Izolace RNA z živočišné tkáně

MUDr. Michal Jurajda

ÚPF LF MU

Zdroj RNA

• Čerstvá tkáň živočišného původu– Slezina, játra, ledviny laboratorního potkana

Uchování a transport biol. materiálu

• Ihned po odběru bude následovat izolace zahájená homogenizací a lýzou vzorku. Lyzační pufr blokuje RNA-ázy. Některé postupy doporučují uchovávat lyzáty pro pozdější izolaci.

Charakter zpracovávaných tkání

• Buněčnost – u jater, sleziny i ledvin vysoká – max. 25μg na jednu kolonku

• Přítomnost lipidů – nízká

• Charakter extracelulární matrix – snadno mechanicky rozrušitelná

Homogenizace tkání

• Použijeme rotor stator homogenizátor

Izolace nukleových kyselin

• Použijeme RNeasy kit fy QIAGEN

Kolonky Qiagen

buněčný lyzát centrifugace promytí a uvolnění

Izolační kolonky

Izolace RNA

28S

18S

1,5% agaróza vTBE

Spektrofotometrické stanovení

• Kyveta z křemičitého skla (quartz, silica)

• A260 – absorbance vlastní NA

• A230 – absorbance složek pufru (Tris, EDTA)

• A280 – absorbance fenolu a proteinů (fenylalanin a tyrosin)

• A320 – absorbance pozadí, NA ani proteiny neabsorbují.

Odstranění RNA-áz

• DEPC diethyl pyrocarbonate

• Karcinogen

• Deaktivovatelný při 100 st.Chttp://www.ambion.com/techlib/tb/tb_178.html

Vlastní postup

• Před prvním použitím nachystat roztoky.– Přidat čistý 96-100% ethanol k RPE pufru– Přidat β-merkaptoethanol k RLT pufru v

poměru 10 μl na 1 ml pufru. Pozor po smíchání zůstává stabilní pouze 1 měsíc.

• Vložit vzorek tkáně (20-25 μg) do 1,5 nebo 2 ml eppendorfky a přidat 600 μl RLT pufru.

• Okamžitě homogenizovat pomocí rotor stator homogenizátoru.

• Centrifugovat 3 minuty při maximálních otáčkách a supernatant přenést do nové zkumavky.

• Přidat stejný objem 70% ethanolu a promíchat opakovaným nasátím pipetou.

• 700 μl vzorku přenést na kolonku vloženou do sběrací zkumavky. Centrifugovat 15s při minimálně 8000g. Vylít roztok, který protekl kolonkou a opětovně použít sběrací zkumavku. Možno nanést zbytek vzorku (max. 700 μl na jednu centrifugaci) a zopakovat postup

• Nanést na kolonku 700 μl pufru RW1 Centrifugovat 15s při minimálně 8000g. Vylít roztok, který protekl kolonkou a opětovně použít sběrací zkumavku.

• Přidat na kolonku 500 μl RPE pufru. Centrifugovat 15s při minimálně 8000g. Vylít roztok, který protekl kolonkou a opětovně použít sběrací zkumavku.

• Přidat na kolonku 500 μl RPE pufru. Centrifugovat 2 min. při minimálně 8000g. Vylít roztok, který protekl kolonkou a vyměnit sběrací zkumavku.

• Centrifugovat 1 min. při minimálně 8000g s čistou sběrací zkumavkou-snaha odstranit veškerý ethanol.

• Kolonku vložit do 1,5 ml zkumavky. Nanést 50 μl RNase free water na střed membrány a centrifugovat 1 min. při minimálně 8000g.

• Při očekávaném výtěžku vyšším než 30 μg možno eluci zopakovat.

• Část eluátu nanést na agarové ELFO, část změřit na spektrofotometru.

• RNA uskladnit při -80 °C.