Fluorescenční a fotoaktivovatelné sondy

Jaroslava Hniličková

• Co jsou to fluorescenční metody, možnosti jejich použití

• Vlastní a nevlastní fluorescence

• Fluorescenční značky

• Fluorescenční sondy

• Příklady použití fluorescenčních sond

Fluorescence

Fluorescence - schopnost některých látek po ozáření - excitaci světlem určité vlnové délky vyzařovat - emitovat světlo jiné vlnové délky

Stokesův posun

Rozdíl vlnových délek absorpčního (excitačního) a emisního maxima

Emitované záření má větší vlnovou délku (nižší energii)

Fluorescenční metody, možnosti použití

• Biochemický a biofyzikální výzkum– Enzymové reakce, transport membránou, přenos signálu, studium neurotransmiterových

receptorů a iontových kanálů, hledání vazebného místa v biomolekule

• Klinická chemie• Genetické analýzy, genetické manipulace

– Analýza DNA

• Biomedicína• Nahrazení metod využívajících radionuklidové zářiče

Využití fluorescence

Výhoda – možnost studia pochodů v živých buňkách

Výhody fotoafinitních sond

Afinitní sondy – nevýhody:

možnost deaktivace, hydrolýzy ještě před navázáním na vazebné místo

možnost interakce na jiném než vazebném místě

Fotoaktivovatelná sonda:

Chemicky inertní sonda chemicky reaktivníozáření

Používané přístroje

Přístroje:

• Fluorimetry• Spektrofluorimetry• Fluorescenční skenery• Fluorescenční mikroskopy• Průtokové cytometry

Princip přístrojů využívajících fluorescenci

Měření fluorescence

vzorek

emisní monochromátor

detektor

zdrojexcitační

monochromátor

čtecí zařízení

Fluorimetr Jenway řady 6200

Fluorescenční mikroskopy

FL 2002 K – Fluorescenční mikroskopFluorescenční mikroskop XFT 313

Software

Leica Application Suite Advance Fluorescence je modulární systém pro základní i profesionální práci s fluorescenčním obrazem.

Endotelové buňky pod mikroskopem

Fluorescenční mikroskop se třemi kanály umožňuje zobrazení jednotlivých částí buňky (mitochondrie, cytoskelet, jádro)

.

Vlastní a nevlastní fluorescence

• Vlastní fluorofory (vnitřní, intrinsic)– vyskytují se přirozeně

• Proteiny (aromatické aminokyseliny, např. fenylalanin), vitamin A, cytochromy, hemoglobin, chlorofyl

• Nevlastní fluorofory (vnější, extrinsic) – jsou přidány ke vzorkům, které nemají vhodné fluorescenční vlastnosti

• Použití nevlastních fluoroforů je mnohem častější než použití vlastních

Nevlastní fluoroscence

• Fluorescenční značky• látky přidané ke studovanému vzorku, které se váží kovalentně

• fluorescenční značení proteinů

• Fluorescenční sondy• látky přidané ke studovanému vzorku, které se váží

nekovalentně

Požadované vlastnostispecifická vazba na buněčné složkycitlivost emise na změny v okolípodobnost s původní sloučeninoupo zavedení fluoroforu nesmí dojít k narušení biologických systémů

• Biologicky aktivní• Chemicky stálé bez přítomnosti světla – možnost

skladování• Stálé v podmínkách experimentu • Krátký poločas – minimalizace nespecifického

značení• Vysoká specificita• Snadná syntetická dostupnost• Stálost aduktu v podmínkách použitých analytických

technik (elektroforéza, hmotnostní spektrometrie)

Principy fotoafinitního značení

Principy fotoafinitního značení

Fotoreaktivní skupina – modrá

Radioizotop – červený

Protein - zelený

Chemické struktury barev Alexa

Emisní spektra pro Alexa Fluor barevné serie

Alexa Fluor Cadaverine 647

N+

NSO3

-

H2NHN SO3

-

SO3-

SO3-

O

Syntéza AFCS

OH

OHOH

OH

O

CMO.HClOH

OHOH

OH

Npy

Okastasteron

OH

OHOH

OH

N

OH

OHOH

OH

N O N

N

N+

NSO3

-

AF 647

O

O

NHS

DCC

NaHCO3

HN

HN SO3

-

SO3-

SO3-

DMF

O

OH

O

O O

DCC: Dicyklohexylkarbodiimid, CMO.HCl: karboxymethyloxim hydrochlorid, NHS: N-Hydroxyskcinimid

Specifičnost absorpce AFCS

Absorpce fluoroforu AF647 minimální ve srovnání s absorpcí AFCS

Snažší absorpce způsobena CS částí molekuly

Rychlá absorpce AFCS

Šipky ukazují endosomy označené AFCS

Pohyb AFCS v buňkách

Signál AFCS se rychle ztrácí z PM a akumuluje se ve vakuolách

Pohyb AFCS v buňkách

AFCS je v PM, endozomech (označeno šipkami) a hromadí se ve vakuolách

AFCS putuje z PM do vakuol

Význam AFCS

Vývoj bioaktivního fluorescenčně značeného brassinosteroidu BR Alexa Fluor 647 kastasteron (AFCS) umožňuje pozorování endocytózy komplexů BR1-ligandu v živých buňkách.

Užitím různých endomembránových značek lze mapovat endocytickou cestu komplexu BRI1-AFCS z plasmatické membrány do vakuol.

Příprava steroidu pro navázání Alexy

O

OH

O

OHN

O

O O

O

O

HO

HO

O

OH

O

O

O

O NH2

O

HO

HO

H H

H H

Me2CO

p-TosOH

BocGlyDCCDMAP

TFA

py

Příprava steroidu pro navázání Alexy

O

OH

O

OHN

O

O O

O

O

HO

HO

O

OH

O

O

O

O NH2

O

HO

HO

H H

H H

Me2CO

p-TosOH

BocGlyDCCDMAP

TFA

py

Příprava aktivního esteru Alexy

HN O NH+

-O3S SO3-

O

H+

N

O

NOO

HN O NH+

-O3S SO3-

O

H+

N

OH

TSTU

EDIPA

ethyldiisopropylamine, (O-(N-succinimidyl)-1,1,3,3 tetramethyluronium tetrafluoroborate, H2O, DMF, 0 °C

Alexa navázaná na steroid

HN O NH+

-O3S SO3-

O

O

O NH

O

HO

HO

H

H+

N

O

DHEA (1), Photo-DHEA (2), a DHEA-Bodipy (3)

 

Další fluorofory

HN O N

HO3S SO3H

O

O

O

OH

HN

PA-Alexa

O

O

O

OH

HN

PA-NBD

NO2

N

NO

CO2H

O

7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol

BODIPY

b

boron-dipyrromethene4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene

N

B

N

F F

Skupina fluorescenčních značek, jejichž fluorofor obsahuje bórPoužití: značení proteinů, nukleotidů, enzymových substrátů, mastných kyselin, fosfolipidů

Struktury BODIPY

Dansylchlorid

S

OO

Cl

N

Reaguje s volnými aminoskupinami proteinů

DNS-Cl5-dimethylaminonaftalén-1-sulfonyl chlorid

Fluorescentní steroly pro studium pohybu cholesterolu v živých buňkách

Závěr

Využití fluorescence – nedestruktivní způsob sledování a analýzy biologických molekul prosřednictvím fluorescenční emise o určité frekvenci.

Existuje velká řada vnějších fluoroforů, takže je možnost výběru toho nejvhodnějšího.

Přehled je možno nalézt na stránkách www.molecularprobes.com

Literatura

Gimpl G. Gehrig-Burger K.: Probes for studying cholesterol binding and cell biology. Steroids 76 (2011) 216–231

Waschatko G. et al.: Photo-DHEA—A functional photoreactive dehydroepiandrosterone (DHEA) analog. Steroids, 76 (2011), 502-507

Irani N. G. et al.: Fluorescent brassinosteroids trace the endocytic route of BRI1, k tisku

Borovska J. et al.:. Neurosteroid access to the NMDA receptor, k tisku

www.molecular probes.com