален климат.

През 1998 г. бе създадена Българска Асоциация постерилитет и репродуктивно здраве, в кояточленуват почти всички специалисти по стерилитети човешка репродукция. От тогава ежегодно сепровеждат конгреси на Асоциацията смеждународно участие, на които се споделят и

обсъждат най-новите постижения в тази област. През 2005 г. се учреди и Българската Асоциация поРепродуктивна Човешка Ембриология, чиетопечатно издание държите е ръцете си. Литература1. In vitro fertilization. A practical Approach. Ed. D.

Gardner. Colorado Center for Reproductive Medicine.Englewood, Colorado, USA

Адрес за кореспонденция:Димитър Баровглавен ембриолог в МЦ “Репродуктивно здраве”E-mail: icsibarov@abv.bg

Въведение: Има недостатъчни познания поотношение причините за фрагментирането насперматозоидната ДНК и нейното влияние върхуоплождането и бременността след IVF и ICSI.Напоследък изследователите фокусираха своетовнимание върху въздействието и участието нафрагментацията на ДНК и мъжкия инфертилитет.Доказано е многократно, че увреждането на ДНКпри еякулирани сперматозоиди, установено чрезTUNEL метода или Сomet assays в значителнастепен корелира негативно с оплождането ибременността при IVF, ICSI и IUI (1,11).Съобщава се зависок процент ранна апоптоза на сперматозоидитеи наблюдението за свързване на анексин-V къмсперматозоидната мембрана, признак чефрагментацията на сперматозоидната ДНК сеявява в резултат на апоптоза (11,13). В човешкитесперматозоиди е доказано също така активиранакаспаза-3, ензим даващ началото на апоптозата (14,15).Фрагментацията на ДНК може да бъдепредизвикана също така от свободни радикали (1,2),които се образуват предимно от увеличен бройлевкоцити в еякулата (1,2,4) и от сперматозоиди сцитоплазматичен остатък (1,12). Между повишенитенива на свободни радикали в семенната течност и

мъжкия инфертилитет е установена силнопозитивна връзка (2,4).

Въпреки нарастващите познания относномеханизмите и факторите, участващи в процеса наоплождане, една от 6 двойки, опитващи впродължение на 1 година да имат деца имапроблем със зачеването(6). Около 50% от причинитесе пада на мъжкия фактор, докато половината отинфертилните мъже се класифицират отпознатите причини за намалена оплодителнаспособност, към групата мъже с идиопатиченинфертилитет.

При голям брой пациенти се установяваleukocytospermia, без това да манифестираинфекция на урогениталния тракт (4). Влияниетона тези клетки и образуваните от тях свободнирадикали са обект на обширни клиничниизследвания, поради тяхното голямо значение замъжкия оплодителен потенциал(6).

В редица водещи Клинични центрове поРепродуктивна медицина са разработени ивнедрени в практиката методи с голяма

7Ембриология Том 4 Книжка 1

ДИАГНОСТИЧНИ МЕТОДИ ЗА ИЗСЛЕДВАНЕ НА СЕМЕННА ТЕЧНОСТ В ПОМОЩ НА АСИСТИРАНАТА РЕПРОДУКЦИЯ

Николова В., Станиславов Р.Университетска Болница “Майчин дом”, Семинологична лаборатория, София

DIAGNOSTIC METHODS FOR INVESTIGATION OF SEMINAL FLUID IN AID OF ASSISTED REPRODUCTION TECHNOLOGY

Nikolova V, Stanislavov R.University Hospital “Maichin dom”, Seminological laboratory, Sofia

Резюме: Независимо от нарастващите ни познания относно процеса на оплождане, все още са необходимиизследвания за въздействието на свободните радикали, причините за фрагментацията на ДНК всперматозоидите и отражението им върху оплождането и бременността. Данните от проучванията в тазинасока имат значение с цел оптимизация на условията и резултата от прилагането на асистиранитерепродуктивни техники. Методът за магнитно активирано клетъчно сортиране на клетки с увредена ДНК(MACS) предоставя възможност за оптимална чистота и извличане на годни да оплождат сперматозоиди ида дадат начало на нормална бременност.

Abstract: Independently of ever-increasing knowledge concerning the fertilization process, there is still a need for bet-ter understanding of significant impact of the reactive oxigen species on sperm DNA fragmentation and their influenceof fertilization and pregnancy. The data of the investigation in the field have purpose for optimize conditions and theresults for achieving better results in assisted reproduction technology. The method of magnetic activated cells sortingseparation with DNA damage (MACS) provides optimal purity and recovery of spermatozoa capable to fulfil fertiliza-tion and initiation normal pregnancy.

прогностична стойност по отношениеуспеваемостта на асистираните репродуктивнитехники и лечението на безплодието като цяло (16). В Клиниката по Репродуктивна Медицина,Кливланд, Охайо, САЩ, под ръководството напрофесор Agarwal бяхме обучени теоретично ипрактически на методи, като:

• Определяне на свободни радикали в семенна течност;

• Тест за количествено определяне на левкоцити в семенна течност;

• Определяне на общ антиоксидантен капацитет;• Определяне на сперматозоидната ДНК фраг-

ментация;• Магнитно активирано клетъчно сортиране на

клетки с увредена ДНК.

Ще се спрем накратко върху същността и прин-ципа на всеки от изброените методи:

Определяне на свободни радикали в семенна течностПовишени нива на свободни радикали, катосупероксидния анион (O2-), водородния прекис(H2O2), хипохлорид (OHC1) и хидроксилен радикал(OH) водят до оксидативен стрес, който води допоражения на различни нива на човешкатарепродукция (3) (фиг. 1). Те се образуват главно отбелите кръвни клетки (БКК) и по-специално отгранулоцитите и от абнормалните сперматозоиди,най-вече от сперматозоиди с цитоплазматиченостатък (10).

Принцип: Свободните радикали могат да бъдатопределени чрез хемилуминисцентен метод,използвайки като реактив луминол (5). Луминолъте изключително чувствителен и реагира съсширока гама свободни радикали при неутралнорН. Той има възможността да определи кактоекстрацелуларните, така също и интраце-

8 Ембриология Том 4 Книжка 1

Фигура 1: Места, на които свободните радикали могат да нарушат сперматозоидната функция и тяхното участие в репродуктивния процес. (Aitken et. al., Nature, 2004)

луларните свободни радикали. Свободнитерадикали имат много къс полуживот и се образуватнепрекъснато (8). Те се свързват с луминола ипроизвеждат светлинен сигнал, който след това сепревръща в електрически сигнал (фотон) в апарат,наречен луминометър. Броят на образуванитесвободни радикали се измерва като изброенифотони за 1 минута (cpm) (1,2).

Тест за количествено определяне на левкоцити всеменна течност (Endtz) тестПовечето човешки еякулати съдържат левкоцити,като преобладаващ клетъчен тип сред тях санеутрофили (4). Прекомерното наличие на тезиклетки в семенната течност (leukocytospermia)може да означава съществуването на инфекция нарепродуктивния тракт.

Нещо повече, увеличеният им брой може да бъдесвързан с отклонения в спермалния профил,включващ намаление на обема на еякулата,концентрацията и сперматозоидната подвижност,а така също загуба на сперматозоидна функциякато резултат на оксидативен стрес и/илисекретиране на цитотоксични цитокини.

Трудно е да бъде определена граничната стойностза концентрация на левкоцитите, след коятооплодителната способност може да бъде увредена.Въздействието на тези клетки зависи от мястото накоето левкоцитите навлизат в семенната течност,типа на левкоцитите, които участват и тяхнотосъстояние на активация.

Като общо правило, нормалният еякулат не трябвада съдържа повече от 5х106 кръгли клетки/мл, аброя на левкоцитите не трябва да надвишава 1х106 /мл. Когато семенната течност съдържаповече от 1х106 /мл БКК трябва да бъдат проведенимикробиологични тестове, за да се изследваналичието на инфекция.

Определяне на общ антиоксидантен капацитет(TAC)Общият антиоксидантен капацитет (ТАС) насеменната плазма беше изследван като бешеизползван кит за антиоксидантно определяне(Cat # 709001; Cayman Chemical, Ann Arbor, MI).Чрез този кит може да се определи ТАС насеменната течност. Принципът на определянетое способността на водно-; и мастно разтворимиантиоксиданти в семенната плазма да подтиснатокислението 2,2’-Azino-di-[3-ethyl-benzthiazolinesulphonate] (ABTS) до ABTS+. При използванитеусловия за реакцията, антиоксидантите в

семенната плазма причиняват подтискане наабсорбцията при 750 nm в степен, пропор-ционална на тяхната концентрация. Капацитетътна антиоксидантите, налични в пробата, дапредотвратяват окислението на ABTS, се сравнявасъс стандартен Trolox, водно разтворим аналог натокоферола. Резултатите се съобщават катомикромоли (μМ) на еквивалента Trolox. Товаопределяне измерва общата антиоксидантнаактивност на всичките нейни съставки,включително витамини, протеини, липиди,глутатион, пикочна киселина и др.

Всички проби семенна плазма бяха разредени1:10 с буфера преди да стартира изследването, зада се избегне вариабилност поради интер-ференция на плазмените протеини илиразреждането на пробата. Всички реагенти ипроби бяха темперирани на стайна t˚ преди дазапочне изследването. Пробите и стандартите наТrolox се изследваха двойно. Стандартите наТrolox и реагентите се приготвяха съгласноинструкциите на фирмата производител повреме на изследването. След центруфогиране наплаката 10 μL от стандарта и от пробите се поста-вяха в съответните кладенчета на плаката. Къмвсички кладенчета се добавяше 10 μL метмио-глобин и 150 μL хромоген. На реакцията се даваначало чрез добавянето на 40 μL Н2О2 по въз-можност по-бързо. Плаката се покрива и се инку-бира за 5 минути върху шейкър при стайна t˚.Лъчите на абсорбцията се нагласяват на 750 nm,използвайки ELх800 Absorbance Microplate Reader(BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT).

Изчисляване на резултатите.Изчисляването на скоростта на реакцията се даваот изчисляването на средната абсорбция на всекистандарт и проба. Средната аритметична наабсорбцията на стандартите като функция накрайната концентрация на Trolox μМ се използваза построяване на стандартните криви при всякоизследване, чрез които се определят неизвестнитепроби.

Пример за стандартната крива за определяне наТАС.Стандартните концентрации на Trolox саразположени върху абцисата, а абсорбцията -върху ординатата. Общата антиоксидантнаконцентрация (OAK) се изчислява, използвайкиуравнението, получено от линеарната регресия настандартната крива чрез заместване на среднатастойност за абсорбцията за всяка проба вуравнението:

9Ембриология Том 4 Книжка 1

ОAK (μМ) = неизвестна ср. ст-ст на абсорбцията – Y–пресечната точка х разр-не x 1000 наклона

Определяне на сперматозоидната ДНКфрагментацияОпределянето на увреждането на спермато-зоидната ДНК е тест, чието време дойде.Спермалният анализ е съществена част приизследването на мъжкия фактор при безплодието вбрака, но той не може да докаже финни спермалнидефекти и да отговори на причините за нара-стващия дял на мъжа при инфертилитета. Въпрекиче оценките варират, приблизително 15% отпациентите с мъжки фактор при безплодие иматнормални спермограми. Необходимо е да бъдатидентифицирани диагностични опреде-ляния насеменна течност, които да са лесни за провеждане,относително нескъпи и да имат прогностичнастойност. Тестовете, които определят спермалнотокачество трябва да идентифицират не самоспособността на сперматозоидите да достигнат домястото на оплождането, но също така тяхнатаспособност да оплодят яйцеклетката и даактивират ембри-онален растеж. Оценката наувреждането на сперматозоидната ДНК очевидноотговаря на гореспоменатата нужда за по-пълнатадиагноза на мъжкия инфертилитет (6,7).

Мъжкото репродуктивно здраве напоследък серазглежда детайлно. Съответно многобройнисъобщения в литературата заключават, чеспермалното качество намалява, докато честотатана тестикуларните ракови заболявания нарастват.Причината, стояща зад тези промени се приписвана увреждане на сперматозоидния хроматин. Презвреме на репродукцията in vivo, процеса наестествения подбор осигурява само сперматозоид снормален геномен материал да оплодияйцеклетката. При АРТ техниките обаче тозипроцес на естествена селекция се прескача, коетоводи до вероятност абнормални сперматозоиди дасе използват за оплождане на яйцеклетката. Бихмемогли да избегнем тази ситуация чрезколичествено определяне на размера и типа нагеномното увреждане на сперматозоидите,използвайки утвърдени лабораторни методи(9).

Що е нормална сперматозоидна ДНК?Сперматозоидната ДНК е организирана поспецифичен начин, което запазва ядренияхроматин компактен и стабилен. Тази ДНКорганизация позволява не само много плътнопакетираната генетична информация да бъдетранспортирана до яйцеклетката, но осигурявасъщо така тази ДНК да бъде отделена въвфизикална и химическа форма, така че да позволилесен достъп на генетичната информация запроцеса на оплождане и развитие на диплоидниязародиш. Фертилният сперматозоид има стабилнаДНК, способна да се декондензира в подходящотовреме на фертилизационния процес и да сепредаде генетичния материал без дефекти.

Кои са типовете и механизмите за увреждане наДНК?Дефектите на геномния материал всперматозоидите могат да се отнасят до форматана кондензация, или дефекти на ядрената зрялост,прекъсване на ДНК веригата, дефекти в целосттана ДНК, или сперматозоидни хромозомнианеуплоиди. Причините за тези дефекти могат дасе дължат на заболявания, прекомерна употреба налекарства, състояние на треска, повишенатестикуларна t˚, замърсяване на въздуха, тютю-нопушене, напреднала възраст и др. Молекулнитемеханизми за увреждане на ДНК пригореспоменатите състояния се изследватзадълбочено. Най-важните механизми, взети всъображение за увреждането на сперматозоиднатаДНК е абнормалното хроматиново пакетиране,свободните радикали и апоптозата. Възможно е даучастват много фактори, базирайки се наклиничната диагноза, отговорна за увреждането наДНК.

Изследване на увреждането на ДНКЗа определянето на степента на увреждане на ДНКв човешките сперматозоиди има много методи.Някои нови тестове са в процес на научноразработване. Възможността на тези нови методиза изследване да определят точно степента наувреждане на ДНК зависи от много методични ибиологични аспекти. Някои от настоящодостъпните методи оценяват целостта насперматозоидната ДНК, включващ terminaldeoxynucleotidyl transferase-mediated deoxyuridinetriphosphate-nick and labeling (TUNEL), определянена сперматозоидната хроматинова структура,(comet assay) in situ nick транслация и доказване напрекъсване на ДНК с флуоресцентна боя (DBD-FISH). Други тестове идентифицират дефектите напакетиране на сперматозоидния хроматин:оцветяване с анилиново синьо, оцветяване столуидиново синьо и оцветяване с хромомицин А3боя.

Ние трябва да изследваме връзката междуналожените тестове и да идентифицираме кои оттях корелират помежду си и кои не. Например,FISH метода за анеуплоиди, предоставяинформация за статуса на сперматозоиднатаДНК, който е различен от информацията, коятопредоставят другите тестове за изследване насперматозоидната ДНК. Научното изследванетрябва да продължи да изяснява естеството наабнормалностите, определени чрез всеки метод иоще по-важно, да идентифицира кои от тезиабнормалитети играе важна роля в спер-матозоидната геномна функция, с огледоптимизиране на прилагането на асистиранитерепродуктивни техники (14).

10 Ембриология Том 4 Книжка 1

Доказателство за ролята на сперматозоиднатаДНК в репродукциятаРешението да бъде въведен нов тест в клиничнатапрактика се основава на обема и качеството напубликуваното доказателсво. Различни изследва-ния са анализирали връзката между степента наувреждането на ДНК и честотата на оплождането,честотата на ембрионалното делене,имплантационната честота, честотата назабременяванията, честотата на живороденитебебета. Когато се публикува голямо съобщениевърху специфичен тест за увреждане насперматозоидната ДНК очевидно, че интереса отстрана на научната общественост се повишава,както и усилията теста да бъде въведен вклиничната практика. В настоящите съобщениялипсва информация за възможността на тезитестове да прогнозират изхода на нормална иабнормална бременност (например, спонтанниаборти и малформации).

В тези научни съобщения, обаче, когато 30% иповече от сперматозоидите са с увредена ДНК,партньорката трудно забременява. Bungumустановяват, че шансът да бъде постигнатабременност / раждане за пациенти, при които сепровежда вътрематочна инсеминация езначително по-висок в групата с ДНК фрагмен-тационен индекс ≤ 27%, отколкото при пациенти сДНК фрагментационен индекс > 27%. От другастрана, при групата с ДНК фрагментационениндекс над 27%, резултатите от прилагане на ICSIса значително по-добри от тези на IVF.

Henkel съобщават, че дори сперматозоидната ДНКфрагментация да не корелира с оплождането ичестотата на ембрионалната фрагментация,честотата на забременяванията при пациенти,които предприемат IVF е била значително ниска,когато TUNEL позитивните сперматозоиди са билинад 36.5%. Спонтанни аборти могат да се срещатпри нарастване степента на ДНК увреждането,(TUNEL метод) и това може да бъде причина занеизяснените спонтанни аборти. Ако сперма-тозоидната ДНК не може да декондензира следнавлизането в ооплазмата, не може да настъпиоплождане или неуспешно пост-фертилизационноразвитие може да настъпи, поради дефектнасперматозоидна ДНК.

Магнитно активирано клетъчно сортиране наклетки с увредена ДНКСперматогенезата спада към динамичнитепроцеси, обхващащи митотичното делене насперматогониите, мейотичното делене на сперма-тоцитите, морфологичната диференциация исъзряване на сперматидите и накрая, образуванетона сперматозоидите. Апоптозата е програ-

мираната клетъчна смърт, която започва презвреме на сперматогенезата, след което някои отзрелите сперматозоиди, набелязани заелиминиране по пътя на апоптозата, могат даизбегнат механизмите на отстраняване ипопадайки в еякулата да допринесат за лошотоспермално качество (13,14).

Ранното манифестиране на апоптозата включваувреждане на сперматозоидната мембрана секстернализация на фосфатидилсерина отвътрешната върху външната повърхност иразкъсване на митохондриалната мембрана.Базирайки се върху високо селективния афинитетна 35-36 kDa фосфолипид-свързващия протеинанексин-V към фосфатидилсерина, апопто-тичните сперматозоиди и сперматозоиди снарушена плазмена мембрана могат да бъдатразделени чрез супрамагнитни анексин-Vмикроперли (ANMB) на ANMB позитивни иANMB негативни фракции чрез магнитноклетъчно сортиране (MACS).

Анексин-V се използва за сепариране насперматозоиди с активирани каспази – ключовиинициатори и екзекуторни ензими на апоптозата –преобладаващи в ANMB позитивната фракция,докато ANMB негативните сперматозоиди сехарактеризират с най-ниската активност наапоптозната сигнална каскада. Системата MACSняма увреждащи ефекти върху сперматозоидниямотилитет, жизненост и морфология (14).

Метод за разделяне на сперматозоиди с нарушенимембрани чрез MACSСперматозоидните суспензии се разделят на двефракции чрез преминаване през магнитно поле(Mini MACS; Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach,Germany), като принципа се базира на свързванетона ANMB към фосфатидилсерина (самосперматозоиди с нарушена мембрана и увреденаДНК). Фосфатидилсерина може да бъдепредставен върху повърхността на сперма-тозоидите поради екстернализация през време наапоптоза, а също така при увреждане на ДНК отсвободните радикали.

Накратко, промити сперматозоиди се инкубират с100 μL ANMB на стайна t˚ за 15 минути и сепоставят върху разделяща колонка, съдържащажелезни топчета. Сперматозоидите, белязани сANMB (ANMB позитивни), се задържат вколонката за разделяне, която се поставя в магнит,докато сперматозоидите с неувредени мембранипреминават през колонката (ANMB негативни).Силата на магнитното поле е 0.5 Tesla междуполюсите на магнита и до 1.5 Tesla в железнитесфери на колоната. След изваждането на

11Ембриология Том 4 Книжка 1

12 Ембриология Том 4 Книжка 1

колонката от магнитното поле задържанатафракция се елуира, като се използва анексинсвързващ буфер.

Заключение: В обобщение на гореказаното,сперматозоидната ДНК е много сложна структураи способността да кондензира / декондензира еедин от съществените критерии, за да бъдезапазена оплодителната способност насперматозоидите. Целостта на ДНК в спер-матозоидите е от важно значение за точнотопренасяне на генетичната информация и от другастрана за доброто здраве на бъдещото поколение.Това е една независима мярка за спермалнотокачество и предоставя допълнителна диагно-стична и прогностична възможност, наред сконвенционалните спермални параметри, замъжкия оплодителен потенциал. Многобройниизследвания са установили негативна корелациякакто in vivo, така и in vitro между честотата назабременяването и процента на сперматозоидите сувредена ДНК в спермалните проби.

Литература1. Aitken RJ, Krausz C 2001 Oxidative stress, DNA

damage and the Y chromosome. Reproduction 122,497-506.

2. Aitken RJ, West KM 1990 Analysis of the relationshipbetween reactive oxygen species production andleukocyte infiltration in fractions of human semenseparated on Percoll gradients. International Journalof Andrology 13,433-451.

3. Aitken RJ, Koopman P, Lewis SE 2004 Seeds ofconcern. Nature; 432:48-52.

4. Aitken RJ, West KM, Buckingham D 1994 Leukocyticinfection into the human ejaculate and its associationwith semen quality, oxidative stress, and spermfunction. Jouranl of Andrology 15, 343-352.

5. Agarwal A, Saleh RA, Bedaiwy MA 2003 Role ofreactive oxygen species in the pathophysiology ofhuman reproduction. Fertil Steril 79, 829-43.

6. Bungum M 2005 Reply to: sperm chromatin structuralassay versus hypoosmotic swelling test in predictingthe need for in vitro fertilization withintracytoplasmic sperm injection. HumanReproduction 20, 841-2.

7. Duran EH, Morshedi M, Taylor S, Oehninger S 2002Sperm DNA quality predictsintrauterineinsemination outcome: a prospective cohort study.Human Reproduction 17, 3122-3128.

8. Henkel R, Ichikawa T, Sanchez R 1997 Differentiationof ejaculates in which reactive oxigen species aregenerated by spermatozoa or leukocytes. Andrologia29, 295-301.

9. Irvine DS, Twigg JP, Gordon EL et all. 2000 DNAintegrity in human spermatozoa: relationship withsemen quality. Journal of Andrology 21, 33-44.

10. Iwasaki A, Gagnon C 1992 Formaton of reactiveoxigen species in spermatozoa of infertile patients.Fertility and Sterility 57, 409-416.

11. Lopes S, Sun JG, Jurisicova A, Meriano J, Casper RF1998a Sperm deoxyribonucleic acid fragmentation isincreased in poor-quality semen samples andcorrelates with failed fertilization in intracytoplasmicsperm injection. Fertility and Sterility 69, 528-532.

12. Lopes S, Jurisicova A, Sun JG, Casper RF 1998bReactive oxigen species: potential cause for DNAfragmentation in human spermatozoa. HumanReproduction 13, 896-900.

13. Oosterhuis GJEMulder AB, Kalsbeek-Batenburg E etall. 2000 Measuring apoptosis in human spermatozoa:a biological assay for semen quality? Fertility andSterility 74, 245-250.

14. Sakkas D, Mariethoz E, Manicardi G et all. 1999 Originof DNA damage in ejaculated human spermatozoa.Reviews of Reproduction 4, 31-37.

15. Sun JG, Jurisicova A, Casper RF 1997 Detection ofdeoxyribonucleic acid fragmentation in humansperm: correlation with fertilization in vitro. Biologyof Reproduction 56, 602-607.

16. World Health Organization 1999 WHO LaboratoryManual for the Examination of Human Semen andSperm-Cervical Mucus Interaction. CambridgeUniversity Press, Cambridge.

Адрес за кореспонденция:Весела Николова, дбСеминологична лабораторияСБАЛАГ”Майчин дом” ЕАДул.”Здраве”2, СофияE-mail: rstanik@abv.bg

При нормален овулаторен цикъл на жената серазвива само един фоликул, съдържащ еднаяйцеклетка (ооцит), която евентуално би могла дабъде оплодена. В програмите за оплождане ‘ин-витро’ се използват препарати, предизвикващиедновременното съзряване на повече фоликули.Независимо от схемата, по която се стимулиратяйчниците (протокол за овариална стимулация),целта е при пункция на предовулаторнитефоликули да се аспирират повече от еднаяйцеклетки (обикновено 8-12). Ооцитите сеоплождат чрез рутинно IVF или ICSI и на 2-5 денслед пукцията в матката на жената сетрансферират 1-3 от получените зиготи.Останалите могат да бъдат замразени. Техникитеза криоконсервация на предимплантационниембриони (програмно замразяване и витри-фикация) са добре отработени и се използватрутинно в клиничната практика(1). По-голямопредизвикателство за ембриолозите представлявавъзможността за успешна криоконсервация наооцитите преди оплождане.

Най-общо случаите, в които се налага замразяванена ооцити, са следните:• Злокачествени заболявания (предстояща

химио- или лъчетерапия, овариектомия).Следва да се отбележи, че при някои от тяххормоналната стимулация е противопоказана ив такъв случай се прибягва към крио-консервация на овариална тъкан;

• Фертилно “застраховане” (професионалнакариера, отсъствие на партньор);

• Законови, религиозни и етични ограничения(напр. в страни като Италия, Германия,Австрия и др. замразяването на ембриони езабранено);

• Донация на ооцити;

• Медицински показания (остър хиперстимула-ционен синдром, невъзможност да се получисеменна течност в деня на процедурата и др.)

Вследствие биологичните си особености, ооцититеса сравнително “труден” обект за крио-консервация. За разлика от сперматозоидите иклетъчните култури, при които загубата наизвестно количество клетки в процеса наконсервация не се отразява съществено накрайният изход, броят на получените ооцити еограничен, всеки от тях се замразяваиндивидуално и следва да се подхожда с особеновнимание. Може да се каже, че в случая важипринципа “всичко или нищо”. В този аспектпредимплантационните ембриони са значително“по-благодатен” обект за консервация, тъй катопри криодеструкция на отделни бластомериостаналите са в състояние да продължатразвитието си.

Известно е, че ооцитите са най-големите клетки вчовешкия организъм (около 180 пъти по големи отсперматозоидите). Правилната им форма обуславяниското съотношение повърхност/обем. Това,както и високата им кумулативна маса, силнозатруднява тяхната дехидратация и насищане скриопротектори. Наличието на “zona pellucida”също затруднява процеса. През първата седмицана ембрионалното развитие кумулативната масана клетките намалява експоненциално, като приекспандиралия бластоцист тя е от 1:10 до 1:100 по-малка в сравнение с тази на ооцита. По подобенначин намалява и съдържанието на вода вклетките. Това е една от причините за по-добратакриотолерантност на ембрионите в сравнение сяйцеклетките.

ВИТРИФИКАЦИЯТА – ЕФЕКТИВЕН МЕТОД ЗА КРИОКОНСЕРВАЦИЯ НА ООЦИТИ

П. ТодоровИнститут по биология и имунология на размножаването – БАН

13Ембриология Том 4 Книжка 1

VITRIFICATION –EFFECTIVE METHOD FOR OOCYTES CRYOPRESERVATION

P. TodorovInstitute for biology and imunology of reproduction – BAS

Мембраните на ооцитите са силно чувствителникъм температурните промени. Охлажданетопредизвиква бърз фазов преход на липидите оттечно в гелообразно състояние. Това е необратимпроцес, който е детриментален за бъдещоторазвитие. Интересен и за момента необясним ефактът, че на следващия етап – след оплождането,мембраните на зиготите стават по-криоустойчиви (2).

При криоконсервация се наблюдават промени вцитоскелета и делителното вретено на ооцитите.Те са следствие от различни фактори на процеса нанискотемпературна консервация – механични(образуване на вътреклетъчни кристали),термални (деполимеризация на микротубулите),химични и др. Увреждането на центриолите, кактои загубата на микротубули води до анеуплоидия.Хромозомните аберации намаляват процента наоплождане и повишават честотата на раннитеаборти (3). Макар и рядко, описани са случаи наконгенитални малформации при деца, заченатичрез оплождане на замразени ооцити.

Замразяването предизвиква промени в корти-калните гранули, което може да компрометиракортикалната реакция (респ. нормалнотооплождане) при гаметите след криоконсервация (4).От друга страна, охлаждането на ооцитите до 4 oС,както и инкубирането им с някои криопротектори(ДМСО; 1,2-пропандиол) предизвикват втърдяванена “zona pellucida” (5). Тези промени могат да бъдатизбегнати чрез добавяне на фетален серум къмсредата за замразяване. Алтернативен подход еоплождане на размразените ооцити чрез ICSI.

Въздействието на различни химични и физичнифактори предизвиква партеногенетична акти-вация на яйцеклетките. Не са редки случаите,когато след криоконсервация се наблюдавапартеногенеза(6). Всичко това предполагазадълбочени криобиологични изследвания върхутози вид биообекти.

Първите експерименти в областта накриоконсервацията на женски гамети сапроведени през 1958 г. (7). През седемдесетте годинина миналия век се появяват съобщения за успешнозамразяване на миши яйцеклетки, довели дораждането на живо потомство (8,9). Първото бебеслед успешно замразяване и оплождане начовешки ооцити се ражда през 1986 г. (10). Вследващите 10 години в света се раждат още около200 деца (11,12). През 1997 г. е осъществено успешноICSI на размразена яйцеклетка (13). Във всички тезислучаи като метод за криоконсервация се използватака нареченото “конвенционално” (програмно)замразяване. Характерни за него са бавнитескорости на охлаждане и използването на ниски

дози криопротектор (1,5М ДМСО или 1,2-пропандиол). Ниската успеваемост на методаналага търсенето на нови, алтернативнитехнологии за криоконсервация на човешкиооцити, включително витрификация.

Витрификацията е метод за криоконсервация, прикойто не се наблюдава образуване на кристали исистемата замръзва в аморфно, стъклоподобносъстояние. Това се постига чрез използването насвръхбързо замразяване (директно потапяне напробите в течен азот, при което скоростта наохлаждане варира от 2,000 до над 20,000 oС/мин, взависимост от вида на контейнера), високаконцентрация на криопротекторите и малък обемна замразяваните проби (14). Първите опити завитрификация на живи клетки са проведени през30-те години на миналия век (15). През 1985 г. есъобщено за успешна витрификация на 8-клетъчнимиши ембриони (16). Понастоящем процедурата сеизползва рутинно в центровете за асистиранарепродукция и в животновъдството за замразяванена предимплантационни ембриони. Има данни зауспешна витрификация на ембрионални стволовиклетки (17), на овариална тъкан (18), на мезенхимнистволови клетки (19) и др. Витрификацията има инякои преимущества в чисто технологичен аспект –не се изисква скъпоструваща апаратура (различнитипове и видове програмни замразители) испециално обучен персонал, значително сесъкращава времето за криоконсервация, намалявасе разходът на течен азот.

Проучванията по свръхбързо замразяване начовешки яйцеклетки започват в Австралия в средатана 80-те години (20). След 15-годишни изследвания втази област трудът на учените се увенчава сраждането на първото бебе през 1999 г. (21). Успехът епостигнат след криоконсервация на 17 ооцита подзащитата на етиленгликол (40%) и 0,6М захароза.През 2003 г. са публикувани резултатите от голямасерия изследвания относно възможностите завитрификация на женски гамети (22). Авторитезамразяват 474 кумулус-ооцитни комплекси (зрели инезрели), като за криопротектори използват 5,5Метиленгликол и 1,0М захароза. За ускоряванескоростта на охлаждане, клетките са замразенивърху електронномикроскопски мрежички.Резултатите са 68,7% преживяемост, 71.7%оплождане, 6.4% имплантация и 6 родени бебета от21 ембриотрансфера (21.4%). До март 2006 г. всветовен мащаб са отчетени още 40 раждания и 51развиващи се бременности (23). Kъм момента, следвитрификация на ооцити, са родени над 3000 бебета.В България първата и засега единствена бременностс използването на замразени яйцеклетки е полученав АГ Медицински Център “Димитров” през 2009 г. (24). Следва да се отбележи, че сравнителните

14 Ембриология Том 4 Книжка 1

проучвания убедително показват преимуществатана витрификацията пред програмнотозамразяване (25,26). По данни на различни автори,преживяемостта на ооцитите след програмнозамразяване е между 40-60%, а процентът наоплождане - около 55%. След витрификация 85-96% от клетките запазват виталитета си, апроцентът на оплождане достига 80%. При това несе наблюдават различия в развитието на такаполучените и контролните ембриони (27). Мащабнопроучване показва, че усложненията при раждане,теглото на новородените и честотата наконгениталните аномалии (2,5%) след витри-фикация на ооцити са съпоставими с тези принормалното забременяване или рутинно IVF (28).

Независимо от постигнатите успехи и все по-широкото прилагане на метода в клиничнатапрактика, в областта на витрификацията наженски гамети има и ред дискусионни въпроси. Напърво място, това е стадият на развитие наооцитите. Интересен и ненапълно изясненфеномен е промяната в криоустойчивостта им впроцеса на матурация. Въпреки минималнитеразлики в размера и формата, незрелите клеткиобикновено са по-чувствителни към процеса накриоконсервация от тези, намиращи се на стадийметафаза II. Почти всички получени до моментабременности са след витрификация на зрелиооцити. Доказано е, че процентът на оплождане имчрез ICSI (79,2%) не се различава достоверно от тозипри незамразените (83,3%) (29). На стадий профаза Iооцитите са по-малки, с плътно прилепнала “zonapellucida”, латентен метаболизъм и пакетирани вядрото хромозоми. Те се характеризират с по-ниска преживяемост (37%) и способност заматурация (20%) след криоконсервация (30). Порадитова се препоръчва, след получаване, незрелитеяйцеклетки да се култивират известен период отвреме, необходим за тяхната матурация и след товада бъдат витрифицирани.

Спорен е въпросът дали трябва да се отделяткумулусните маси преди замразяване. Повечетоавтори поддържат идеята, че ооцитите трябва дабъдат денудирани преди витрификация (31,32).Други предлагат частично отделяне на кумулуса (30).При криоконсервация на незрели ооцити не ежелателно отделянето на кумулусните клетки,тъй като те подпомагат матурацията следразмразяване.

Изборът на оптимален времеви интервал междуразмразяването и оплождането е важен, както засамата фертилизация, така и за последващоторазвитие на ембриона. Част от криоуврежданиятасе репарират в рамките на 1 до 3 часа следразмразяване. Особено важна е реполи-

меризацията на делителното вретено. Времето завъзстановяване на вътреклетъчните структури е впряка връзка с избрания протокол закриоконсервация (26). Повечето автори препоръчватоплождането да се извършва 2-3 часа следразмразяване на ооцитите.

Съществуват и ред организационни въпроси –например дали да се замразяват всички получениооцити, или само тези с добро качество иопределена степен на зрялост. Някои екипи дорипрепоръчват преди криоконсервация да се правиPGD на полярното телце и да се замразяват самояйцеклетки без нарушения в хромозомния набор.От друга страна, не е ясно доколко нарушениятана zona pellucidа и цитоплазмената мембрана,настъпващи при аспириране на полярното телцеили други микроманипулации (напр. трансфер нацитоплазма), се отразяват на успеваемостта напоследващото замразяване.

В повечето случаи, за защита на ооцитите привитрификация се използват среди, съдържащикомбинация от различни проникващи (ДМСО,етиленгликол, глицерол) и непроникващи(захароза, Фикол-70 и др.) криопротектори.Първоначално клетките се еквилибрират в среда,съдържаща сравнително ниски (1,5М) концен-трации на веществата, след което се прехвърлят въввитрификационния разтвор. Независимо отвисоката си токсичност, ДМСО е основенкомпонент на средите за витрификация. Нашиизследвания показват, че отсъствието на ДМСО вразтвора редуцира съществено способността заматурация на човешки GV-ооцити следразмразяване (33). От друга страна, 5-минутнатаинкубация с веществото при 37 оС ги активира иводи до партеногенетично делене.

Базирайки се на получените резултати, ниеизползваме краткотрайна експозиция (не повече от1 мин) на гаметите при стайна температура въввитрификационния разтвор, съдържащ ДМСО.Наред с по-ниската температура на еквилибрация(стайна или при 4 oС), някои автори препоръчват сцел намаляване токсичния ефект на ДМСО къмкриозащитните среди да се добавя ацетамид. Другважен проникващ криопротектор в състава насредите е етиленгликолът. Веществото се отличавас ниска токсичност и добри криозащитни свойства,особено в комбинация с ДМСО. Присъствието назахароза в системата има значителен осмотиченефект. Прибавянето й към средата за замразяваневоди до дехидратация на клетките истабилизиране на клетъчните мембрани. Следразмразяване, яйцеклетките се инкубиратпоследователно в разтвори с понижаваща секонцентрация на захароза с цел “отмиване” на

15Ембриология Том 4 Книжка 1

16 Ембриология Том 4 Книжка 1

проникващите криопротектори и последващарехидратация на клетките. Фиколът е нейоненсинтетичен полимер на захарозата. Добавянето мукъм разтвора за витрификация води доповишаване на вискозитета на средата. Отразновидностите му най-широко приложениенамира Фикол-70 (с молекулна маса 70 KDa).Следва да се отбележи, че в момента повечетофирми предлагат готови среди за витрификация исъответните протоколи за тяхното използване,което в значителна степен улеснява работата наембриолозите. В чисто научен аспект, интереспредставлява използването на естественибиологични антифризи (напр. вещества,изолирани от кръвта на някои арктически риби,възможността за инжектиране на непроникващикриопротектори в цитоплазмата на ооцита спомощта на микроманипулационни техники и др.)

Друг важен въпрос при витрифицацията наооцити е изборът на подходящ носител(контейнер). Основните изисквания къмконтейнера за витрификация са следните:- малък обем на разтвора за витрификация

(осигурява добра топлопроводимост, високискорости на охлаждане, безкристалнозамръзване);

- да е достъпен и удобен за работа;- да е сигурен (както по отношение на загуба на

ооцитите, така и по отношение на евентуалнаконтаминация).

При първите успешни опити за витрификация наооцити и предимплантационни ембриони саизползвани 0,25 мл пайети (conventional straw) (16).Замразяването се осъществява чрез директнопотапяне на пайетите в течен азот или междиненхладоносител (напр. предварително охладен до -180 oС алуминиев окис). Методът е сравнителносигурен (пайетите се запечатват преди

замразяване, удобни са за маркиране) и все още сеизползва рутинно в животновъдството. Катонедостатък следва да се отбележи сравнителноголемият обем, което не позволява достигането надостатъчно високи скорости на охлаждане.Съвременни модификации на метода са таканаречените “OPS – open pulled straw, CPS - closedpulled straw, Hemi-straw system”, които сеизползват с успех в медицинската практика.Има доста съобщения за успешна витрификацияна ооцити и ембриони върху електронно-микроскопски мрежички (еlectron microscopecopper grids). Ооцитите се поставят наповърхността на мрежичката, а долната й част сепоставя върху филтърна хартия с цел намаляванеобема (попиване) на витрификационния разтвор,след което мрежичката се потапя в течен азот.

Широко използван в практиката е така нареченият“cryotop” метод. Устройството за замразяване сесъстои от фин полипропиленов връх (0,4 ммширина х 20 мм дължина х 0,1 мм дебелина), върхукойто се поставят ооцитите, прикрепен къмхолдер. След потапяне в течния азот носителят сепоставя в защитен пластмасов контейнер.Недостатък на метода е директният контакт наклетките с азота. Съществуват и редица другиконтейнери, които се използват както завитрификация на ооцити, така и напредимплантационни ембриони (табл.1).

Гореизложените резултати, както и собственият ниопит ни дават основание да твърдим, чевитрификацията е ефективен метод закриоконсервация на женски гамети, койтонесъмнено ще намира все по-широко приложениев клиниките за асистирана репродукция,включително и в България.

Метод Автор, годинаStraw Rall and Fahy, 1985Direct dropping into liquid nitrogen Launda and Tepla, 1990Electron microscopic grids Steponkus et al, 1990Minimum drop size (MDS) Arav, 1992Open pulled straw (OPS) Vajta et al, 1992Minimum volume cooling (MVC) Hamawaki et al, 1999Cryoloop Lane et al, 1999Glass micropipettes (GMP) Kong et al, 2000Solid surface vitrification (SSV) Dinnyes et al, 2000Hemi-straw system (HSS) Vanderzwalmen et al, 2000Cryotop Kuwayama and Kate, 2000Nylon mesh Matsumoto et al, 2001Closed pulled straw (CPS) Chen et al, 2001Flexipet denuding pipette (FDP) Liebermann et al, 2002Cryotip Kuwayama et al, 2005Cryoleaf Chian et al, 2005Direct cover vitrification (DCV) – for ovarian tissue Chen et al, 2006

Табл. 1 - Методи за витрификация на ооцити и ембриони

17Ембриология Том 4 Книжка 1

Литература1. 1. Tucker M.J., Liebermann J. Vitrification in

assisted reproduction. Informa Healthcare UK Ltd;2007: p304

2. Ghetler Y., Yavin S., Shalgi R. The effect of chilling onmembrane lipid phase transition in human oocytesand zygotes. Human Reproduction 2005, 20: 3385-9

3. Smith GD, Silva E., Silva CA. Developmentalconsequences of cryopreservation of mammalianoocytes and embryos. Reprod. Biomed. Online 2004,9: 171-8. Review

4. Agca Y., Liu J., Rutledge J. Effect of osmotic stress onthe development at competence of GV and metaphaseII stage bovine cumulus oocyte complexes and itsrevelance to cryopreservation. Mol. Reprod.Development 2000, 55: 212-9

5. Stachecki J., Cohen J. An overview of oocytecryopreservation. Reprod. Biomed. Online 2004, 9:152-63

6. Isachenko V, Montag M, Isachenko E Asepticvitrification of human germinal vesicle oocytes usingdimethyl sulfoxide as a cryoprotectant Fertility andSterility 2006, 3: 741-7

7. Sherman JK, Lin TP. Survival of unfertilized mouseeggs during freezing and thawing. Proc Soc Exp BiolMed 1958, 98: 902–5

8. Parkening TA, Tsunoda Y, Chang MC. Effect ofvarious low temperatures, cryoprotective agents andcooling rates on the survival, fertilizability anddevelopment of frozen-thawed mouse eggs. J ExpZool 1976, 197: 369 –74.

9. Whittingham DG. Fertilization in vitro anddevelopment to term of unfertilized mouse oocytespreviously stored at _196°C. J Reprod Fertil 1977;49:89–94.

10. Chen G. Pregnancy after human oocytecryopreservation. Lancet 1986; 1: 884-6

11. Al-Hasani S, Diedrich K, van der Ven HCryopreservation of human oocytes. Hum Reprod1987, 2: 695–700

12. Tucker M, Wright G, Morton F, Shanguo L, Massey Y,Kort H. Preliminary experience with human oocytescryopreservation using 1,2-propanediol and sucrose.Hum Reprod 1996, 11: 1513–5

13. Porcu E, Fabbri R, Seracchioli R, Ciotti PM, Magrini O,Flamigni C. Birth of a healthy female afterintracytoplasmic sperm injection of cryopreservedhuman oocytes. Fertil Steril 1997, 68: 724–6

14. Shaw J.M., Jones G.M. Terminology associated withvitrification and other cryopreservation procedure foroocyte and embryos. Hum Reprod Update 2003; 9:583-605.

15. Luyet B. The vitrification of organic colloids and ofprotoplasm. Biodyn 1937, 1:1-14

16. Rall WF, Fahy GM. Ice-free cryopreservation ofmouse embryos at -196oC by vitrification. Nature1985; 313:573-5

17. Reubinoff BE, Pera MF, Vajta G, Trounson AO.Effective cryopreservation of human embryonic stemcells by the open pulled straw vitrification method.Hum Reprod 2001; 16:2187-94

18. Isachenko V, Isachenko E, Todorov P., Cryobankingof human ovarian tissue for anti-cancer treatment:Comparison of vitrification and conventionalfreezing. CryoLetters 2009, 6: 449-54

19. Todorov P., Hristova E., Konakchieva R. Comparativestudies of different cryopreservation methods formesenchymal stem cells derived from human fetal liver. CellBiology International 2010, in press

20. Trounson A., Peura A., Kirby C. Ultrarapid freezing: anew low-cost and effective method of embryocryopreservation. Fertil. Сterility 1987, 5: 843-50.

21. Kuleshova L., Gianaroli L., Magli C. Birth followingvitrification of a small number of human oocytes: casereport. Human Reproduction 1999, 14: 3077-9

22. Yoon TK, Kim TJ, Park SE Live births aftervitrification of oocytes in a stimulated IVF/ETprogram. Fertil. Sterility 2003, 79: 1323-6

23. Oktay K., Cil AP, Bang H. Efficienty of oocytecryopreservation: a meta-analysis. Fertil. Steril. 2006,86: 70-80

24. Тодоров П., Димитров Й. Първи случай набременност в България след оплождане итрансфер на размразени яйцеклетки. 10-тиНационален Конгрес по стерилитет,контрацепция, хормонозаместителна терапия игинекологична ендоскопия с международноучастие, 23-26 Април 2009, Несебър

25. Cao YH, Xing Q., Li L. Comparison of survival andembryonic development in human oocytescryopreserved by slow-freezing and vitrification.Fertil. Sterility 2009, 4:1307-11

26. Ciotti PM, Porcu E, Notarangelo L Meiotic spindlerecovery is faster in vitrification of human oocytescompared to slow freezing. Fertil. Sterility 2009, 6:2399-407

27. Magli MC, Lappi M, Ferraretti Impact of oocytecryopreservation on embryo development. FertilSteril 2009. Epub ahead of print

28. Chian RC, Huang JYJ, Tan SL Obstetric and perinataloutcome in 200 infants conceived from vitrifiedoocytes. Reprod Biomed Online 2008;16:608–10.

29. Rienzi L., Romano S., Albricci L. Embryodevelopment of fresh ‘versus’ vitrified metaphase IIoocytes after ICSI: a prospective randomized sibling-oocyte study. Human Reproduction 2010, 1:66-73

30. Kuwayama M., Vajta G., Kato O. Highly efficientvitrification method for cryopreservation of humanoocytes. Reprod. Biomed. Online 2005, 11: 300-8

31. Chian RC, Son WY., Huang JY High survival ratesand pregnancies of human oocytes followingvitrification: preliminary report. Fertil. Sterility 2005,84 (Suppl.1): S36

32. Lucena E., Bernal DP, Lucena C. Succesful ongoingpregnancies after vitrification of oocytes. Fertil.Sterility 2006, 85: 108-11

33. Isachenko V, Nawroth F., Todorov P. Vitrification ofpronuclear embryos: Research ground of aseptictechnology and application for oocytes andblastocysts. Embryology 2007, 1: 3-13

Адрес за кореспонденция:П.Тодоров, ИБИР-БАНСофия 1113, бул. “Цариградско шосе”№73E-mail: plamen@ivf.zzn.com

18 Ембриология Том 4 Книжка 1

През 2009 година беше реализиран проект засъздаване на неправителствена организация собщественополезна цел, която да обединявасъвместните професионални усилия и интереси набългарски учени и специалисти в областта на ин-витро биотехнологиите, регенеративнатамедицина и клетъчната терапия – БългарскаАсоциация по Регенеративна Медицина, съсседалище гр. София. Управителният съвет наорганизацията се състои от лекари и биолози,доктори и доктори на науките, представители наразлични научни и клинично-приложни звена.Основаването на aсоциацията беше продиктуваноот острата нужда да бъдат популяризирани вБългария чрез разбираем и научно обоснованподход авангардните биотехнологии на базата настволови клетки, постепенно формиращи всветовен мащаб ново, бурно развиващо семедикобиологично направление. По този начиносновната мисия на сдружението беше естественоформулирана като дейност в полза наинформационното биотехнологично общество иприобщаването му към най-значимитевисокоспециализирани научни постижения.

В световен мащаб развитието на регенеративнатамедицина получи мощен тласък в последнитегодини с поредица от научни открития в областтана биологията на стволовите клетки и тъканнотобиоинженерство, които придават на това новонаправление все по-голямо значение вперспективите за лечението на тежки заболявания,за които няма подходяща специфична терапия.Пренасочването на човешки и капиталов ресурс втази иновативна област се отразява в интензивнотосъздаване на научно-изследователски и развойниструктури, имащи за цел развитие и приложениена новите биотехнологии в хуманната иветеринарната медицина. Бързо развиващата семрежа от национални и международнинеправителствени организации и научно-изследователски центрове в Европа и света, чрез

организираните от тях многобройнимеждународни прояви за обучение и дискутиранена актуални проблеми оказват все по-осезаемовъздействие върху формирането на националниполитики и привличането на инвеститорскиинтерес в тази област.

В България през последните години бяхарегистрирани няколко банки за получаване исъхранение на стволови и репродуктивни клетки,сформират се звена, които заявяват сериозноучастие в новата област чрез разработването наразлични ниши от научно-приложни изследвания.Членове на асоциацията активно работят върхунаучни проблеми свързани с изясняванебиологията и криобиологията на стволовитеклетки, което намира израз в реномирани научнипубликации у нас и в чужбина. За първи път подръководството на ст.н.с. Пламен Тодоровв края на 2009 г. в България беше защитен научентруд за придобиване на докторска степен върхукриоконсервацията на стволови клетки,изолирани от човешки фетуси. Чрез активнанаучно-приложна дейност в областта на ин-витротехнологиите, амбицията на създателите на БАРМе асоциацията да се превърне в обединяващо звеноза трансфер на научни технологии към практикатапри съдействието на българския бизнес. Тозипроцес може да бъде успешен само чрезобединяване и насочване усилията на всичкиучастници в него към обществените нужди, за дауспеем заедно да изградим национални стандартив областта на клетъчната терапия итрансплантационната медицина в съгласие севропейските стандарти и директиви. ДалиБългарската Асоциация по РегенеративнаМедицина ще успее да изпълни своята благороднамисия и да стане част от този процес може дапокаже само бъдещето.

С пожелания за успех и уважение към всички Вас

БЪЛГАРСКАТА АСОЦИАЦИЯ ПО РЕГЕНЕРАТИВНА МЕДИЦИНА

В ОБЩЕСТВЕНА ПОЛЗА ЗА РАЗВИТИЕТО НА СЪВРЕМЕННИ КЛЕТЪЧНИ БИОТЕХНОЛОГИИ

Доцент Росица Конакчиева, избрана от Учредителното събрание за Председател на БАРМ, е биолог по образование, док-тор на биологичните науки, дългогодишен старши научен сътрудник в ИБИР-БАН и хоноруван преподавател в СУ

„Св. Кл. Охридски”. Носител на множество престижни международни и национални отличия, водещ изследовател,специалист по невроендокринология и клетъчна биология, експерт по алтернативни ин-витро методи към ЕК.

19Ембриология Том 4 Книжка 1

Световната Здравна Организация (WHO) най-накрая призна безплодието за болестСЗО, съвместно с Международния комитет замониторинг на асистираните репродуктивнитехнологии (ICMART), формално признаинфертилитета за заболяване в новиямеждународен речник на АРТ термините,публикуван едновременно във Fertility and Sterilityи Human Reproduction. Според дефиницията вречника: “Безплодието е заболяване нарепродуктивната система, дефинирана катоневъзможност да се постигне клиничнабременност в продължение на 12 и повече месецана редовни полови контакти без прилаганаконтрацепция”

Според Dr William Gibbons, Президент наАмериканското общество по репродуктивнамедицина (ASRM): “Това е крайъгълен камък вразвитието на отношението към това състояние;ние приветстваме СЗО за това усилие и за яснотоотношение към болестния статут на безплодието.Твърде дълго хората с това заболяване бяханеглижирани. Застрахователните компании(осигурителните системи) не покриват разходитеза лечението, правителствата не влагат ресурси заизучаването му и в крайна сметка страдатпациентите. Надяваме се, че международноторазпознаване на инфертилитета като заболяванеще позволи той да бъде третиран наравно сдругите известни болести.”

Новите EU правила ще оскъпят значително IVFпроцедуритеВсички пациенти, които се подлагат наaсистирани репродуктивни технологии, следвада бъдат скринирани между отделните опити затрансмисивни заболявания, според изискваниятана директивите за донорство на тъкани и клетки.Това, обаче, води до значително нарастване наразходите за пациентите при извършване напоследователни АРТ опити. До сега двойкитебяха изследвани еднократно за трансмисивни

заболявания (HIV, хепатит B, хепатит С исифилис) преди започване на терапията.

На заседание на Европейската комисия (EC) от19-20 Октомври 2009 г. бе изказано становището,че всички пациенти следва да се изследват предивсеки опит за АРТ и това не е тема, която подлежина национално интерпретиране чрезразпоредбите на отделните държави-членки (т.е.следва да очакваме, че и в България ще има нови,по-строги изисквания към предварителнитеизследвания на пациентите).

Понастоящем, в Европа, се осъществват около500,000 IVF (in vitro fertilisation), както и около400,000 IUI ( intrauterine insemination) процедуригодишно. Според изисления на Европейскотообщество по човешка репродукция иембриология (ESHRE), се очаква това новоправило да струва на пациентите (респ. наосигурителните системи, където се покриват иизследванията) допълнително около 140 милионаЕвро годишно. Към тези разходи следва да седобавят и тези за администрация, работнизаплати, документация и други.

Според Prof Peter Braude, ръководител насекцията по женско здраве в King's College,London: “Тази нова интерпретация на EСдирективата е от особено значение заспециалистите по репродуктивна медицина, тъйкато това значително ще повлияе себестойносттана процедурите за лечение на безплодието и щенатовари както индивидиалните пациенти, такаи здравно-осигурителната система (NHS). Докатодонякъде сме склонни да приемем странната ‘ЕСидея’, че пробите семенна течност от съпруга савид “партньорска донация” и могат да бъдаттестирани поне еднократно за трансмисивниинфекции, то последното тълкование натъканните директиви означава, че при всичкидвойки и мъжете и жените следва да бъдаттестирани наново при всяка поредна процедура

НОВИНИ ОТ СВЕТОВНАТА МРЕЖАП. Тодоров 1, Г. Николов 2

1. Ин витро АГ Медицински център “Димитров”, София2. МЦ “РепроБиоМед” – София

NEWS FROM THE INTERNETP. Todorov 1, G. Nikolov 2

1. Center for Human Reproduction “Dimitrov”, Sofia, Bulgaria2. Medical center “ReproBioMed” Ltd, Sofia, Bulgaria

20 Ембриология Том 4 Книжка 1

Предстоящи научни форуми и събития

The 26th Annual Meeting of the European Society of Human Reproduction and Embryology Rome, Italy27 - 30 June 2010

Basic course on “Update on pluripotent stem cells (hESC and iPS)Hands on course on “Derivation and culture of pluripotent stem cellsESHRE Campus 2010Barcelona Spain8-12 February 2010

Basic Genetics for ART PractitionersESHRE Campus 2010Porto, Portugal16 April 2010

Preimplantation genetic diagnosis: a celebration of 20 yearsESHRE Campus symposiumRome, Italy1 July 2010

The 1st International Congress onControversies in Cryopreservation of Stem Cells, Reproductive Cells,Tissue and Organs (CRYO)Palacio de Congresos, Valencia, Spain, April 22-25, 2010

20th World Congress on Fertility and SterilityMunich, GermanySeptember 12-16, 2010

за АР и то не само преди IVF, но и преди IUIпроцедурите, които могат да бъдат 2, 3 илиповече в рамките на една година”

Dr Luca Gianaroli, Председател на ESHRE,приканва членовете на организацията дапредприемат мерки и действия срещу “твърдетревожните сигнали”, идващи от EC приинтерпретирането на изискванията на тъканните

директиви. Според него за повече от 30 годиниопит в областта на АРТ и над 15 милиона вечеродени деца, не е имало нито един известенслучай за трансмисия на вирусно заболяване(като HIV, хепатит или други, визирани вДирективите на ЕС).

21Ембриология Том 4 Книжка 1

PROF. DR. WILFRIED FEICHTINGER

Професор Файхтингер (Univ. Prof. Dr. Wilfried Feichtinger) е роден през 1950 г. във Виена.През 1975 г. завършва медицина във Виенския университет, след което специализираакушерство и гинекология. В областта на асистираната репродукция работи от 1978 г. Впериода 1979 - 1982 г. е ръководител на програмата по оплождане “ин-витро” въвУниверситетската АГ-болница във Виена, където през 1982 г. се ражда първото “ин-витро”бебе в Австрия. През 1983 г. заедно с д-р П. Кеметер създават Института по репродуктивнаендокринология и оплождане ин-витро. От 1991 г. е ръководител на Wunschbaby-Zentrum –един от водещите световни центрове в областта на асистираната репродукция. От 1988 г. епрофесор; автор е на повече от 200 научни труда, включително няколко монографии.Постоянно ръководи дипломни работи и дисертации в медицинския университет във Виена.

Проф. Файхтингер е президент на Австрийската асоциация по стерилитет, консултант е порепродуктивна медицина на световната асоциация по акушерство и гинекология (FIGO),участва в ръководството на редица международни организации. От 1998 до 2005 г. епрезидент на световната асоциация на центровете за асистирана репродукция (APART).Почетен член е и на Българската асоциация по репродуктивна човешка ембриология.Многократно е награждаван за професионалната си дейност. Сред приносите му заразвитието на асистираните репродуктивни технологии са: - 1982 г. - раждане на първото бебе в епруветка в Австрия;- 1984 г. - разработка и внедряване в практиката на използвания в момента метод затрансвагинална пункция на фоликулите под ултразвуков контрол (в сътрудничество сфирмата Kretz-Technik);- 1990 г. - внедряване на метода “изкуствен хетчинг” (изтъняване на обвивката на ембрионас цел облекчаване на имплантацията) с помощта на лазер. Разработка на предназначено зацелта устройство съвместно с фирмата LISA-Laser.- 2000 г. - разработка на методи и апаратура за ултразвуковото изследване, даващивъзможност за получаване на триизмерен образ.

Проф. Файхтингер е женен, има седем деца. Увлича се от подводен риболов, кара ски.Благодарение на прекрасния си глас проф. Файхтингер нееднократно е канен да участва вразлични концерти, включително професионални. Няколко пъти е пял и във Виенскатаопера. В интервю пред Австрийски вестник през 2008 г. на въпрос, как му се удава дазапазва своята работоспособност и да изглежда толкова млад за възрастта си,проф. Файхтингер отговаря: „не пуша, обичам да пия червено вино и да се веселя,занимавам се със секс вместо физкултура“.

22 Ембриология Том 4 Книжка 1

Списание “Ембриология” е специализирано научно издание на БългарскаАсоциация по Репродуктивна Човешка Ембриология (БАРЧЕ). В него могат дабъдат публикувани оригинални научни статии и обзори в областта наексперименталната и клинична ембриология и асистираната репродукция.Кратките предварителни съобщения, публикувани в това списание, могат впоследствие да бъдат отпечатвани в разгърнат вид и в други научни списания.

Материалите следва да бъдат представяни единствено на електронен носител.Желателно е текстът на статиите да не надвишава 6 страници формат А4 приразмер на шрифта 12 и разрядка 1 ред. Препоръчваме илюстрациите да не саповече от 4, да са включени в текста на определените от автора места и да са смаксимално висока разделителна способност (формат .tiff или .eps).

Статиите следва да съдържат на български и английски език - заглавие, именаи месторабота на авторите и резюме. Основният текст следва да бъдеправилно структуриран и да съдържа следните раздели: въведение,материали и методи, резултати и обсъждане, литературни източници, адресза кореспонденция. Списъкът на използваната литература да бъде встандартен формат (автори, наименование на статията, издание, година, том,брой, страници) и да не надвишава 20 автора, подредени по реда нацитиранията в текста.

Всички изпратени материали подлежат на рецензия от страна наредакционната колегия, като могат да бъдат връщани на авторите за корекцияи доработка или да бъдат отказвани за публикация.

Публикуваните материали са лични мнения на авторите и списанието не носиотговорност за тяхното съдържание.

За повече информация и изпращане на материали:

Българска Асоциация по Репродуктивна Човешка Ембриология (БАРЧЕ),гр. София 1606, ул. “Константин Иречек” № 17.

E-mail: gnikolov@yahoo.com; plamen@ivf.zzn.com

Тел.: 088 870 3786 (д-р Г. Николов)088 821 7095 (П. Тодоров)

ИЗИСКВАНИЯ КЪМ АВТОРИТЕ: