INFRAČERVENÁ A RAMANOVA SPEKTROSKOPIE INFRAČERVENÁ A RAMANOVA SPEKTROSKOPIE
aneb aneb
CO NÁM MOHOU VIBRACE ŘÍCI CO NÁM MOHOU VIBRACE ŘÍCI
O (BIO)MOLEKULÁCHO (BIO)MOLEKULÁCH
Vladimír BaumrukVladimír Baumruk
Univerzita Karlova v PrazeUniverzita Karlova v PrazeMatematicMatematickko-fyzikální fakultao-fyzikální fakulta
Fyzikální ústav UKFyzikální ústav UK
vibrační spektroskopievibrační spektroskopie infračervená spektroskopie (IČ)infračervená spektroskopie (IČ)
Ramanova spektroskopie (RS)Ramanova spektroskopie (RS)
MetodyMetody
2
COCO22 - lineární molekula (O=C=O) se středem symetrie - lineární molekula (O=C=O) se středem symetrie
nn = 3 = 3 33nn – 5 = 4 – 5 = 4 2 valenční vibrace2 valenční vibrace nesymetrickánesymetrická aktivní v IČaktivní v IČ symetrickásymetrická aktivní v RSaktivní v RS
2 deformační vibrace (degenerované)2 deformační vibrace (degenerované) aktivní v IČaktivní v IČ
středstřed symetr symetrieie alternativní zákazalternativní zákaz
vibrace aktivní v IČ spektru nejsou aktivní vibrace aktivní v IČ spektru nejsou aktivní v Ramanově spektru a vice versa (tedy v Ramanově spektru a vice versa (tedy komplementarita IČ a Ramanakomplementarita IČ a Ramana))
frefrekvencekvence vibra vibracece
f f – – silová konstantasilová konstanta ( (síla vazbysíla vazby)) – – reduredukovanákovaná hmotnosthmotnost
VibrVibrační spektroskopie – principační spektroskopie – princip
3
COCO22 - lineární molekula (O=C=O) se středem symetrie - lineární molekula (O=C=O) se středem symetrie
nn = 3 = 3 33nn – 5 = 4 – 5 = 4 2 valenční vibrace2 valenční vibrace nesymetrickánesymetrická aktivní v IČaktivní v IČ symetrickásymetrická aktivní v RSaktivní v RS
2 deformační vibrace (degenerované)2 deformační vibrace (degenerované) aktivní v IČaktivní v IČ
středstřed symetr symetrieie alternativní zákazalternativní zákaz
vibrace aktivní v IČ spektru nejsou aktivní vibrace aktivní v IČ spektru nejsou aktivní v Ramanově spektru a vice versa (tedy v Ramanově spektru a vice versa (tedy komplementarita IČ a Ramanakomplementarita IČ a Ramana))
frefrekvencekvence vibra vibracece
f f – – silová konstantasilová konstanta ( (síla vazbysíla vazby)) – – reduredukovanákovaná hmotnosthmotnost
VibrVibrační spektroskopie – principační spektroskopie – princip
4
h h E ER 0 2 1( )
VibrVibrační spektroskopie – principační spektroskopie – princip
vibrace aktivní v IČ spektru (změna dipólového momentu)
vibrace aktivní v Ramanově spektru (změna polarizovatelnosti)
Ramanův posuv vib = 0-R
5
VibrVibrační spektroskopie – spektraační spektroskopie – spektra
Infračervené absorpční a Ramanovo spektrum kyseliny benzoové
inte
nzita
roz
ptyl
u
prop
ustn
ost
(%)
IČIČ
RamanRaman
vlnočet (cm-1)
daleká daleká IČIČ
(FIR)(FIR)
6
1 460 cm-1
plně symetrická
2 214 cm-1
2x degenerovaná
3 780 cm-1
3x degenerovaná
4 313 cm-1
3x degenerovaná
polarizované spektrum
depolarizované spektrum
Jednoduché molekuly – symetrie a vibrace (příklad CClJednoduché molekuly – symetrie a vibrace (příklad CCl44))
infračervená absorpce
-1vlnočet (cm )
7
Detailní pohled naDetailní pohled na pás v Ramanově spektru CClpás v Ramanově spektru CCl44
Izotopické štěpení díky existenci dvou stabilních izotopů 35Cl a 37Cl(jednotlivé komponenty odpovídají různému zastoupení těchto dvou izotopů v molekule CCl4)
C 35Cl337Cl
C 35Cl4C
35Cl237Cl2
C 35Cl 37Cl3
1 - symetrická valenční vibrace
vlnočet (cm-1)
8
Vyzařování oscilujícího dipóluVyzařování oscilujícího dipólu
Úhlové rozdělení amplitudy E (---) a zářivosti I ( ) oscilujícího elektrického dipólu.
Oscilující elektrický dipól
směršíření
9
RozptylRozptyl
(a) (b)
Rozptyl lineárně polarizovaného světla molekulouRozptyl lineárně polarizovaného světla molekulou
10
RozptylRozptyl
Rozptyl nepolarizovaného světla molekulouRozptyl nepolarizovaného světla molekulou
11
12
Polarizovaný Ramanův rozptylPolarizovaný Ramanův rozptyl
Měření polarizovaných Ramanových spekter v pravoúhlé geometrii experimentuMěření polarizovaných Ramanových spekter v pravoúhlé geometrii experimentu
E �
2
22
3
45 4
I
I
Depolarizační poměrDepolarizační poměr tenzor polarizovatelnosti
2
1
313
2
izotropní invariant
anizotropní invariant
vlnoèet (cm-1)
200 400 600 800 1000
inte
nzi
ta r
op
ztyl
u
polarizované kolmopolarizované rovnobì žnì
217 31
4
461
760
788
= 0,75
= 0,006
2245 7totI I I
Totální spektrum
x
y
z
excitace
rozptyl
y
x
z
excitace
rozptyl
z
x
y
excitace
rozptyl
y
x
z
excitace
rozptyl
x
z
y
excitace
rozptyl
z
y
x
excitace
rozptyl
Polarizovaná Ramanova Polarizovaná Ramanova spektra orthorombického spektra orthorombického monokrystalumonokrystalu
T=300KT=300Koblast vnitro-oblast vnitro-molekulárních molekulárních vibracívibrací
monokrystal monokrystal síranu adeninusíranu adeninu
x(yz)y
y(xz)x
z(xy)x
y(zz)x
x(yy)z
z(xx)y
Portova notacePortova notace
x(yy)z
13
x
z
y
excitace
rozptyl
x
z
y
excitace
rozptyl
z
y
x
excitace
rozptyl
z
y
x
excitace
rozptyl
x
z
y
excitace
rozptyl
Polarizovaná Ramanova Polarizovaná Ramanova spektra orthorombického spektra orthorombického monokrystalumonokrystalu
T=10KT=10Knízkofrekvenční oblastnízkofrekvenční oblast(mezimolekulární (mezimolekulární vibrace)vibrace)
x(zx)z
x(zx+zy)z
z(yx+yz)y
x(zy)z
z(zy)y
bez analyzátoru
bez analyzátoru
14
monokrystal síranu adeninumonokrystal síranu adeninu
15
16
Tsu et al. Appl. Phys. Lett. 40, 534 (1982)
1
0.88
p p aI I I
y
y
Dvoufázový systém - mikrokrystalický křemík v amorfní matrici
pás amorfní komponenty
pás polykrystalické komponenty
17
strukturní informaci lze získat v relativně krátkém čase (proto strukturní informaci lze získat v relativně krátkém čase (proto nachází využití například v proteomice)nachází využití například v proteomice)
neomezuje se pouze na statický obrázekneomezuje se pouze na statický obrázek (citlivost ke změnám, (citlivost ke změnám, možnost dynamických studií)možnost dynamických studií)
velikost studovaných molekul a povaha okolního prostředí velikost studovaných molekul a povaha okolního prostředí nepředstavují žádné omezení (a nebo jen výjimečně)nepředstavují žádné omezení (a nebo jen výjimečně)
je to mimořádně vhodná metoda pro zkoumání vztahu mezi je to mimořádně vhodná metoda pro zkoumání vztahu mezi strukturoustrukturou aa funkcí biomolekulfunkcí biomolekul
Proč vibrační spektroskopieProč vibrační spektroskopie ? ?
18
Výhody vibračníVýhody vibrační spektroskopiespektroskopie
RS a IČ jsou nedestruktivní metody (možnost testování biologické aktivity po skončení měření).
Aplikovatelné na vzorky libovolné morfologie (roztoky vodné i nevodné, suspenze, precipitáty, gely, vrstvy, vlákna, prášky, monokrystaly, …). Pro biomolekuly lze tak ověřit nakolik se shoduje či naopak odlišuje jejich struktura v krystalu a v roztoku.
Nenáročné na objem vzorku (cca 10 ml pro konvenční RS, 20 ml pro IČ).
Rychlá časová škála absorpce i rozptylu ( 10-15 s) - využití vibrační spektroskopie pro časově rozlišené studie procesů, které nejsou přístupné pomocí fluorescence či NMR.
Existence rozsáhlé databáze IČ a Ramanových spekter (včetně přiřazení pásů jednotlivým vibracím a známých strukturně-spektrálních korelací).
19
Specifické výhody Ramanovy spektroskopieSpecifické výhody Ramanovy spektroskopie
Voda představuje ideální rozpouštědlo pro Ramanovu spektroskopii
(na rozdíl od IČ).
Intenzívní pásy v Ramanových spektrech pocházejí od vibrací, při kterých dochází k velké změně polarizovatelnosti (např. aromatické molekuly).
Relativně snadné měření i v oblasti nízkých vlnočtů (pod 400 cm-1, daleká IČ oblast) v jediném experimentu se základní oblastí
Selektivní rezonanční zesílení (tzv. rezonanční Ramanův jev).
Povrchem zesílený Ramanův rozptyl (SERS) (design SERS aktivního povrchu spadá do oblasti nanotechnologií)
20
Nevýhody vibrační spektroskopieNevýhody vibrační spektroskopie
Spektrální rozlišení je sice vyšší než v elektronových spektrech, ale nižší ve srovnání s NMR. Nedostatečné rozlišení může být částečně kompenzováno chemickou (izotopická záměna) nebo biologickou (bodová mutace) modifikací.
Jsou potřeba relativně vysoké koncentrace vzorku ( 10-100 g/l) byť v malých objemech.
Jak H2O tak i D2O nejsou ideálním rozpouštědlem pro IČ spektroskopii
(na rozdíl od Ramanova rozptylu).
Ramanův jev (nepružný rozptyl světla) je ze své podstaty slabý jev (ve srovnání s absorpcí nebo emisí světla). Je tedy nutná značná čistota vzorků a péče při manipulaci s nimi (velmi vadí fluorescence příměsí).
21