APLIKACE MOLEKULÁRNĚ GENETICKÝCH METOD APLIKACE MOLEKULÁRNĚ GENETICKÝCH METOD V MATERIÁLOVÉM INŽENÝRSTVÍV MATERIÁLOVÉM INŽENÝRSTVÍ

Petr Humpolíček

Obsah přednáškyObsah přednášky

0 Styčné body materiálového inženýrství a molekulární genetiky0 Studium buněčné reakce

0 Buněčná smrt - průtoková cytometrie

0 Genová exprese - microarray a qRT PCR

0 Příprava materiálů pomocí GMO0 Pedagogický rozvoj oboru0 Vědecký rozvoj oboru

Molekulární genetikaMolekulární genetika

Co mají společného tyto dva zjevně vzdálené obory?

Materiálové inženýrstvíMateriálové inženýrství

Věda zabývající se přípravou a úpravou materiálů s

konkrétními vlastnostmi.

Věda zabývající se strukturou, funkcí, regulací a interakcemi genů na molekulární úrovni.

Materiálové inženýrství / molekulární genetikaMateriálové inženýrství / molekulární genetika

0 Tkáňové inženýrství kombinuje molekulární genetiku a biologii, materiálové inženýrství a biochemické faktory za účelem náhrady či obnovy poškozené tkáně či orgánu.

0 Posun od přípravy umělé náhrady k přípravě scafoldu (lešení) pro buněčnou kultivaci a následnou regeneraci tkáně.

Journal of Surgical Research (2011) doi:10.1016/j.jss.2009.08.001

Bifurcated vascular prostheses. Výzkumný ústav pletařský, Brno

Biomaterials (2010) doi:10.1016/j.biomaterials.2010.02.002

Materiálové inženýrství / molekulární genetikaMateriálové inženýrství / molekulární genetika

0 Materiál může ovlivňovat:0 Adhesi buněk0 Proliferaci buněk0 Diferenciaci buněk 0 Buněčnou smrt0 Genovou expresi

Acta Biomaterialia (2010) doi:10.1016/j.actbio.2010.01.016

Biomaterials (2006) 27(3):473-84.

Molekulární genetika

Buněčná smrt - průtoková cytometrieBuněčná smrt - průtoková cytometrie

Průtoková cytometrie - principPrůtoková cytometrie - princip

Průtoková cytometrie je technologie, která umožňuje simultánní měření několika charakteristik na úrovni jednotlivých buněk.

Využití např. pro:-Kvantifikaci apoptozy.-Detekce genové exprese.-Studium RNA interference.

www.cell.com

www.invitrogen.com

www.cell.com

Zdravé = Annexin- / PI-Ranně apoptické = Annexin+ / PI-Pozdně apoptické = Annexin+ / PI+Nekrotické = Annexin+ / PI+

Průtoková cytometrie - apoptozaPrůtoková cytometrie - apoptoza

0 Fluorescenčních sond: Anexinu V a propidium jodidu.0 V rané fázi přesun fosfatidylserinu z vnitřní na vnější

část cytoplazmatické membrány.0 Na fosfatydilserin se váže annexin V.

0 V pozdní fázi (a při nekroze) ztrácí cytoplazmatická membrána integritu.0 Dochází k pronikání propidium jodidu do buňky.

BD biosciences

Průtoková cytometrie - příklad využitíPrůtoková cytometrie - příklad využití

0 Kultivace osteogenních buněk na modifikovaných polyhydroxyalkanoátech.

0 Zvýšený výskyt apoptických buněk.0 V závislosti na povrchových

vlastnostech.0 Povrch ovlivňuje množství integrinu β3.0 Integrin β3 aktivuje kaspázu 8.

Biomaterials (2013) doi:10.1016/j.biomaterials.2013.01.088

Genová exprese - qRT-PCR, microarrayGenová exprese - qRT-PCR, microarray

qRT PCR - principqRT PCR - princip

Kvantitativní PCR spojená s reverzní transkripcí (qRT PCR).0Reverzní transkripce:

0 Množství mRNA koreluje s genovou expresí.0 Z mRNA se vytváří komplementární DNA (cDNA).0 cDNA vstupuje do PCR.

0Kvantitativní PCR:0 Vychází z principu PCR.0 Přesná kvantifikace genové exprese díky:

0 Měření amplifikačních produktů v průběhu každého cyklu pomocí fluorescence.

Microarray - principMicroarray - princip

0 Reverzní transkripce:0 cDNA je označena fluorescenčními

sondami.0 DNA čip:

0 Prostorově specifická vazba DNA.0 DNA komplementární k hledaným cDNA.

0 Hybridizace:0 Inkubace destičky za přítomnosti cDNA.0 Hybridizace komplementárních

sekvencí.0 Omytí.

0 Identifikace hybridizace:0 Skenovací laserové mikroskopie.

0 Kvantifikace exprese:0 Srovnáním s housekeepingovým genem.

qRT PCR - iqRT PCR - interanterakce osteoblastůkce osteoblastů sese scaffold scaffoldyy

- Trikalcium fosfát + hydroxyapatit (TCP/HA).- Stroncium–hardystonite–gahnite (Sr–HT–gahnite) vyniká:

- Výrazně vyšší adherencí a proliferací buněk. - Zvýšená exprese genů: Runx2 (diferenciace osteoblastů); IBSP

(osteopontin); osteokalcin a kolagen I typu.

Acta Biomaterialia 9 (2013) 7014–7024. doi:10.1016/j.actbio.2013.02.039

TCP/HA

TCP/HA

Sr–HT–gahnite

Sr–HT–gahnite

qRT PCR – reakce buněk na mechanické stimulyqRT PCR – reakce buněk na mechanické stimuly

0 Nanovlákna vytvořená pomocí elektrospiningu.

0 Působení mechanických stimulů.0 Změny v expresi genů pro produkci

kolagenu.

Society for biomaterials. DOI: 10.1002/jbm.a.34102

50 um

B A C

Microarray – individualizace léčbyMicroarray – individualizace léčby

0 Regenerace kostní tkáně pomocí kultivace mezenchymálních stromálních buňek v keramickém scaffoldu.

0 Rozdílná úspěšnost implantace.

0 Predikce regenerace před implantací pomocí detekce exprese genu CADM1 (Cell Adhesion Molecule 1) u buněk pacienta.

Biomaterials (2013) http://dx.doi.org/10.1016/j.biomaterials.2013.03.001

Produkce materiálů pomocí GMOProdukce materiálů pomocí GMO

Produkce materiálů pomocí GMOProdukce materiálů pomocí GMO

0 TephaFLEX® je termoplastický lineární polyester.0 Schválený U.S. Food and Drug Administration.0 Produkovaný GMO bakteriemi.

0 Výborné materiálové vlastnosti.0 Biodegradabilní – hydrolýzou na monomery, které jsou snadno

odstraňovány z těla.

TephaFLEX® TephaFLEX®

PEDAGOGICKÝ ROZVOJ OBORUPEDAGOGICKÝ ROZVOJ OBORU

Pedagogický rozvoj oboruPedagogický rozvoj oboru

Bakalářské studium:0Základy molekulární biologie a genetiky.0V rámci specializace „Medicínské a farmaceutické materiály“

0 Aplikovaná biologie a mikrobiologie.0 Aplikovaná biologie a buněčné kultury.

Navazující magisterské studium:0Od akademického roku 2014/15 - Genetika a omické přístupy.

Doktorské studium0Díky úzkému propojení s vědeckými projekty personální rozvoj v oblasti studentů doktorských studijních oborů.

Studentské brigády

Spolupráce s firmami

VĚDECKÝ ROZVOJ OBORUVĚDECKÝ ROZVOJ OBORU

Participace na projektechParticipace na projektech

0 Centrum polymerních systémů – dovybavení laboratoře buněčných kultur na UTB ve Zlíně.0 Bioreaktor pro kultivaci v 3D.0 qPCR.0 FACS CANTO (Becton, Dickinson, US). 0 Olympus IX51 (Olympus, Japan).0 Infinite® 200 NanoQuant (Tecan, Switzerland).

www.synthecon.cz

Participace na projektechParticipace na projektech

0 Projekt GAČR č. 13-08944S „Vodivé polymery a jejich interakce s buňkami” – hlavní řešitel0 Spolupráce s Ústavem makromolekulární chemie AVČR a Ústavem

experimentální biologie, Přírodovědecká fakulta MU Brno.0 Zaměření na molekulárně genetické a biologické interakce

vodivých polymerů s eukaryotickými buňkami.

0 Příprava projektů TAČR, GAČR a projektů v rámci Horizont2020.

Děkuji za pozornost