FastFraXTM - Pentagen · CGG repetic přítomným ve vzorku. Vzhledem k tripletovému opakování...

The Biofactory FastFraXTM FMR1 Sizing kit

Manuál pro FastFraXTM FMR1 Sizing kit verze A

FastFraXTM

FMR1 Sizing Kit Katalogové číslo: F2-050-V

Manuál

Pro In vitro diagnostiku

Skladování: 2-8°C pro okamžité použití

≤ -20°C pro dlouhodobé skladování

Chraňte před světlem



1. Úvod Syndrom fragilního X (FXS) je způsoben mutacemi v genu FMR1 (fragile X mental retardation 1

gene) na chromozomu X. Mutace způsobuje expanzi CGG repetic v 5´regionu (UTR-untranslated

region) genu FMR1 a spolu s jejich možnou metylací má za následek umlčení genu a zastavení

produkce FMR1 proteinu. Inaktivace genu FRM1 má za následek nulovou expresi FMR1 proteinu

(FMRP) [1], který se dominantně vyskytuje v neuronech, kde se podílí na stabilitě, transportu a

translaci mRNA. FMRP má významnou roli v synaptické plasticitě a dendritickém rozvoji [2].

Umlčení FMRP má za následek manifestaci FXS, což je jedna z nejčastějších příčin dědičné

mentální poruchy [3].

Na základě závažnosti mutace rozdělujeme pacienty do následujících genotypů: normální, šedá

zóna, premutace a plná mutace. Typ genotypu určuje klinickou závažnost FXS [4]. Plná mutace

alel s počtem repetic větším než 200 a s methylací vede klasicky k přítomnosti FXS, takto

postižení jedinci vykazují kognitivní poruchy, autismus, a poruchy chování, jako je porucha

pozornosti s hyperaktivitou (ADHD). Nosiči premutovaných alel (55-200 repetic) nemají

vyvinutou FXS, ale hrozí jim jiné zdravotní problémy v dospělosti, jako je s fragilním X asociovaná

primární ovariální nedostatečnost (FXPOI) u žen a tremor/ataxie (FXTAS) u obou pohlaví.

Důležité je, že ženy přenašečky s premutací mají riziko přenosu plné mutace na své děti.

Jedinci s normálním počtem repetic (6 až 44) mají normální hladinu FMRP a jsou klinicky

nepostižení. Jedince z šedé zóny (intermediate 45 až 54 repetic) najdeme v zóně mez

normálními a premutovanými jedinci a jsou svázáni s repetiční instabilitou, ačkoliv asociace

s fenotypovým projevem je stále nejasná.

Vzhledem k rozsahu FXS-souvisejících poruch a jejich značnému vlivu, je genetické testování

důležité pro potvrzení klinické diagnózy FXS a souvisejících poruch a k identifikaci nosičů

expandovaných alel, kteří plánují rodinu.

Interpretace FXS alelické klasifikace

Velikost CGG repetice v genu FMR1 od normální po intermediate je v obecné populaci vysoce

polymorfní a to v rozmezí od přibližně 5 do 50 repetic s nejvyšším výskytem repetic 29-30.

Aktuální guideline American College of medical Genetics [5] definují čtyři FMR1 alelické formy:

i. Normální (NL), přibližně 5-44 repetic;

ii. Intermediate (IM), přibližně 45-54 repetic;

iii. Premutace (PM), přibližně 55-200 repetic; a

iv. Plná mutace (FM), vice než 200 repetic.

Stávající metody FXS testování

CGG repetitivní oblast v genu FMR1 se obvykle detekuje analýzou Southern blot jako velká GC-

bohatá repetice. Standardní PCR techniky neumožňují amplifikaci nad ~ 100 repetic, což má za

následek, že velké premutace a plné mutace nejsou detekovány, protože dochází k přednostní



amplifikaci menších alel (repetic). Navíc, ženské vzorky homozygotní pro FMR1 musí být

doanalyzovány pomocí Southern blotu, aby se vyloučila možnost nezjištěné expandované alely.

Southern blot analýza, na druhé straně, je pracná, časově náročná, a vyžaduje velké množství

DNA. Rozlišení Southern blot analýzy je také nízké. Tyto metody jsou proto nevhodné pro rutinní

testování a / nebo screening FMR1 CGG expanse u velkého množství vzorků.

FastFraXTM FMR1 Sizing Kit řeší problémy pro sizing analýzu CGG repetitivního regionu genu

FMR1. CGG opakování v genu FMR1 jsou amplifikována triplet-primed PCR následovanou

fragmentační analýzou na kapilární elektroforéze (CE). Metodika kitu umožňuje sizování až 200

CGG repetic a detekci alel s > 200 repetic. Souprava také dává určitou informaci o umístění AGG

přerušení v CGG oblasti. Použitím kitu lze take rozlišit zygositu u žen.

2. Skladování a použití

Reagencie mohou být skladovány při 2-8°C v případě, že je budete okamžitě používat a při

-20°C při dlouhodobém skladovaní. Před otevřením zkumavek je krátce centrifugujte, abyste

odstranili kapky z víček. Přípravu reakčních mixů je možné provádět při laboratorní teplotě.

3. Použití

FastFraXTM FMR1 Sizing kit amplifikuje CGG repetice v 5´- netranslačním regionu FMR1 a

detekuje tak expanzi CGG repetic v tomto regionu. Kit se používá pro stanovení počtu CGG

repetic v množství až 200 a detekci alel s > 200 repeticemi. Test využívá k určení počtu CGG

repetic přímé triplet-primed polymerázové řetězové reakce (dTP-PCR) na genomové DNA,

následované fragmentační analýzou na genetickém analyzátoru Applied Biosystems. Tento

test je určen pro profesionální použití v klinických laboratořích, pro pomoc při diagnóze

syndromu fragilního X a jiných souvisejících stavů, jako je s fragilním X vázaná primární

ovariální nedostatečnost a s fragilním X související tremor / ataxie.

4. Princip testu

Konvenčně se pro detekci fragilního X a počtu repetic CGG ve FMR1 genu využívá kombinace

obvyklých metod PCR a southern blot analýzy. Nicméně, tento pracovní postup je nevhodný

při velkém počtu rutinních testů, protože je časově náročný, nákladný a vyžaduje častý zásah

uživatele. FastFraX™ FMR1 kit překonává tyto nevýhody pomocí vylepšení běžných metod

PCR bez nutnosti provedení Southern blottingu. V sofistikované strategii detekce kitem jsou

použity inovativní PCR techniky pro zvýšení citlivosti a specifičnosti a zároveň se snižuje

celkové zatížení a náklady.

FastFraX™ FMR1 Sizing Kit poskytuje test k určení počtu CGG repetic uvnitř repetitivní oblasti

CGG genu FMR1, a také k určení polohy AGG přerušení v rámci CGG repetitivní oblasti jak pro

mužské tak i pro ženské vzorky.

POZNÁMKA: Jako screeningový test doporučujeme použít FastFraX™ FMR1 Identification Kit,

který poskytuje efektivnější přístup k rutinnímu testování expandovaných FMR1 alel. Jako

konfirmační test lze použít Fastrax™ FMR1 Methylation kit, který poskytuje další informace,

včetně velikosti repetice a methylačního statusu u mužských a ženských vzorků.



FastFraXTM Sizing kit využívá dTP-PCR a CE pro sizovaní FMR1 alel

FastFraX ™ FMR1 Sizing Kit využívá dTP-PCR, která zahrnuje kombinaci amplifikací

primovaných zevnitř opakování CGG. Sady použitých primerů jsou navrženy tak, aby

amplifikovaly od 3 'konce repetitivní oblasti CGG nemodifikované genomové DNA. Po

amplifikaci jsou nepurifikované PCR amplikony denaturovány přídavkem Hi-Di formamidu a

sizovány za použití kapilární elektroforézy společně s ROX 1000 size standardem. Amplikony

jsou sizovány na libovolném Applied Biosystems genetickém analyzátoru s POP-7 polymerem.

U expandovaných alel lze pozorovat elektroferogram mnoha píků, které odpovídají počtu

CGG repetic přítomným ve vzorku. Vzhledem k tripletovému opakování CGG v repetitivní

oblasti jsou amplifikační píky v elektroforeogramu od sebe periodicky vzdáleny 3-páry bází

(obr. 1). Spočítáním píků lze určit počet CGG repetic (viz oddíl 9: Analýza dat).

Ženský vzorek s plnou

mutací

(GM07537)

29 (9+9+9)/>200rpts

Obrázek 1. Amplifikační píky získané kapilární elektroforézou pro dTP-PCR. Píky vykazují

periodicitu po 3-párech bází.

Elektroferogramy získané kapilární elektroforézou rovněž ukazují kontinuitu CGG repetic v

regionu. Přítomnost vložené AGG sekvence v CGG repetitivním regionu vede k produkci

klastrů píku oddělených mezerami bez produktu amplifikace. Kromě toho lze identifikovat

ženskou zygositu z profilu píků.

Použití kontrol v každém runu

Doporučujeme přidání pozitivní a negativní kontroly do každého runu pro zajištění integrity

reagencií a genetického analyzátoru. Negativní netemplátová kontrola obsahuje všechny

reagencie vyjma genomové DNA. Jako pozitivní kontrolu doporučujeme použít ženský vzorek

s plnou mutací (viz sekce 5: Materiál)



5. Materiál

Reagencie, které jsou součástí kitu (5 zkumavek)

Tabulka 1. Reagenci dodané v kitu.

Katalogové číslo. Komponenta Počet zkumavek Objem

F2-PRI-01 Sizing Primer Mix 1 50 µl

F2-PCR-02 Sizing PCR Mix A 1 125 µl

FX-PCRB-02 Sizing PCR Mix B 1 375 µl

FX-TAQ-02 Taq Polymerase 1 50 µl

FX-TAQP-01 Taq Plus 1 50 µl

Počet reakcí

- Množství reagencií dodaných v kitu je dostatečné pro více než 50 reakcí.

- Doporučujeme připravovat master mixy pro přesný počet vzorků v runu.

Doporučené pozitivní kontroly (Nejsou součástí kitu)

- Ženský vzorek s plnou mutací (NA07537 z Coriell Cell Repositories)

Další reagencie (Nejsou součástí kitu)

- Reagencie pro izolaci genomové DNA

- Nuclease-free voda

Materiál pro kapilární elektroforézu (Není součástí kitu)

- Genetický analyzátor Applied Biosystems s 50 cm kapilárou, POP7 polymerem pro ABI

3130xl, 3730xl nebo 3500 kalibrované na DS-30, DS-31, DS-33 nebo DS-40 dyeset.

POZNÁMKA: Dyeset musí být zvolen tak, aby byl vhodný pro použitý size standard.

- Pro ABI 3730xl: 96-well Plate Septa, Plate Reatiner (septa seal) a Plate Base (septa seal),

Applied Biosystems #4315933, #4334869, #4334873.

POZNÁMKA: Používejte vhodný spotřební materiál pro každý ABI genetický analyzátor dle

doporučení výrobce.

- Hi-DiTM Formamide: Applied Biosystems, #4311320 nebo ekvivalentní.

- MapMarker® 1000-ROX: Bioventures, #MM-1000-ROX. Mohou být použity i ostatní ROX

nebo LIZ-značené size standardy s velikostí až do 1000 bp, pokud splňují denaturační

podmínky kitu. (Nelze použít GeneScanTM 1200 LIZ®).

Ostatní potřebný spotřební materiál a vybavení (není součástí kitu)

- Minicentrifuga (1,5 - 2 ml zkumavky)

- Mikrocentrifuga (0,2 ml zkumavky)

- Vortex

- Thermal cycler: BioRad C1000TM Thermal Cycler s 96well modulem nebo ekvivaletní.

- Pipety s přesností mezi 0,2 – 2 µl, 1 - 10 µl, 2 - 20 µl, 20 - 200 µl a 100 - 1000 µl.

- PCR zkumavky a víčka.



6. Varování a bezpečnostní opatření

FastFraXTM Sizing kit je míněn jako sizovací test a nemůže být použit pro potvrzení

velikosti opakování FMR1 genu nebo samostatně pro klinickou diagnózu.

Osoba provádějící test musí být vyškolena v používání PCR a kapilární elektroforézy.

Všechny použité a nepoužité reagencie je nutné likvidovat v souladu s místními předpisy

o chemické bezpečnosti, s biologické bezpečnosti a předpisy na ochranu životního

prostředí.

Všechny vzorky DNA by měly být považovány za potenciálně nebezpečné. Při práci by se

měly používat ochranné prostředky. Vyvarujte se rozlití a kontaktu s pokožkou.

Dezinfikujte pomocí 10% bělidla nebo 70% alkoholu, pokud je třeba. Řezy a rány musí

být chráněny. Ruce musí důkladně být umyty před a po použití kitu a vzorků.

Nepoužívejte prošlé reagencie.

Nemíchejte reagencie z různých kitů a šarží.

Ujistěte se, že použité vybavení je kalibrováno a používáno v souladu s doporučením

výrobce.

Zabraňte opakovanému zmrazování a rozmrazování kitu.

Ujistěte se, že jsou reagencie skladovány v temnotě.

Po otevření má kit trvanlivost 3 měsíce, pokud je skladován při -20°C.

7. Příprava vzorku

Izolace DNA

Genomová DNA izolovaná z plné krve (v EDTA) běžnými izolačními metodami je kompatibilní

s kitem FastFraXTM FMR1 Sizing. Po izolaci a přečištění (pokud je nutné) změřte koncentraci

genomové DNA a její čistotu (OD 260/280) a skladujte při -20°C pokud není použita ihned.

8. FastFraXTM FMR1 Sizing kit protokol

FastFraXTM FMR1 Sizing kit protokol sestává z dvou klíčových kroků:

I. dTP-PCR; a

II. kapilární elektroforézy

Následující pokyny jsou psány pro jedinou reakci; pro více reakcí se doporučuje příprava

master mixu. Reakční činidla dodaná v kitu jsou dostatečná pro až 50 reakcí.

Vzhledem k pravděpodobnosti kontaminace preamplifikačních reagencií PCR amplikony, se

doporučuje jednosměrný workflow. Příprava master mixu (před částí I, krok 6) by měla být

provedena v oblasti oddělené od post-amplifikačních prostor pro zpracování vzorků (po části

I, krok 6). Vybavení použité v post-amplifikačních prostorách zpracování vzorků by se nemělo

používat v preamplifikačním prostoru, aby se minimalizovala kontaminace amplikonem.

Pro každý run použijte dvě kontroly:

- ženský vzorek s plnou mutací jako pozitivní kontrola (viz sekce 5: Materiál) a

- netemplátová negativní kontrola (NTC).



ČÁST I. příprava dTP-PCR

1. Nechte všechny reagencie (kromě Taq a Taq Plus) rozmrznout při laboratorní teplotě. Taq

a Taq Plus uchovávejte na ledu. Lehce vortexujte (kromě Taq a Taq Plus) a centrifugujte

zkumavky před otevřením.

2. Pro každý vzorek připravte dTP-PCR mix v PCR zkumavce dle složení uvedeného v tabulce

2. Test může být proveden v PCR stripech, PCR zkumavkách nebo 96-well destičce.

Tabulka 2. příprava dTP-PCR.

Reagencie Objem pro jednu reakci (µl)*

Sizing Primer Mix 1,0

Sizing PCR Mix A 2,5

Sizing PCR Mix B 7,5

Taq Polymerase 1,0

Taq Plus 1,0

DNA templát (100 ng) X

Nuclease-free voda 2,0-X

Celkový objem 15,0

*POZNÁMKA: Příprava master mixu je doporučena pro analýzu více vzorků. Master mix

obsahuje všechny reagencie kromě DNA templátu.

3. Ujistěte se, že jsou zkumavky pevně uzavřeny.

4. Promíchejte zkumavky.

5. Centrifugujte zkumavky nebo destičku.

6. Přeneste uzavřené zkumavky nebo zalepenou destičku do BioRad C1000TM Thermal

Cycleru nebo ekvivalentního cycleru a spusťte run dle programu uvedeného v tabulce 3.

Tabulka 3. program dTP-PCR amplifikace.

Teplota Čas Počet cyklů

95°C 15 min 1

99°C 45 sec 40 55°C 45 sec

70°C 8 min + přídavek 15 sec/cyklus*

72°C 10 min 1

11°C End 1

*POZNÁMKA: Přídavek 15 sec/cyklus znamená 8 min v první cyklu, 8 min 15 sec

v druhém cyklu, 8 min 30 sec v třetím cyklu a tak dále.



7. Přeneste PCR produkty pro kapilární elektroforézu do ledničky (4°C) a chraňte je před

světlem do doby než je budete analyzovat*.

*POZNÁMKA: Proveďte analýzu na kapilární elektroforéze co nejdříve po PCR reakci,

abyste minimalizovali degradaci PCR produktů.

ČÁST II. kapilární elektroforéza (s polymerem POP-7)

1. Nechte rozmrznout Hi-DiTM Formamide a MapMarker® 1000-ROX pro laboratorní

teplotě. Lehce vortexujte a centrifugujte před otevřením zkumavek.

2. Připravte následující mix do jednotlivých zkumavek 96-well destičky pro kapilární

elektroforézu dle složení v tabulce 4. Ujistěte se, že jsou vzorky dobře promíchány

propipetováním ode dna 2-3x. Vzorky napipetujte do jamek dle pořadí uvedeného

v programu genetického analyzátoru. Pokud je počet vzorků nižší než je počet kapilár,

napipetujte do prázdných jamek 13,5 µl Hi-DiTM Formamidu.

Tabulka 4. Mix pro Post-PCR analýzu.

Reagencie Objem pro jednu reakci (µl)*

PCR produkt 1,0

Hi-DiTM Formamide 9,0

MapMarker® 1000-ROX** 0,5***

Celkový objem 13,5

*POZNÁMKA: Příprava master mixu je doporučena pro analýzu více vzorků. Master

mix obsahuje všechny reagencie kromě PCR produktu.

**POZNÁMKA: Je možné použít i jiné ROX nebo LIZ-značené size standardy o velikosti

alespoň 1000 bp místo MapMarkeru® 1000-ROX, ale pouze pokud fungují za stejných

denaturačních podmínek. Pokud je použit LIZ-značený size standard, přístroj musí být

kalibrován na DS-33 nebo DS-40 dyeset.

***POZNÁMKA: Použijte objem size standardu dle doporučení výrobce. Pro příklad,

pokud je doporučený objem size standardu menší než 0,5 µl, snižte objem Hi-DiTM

Formamidu tak, aby výsledný objem byl stejný (13,5 µl).

3. Uzavřete destičku septem a poklepáním odstraňte případné bubliny. Centrifugujte

destičku a vložte ji do cycleru.

4. Denaturujte vzorky 5 minut při 95°C**** a poté chlaďte na 4°C dokud nejste připravení

na vložení destičky do genetického analyzátoru. Doporučujeme analyzovat vzorky do 24

hodin pro optimální výsledky.

****POZNÁMKA: Při spuštění denaturačního programu u septem uzavřené 96-well

destičky v termocykleru, nezavírejte vyhřívané víko termocykleru, jinak dojde

k roztavení septa.



5. Nastavte genetický analyzátor dle doporučení výrobce. Ujistěte se, že je přístroj

kalibrován pro (1) FAM; a (2) ROX nebo LIZ fluorescenční barvy, v závislosti na tom, jaký

použijete size standard (tabulka 5).

Tabulka 5. Dye sety Applied Biosystems použitelní pro různé size standardy.

Barva size standardu Dye Set Filter Set

ROX (včetně MapMarker® 1000-ROX) DS-30 D

DS-31 D

LIZ DS-33 G5

DS-40 S

6. Použijte základní protokol Fragment Analysis POP-7 a příslušná délka kapiláry jako

základní protokol, upravte injection time a voltage a run time dle doporučených

parametrů pro různé přístroje v tabulce 6.

Tabulka 5. Dye sety Applied Biosystems použitelní pro různé size standardy.

Přístroj Délka kapiláry Injection Run Voltage, Time

3130xl 36 cm 1,2 kV, 18 sec 15 kV, 3000 sec

3730xl 50 cm 1,5 kV, 18 sec 15 kV, 3000 sec

3500 50 cm 1,5 kV, 18 sec 15 kV, 3000 sec

a. Pro jiné přístroje, které zde nejsou uvedeny, se mohou optimální parametry

kapilární elektroforézy lišit a musí být uživatelem zvalidovány.

7. Po CE mohou být data analyzována na počet CGG repetic.

9. Analýza dat

Analýza dat může být provedena s použitím následujícího schématu (obrázek 2). Detailní

instrukce pro každý krok analýzy je vyznačen ve schématu.

Příprava dTP-PCR/CE Viz sekce 8

Generování CE profilů Viz sekce 9, část I

Kontrola Size standardu Viz sekce 9, část II, krok 1a

Kontrola CE profilů kontrol Viz sekce 9, část II, krok 1b/c



Analýza CE profilů vzorků

Určení Prvního píku Viz sekce 9, část II, krok 2a

Odhad rozpětí velikostí Viz sekce 9, část II, krok 2b

140 - ~ 300 bp

Normální nebo intermediate

140 – 450 bp

Premutace

140 - > 450 bp

Velká Premutace nebo Plná mutace

Určení Posledního píku

Viz tabulka 7a Viz tabulka 7b Viz tabulka 7C

Určení přesného počtu repetic

viz sekce 9, část II, krok 3

Muž Žena

Určení zygosity Viz tabulka 8

Interpretace výsledků Viz sekce 10

Obrázek 2. Data interpretační schéma pro analýzu výsledků

ČÁST I.Parametry pro analýzu dat

Výsledky kapilární elektroforézy (CE) z genetických analyzátorů ABI 3130xl a 3730xl mohou být

analyzovány s použitím softwaru Peak ScannerTM 2 nebo GeneMapper®. Software Peak ScannerTM 2

lze zdarma stáhnout z webu Life Technologies.

CE výsledky z genetického analyzátoru ABI 3500 mohou být analyzovány softwarem GeneMapper®.

Analýza softwarem Peak ScannerTM 2 je popsána zde.

1. Vytvořte nový projekt a přidejte vzorky (sample results files .fsa) do nového projektu

použitím „Add Files“.

2. Pod „Resources“ v levém panelu vytvořte „New Size standard“ s použitím velikostí standardu

MapMarker® 1000-ROX:



100, 125, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 475, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800,

850, 900, 950 a 1000.

Barva: Red

Uložte nově vytvořený Size Standard jako „MM-1000“.

POZNÁMKA: Pokud byl použit jiný Size standard, vytvořte příslušný Size standard s příslušnými

velikostmi a barvou dle doporučení výrobce.

3. Pod „Resources“ v levém panelu vytvořte „New Analysis Method“ s použitím defaultní

metody a následujícími modifikacemi:

a. Peak Detection > Minimum peak heights > Peak treshold pro Blue a Red nastavte na 10.

b. Quality flags > Sizing quality > Low quality range > 0,0 to 0,05.

c. Quality flags > Sizing quality > Pass range > 0,06 to 1,0.

Uložte nově vytvořenou „Analysis Method“ jako „FastFraX Analysis“.

POZNÁMKA: Pokud byl použit LIZ – značený size standard, nastavte Peak treshold pro Blue a

Orange na 10.

4. Pro každý vzorek vyberte MapMarker® 1000-ROX „MM-1000“ a Analysis Method „FastFraX

Analysis“.

5. Stiskněte tlačítko „Analysis“.

6. Při analýze dat vzorku vypněte zelenou, žlutou a oranžovou barvu, protože signál budou

přítomny pouze v modré (FAM) a červené (ROX).

POZNÁMKA: Pokud byl použit LIZ – značený size standard, signál bude přítomen v modré (FAM) a

oranžové (LIZ).

7. Prohlédněte píky v rozmezí od 125 – 1000 bp. Rozmezí může být specifikováno v „Plot

Settings“ .

ČÁST II. Pokyny pro analýzu dat

1. Kvalifikace platnost runu

a. Kontrola píků ROX size standardu. MapMarker® 1000-ROX produkuje charakteristické

píky s konkrétní velikostí (dle obrázku 3). Nesrovnalosti v intervalu mezi píky těchto

standardních velikostí budou mít vliv na analýzu. Vzorky s nestandardními píky size

standardu (například, píky se nezobrazují v očekávané velikosti párů bází), musí být z

další analýzy vyloučeny.

b. Kontrola negativní kontroly. Ujistěte se, že není přítomen žádný signál v modré (FAM)

barvě (dle obrázku 3).



Obrázek 3. Typický profil netemplátové negativní kontroly.

c. Kontrola pozitivní kontroly (žena s plnou mutací). Ujistěte se, že pozitivní kontrola

splňuje následující parametry:

- shluky píků normální alely jsou dobře identifikovatelné oproti pozadí expandované

alely (dle obrázku 4a a 4b); a

- kontinuální profil píků plné mutace pokračuje až za 200 repetic (dle obrázku 4c), tj.

pokračuje až za červený pík size standardu o velikosti 715 bp.

Obrázek 4a. Typický profil NA07537.



Obrázek 4b. Zvětšená oblast ukazující shluky píků kratší alely (modře vyplněné) s

označením prvního píku pro analýzu. První pík má velikost přibližně 140 bp a odpovídá

5 repeticím.

Obrázek 4c. Zvětšená oblast kontinuálního profilu delší alely s označením posledního

píku a píku odpovídajícího 200 repeticím (modře vyplněné).

2. Určení prvního a posledního píku pro analýzu

a. Určení prvního píku. Píky jsou zobrazeny s periodicitou přibližně 3 bp. První vysoký pík by

měl být zobrazen okolo 140 bp; tento pík odpovídá amplikonu s 5 CGG repeticemi (dle

obrázku 4b). Počítáním následujících píku dojdeme k celkovému počtu CGG repetic.



b. Odhad rozmezí velikostí CE profilu. MapMarker® 1000-ROX obsahuje píky s velikostí 300

bp a 450 bp. S použitím těchto píků lze určit, do které z níže uvedených rozmezí velikostí

CE profil patři (Obrázek 5). Toto bude mít vliv na stanovení posledního píku pro analýzu.

140 - ~300 bp

Normální nebo

intermediate alely (5 –

54 repetic)

140 – 450 bp Malá premutace

(55 - ~110 repetic)

140 - > 450 bp

Velké premutace a

plné mutace

(~110 - > 200 repetic)

Obrázek 5. Typické CE profily různých rozmezí délek. Rozmezí délek CE profilu se

prodlužuje s množstvím repetic. Pík odpovídající 200 repeticím najdeme v blízkosti

červeného píku 715 bp.



c. Určení posledního píku jak pro mužské, tak i pro ženské vzorky a jeho zahrnutí do

analýzy. Poslední pík, který je zahrnut do analýzy, lze určit dle jeho morfologie a signálu

vzhledem k sousedním píkům. Tabulka 7 uvádí pokyny pro stanovení posledního píku,

který mají být zahrnut do analýzy, v závislosti na rozsahu velikostí CE profilů.

Tabulka 7. Stanovení posledního píku pro analýzu pro jak mužské, tak i ženské vzorky.

Do rozhodnutí o posledním píku je zahrnut pokles signálu a morfologie píku u různých

typů profilů.

Velikostní

rozmezí

CE profil Zvětšení posledního píku

a) 140 - ~300bp Normální a intermediání alely

Zaměřte se na pík shluku nejvíce vpravo. V rámci tohoto shluku píků, vyberte nejvyšší pík vpravo

těsně předtím, než se signál výrazně snižuje. Poslední pík CE profilu a poslední pík v každém

shluku jsou stanoveny podobně. Poslední pík CE profilu by měl být vyšší než falešné píky

předcházející před shluky (viz sekce 11: Další informace týkající se AGG přerušení)

b) 140 – 450

bp

Premutace

Pro premutace s dobře definovaným rozmezím píků, vyberte nejvyšší pík vpravo těsně předtím, než se signál významně snižuje na úroveň pozadí. POZNÁMKA: Za posledním píkem by už neměly být žádné další píky. Přítomnost malých píku po poklesu

signálu může indikovat přítomnost více alel ve vzorku (mozaiky). Viz sekce 12: atypické profily

jako příklad takových profilů.



c) 140 - >

450 bp

Velká

premutace

nebo plná

mutace

Pro velké premutace a plné mutace s amplifikovanými píky, které vykazují postupný pokles spíše než výrazný pokles signálu je určení posledního píku založeno na morfologii píku.

Poslední pík má definovaný tvar (viz výše ve schématu).

Na levé části od posledního píku (zelená oblast) jsou bílé plochy pod píkem jasně

viditelné. Naproti tomu, vrcholy vpravo od posledního píku (vyplněného modře) mají bílé oblasti špatně definovatelné (oranžová plocha).

Signál vpravo od posledního píku je snížen na úroveň pozadí (přibližně indikováno červeně čárkovaně).

Obecně platí, že poslední pík má výšku signálu nižší než 40 RFU. Poslední pík u vzorků s profily s délkou více než ~ 650 bp může být nízký (10 RFU), ale je platný jen pokud má dobře definovaný tvar.

Jako doporučení lze říci, že profily přesahující 600 bp mohou být analyzovány pomocí následujícícch parametrů:

osa x: 600 bp – 850 bp

osa y: 0-160 RFU



d. Určení posledního píku druhé (kratší) alely u ženských vzorků. Píky kratší alely by se

měli analyzovat až po dokončení analýzy delší alely. Typicky jsou píky kratší alely u

heterozygotních ženských vzorků výrazně vyšší než zbytek CE profilu. Proto, analýzou

těchto vyšších píku dostaneme počet repetic kratší alely. Tabulka 8 ukazuje způsob

identifikace počtu repetic kratší alely u žen v závislosti na genotypu nebo rozmezí CE

profilu.

Tabulka 8. Stanovení posledního píku kratší alely u žen. Výška píku a pokles signálu jsou

vzaty v potaz u různých profilů.

Velikostní

rozmezí

CE profil Zvětšení posledního píku

a) 140 -

~300bp

Normální a

intermediální

alely

V případě, že má ženský vzorek CE profil podobný CE profilu normálního muže (viz výše, vlevo), jedná se o homozygotní ženu. Homozygotní žena může mít: (1) stejný počet repetic u obou alel (např. 29/29 RPT); nebo (2) rozdíl jedné repetice mezi těmito dvěma alelami (např. 29/28) RPT.

Ženský vzorek s CE profilem obsahujícím shluky píků s různou výškou patří heterozygotní ženě. Ve výše uvedeném příkladu, jsou první tři shluky vyšší než je výška signálu u čtvrtého shluku. Tento vyšší signál je důsledkem příspěvku jak kratší tak i delší alely. To znamená, že poslední pík třetího shluku je posledním píkem pro kratší alelu. Za tímto píkem následuje výrazný pokles hodnot výšek a poté čtvrtý shluk. Píky čtvrtého shluku mají významně nižší signál než předchozí tři shluky a je

generován pouze větší alelou. Poslední pík čtvrtého shluku je posledním píkem

delší alely.



POZNÁMKY:

- U některých normálních žen může mít poslední pík shluku viditelně, ale ne

drasticky nižší signál než předcházející shluky (~ 60% v výšky signálu). Tyto ženy

mohou být homozygotní.

- Některé heterozygotní normální ženy mohou mít CE profily, které je složitější

analyzovat, vzhledem k odlišným vzorům opakovaní u dvou alel (viz sekce 11: Další

informace o AGG Přerušení a sekce 12: atypické profily).

b) 140 – >

~300 bp

Premutace a

plná mutace

Ženy s premutací a plnou mutací jsou obvykle heterozygotní, s jednou expandovanou alelou a druhou typicky buď normální nebo intermediální alelou. Menší alela přispívá k shluků píky s vyššími signály, které se střídají v kontinuálním profilu delší, expandované alely. U takových uskupení, vyberte nejvyšší pík vpravo těsně předtím, než se signál

významně snižuje a to je poslední pík menších alely.

3. Určení počtu CGG repetic

a. Počítání píků. Jakmile je určen první a poslední pík, lze manuálně spočítat počet píků

mezi nimi a tento počet odpovídá počtu CGG repetic. První pík odpovídá 5 CGG

repeticím.

Počet CGG repetic = Počet píků + 4 + (5 x počet 18 bp mezer)

Příklad, CE profil s nepřerušovaným úsekem 16 píků bez 18 bp mezer indikuje alelu

s počtem repetic 20.

CE profil s třemi shluky po pěti pících v každém shluku, přerušený dvěma mezerami

odpovídajícími 18 bp, indikuje alelu s počtem repetic 29. Další instrukce k určení počtu

repetic najdete v sekci 11: Další informace o AGG přerušeních.



b. Výpočet s použitím vzdálenost mezi píky (v párech bází). Vzhledem k ~ 3 bp periodicitě

amplifikačních píků, lze počet CGG repetic vypočítat a aproximovat pomocí vzdálenosti (v

párech bází), mezi prvním a posledním píkem. Vzorec je následující:

PíkF – Pík1

Počet CGG repetic = -------------------- + 5

2,95

kde PíkF je velikost posledního píku v párech bází a Pík1 je velikost prvního píku v párech

bází.

2,95 je použito místo 3,0 kvůli zkreslení elektroforetické mobility GC bohatých PCR

produktů. Použití 2,95 je specifické pro přístroj, jeho konfiguraci a použitý size standard a

bylo verifikováno tak, aby dalo přesnost počtu repetic (± 1 repetice) až do 200 repetic při

použití následujících kombinací:

Přístroj Polymer Délka kapiláry Size standard

3130xl POP-7 36 cm BioVentures MapMarker® 1000-ROX

3730xl POP-7 50 cm BioVentures MapMarker® 1000-ROX

3500 POP-7 50 cm BioVentures MapMarker® 1000-ROX

*POZNÁMKA: Pro přesnější sizování alel s více než 200 repeticemi použijte počítání píků místo

výpočtu vzdálenosti mezi píky.

*POZNÁMKA: Alely s posledním píkem stanoveným jako > 200 repetic a za červeným píkem

715 bp se klasifikují jako alely s >200 repeticemi.

10. Interpretace dat Počet CGG repetic pro FMR1 alely může být určen pro 5 až 200 CGG repetic. Všechny alely

s více než 200 CGG repeticemi jsou klasifikovány jako > 200 repetic. U vzorků s více FMR1

alelami je možné reportovat rozsah CGG repetic u obou alel.

Vzorky pacientů mohou být zařazeny do jedné ze čtyř FMR1 alelických tříd na základě

velikosti CGG repetice a struktury CE profilu píků (viz tabulka 9).



Klasifikace alely Počet repetic

Vzorek AGG přerušení Vzorový CE profil

Normální (NL) a Intermediální (IM)

5 - 54 Muž Obvykle jsou přítomny jedna nebo dvě přerušení. Mohou však být přítomny až čtyři přerušení.

Malé shluky píků

Žena Obvykle jsou přítomny

jedna nebo dvě přerušení. Mohou však být přítomny až čtyři přerušení.

Malé shluky píků.



Premutace (PM) 55 - 100 Muž Přerušení jsou nebo nejsou přítomna.

Kontinuální žebřík píků, které mohou být a nemusí být separovány do shluků.

Žena Přerušení jsou obvykle

přítomna u kratší alely. U delší alely jsou anebo nejsou přerušení přítomna.

Shluky píků s vysokým signálem jsou promíchány mezi kontinuální žebřík píků. Žebřík píků může, ale nemusí být rozdělen do shluků.



Premutace (PM) 101 - 200 Muž Přerušení obvykle nejsou přítomna.

Kontinuální žebřík píků.

Žena Přerušení jsou obvykle

přítomna u krátké alely, ale ne u dlouhé alely.

Shluky píků s vyšším signálem jsou promíchány mezi kontinuální žebřík píků.



Plná mutace > 200 Muž Přerušení nejsou přítomna.

Kontinuální žebřík píků pokračující až za 200 repetic (přibližně okolo 715 bp).

Žena Přerušení jsou přítomna

u krátké alely, ale ne u dlouhé alely.

Shluky píků s vyšším signálem jsou promíchány mezi kontinuální žebřík píků, který pokračuje až za 200 repetic (přibližně okolo 715 bp).



11. Další informace k AGG přerušením

CE profily CGG repetitivní oblasti FMR1 obsahují často shluky píků, které jsou odděleny

mezerami. Tyto mezery mezi shluky naznačují přítomnost AGG přerušení v rámci CGG

repetic. Přítomnost AGG přerušení se vyznačuje významným poklesem signálu, za nímž

následuje obnovení CGG signálu po 18 bp (nebo ekvivalentu 6 CGG píků).

Vzhledem k tomu, primery amplifikují z 3 'konce repetitivní oblasti CGG, 5' → 3 'repetitivní

patern lze číst zprava doleva profilu. Tabulka 10 udává, jak mohou být AGG přerušení

identifikována z CE profilů.

Tabulka 10. Pozice AGG přerušení je indikována mezerami mezi shluky. Pozice AGG přerušení

je označena „+“.

Genotyp CE profil Zvětšení shluků

Normální a

intermediální

muž

Homozygótní

normální a

intermediální

žena

Přítomnost jednoho AGG přerušení bude mít za následek mezeru mezi shluky píků. Určení posledního píku v každém shluku s použitím tabulky 6. První pík následného shluku je ~ 18 bp (nebo 6 píků v intervalu) vzdálen od posledního píku předchozího shluku. Ve výše uvedeném příkladu běžného vzorku je počet opakování vypočtený pomocí následujícího vzorce pro každý pík shluku: Počet CGG repetic = Počet píků + 4 charakterizován jako 9 + 9 + 9 (9 píků pro každý shluk). Po každém AGG přerušení se započítává 1 opakování. Profil výše (obsahuje 2 AGG přerušení) má tedy celkem 29 opakování. POZNÁMKA: Heterozygotní normální a intermediální ženské vzorky mohou mít

CE profily, které jsou složitější analyzovat. Takové případy jsou uvedeny v sekci

12: Atypické Profily.



Premutace

muž;

premutace

žena

U premutací, dojde AGG přerušením ke vzniku mezery v rámci profilu píků. K určení posledního píku v každém shluku použijte tabulku 6. První pík následného shluku je ~ 18 bp (nebo 6 píků v intervalu) vzdálen od posledního píku předchozího shluku. Ve výše uvedeném příkladu vzorku premutace mužského vzorku je CGG

repetitivní oblast spojitá pro 82 repetic poté vykazuje značný pokles signálu, což

naznačuje přítomnost AGG přerušení. První pík následujícího shluku je určen

spočítáním 6 píkového intervalu od posledního píku předchozího shluku. Počet

CGG opakování je 10 + 82 z 5 'konce (shluk s deseti repeticemi a AGG přerušení je

na 5' konci repetitivní CGG oblasti).

Žena;

Premutace a

plná mutace

Zygocitu lze vyřešit pro ženy s dvěma alelami. Shluky píků (PC), které jsou promíchány s kontinuálním profilem, ukazují na přítomnost dvou alel s různými CGG repeticemi. Velikost delší alely může být určena spočítáním počtu píků mezi prvním a posledním píkem profilu. Ve výše uvedeném příkladu premutace ženy, má delší alela 122 repetic. Shluky píků jsou snadno identifikovatelné vzhledem k jejich zvýšené signálu.

Mezery mezi vysokými shluky ukazují na přítomnost AGG přerušení uvnitř CGG

repetitivní oblasti. K určení posledního píku v každém shluku lze použít tabulku 6.

První pík následujícího shluku je určen spočítáním 6 píkového intervalu od

posledního píku předchozího shluku. Ve výše uvedeném příkladu, je kratší alela

charakterizována jako 9 + 9 + 9 (2 AGG přerušení do 29 repeticích). Dohromady je

počet CGG repetic v tomto vzorku 29 (9 + 9 + 9) / 122 pro obě alely.



12. Atypické profily

Heterozygotní normální nebo intermediální ženské vzorky mohou generovat atypické CE profily,

které představují složitost a nejistotu při analýze dat. Příklady takových případů, a některé

pokyny pro analýzu jsou uvedeny v tabulce 11.

Tabulka 11. Příklady atypických CE profilů, které mohou způsobit komplikace při analýze dat.

Problém Typický CE profil

Výrazné opakující se vzory u více alel

U některých heterozygotních normálních a intermediálních ženských alel, se může CE profil jevit složitější pro analýzu v důsledku odlišných opakujících se vzorů dvou alel.

Jako obecné vodítko: shluky píků s vyššími signály naznačují příspěvek dvou alel. Díky analýze změny výšky signálu, a lokalizaci pozice AGG přerušení 18 bp nebo intervalu 6 píků je možné opakované vzory dvou alel rozlišit. Pro profil vzorku výše je větší alela charakterizována jako 29 repetic (9 + 9 + 9), a kratší alela je charakterizována jako 23 repetic(13 + 9).



Mnohočetný CGG patern v jednom CE profilu

Pro některé CE profily lze odvodit více závěrů.

Například, možné vzory repetic pro ženské vzorek jsou: Možnost 1

Delší alela: 36, 9+6+9+9

Kratší alela: 29, 12+6+9



Možnost 2

Delší alela: 36, 9+9+6+9

Kratší

alela: 29, 9+9+9

To znamená, že vzorek je označen jako mající větší alelu 36 repetic a menší alelu 29 repetic, s možným větším počtem opakovacích paternů. Celosvětově nejčastější jsou opakovací paterny, které obsahují shluky 9 nebo 10 CGG repetic, a proto je možnost 2 pravděpodobnějším genotypem.

Neidentifikovatelný počet repetic a AGG přerušení u kratší alely

U většiny ženských heterozygotních vzorků lze kratší alelu identifikovat po stanovení repetic větší alely. Nicméně, u některých normálních ženských vzorků je patrné kolísání výšky signálu, což má za následek nemožnost identifikace vyšších píků kratší alely. Takové vzorky také typicky dělají potíže při identifikaci AGG přerušení. V příkladu níže je možné poslední pík delší alely (zvýrazněno) identifikovat. Nicméně, opakování vzoru u AGG přerušení, jakož i poslední pík kratší alely nelze určit.



Mosaicismus Počet CGG repetic u premutace může být obvykle identifikován výrazným poklesem výšky signálu po poslední pík. Nicméně mnoho vzorků s FMR1 expanzemi (premutace a plné mutace) jsou velikostní mozaiky a může obsahovat více alel různých velikostí CGG repetic. Tyto vzorky mohou mít nízké píky po počátečním poklesu signálu. Níže uvedený vzorek má alespoň dvě alely s 30 a 74 CGG repeticemi.

Avšak přetrvávání nízkých píků po píku odpovídajícímu 74-RPT naznačuje, že tento vzorek může mít větší třetí alelu v nízkém množství. Tato třetí alela obsahuje alespoň 108 CGG repetic.



13. Parametry kitu

Přesnost sizování

Studie pro určení přesnosti byla provedena na 11 reprezentativních vzorcích genomové DNA

z Coriell Cell Repositories, které byly předtím charakterizovány na počet repetic v genu FMR1

s použitím stávajících metod, jako je například Southern blot nebo flanking PCR. Počet repetic

každého vzorku pak byl stanoven prostřednictvím spočítání píků a aproximace pomocí

vzdálenost mezi píky. Výsledky studie ukázaly, že souprava má vynikající výkon a všechny

získané genotypy vzorků souhlasily s referenčními genotypy, které poskytly Coriell Cell

Repositories.

Přesnost sizování byla hodnocena pomocí dat z Coriell referenčních vzorků s dostupnými

informacemi [11]. FastFraXTM FMR1 Sizing Kit udává počet repetic s přesností:

Tabulka 12. Souhrn přesnosti sizování vzorků s různými FMR1 genotypy. Přesnost sizingu

nebyla hodnocena pro vzorky s plnou mutací, protože kit je určen pro detekci a ne pro

sizování takových vzorků.

Referenční genotyp Přesnost sizování

NL a IM 1 repetice

PN (< 110 repetic] 3 repetice

PM (≥ 110 repetic) 3 repetice

FM (> 200 repetic) N/A (výsledek je reportován jako > 200 repetic)

Analytická sensitivita a specifita

Pro analytickou citlivost, byla mez detekce ověřena pomocí řady množství DNA. Limit detekce

pro plnou mutaci je 25 ng genomové DNA. Doporučené množství DNA na test je 100 ng, což

umožňuje sizování obou alel u ženských vzorků.

Citlivost soupravy na detekci mosaicismu byla hodnocena pomocí simulovaných mozaikových

vzorků s rozdsahem mosaicismu. Pro NL / PM mozaiky, byla PM alela přesně sizována až na

5% hladině mozaicismu. U 2,5% mosaicismu, byla PM alela správně rozpoznána jako PM. Mez

detekce plné mutace alely byla 10% pro NL / FM mozaiky a 20% u PM / FM mozaiky.

Souprava je schopna detekovat veškeré mutace alel, velké PM u 2,5% pro NL / FM mozaiky a

5% pro PM / FM mozaiky.

Pro analytickou specifičnost byl otestován "non-relevantní" DNA vzorek nesoucí 135-145 CTG

repetici, aby se prověřilo, zda zvýšení koncentrace nukleové kyseliny s potenciálem cross

reaktivity by mohl mít vliv na kit. Výsledky ukazují, že zvyšující se množství "non-relevantní"

DNA neinterferuje s amplifikací, sizováním a rozpoznáváním počtu CGG repetic v genu FMR1.

Přesnost

Opakovatelnost a reprodukovatelnost byly hodnoceny. Variační koeficient hlášených počtů

repetic byl obecně nízký pro NL, IM a PM vzorky (CV <2%). Všechny vzorky s FM mohli být

detekovány jako mající více než 200 CGG repetic.



Klinická výkonnost

Studie vyhodnocení výkonnosti byla provedena na 198 vzorcích genomové DNA izolovaných z

plné krve, které byly dříve charakterizovány na počet CGG repetic FMR1 genu

prostřednictvím kombinace flanking PCR a Southern blottingu. Vzorky byly testovány pomocí

soupravy FastFraX ™ FMR1 Sizing kit na kombinaci termocykleru Biorad C1000 a ABI 3730XL

DNA Analyzeru. Analýza byla provedana zaslepeně a výsledky byl porovnány s referenční

metodou.

Test hlásil dobrou shodu s referenčními údaji, 100% shoda, pokud jde o genotyp (Tabulka 13).

Zejména, všechny vzorky s FM byly úspěšně osizovány jako nesoucí více než 200 RPT (žádné

falešně negativní výsledky, 100% klinická citlivost a klinická specifičnost). Žádný PM vzorek

nebyl klasifikován jako FM (žádné falešné pozitivity). Výsledné klinické výkonnostní vlastnosti

kitu jsou vynikající, s citlivostí 100% a přesnosti ve zjišťování vzorků FM (Tabulka 14).

Tabulka 13. Porovnání referenčního genotypu s výsledky reportovanými kitem FastFraXTM

Sizing.

Výsledek z referenční metody *

Výsledek u kitu SZ NL IM PM FM

NL 155 0 0 0

IM 0 4 0 0

PM 0 0 21 0

FM 0 0 0 18

Klíč:

Tabulka 14. Souhrn klinických parametrů kitu FastFraXTM Sizing

Statistika Hodnota 95% Cl

Klinická specifita 100,00% 97,9% - 100,00%

Klinická sensitivita 100,00% 81,47% - 100,00%

Pozitivní prediktivní hodnota 100,00% 81,47% - 100,00%

Negativní prediktivní hodnota 100,00% 97,97% - 100,00%

Pravdivě negativní Pravdivě pozitivní Falešně negativní Falešně pozitivní



14. Troubleshooting A) Netemplátová kontrola

Problém Pravděpodobná

příčina

Doporučení

CE profil netemplátové

kontroly obsahuje píky

s periodicitou 3 bp

Kontaminace master

mixu DNA templátem

Opakujte test, dejte pozor, aby se DNA pipetovala jako poslední, aby se zabránilo kontaminaci master mixu.

Kontaminace pipet

PCR produktem

Dekontaminujte pipety před

opakováním testu.

Ujistěte se, že jsou před

amplifikační a post amplifikační

prostory odděleny.

B) Pozitivní kontrola

Problém Pravděpodobná příčina Doporučení

žádné CE profily

NEBO

CE profil

neodpovídá

očekávanému

profilu (viz sekce

4a, b a c)

Chyba při přípravě master mixu Opakujte test, dejte pozor, že byly přidány všechny reagencie ve správném objemu

Nedostatečná/degradovaná

DNA

Zkontrolujte koncentraci a

kvalitu DNA

Pokud je třeba, použijte

čerstvou DNA (novou šarži

referenční DNA) a opakujte

test

Špatné nastavení PCR Zkontrolujte run report

z přístroje a ujistěte se, že bylo

použito správné nastavení

Opakujte test, ujistěte se, že je


Špatné nastavení CE Zkontrolujte run report

z přístroje a ujistěte se, že bylo


Pokud bylo použito správné

nastavení PCR, opakujte CE

protokol na stejných PCR

produktech (sladovaných při

4°C)

Pokud bylo nastavení PCR i CE

v pořádku, opakujte test



Prošlé reagencie Zkontrolujte exspiraci

Pokud je třeba, opakujte test

s novým neexspirovaným

kitem

Píky size

standardu jsou

špatně přiřazeny

Použití nevhodného size

standardu pro denaturační

podmínky kitu

Opakujte CE protokol se

stejnými PCR produkty

s použitím vhodného size

standardu, který má stejné

denaturační podmínky jako

MapMarker® 1000-ROX.

Nesrovnalosti v MapMarker®

1000-ROX size standardu

Upravte size standard

v analyzačním softwaru.

- Vyberte velikosti 100, 800,

850, 900, 950 a 10000

- Vymažte vybrané velikosti.

- Reanalyzujte vzorky

s použitím upraveného size

standardu

Zkontrolujte správnost

přiřazení píků size standardu a

upravte, pokud je to třeba

Pro GeneMapper® software,

přepsání „override sizing

quality“ nevyřeší problém

C) VZORKY

Problém Pravděpodobná příčina Doporučení

CE profil

neodpovídá

očekávanému

profilu (viz sekce

9)

NEBO

žádné CE profily

(Viz sekce 3)

Nedostatečná/degradovaná

DNA

Zkontrolujte koncentraci a kvalitu

DNA

Pokud je třeba, použijte čerstvou

DNA (opakujte izolaci DNA) a

opakujte test

POZNÁMKA: Pokud se opakují nulové / atypické výsledky získané navzdory tomu, že jste vyloučili technickou chybu, vzorky mohou mít delece v sekvenci FMR1. Tyto vzorky by měly být testovány za použití



alternativních metod, například Kitem FastFraXTM FMR1 Methylation.

Píky size

standardu jsou

špatně přiřazeny

Použití nevhodného size

standardu pro denaturační

podmínky kitu

Opakujte CE protokol se stejnými

PCR produkty s použitím

vhodného size standardu, který

má stejné denaturační podmínky

jako MapMarker® 1000-ROX.

Nesrovnalosti v MapMarker®

1000-ROX size standardu

Upravte size standard

v analyzačním softwaru.

- Vyberte velikosti 100, 800, 850,

900, 950 a 10000

- Vymažte vybrané velikosti.

- Reanalyzujte vzorky s použitím

upraveného size standardu

Zkontrolujte správnost přiřazení

píků size standardu a upravte,

pokud je to třeba

Pro GeneMapper® software,

přepsání „override sizing quality“

nevyřeší problém



15. Zřeknutí se zodpovědnosti

Výrobce omezuje záruku testovacího kitu, stejně jako, že testovací kit bude

fungovat jako diagnostický test in vitro v rámci omezení a specifikace, jak je

popsáno v manuálu k produktu, při použití přesně v souladu s pokyny v něm

obsažených. Výrobce se zříká jakékoli záruky výslovně uvedené nebo

předpokládané včetně takové výslovně uvedené nebo předpokládané záruky

vzhledem k obchodovatelnosti, vhodnosti pro použití nebo implicitní utility pro

jakýkoliv účel. Odpovědnost výrobce je omezena buď výměnu výrobku nebo

vrácení kupní ceny výrobku, a v žádném případě není povinnen k reklamaci

jakéhokoli druhu za částku vyšší než je kupní cena zboží, které je poškozeno.

Výrobce nenese žádnou odpovědnost vůči kupujícímu nebo třetím osobám za

škodu nebo ekonomickou ztrátu, způsobenou použitím výrobku jakýmkoli

způsobem nebo aplikací.

UPOZORNĚNÍ: Je vynaloženo veškeré úsilí dodávat objednané zásilky podle

uvedeného vzoru, ale vzhledem k neustálému vývoji si společnost vyhrazuje

právo na zlepšení / změny jakékoliv specifikace / komponenty bez předchozí

informace / oznámení kupujícímu.



16. Reference



Date post:	12-Jul-2020
Category:	Documents
Upload:	others
View:	2 times
Download:	0 times

FastFraXTM - Pentagen · CGG repetic přítomným ve vzorku. Vzhledem k tripletovému opakování...

Documents