Formalín – pravdivý příběh

aneb Všechno, co jste chtěli vědět o formalínu,

ale báli jste se zeptat

Petra Kašparová & Hanka Vošmiková

Fingerlandův ústav patologie

LF UK a FN Hradec Králové

FFPE aneb

Všichni vědí, že…

• FFPE = formalin-fixed, paraffin-embedded

• „zlatý standard“ fixace

Proč formalín? aneb

Jak to vlastně začalo…

• formaldehyd = plyn

• formalín = vodný roztok formaldehydu

• průmyslová výroba: koncentrovaný formalín + methanol

Proč formalín? aneb

Jak to vlastně začalo…

• 1892

• Ferdinand Blum

• antiseptikum x fixativum

Ferdinand Blum – články o formalínu

• Blum F.: Der formaldehyd als antisepticum, 1893

• Blum F.: Der Formaldehyd als hartungsmittel, 1893

• Blum F.: Notiz uber die Anwendungdes Formaldehyds(Formol) als Hartungs- und Konservierungsmittel, 1894

• Blum F.: Ueber Wesen und Wert der Formolhartung, 1896

FFPE „bájná“ verze

• 10% pufrovaný formalín

• okamžité vložení do fixativa

• objem fixativa = 10-20x objem tkáně

• fixace 24-48h

Co požadujeme od fixace?

• morfologie

• speciální metody

– speciální barvení

– ihc

– molekulární vyšetření

• uchování pro budoucí vyšetření

Fixace tkáně pro potřeby molekulárního vyšetření

Tkáň pro molekulární vyšetření:

• nativní – ideální!

– x časová a logistická náročnost

• fixovaná – nejčastěji FFPE

– snadná manipulace, snadný výběr reprezentativní tkáně (co největší množství nádorových buněk), téměř neomezená doba archivace

– x poškození nukleových kyselin

Formalinová fixace a kvalita DNA • formalínová fixace ovlivnění DNA:

• cross-linking:

– formaldehyd zesíťování DNA (RNA) a proteinů pomocí kovalentně vázaných methylenových můstků (-CH2-)

– urychlení: kyselé pH formalinu, doba fixace tkáně

• fragmentace DNA:

– kyselina mravenčí štěpení N- glykosidické vazby mezi purinovými bázemi a deoxyribózou → nevratná ztráta purinů z řetězce DNA a fragmentace celého vlákna DNA

• modifikace sekvence nukleových kyselin:

– formalínem indukovaná deaminace cytosinu za vzniku uracilu → falešně pozitivní výsledky sekvenace (deaminace je nerozlišitelná od bodové mutace!)

vyšetření

• histologická – TMA

• molekulární – kvalita DNA

TMA

• základní barvení – HE

• imunohistochemie – CK, LCA, vim

– Ki67

– CD10, CD30, bcl6

– PD-L1

• ISH – SISH HER2

Testování kvality DNA

Co to znamená?

• kontrola míry poškození DNA fixačním procesem

• kontrola použitelnosti DNA pro molekulárně-biologické analýzy

Jak se to dělá?

• kontrola výtěžku izolace

• kontrola integrity získané DNA

Izolace DNA z parafinových bločků

Deparafinizace Buněčná lýza Navázání DNA Promytí Eluce DNA

Ruličky 8-10 μm Roztok DNA

Změření koncentrace DNA

Izolace DNA z parafinových bločků

Deparafinizace Buněčná lýza Navázání DNA Promytí Eluce DNA

Ruličky 8-10 μm Roztok DNA

Změření koncentrace DNA

Izolace DNA z parafinových bločků

Deparafinizace Buněčná lýza Navázání DNA Promytí Eluce DNA

Ruličky 8-10 μm Roztok DNA

Změření koncentrace DNA

Měření koncentrace DNA

Fluorescenční barvička, která se začne intenzivně svítit po vazbě na doušroubovici DNA

Množství fluorescence je přímo úměrné koncentraci DNA v roztoku

1 10μm rulička tkáně z FFPE (1cm2)- cca 2 mg DNA

real-time PCR

Polymerase Chain Reaction, polymerázová řetězová reakce

amplifikace (namnožení) vybraného úseku DNA - z jedné molekuly DNA vznikne během dvou hodin cca bilión kopií

real-time PCR- fluorescenční barvivo ke značení produktu- čím více produktu vznikne, tím více fluorescence detekujeme

https://www.youtube.com/watch?v=C6pHZXFXq1c

real-time PCR

Polymerase Chain Reaction, polymerázová řetězová reakce

amplifikace (namnožení) vybraného úseku DNA - z jedné molekuly DNA vznikne během dvou hodin cca bilión kopií

real-time PCR- fluorecnční barvivo ke značení produktu- čím více produktu vznikne, tím více fluorescence detekujeme

Kvalita DNA- β-globin

testování kvality DNA- amplifikace části genu pro lidský β-globin

Gen HBB- kóduje β-podjednotku lidského hemoglobinu, je přítomen ve všech jaderných buňkách

´

ACACAACTGTGTTCACTAGC

CAACTTCATCCACGTTCACC

GAAGAGCCAAGGACAGGTAC

268 bp

110 bp

FFPE

• 10% pufrovaný formalín

• okamžité vložení do fixativa

• objem fixativa = 10-20x objem tkáně

• fixace 24-48h

koncentrovaný (100%) formalín =

35-37% formaldehydu

10% formalín =

(3,5 – 3,7%) »

4% formaldehydu ! !

TMA porovnání 4% x 10% formaldehydu (techmat) 4% 10%

techmat 24h 24h

techmat 96h 96h

techmat 24h 24h

techmat 24h 24h

techmat 24h 24h

techmat 24h 24h

techmat 72h 72h

Ki67

PD-L1

FFPE

• 10% pufrovaný formalín

• okamžité vložení do fixativa

• objem fixativa = 10-20x objem tkáně

• fixace 24-48h

Objem fixativa aneb

Jak se k sobě mají objem a koncentrace

Doporučený objem fixativa při použití 10% formalínu (= 4% formaldehydu):

3x vyšší koncentrace fixativa =

3x menší objem fixativa!

FFPE

• 10% pufrovaný formalín

• okamžité vložení do fixativa

• objem fixativa = 10-20x objem tkáně

• fixace 24-48h

Proč pufrovaný formalín? aneb

Úprava a pH formalínu

• koncentrovaný formalín je neupravovaný!

• formalín =

formaldehyd + methylenglykol + kys. mravenčí

• pH: – „přirozené“ pH formalínu = 3-4

– pH upraveného formalínu cca 7,2-7,3

• úprava: – neutralizace (CaCO3)

– pufrování (fosforečnany)

• pufrovaný formalín – osmotická aktivita roztoku???

stárnutí formalínu pufrovaný x neutralizovaný

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Řady1

Řady2

Řady3

Řady4

Řady5

Řady6

Řady7

Řady8

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Řady1

Řady2

Řady3

Řady4

Řady5

Řady6

Řady7

Řady8

TMA stárnutí formalínu

játra fixace ihned nízce

dif DCI fixace ihned techmat 4%

fixace ihned techmat 10%

pufr 4% tmavý 10% tmavý 4% tmavý 10% tmavý

4% čirý 10% čirý 4% čirý 10% čirý

neutral 4% tmavý 10% tmavý 4% tmavý 10% tmavý

4% čirý 10% čirý 4% čirý 10% čirý

Ki67

pufr

neutral

Vliv stárnutí formalinu na kvalitu DNA

4% formaldehyd, nepufrovaný, půl roku na parapetu v průhledné nádobě

10% formaldehyd, nepufrovaný, půl roku na parapetu v průhledné nádobě

Nižší výtěžek DNA, PCR β-globinu bez amplifikace

TMA pH formalínu techmat techmat 1 techmat 2 techmat 3 techmat 4

játra I

II

III

IV

Ki67

PD-L1

I II III IV

TMA pH formalínu nádory játra

meningeom lymfom thymus gbm adenoca

I x x x x

II

III

IV x x x x I II III IV

nízké pH

neutrální

Ki67

nízké pH

neutrální pH

FFPE

• 10% pufrovaný formalín

• okamžité vložení do fixativa

• objem fixativa = 10-20x objem tkáně

• fixace 24-48h

Studená ischémie aneb

Kdy do fixace?

• odebrání vzorku → období „studené ischémie“

• okolní teplota?

• vlhkost!

TMA studená ischémie

fixace ihned 24 RT 24 lednice 48 RT 48 lednice

techmat x x

techmat x

techmat x

DLBCL x x x

HG serózní ca

střevo x x

meningiom x x

ihned 24RT 24led 48RT 48led

Ki67

48h

PD-L1

24 RT

48 RT

24 lednice

48 lednice

FFPE

• 10% pufrovaný formalín

• okamžité vložení do fixativa

• objem fixativa = 10-20x objem tkáně

• fixace 24-48h

Doba ve fixaci aneb

Kdy z fixace?

• paradox penetrace – fixace

• krátká fixace → alkoholová fixace

• co je to přefixování?

TMA doba ve fixaci

4% 10% 4% 10%

24h 8 dní x

48h 9 dní

72h x 10 dní x

96h 11 dní

5 dní 14 dní x

Ki67

fixace 24h

14 dnů ve fixaci

PD-L1

fixace 24h

14 dnů ve fixaci

Vliv délky fixace na kvalitu DNA

Tonzila, fixace 4% a 10% formaldehydem. Testovaní kvality DNA po 1, 2, 3, 7, 10 a 14 dnech fixace

3 a více dní fixace způsobují výrazné snížení výtěžku izolace DNA bez ohledu na koncentraci formalinu

0

1

2

3

4

5

6

7

1 2 3 7 10 14

Výt

ěže

k D

NA

(m

g)

Vliv doby fixace na výtěžek izolace

4% formalin

10% formalin

0

5

10

15

20

25

30

1 2 3 7 10 14

Kva

lita

DN

A (

Ct)

Vliv doby fixace na kvalitu DNA

4% formalin

10% formalin

Vliv délky fixace na kvalitu DNA

Tonzila, fixace 4% a 10% formaldehydem. Testování kvality DNA po 1, 2, 3, 7, 10 a 14 dnech fixace

Delší doba fixace 4% formaldehydem zásadně kvalitu DNA neovlivní

3 a více dní fixace 10 % formaldehydem způsobují nevratné poškození DNA

FFPE shrnutí aneb

Báje versus skutečnost

• 10% formalín

• pufrovaný formalín

• okamžité vložení do fixativa

• objem fixativa = 10-20x objem tkáně

• fixace 24-48h

FFPE shrnutí

koncentrace

• 10% formalín – pro práci v laboratoři je výhodný 30% formalín

(10% formaldehydu)

– menší množství fixativa

– nezbytné dodržení maximálního času ve fixaci! (72h)

• pufrovaný formalín

• okamžité vložení do fixativa

• objem fixativa = 10-20x objem tkáně

• fixace 24-48h

FFPE shrnutí

úprava formalínu • 10% formalín • pufrovaný formalín

– při použití čerstvého formalínu pH > 3 bezpečné – množství kys. mravenčí! – nízké pH posouvá rovnováhu ve prospěch volného

formaldehydu (zvyšuje účinnou koncentraci formalínu) – neutralizace (pH 7,2-7,3) zvyšuje vazbení formaldehydu,

„ochraňuje“ materiál pro molekulární vyšetření – pufr je hyperosmolární roztok, má osmotickou aktivitu!

• okamžité vložení do fixativa • objem fixativa = 10-20x objem tkáně • fixace 24-48h

FFPE shrnutí

vložení do fixativa

• 10% pufrovaný formalín

• okamžité vložení do fixativa

– při zachování jiných parametrů je určitá tolerance (až 48h)

– teplota

– zachování osmotické rovnováhy (nedehydrovat!)

• objem fixativa = 10-20x objem tkáně

• fixace 24-48h

FFPE shrnutí

objem fixativa

• 10% pufrovaný formalín

• okamžité vložení do fixativa

• objem fixativa = 10-20x objem tkáně

– důležitější je počet volných molekul formaldehydu!

– možnost ovlivnění koncentrací fixativa

• fixace 24-48h

FFPE shrnutí

doba fixace

• 10% pufrovaný formalín

• okamžité vložení do fixativa

• objem fixativa = 10-20x objem tkáně

• fixace 24-48h – krátká fixace = alkoholová fixace

• ovlivnění morfologie

• nemá vliv na imunohistochemii a molekulární vyšetření

– dlouhá fixace • neovlivňuje morfologii a imunohistochemii

• znehodnocuje materiál pro molekulární vyšetření !!!

Poděkování

• VFN: Dundr & Véghová & Veselá

• MOÚ: Fabián & Kohoutková

• FNKV: Vadinská

• Agel: Schwarzová & Galiová

• FNUSA: Hermanová & Kuzmínová

• Histologická a cytologická laboratoř J. Nožičky: Nováková

• NPK Pardubice: Hácová & Čefelínová

• Nemocnice Náchod: Navrátilová

• FN Brno Bohunice: Lišková

• Thomayerova nem: Matěj & Štecherová

• SNO: Sehnálková & Levák

• Liberec: Jirásek

• Chrudim: Korcová

• Aeskulab: Staňková

• Litomyšl: Kohout

• IKEM: Lodererová

• FN Motol: Tarasová

• Havlíčkův Brod: Boháč & Doležalová

• České Budějovice: Vítková & Hanzalíková

• FNO: Vaculová

• Česká Lípa: Urbanec

• lékárna Jindřichův Hradec

• lékárna Trutnov

#everydaypathology