Dvouděložná rostlina huseníček rolní jemalá a nenápadná jednoletá bylina (obr. 1),kterou v 16. stol. poprvé popsal NěmecJohannes Thal. Tehdy ji nazval Pilosella sili-quosa. Až v r. 1842 byl přijat její dnešnínázev Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.Můžeme se s ní běžně setkat v přírodě a jejípopulace se vyskytují na celé severní polo-kouli v Evropě, Asii a Africe, byla nalezenataké v Severní Americe a Austrálii, kam bylapravděpodobně zavlečena z Evropy.

Z jakého důvodu získala tato rostlina zce-la výsadní postavení v genetice a předevšímv molekulární genetice rostlin? Je to proto,že splňuje všechny podmínky modelovéhoorganismu. K těm patří snadná kultivacev laboratorních podmínkách i v podmín-kách in vitro a prostorová nenáročnost.Krátká generační doba, pouhých 6 až 8 týdnůod vysetí, nám umožňuje získat 6 až 8 ge-nerací do roka. Při optimálním růstu získá-me z jedné rostliny až několik tisíc semen

a tedy i stejný počet potomků v další gene-raci, což je výhodné pro genetickou analý-zu. Avšak tím hlavním důvodem, proč sehuseníček rolní stal skutečným reprezen-tantem vyšších rostlin, je velikost a struk-tura jeho genomu. V jádře má pět párůchromozomů a haploidní genom obsahuje125×106 párů bazí (bp), tj. 125 Mb. Jehogenom je tedy asi jen 25krát větší než ge-nom bakterie Escherichia coli, 10krát většínež genom kvasinky Saccharomyces cere-visiae, je porovnatelný s genomem živočiš-ného modelového objektu mušky octomilky(Drosophila melanogaster) a asi 26krátmenší než genom člověka. A právě velikostgenomu byla rozhodujícím faktorem při vý-běru první rostliny pro kompletní sekve-nování DNA.

Huseníček rolní a současný výzkum rostlinného genomu

Jana Řepková

CCCC MMMM YYYY KKKK

5živa 1/2007 www.cas.cz/ziva

Huseníček rolní (Arabidopsis thaliana) z čel. brukvovitých (Brassicaceae) jevýznamným modelovým objektem pro molekulární genetiku rostlin. Velikostgenomu tohoto druhu, nejmenšího genomu v rostlinné říši, byla rozhodujícímdůvodem pro získání první kompletní sekvence rostlinné DNA a zahájení syste-matické funkční analýzy jednotlivých genů.

Obr. 2 Mutant huseníčku rolního (A. thaliana).Mutace byla indukována ionizujícím zářením— rentgenovými paprsky. Fenotypově (fenotypje soubor znaků, kterými se v daném prostředíprojevuje genotyp) se projevuje protáhlými dělo-hami a listy, které jsou šedozelené, romboidní(ve tvaru kosočtverce), se dvěma zuby

tvary, pozoruhodnou symetrií a povrchembuněk. Učebnicovým příkladem je skupinas příznačným českým názvem krásivky (t鞎iva 2004, 1: 12–14). Krásné jsou nejenbuněčné tvary a povrch buněk, ale i chlo-roplasty nacházející se uvnitř a jejich struk-tura (obr. 3).

Neméně krásy, která se ovšem ukáže ažpři bližším průzkumu, v sobě ukrývají naprvní pohled uniformní „zelené kuličky“ zeskupiny Chlorococcales. Mezi ně patříi řasa s latinským názvem Dictyochloropsis,která se vyznačuje poměrně velkými roz-měry buněk, dosahujícími v průměru až50 µm. Buňky tohoto organismu jsem opa-kovaně nalezl na vrchu Boreč v Českémstředohoří, který je proslulý svými ventaro-ly, tj. místy s vývěry teplého a vlhkéhovzduchu v zimním období. Jednobuněčnéřasy kulovitého tvaru se složitě utvářenýmchloroplastem zde rostou ukryty ve stél-kách mechů a na povrchu kamenů ve ven-tarolech a jejich nejbližším okolí. Již první

konfokální snímky odhalily nečekaně boha-tou strukturu chloroplastu s mnoha síťovitěspojenými laloky. Po několika opakovanýchstudiích již bylo možné načrtnout celouzměnu tvaru chloroplastu od mladých buněkaž po dospělé, dělící se buňky. Ze seriálníchoptických řezů živými buňkami bylo poslé-ze možno vytvořit trojrozměrné rekonstruk-ce chloroplastů v různých stadiích životníhocyklu (obr. 4).

Konfokální mikroskopie:ideální nástroj pro studium řas

S nástupem konfokální mikroskopie vý-razně narůstají možnosti studia složitýchchloroplastů řas, které dosud stály stranouzájmu algologů. Pomocí této metody lze ne-jen detailně postihnout změny chloroplas-tu během životního cyklu mnoha druhů čistudovat rozsáhlé přestavby chloroplastupřed buněčným dělením, ale také zkoumatvliv různých abiotických faktorů (jako např.

intenzity světla) na trojrozměrné uspořádá-ní laloků chloroplastů.

Rozdíl mezi uniformním tvarem chloro-plastů všech vyšších rostlin a velkou varia-bilitou tvarů chloroplastů mnohých zelenýchřas je až zarážející. Zdá se, jako by jedno-buněčné řasy projevovaly svou druhovouvariabilitu právě ve struktuře chloroplastů,kdežto mnohobuněčné vyšší rostliny jižvytvářejí pouze morfologicky velmi jedno-duché a uniformní chloroplasty „fádního“tvaru. Také vláknité řasy většinou ve svýchbuňkách obsahují chloroplasty jednoduš-ších tvarů. Zelené řasy se složitější stavboustélky, jako např. parožnatky (chary), pak vesvých buňkách hostí tvarově stejně uni-formní chloroplasty jako vyšší rostliny. Jetedy možné vyslovit hypotézu, že zatímcovyšší rostliny projevují tvarovou rozmanitostna úrovni listů, květů a jiných orgánů, auto-trofní organismy, kterým se v evoluci nepo-dařilo „vynalézt“ mnohobuněčnost, si touhupo individualitě uspokojují poněkud jinak.

Obr. 1 Dvouděložná rostlina huseníček rolní(Arabidopsis thaliana) je významným modelo-vým objektem v genetice. Na obr. ekotyp Co-lumbia, který je výchozím genotypem pro navo-zení mutací jak klasických tak inzerčnícha jejich další analýzu zaměřenou na zjištěnía charakterizaci genů

1

2

Projekty studia genomu

V r. 1992 byl zahájen projekt The Arabi-dopsis Genome Initiative, jehož cílem byloporozumět fyziologii, biochemii, růstu a vý-voji huseníčku rolního jako představitelekvetoucích rostlin. Zahrnoval analýzu mu-tantů, genových interakcí (jeden znak je kó-dován dvěma a více geny), klonování geno-mových sekvencí a jejich sekvenování.Vlastní sekvenování bylo zahájeno v r. 1996a koncem r. 2000 bylo dokončeno. Na vý-zkumu se podílelo 6 týmů a 40 světovýchlaboratoří z Evropy, Japonska a USA.

Díky tomuto klíčovému projektu je známsled nukleotidů celého jaderného i mimo-jaderného genomu huseníčku rolního u eko-typu Columbia a počet genů byl stanovenna 25 498. Kódují 11 600 různých druhů pro-teinů, z nichž 35 % je jedinečných. U mnohaproteinů lze předpokládat určitou homo-logii s proteiny člověka i dalšího modelo-vého organismu — hlístice háďátka řep-ného (Caenorhabditis elegans). Asi 20 %z těchto předpokládaných proteinů, prokteré jsou k dispozici kompletní sekvenceaminokyselin, vykazuje homologii s protei-ny jiných eukaryotických organismů, coždokumentuje evoluční konzervativní charak-ter buněčných funkcí u eukaryot. Současněprobíhalo a probíhá sekvenování genomůdalších rostlinných druhů. Druhou rostlinouse známou sekvencí DNA se stala rýže setá(Oryza sativa).

Po r. 2000 byly zahájeny další dva klíčovéprojekty, The Arabidopsis 2010 Programa The Plant Genome Program, jejichž cílemje do r. 2010 určit funkce co největšího po-čtu rostlinných genů. Tím se výzkum původ-ně zaměřený zejména na strukturu genomurostlin dostal do období funkční genomikyzaměřené převážně na přiřazení funkcíjednotlivým genům vyřazením příslušnýchgenů z činnosti. Základním předpokladempro zjišťování funkce rostlinných genů jemutační analýza s využitím chemomutage-nů (chemických látek navozujících mutace),jako jsou např. EMS (etylmetansulfonát),ENU (1–etyl–1–nitrozomočovina), MNU (1–metyl–1–nitrozomočovina) nebo dES (die-tylsulfát), či fyzikálních mutagenů, jako jeionizující záření, nejčastěji rentgenové pa-

prsky. Takto byly získány a posléze zmapo-vány tisíce mutantů huseníčku rolního.

K dalšímu urychlení rozvoje funkční ge-nomiky došlo po zavedení metodik tzv. in-zerční mutageneze — metod funkčníhoovlivnění genů prostřednictvím cizorodéDNA. Při inzerční mutagenezi jsou většinourostlinné buňky transformovány bakteriemiAgrobacterium tumefaciens, což umožňujevnášet prostřednictvím molekulárních vek-torů do genomu tzv. T–DNA (T–DNA je sou-částí onkogenního Ti plazmidu bakterieA. tumefaciens a za normálních okolnostívyvolává vznik rostlinných nádorů. Vhodně„odzbrojená“ T–DNA se však stala mocnýmnástrojem rostlinné molekulární genetikya genetického inženýrství). Začleněním dorostlinné DNA způsobují T–DNA a transpo-zony (mobilní genetické elementy) inaktiva-ci nebo i aktivaci genů, a tak usnadňují iden-tifikaci a izolaci genů hostitele.

Výzkum huseníčku rolního probíhá i naněkolika pracovištích v České republice(Biofyzikální ústav AV ČR v Brně, Ústavexperimentální botaniky AV ČR v Prazea v Olomouci, Ústav molekulární biologierostlin AV ČR v Českých Budějovicích). Nanašem oddělení genetiky a molekulární bio-logie Masarykovy univerzity v Brně byli jižv 70. letech 20. stol. získáni vlastní mutan-ti s chlorofylovými a embryonálními defektya s defekty v morfologických znacích. Řadaz nich je uchována v genové bance NASC

(Nottingham Arabidopsis Stock Centre).Cílem současné práce je lokalizace mutant-ních alel v genetické mapě huseníčku, cožje první krok k identifikaci genů určujícíchtyto znaky a jejich izolaci.

Studium mutací

Morfologické mutace — dědičné změnygenotypu založené na nukleotidové změněDNA — lze z fenotypového hlediska roz-dělit do několika základních kategorií. Odstandardní rostliny se mutanti odlišují v cel-kové velikosti nebo ve velikosti a tvaru listu,v charakteru okraje listu nebo ve struktuřezákladní růžice (obr. 2–8), jejíž uspořádánízávisí na délce řapíku listů, počtu listů a je-jich vzájemném postavení. Identifikace genůa především funkce jejich předpokládanýchproteinů ovlivňujících morfogenezi listůnení doposud ve většině případů spolehlivěobjasněna. Morfogeneze listu je složitý pro-ces a je zřejmé, že mechanismů, které se naní podílejí, bude značné množství.

Na našem pracovišti se podrobně stu-dovaly morfologické mutace cupuliformisa rotundata (obr. 10), které mění růstovýpotenciál listů. Mutace involuta (obr. 7)a lycopodioformis dávají vznik mutantůms defekty jak ve struktuře vegetativních orgá-nů, tak i ve struktuře květenství a v době do

CCCC MMMM YYYY KKKK

6 živa 1/2007www.cas.cz/ziva

Příklady mutací huseníčku rolního (Arabido-psis thaliana). Obr. 3 Mutace compacta (cp) sefenotypově vyznačuje polozakrslým vzrůstemrostlin a nahloučenými listy v listové růžici.Gen určující tyto vlastnosti se nachází na chro-mozomu 2 a využívá se jako signální gen. Prosnadnou detekci se tento znak používá jakomorfologický marker

Obr. 4 Mutace angustifolia (an) indukovanárentgenovými paprsky. Fenotypově se projevujeúzkými a celokrajnými listy a větším počtemlistů v růžici © Obr. 5 Mutace chlorominuta (chm)indukovaná chemomutagenem EMS. Vyznačujese světle zelenými mladými listy, květní stonkya kališní listy jsou žlutozelené. Mutace způsobu-je poruchu ve tvorbě chlorofylu

Obr. 6 Mutace convoluta (cn) indukovaná rentge-novými paprsky. Fenotypovým projevem mutaceje stáčení děloh, řapíků a stonků kolem své osyproti směru hodinových ručiček, listy v růžicijsou také stočené © Obr. 7 Mutace involuta (iv)indukovaná chemomutagenem EMS. Listy v lis-tové růžici jsou velmi drobné, složené podél hlav-ního žebra. Mutace je charakteristická velmidrobným vzrůstem rostlin, květenstvím složenýmjen z několika květů a výraznou raností

3

4

5

6

7

kvetení. Přesto je mutantní fenotyp určovánjedním genem. Extrémně zakrslý fenotypby mohl být spojen s defektem ve funkcifytohormonů, které se u rostlin podílejí namnoha vývojových procesech.

Různými mutacemi je narušena také ini-ciace a tvorba trichomů. Trichomy patří kespecializovaným buňkám, které mají u růz-ných druhů odlišný tvar. U huseníčku rolní-ho jsou jednobuněčné a vytvářejí obvykledvě nebo tři větve. Diferencují se z pokožky(epidermis) listových primordií a na jejichiniciaci a vývoji se podílí více než 36 genů.Tvorbu trichomů narušují např. mutacev genu GLABROUS1 (GL1). Gen GL1 kó-duje transkripční faktor a byl již klonován.U mutantů gl1 (obr. 9) nevznikají v epider-mis žádné prekurzorové buňky trichomů.Iniciace i morfogeneze trichomů jsou podkontrolou hormonu giberelinu, který pozi-tivně reguluje expresi genu GL1. Rostlinyrostoucí při nízké koncentraci inhibitorůbiosyntézy giberelinu vykazují snížení po-čtu trichomů a jejich větvení, rostliny klíčí-cí při jejich vyšší koncentraci jsou bez tri-chomů.

Intenzivně se studují také mutace měnícíprůběh embryogeneze. Embryogeneze vyš-ších rostlin se vyznačuje morfologicky velmijednoduchými stadii embrya, od preglobu-lárního, globulárního, srdčitého, torpédovi-

tého až do stadia zralosti, ale na molekulár-ní úrovni jde o proces velmi komplikovaný,kterého se účastní kolem čtyř tisíc genů.Pro zajištění vývoje zygoty až po organizo-vanou mnohobuněčnou strukturu zraléhoembrya musejí být jejich funkce přesněkoordinovány. K určování funkcí genů sevyužívají opět modelové organismy, přede-vším huseníček, ale také kukuřice setá (Zeamays). Na našem pracovišti bylo identifiko-váno několik různých mutací s defekty vevývoji nezralých semen. Poznatky o regulaciembryogeneze rostlin jsou však stále ne-úplné a funkce genů je často spojena s funk-cí rostlinných hormonů, auxinů a cytokini-nů (viz článek J. Frimla na str. 8).

Pro tvorbu jednotlivých orgánů jsou dů-ležité také procesy zahrnující fotosyntézu.Mutace v genech, které se na ní podílejí,jsou spojeny s defekty při tvorbě chlorofy-lu. Dvě mutace s chlorofylovými defektychlorominuta (obr. 5) a lucida (obr. 11)byly charakterizovány prostřednictvím ge-netického mapování. Žlutozelené zbarvenílistů naznačuje, že došlo k defektu ve tvor-bě chlorofylu.

Rozvoj genomiky

Na základě poznání kompletních sekven-cí genomů dvou rostlinných druhů a čás-tečných sekvencí dalších byl získán rozsáhlýstudijní materiál a přímo se nabízí jejichsrovnání z různých hledisek. To je také cí-lem tzv. srovnávací genomiky. Např. uspo-řádání genů a lokusů na chromozomech sestalo náplní srovnávací genomiky druhůčtyř čeledí — již zmíněných brukvovitých,lipnicovitých (Poaceae), bobovitých (Faba-ceae) a lilkovitých (Solanaceae). Čeledi

nebyly vybrány náhodou, zahrnují totižekonomicky nejvýznamnější druhy, jako jebrukev zelná (Brassica oleracea), brukevřepák (B. rapa), brukev černá (B. nigra)a jejich hybridy brukev sítinovitá (B. juncea),brukev řepka (B. napus) a hořčice habeš-ská (B. carinata) — brukvovité; kukuřicesetá, pšenice setá (Triticum aestivum),rýže setá — lipnicovité; sója luštinatá (Gly-cine max), čočka kuchyňská (Lens culina-ris), fazol obecný (Phaseolus vulgaris),hrách setý (Pisum sativum), vojtěška setá(Medicago sativa) — bobovité; rajče jedlé(Solanum lycopersicum), lilek brambor(S. tuberosum), tabák virginský (Nicotia-na tabacum), paprika setá (Capsicum an-nuum) — lilkovité.

Dostáváme se tak od poznání genomu„bezvýznamného“ huseníčku k poznánígenomů významných plodin, ale i k mož-nosti využití konkrétních rostlinných genůpro zlepšení znaků a vlastností kulturníchdruhů prostřednictvím genetických modifi-kací (viz seriál E. Pekárkové, 2004–6: 1–6).Soubor dat, který poskytuje uživatelsky do-stupné informace o huseníčku rolním, seneustále průběžně aktualizuje. Zdrojemkomplexních informací je internetová data-báze The Arabidopsis Information Resour-ce — TAIR na adrese www.arabidopsis.org.

Obr. 8 Mutace sparsipila (spi) indukovaná che-momutagenem MNU. Vyznačuje se světle zele-nými listy, které jsou téměř bez trichomů. Rost-liny jsou velmi statné s větším počtem listův listové růžici a velmi pozdní © Obr. 10 Mu-tace rotundata (rd) indukovaná chemomuta-genem MNU. Fenotypově se projevuje širokýmia okrouhlými listy a krátkými řapíky

CCCC MMMM YYYY KKKK

7živa 1/2007 www.cas.cz/ziva

Obr. 9 Mutace glabrous (gl) vyznačující se lysýmilisty a stonky, což je způsobeno ztrátou schopnos-ti tvořit trichomy. Tento výrazný znak je využí-ván jako morfologický marker. Gen determinu-jící znak je lokalizován na chromozomu 3 ©Obr. 11 Mutace lucida (lc) indukovaná chemo-mutagenem MNU. Vyznačuje se svítivě žluto-zeleným zbarvením děloh a listů v důsledkuporuch ve tvorbě chlorofylu. Snímky J. Řepkové

8

10

9

11