Kampylobaktery Kampylobaktery v potravním v potravním

řetězciřetězci

Iva SteinhauserováIva SteinhauserováGabriela BořilováGabriela Bořilová

Veterinární a farmaceutická univerzitaÚstav hygieny a technologie masa

Palackého 1-3Brno, 612 42

KAMPYLOBAKTERIÓZAKAMPYLOBAKTERIÓZA

epidemiologicky epidemiologicky významné alimentární onemocněnívýznamné alimentární onemocnění – – zoonózazoonóza

původce: původce: termofilní druhy rodu termofilní druhy rodu CampylobacterCampylobacter – C. jejuni, – C. jejuni, C. coliC. coli

kampylobakteriózy x salmonelózykampylobakteriózy x salmonelózy

rozvinuté země x rozvojové zeměrozvinuté země x rozvojové země Vzhled C. jejuni pod elektronovým mikroskopem

KAMPYLOBAKTERIÓZY VE SVĚTĚKAMPYLOBAKTERIÓZY VE SVĚTĚ

Nemocnost na 100 000 obyvatel

2000 2001 2002 2003 2004 2005 2005Belgie 6 682 7 357 7 354 6 556 6 716 6 879 65,8Dánsko 4 386 4 620 4 385 3 537 3 724 3 677 68,0Estonsko - 113 114 98 124 124 9,2Finsko 3 327 3 969 3 738 3 190 3 583 4 002 76,4Francie 378 203 1 353 1 997 2 127 2 049 3,3Irsko 1 613 1 286 1 336 1 568 1 711 1 803 43,7Německo 30 876 54 410 56 350 47 876 55 745 62 114 75,3Nizozemí 3 474 3 682 3 421 2 805 3 273 3 761 46,2Polsko - - - - 24 47 0,1Rakousko 3 458 3 919 4 446 3 926 5 365 5 065 61,7Slovensko - 1 353 1 267 1 195 1 691 2 204 40,9Španělsko 6 113 6 149 5 051 6 048 5 958 5 513 12,8Švédsko 7 646 7 845 7 137 7 149 6 167 6 811 66,2Velká Británie 63 371 62 052 54 372 52 126 50 388 52 686 88,5EU celkem 131 527 157 631 150 332 139 581 183 480 197 363 51,6Norsko 2 326 2 889 2 192 2 270 2 275 2 631 57,1

Počet hlášených případů za rokZemě

NÁRŮST KAMPYLOBAKTERIÓZNÁRŮST KAMPYLOBAKTERIÓZ

zlepšení diagnostických metodzlepšení diagnostických metod

zkvalitnění zdravotnické dokumentace / administrativyzkvalitnění zdravotnické dokumentace / administrativy

nárůst konzumace drůbeže/drůbežích výrobkůnárůst konzumace drůbeže/drůbežích výrobků

Produkce Produkce = vysoká efektivita výkrmu, vysoce prošlechtěná = vysoká efektivita výkrmu, vysoce prošlechtěná masá masá plemena plemena

EkonomikaEkonomika = relativně nízká cena = relativně nízká cena

SpolečnostSpolečnost = přijatelné pro většinu skupin obyvatel, = přijatelné pro většinu skupin obyvatel, semivegetariáni, semivegetariáni, náboženské důvody náboženské důvody

VýživaVýživa = nízký obsah tuku, snadná stravitelnost, rychlá a = nízký obsah tuku, snadná stravitelnost, rychlá a snadná kulinární úprava, vysoká míra inovace snadná kulinární úprava, vysoká míra inovace nabízeného nabízeného sortimentu (např. drůbež s prodlouženou sortimentu (např. drůbež s prodlouženou dobou výkrmu, dobou výkrmu, baby výrobky, apod.)baby výrobky, apod.)

ZDROJEZDROJE NÁKAZYNÁKAZY

kontaminované suroviny / potraviny kontaminované suroviny / potraviny = syrové maso, syrové mléko, syrová zelenina= syrové maso, syrové mléko, syrová zelenina= nedostatečně tepelně upravené maso = nedostatečně tepelně upravené maso

(chybná kulinární úprava), mražené výrobky(chybná kulinární úprava), mražené výrobky

kontaminovaná vodakontaminovaná voda= použití kontaminovaných povrchových nebo odpadních = použití kontaminovaných povrchových nebo odpadních

vodvod

kontakt se zvířatykontakt se zvířaty= zemědělská prvovýroba, domácí mazlíčci (pets)= zemědělská prvovýroba, domácí mazlíčci (pets)

VÝSKYTVÝSKYT CAMPYLOBACTERCAMPYLOBACTER SPP. SPP.

caecum a colon hospodářských a volně žijících zvířat caecum a colon hospodářských a volně žijících zvířat (většinou bez klinických příznaků)(většinou bez klinických příznaků)

drůbež drůbež = vysoký výskyt = 0 – 92 % farem (0 – 100 % jedinců v hejnu)= vysoký výskyt = 0 – 92 % farem (0 – 100 % jedinců v hejnu)

= = C. jejuniC. jejuni, , C. coliC. coli, , C. fetusC. fetus subsp. subsp. fetusfetus, , C. lariC. lari

= různá prevalence u různých druhů drůbeže (brojleři, křepelky, = různá prevalence u různých druhů drůbeže (brojleři, křepelky, krůty)krůty)

= různá prevalence u stejných druhů drůbeže v různých zemích= různá prevalence u stejných druhů drůbeže v různých zemích

== vliv chovné technologie, věk zvířat, zoohygiena farem, logistika vliv chovné technologie, věk zvířat, zoohygiena farem, logistika porážekporážek

divocí ptácidivocí ptáci = bažanti, vrabci, holubi, vrány,aj. = bažanti, vrabci, holubi, vrány,aj.

prasataprasata = 30 – 70 % (= 30 – 70 % (C. coliC. coli))

hlodavci, hmyzhlodavci, hmyz

pets (častý a těsný kontakt s lidmi (dětmi)pets (častý a těsný kontakt s lidmi (dětmi)

skotskot = 10 – 30 %= 10 – 30 %

ovceovce = 10 – 30 %= 10 – 30 %

VÝSKYTVÝSKYT CAMPYLOBACTERCAMPYLOBACTER SPP.SPP.

KULTIVACE KULTIVACE CAMPYLOBACTERCAMPYLOBACTER SPP. SPP.

ČSN EN ISO 102 72ČSN EN ISO 102 72 (2006)(2006) Horizontální metoda Horizontální metoda průkazu a stanovení počtu průkazu a stanovení počtu CampylobacterCampylobacter spp. spp.

PomnoženíPomnožení = bujon dle = bujon dle Boltona Boltona = při 37= při 37°°C po dobu 4hC po dobu 4h= dále při 41,5= dále při 41,5°°C po dobu 44h C po dobu 44h ±±4h4h= mikroaerobně = mikroaerobně ((GeneratingKit GeneratingKit

CAMPCAMPsystem) system)

IzolaceIzolace = = mCCDAmCCDA agar + druhá izolační půda agar + druhá izolační půda ((Karmali Karmali agar)agar)

= při = při 41,541,5°°C po dobu 44h C po dobu 44h ±±4h4h= mikroaerobně = mikroaerobně = charakteristické kolonie= charakteristické kolonie

Vzhled Campylobacter spp. na Karmali

IDENTIFIKACE PCR / RFLPIDENTIFIKACE PCR / RFLP

typizace termofilních typizace termofilních CampylobacterCampylobacter – – C. coliC. coli, , C. jejuniC. jejuni, , C. lariC. lari a a C. upsaliensisC. upsaliensis

= 491 bp: gen = 491 bp: gen 23S rRNA23S rRNA = specifický = specifický pro termofilní pro termofilní Campylobacter spp.Campylobacter spp.

štěpení produktu restrikční štěpení produktu restrikční endonukleázou endonukleázou AluAluI: identifikace I: identifikace C. jejuniC. jejuni a a C. coliC. coli

štěpení produktuštěpení produktu RE Tsp RE Tsp509I = 509I = identifikace identifikace C. lari a C. upsaliensisC. lari a C. upsaliensis))

PCR IDENTIFIKACE PCR IDENTIFIKACE C. JEJUNI /C. COLIC. JEJUNI /C. COLI

identifikace pomocí identifikace pomocí multiplex PCRmultiplex PCR

16S rRNA16S rRNA gen gen – 857 bp – 857 bp = = Campylobacter Campylobacter spp.spp.

mapA mapA gen – 589 bp gen – 589 bp = = Campylobacter Campylobacter jejunijejuni

ceuEceuE gengen – 462 bp – 462 bp = = Campylobacter coliCampylobacter coli

462 bp

1 2 M 3 4

(M = marker, 1 = C. jejuni ATCC 33560 , 2= C. coli ATCC 43478 , 3 = mix, 4 = C. coli wild typ, 5 = C. jejuni wild typ)

M 1 2 3 4 5

jejuni coli mix coli jejuni

857 bp

589 bp

Identifikace C. jejuni / C.coli pomocí mPCR

REZISTENCE K ATBREZISTENCE K ATB

ATB :ATB : NAL = kyselina nalidixová,NAL = kyselina nalidixová, CIP = CIP = ciprofloxacinciprofloxacin, TET = , TET = tetracytetracyklin, ERY= klin, ERY= erythromycinerythromycin, CMP = , CMP = chloramphenicolchloramphenicol, , AMP = AMP = ampiciampicilin, GEN = lin, GEN = gentamicingentamicin + ENR = enrofloxacin, KAN = kanamycin, STR = streptomycin + ENR = enrofloxacin, KAN = kanamycin, STR = streptomycin

inoculum:inoculum: 4848 h kultura, ředěna v BHI do h kultura, ředěna v BHI do 0.5 0.5 MMccFF kultivace:kultivace: Mueller - Hinton agar Mueller - Hinton agar inkubace:inkubace: 42ºC42ºC po dobu po dobu 4488±±2h, mikroaerobně (2h, mikroaerobně (GeneratingKit GeneratingKit CAMPCAMPsystem) system)

vyhodnocení:vyhodnocení:CLSI M100 - S16 (2006) – Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing, Sixteenth Informational CLSI M100 - S16 (2006) – Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing, Sixteenth Informational SupplementSupplement

COMITE DE L’ANTIBIOGRAMME DE LA SOCIETE FRANCAISE DE MICROBIOLOGIE - Recommandations 2007COMITE DE L’ANTIBIOGRAMME DE LA SOCIETE FRANCAISE DE MICROBIOLOGIE - Recommandations 2007

Agarová diluční metoda Agarová diluční metoda (CLSI M7 – A7)(CLSI M7 – A7)

MECHANISMUS REZISTENCEMECHANISMUS REZISTENCE

REZISTENCE K MAKROLIDŮM PCR-RFLP + MAMA PCR

detekce dvou bodových mutací (A2074C + A2075G) v genu

23S rRNA ERY

REZISTENCE K CHINOLONŮMMAMA PCR

detekce mutací v genu gyrA mutace na pozici Thr-86-Ile NAL, CIP, ENR

REZISTENCE K TETRACYKLINŮMMULTIPLEX – PCR

detekce tet genů tet(O), tet(M) + tet(A), tet(B)

tet(E) TET

sledování pomocí molekulárně-biologických metod – PCR, mPCR, sledování pomocí molekulárně-biologických metod – PCR, mPCR, PCR/RFLP, MAMA PCRPCR/RFLP, MAMA PCR

320 bp

M 1 2 3 4

RFLP detekce mutace A2059G – štěpení RE BsaI

M = marker 1, 2 , 3 , 4 = resistant strains C. coli

VÝSKYT VÝSKYT CAMPYLOBACTERCAMPYLOBACTER SPP. NA SPP. NA FARMÁCH BROJLERŮ V ČRFARMÁCH BROJLERŮ V ČR

2005 + 20062005 + 2006 Campylobacter  Campylobacter  spp.spp. Campylobacter  Campylobacter  jejunijejuni Campylobacter  coliCampylobacter  coli

Farmy Farmy s intenzivní s intenzivní

produkcíprodukcí

  vyšetřené farmyvyšetřené farmynn

5050 5050 5050

CampylobacterCampylobacter spp. pozitivní spp. pozitivní

farmyfarmynn

4545 4343 1717

prevalenceprevalence 90 %90 % 86 %86 % 34 %34 %

Farmy Farmy ekologickéekologické

vyšetřené farmyvyšetřené farmynn

11 11 11

Campylobacter Campylobacter spp. pozitivní spp. pozitivní

farmyfarmynn

11 11 11

prevalenceprevalence 100 %100 % 100 %100 % 100 %100 %

VÝSKYT A TYPIZACE VÝSKYT A TYPIZACE CAMPYLOBACTER CAMPYLOBACTER SPP. SPP. IZOLOVANÝCH Z BROJLERŮIZOLOVANÝCH Z BROJLERŮ

PočetPočettest.test.

faremfaremPočetPočetvzorkůvzorků

VzorkyVzorkyCampylobacterCampylobacter

spp.spp.pozitivnípozitivní

C. jejuniC. jejuni C. coliC. coliMix samplesMix samples

((C. jejuni C. jejuni + C. coli)+ C. coli)

nn %% nn %% nn %% nn %%

20052005 2121 594594 448448 75.4275.42 400400 89.2989.29 4444 9.829.82 44 0,890,89

20062006 3030 541541 447447 82.6282.62 316316 70.7070.70 5151 11.4011.40 8080 17.8917.89

celkemcelkem 5151 11351135 895895 78.8578.85 716716 80.0080.00 9595 10.6110.61 8484 9.399.39

VÝSKYT CAMPYLOBACTER SPP. U DRŮBEŽE VE VYBRANÝCH ZEMÍCH

Výskyt Výskyt CampylobacterCampylobacter spp. (%) spp. (%)

20052005 2004 2004 2003 2003 2002 2002 2001 2001

RakouskoRakousko 61.461.4 64.564.5 58.758.7 57.657.6 **

DánskoDánsko 29.929.9 19.419.4 32.432.4 38.838.8 **

Finsko 7.4 6.2 6.5 * 4.0

NěmeckoNěmecko 50.450.4 39.239.2 ** 63.963.9 **

ItálieItálie 86.386.3 9191 71.471.4 8787 **

Norsko 3.4 3.1 4.9 6.3 7.7

Švédsko 13.313.3 14.214.2 17.617.6 19.819.8 16.216.2

FrancieFrancie 85.285.2 83.183.1 ** ** **

VÝSKYT CAMPYLOBACTER SPP. NA FARMÁCH S RŮZNOU TECHNOLOGIÍ

CHOVU BROJLERŮ V ITÁLII

Typ chovuVyšetřené

farmy

Camp.pozitivní

farmy

Odebrané vzorky

Camp. pozitivní vzorky

C. jejuni C. coli

N N % N N % %

Intenzivní chovy 26 25 96.1 128 123 23.58 56.91

Extenzivní chovy 11 10 90.9 56 51 66.67 29.41

Ekologické chovy 7 7 100 35 35 48.57 48.57

FLAFLA – RFLP SUBTYPIZACE – RFLP SUBTYPIZACE C. JEJUNIC. JEJUNI

amplifikace amplifikace variabvariabilní částilní část genu progenu pro flagellinAflagellinA

profily fragmentů po štěpení třemi RE:profily fragmentů po štěpení třemi RE: AfaAfaI – I – 6 typů,6 typů, MboMboI – I – 7 typů 7 typů HaeHaeIII – III – 55 typ typůů

kombinací typů štěpení dosud nalezenokombinací typů štěpení dosud nalezeno 31 subtyp31 subtypů ů C. jejuniC. jejuni

PFGE SUBTYPIZACE PFGE SUBTYPIZACE C. JEJUNIC. JEJUNI

pulsní gelová elektroforéza celého pulsní gelová elektroforéza celého chromozomu štěpeného REchromozomu štěpeného RE SmaSmaII

fragmentfragmentyy děleny naděleny na CHEF-DR III CHEF-DR III systsystémuému (BioRad) (BioRad),, 1% agar 1% agaróza,óza, 200 200 V, V, úhelúhel 120 120oo,, 9 9ooCC;; 5 -10 s 5 -10 s,, 4 h 4 h;; 10 - 10 - 40 s40 s, , 14 h14 h; ; 50 - 60 s50 - 60 s,, 4 h 4 h..

dosud bylo nalezeno dosud bylo nalezeno 32 PFGE32 PFGE subtypůsubtypů

b+b1, e+1+ e2 – příbuzné kmeny, * - C. coli

VÝSLEDKY SUBTYPIZACEVÝSLEDKY SUBTYPIZACE

chovy chovy nejsou infikovány různými bakteriálními klonynejsou infikovány různými bakteriálními klony, , kombinace výsledků obou analýz naznačují, že jednotlivá kombinace výsledků obou analýz naznačují, že jednotlivá hejna byla kontaminována převážně identickými klony hejna byla kontaminována převážně identickými klony u kterých během kolonizace došlo k mutacím u kterých během kolonizace došlo k mutacím

vvariabilitu subtypůariabilitu subtypů lze vysvětlit především mutacemi lze vysvětlit především mutacemi v genu v genu flaAflaA (detekované PCR/RFLP) polymorfismy (detekované PCR/RFLP) polymorfismy v oblastech štěpených v oblastech štěpených SmaSmaI (detekované PFGE) jsou I (detekované PFGE) jsou méně časté. méně časté.

genotyp zjištěný PFGEgenotyp zjištěný PFGE se jeví jako se jeví jako stabilnějšístabilnější, mutace , mutace v genu v genu flaAflaA jsou častější a vytvářejí tak větší jsou častější a vytvářejí tak větší variabilitu PCR subtypůvariabilitu PCR subtypů

REZISTENCE - DRŮBEŽREZISTENCE - DRŮBEŽ

20062006 AMPAMP TETTET NALNAL CMPCMP ERYERY CIPCIP GENGEN

C.coliC.coli % R% R(n = 24)(n = 24) 5454 44 8888 00 3333 8888 0 0

C. jejuniC. jejuni % R% R(n = 104)(n = 104) 4646 2020 5353 00 2222 5252 0 0

Tab. : Monitoring rezistence/senzitivity k vybraným ATB u kmenů C. coli and C. jejuni izolovaných z brojlerů (2006)

0102030405060708090

Perc

enta

ge o

f res

ista

nt

stra

ins

AMP TET NAL CMP ERY CIP GEN

Antibiotic preparates

C.coli C. jejuni

BAŽANT OBECNÝ BAŽANT OBECNÝ ((Phasianus colchicusPhasianus colchicus subsp. subsp. torquatustorquatus))

PůvodPůvod CelkemCelkem C. coliC. coli C. jejuniC. jejuni C. coliC. coli + + C. jejuniC. jejuni

n / Nn / N %% n / Nn / N %% n / Nn / N %% n / Nn / N %%

FarmyFarmy 212/302212/302 70.2070.20 107/302107/302 35.4335.43 87/30287/302 28.8128.81 18/30218/302 5.965.96

VolněVolněžijícížijící

55/20055/200 27.5027.50 20/20020/200 10.0010.00 32/20032/200 16.0016.00 3/2003/200 1.501.50

Výskyt rezistentních kmenů Campylobacterspp. u bažantů z farmového chovu

0

10

20

30

40

50

60

70

80

AMP TET NAL CMP ERY CIP GEN

Zvolené antibiotické preparáty

Zách

yt re

zist

entn

ích

kmen

ů [%

] C. coli

C. jejuni

Tab. : Monitoring výskytu termofilních Campylobacter spp. u bažanta obecného (2006)

Výskyt rezistentních kmenů Campylobacter spp. u volně žijících bažantů

0

10

20

30

40

50

60

70

80

AMP TET NAL CMP ERY CIP GENZvolené antibiotické preparáty

Zách

yt re

zist

entn

ích

kmen

ů

[%]

C. coli

C. jejuni

KŘEPELKA JAPONSKÁKŘEPELKA JAPONSKÁ((Coturnix coturnix japonicaCoturnix coturnix japonica))

vyšetřeno 50 ks zdravých zvířat z intenzivního chovu (2006)vyšetřeno 50 ks zdravých zvířat z intenzivního chovu (2006) pozitivní nálezy – pozitivní nálezy – 86 %86 % (obsah caeca) (obsah caeca) 70 % (36 %) -70 % (36 %) - C. jejuniC. jejuni 34 % -34 % - C. jejuni + C. coliC. jejuni + C. coli potencionální nebezpečí pro konzumenta (specifická skupina) – ostatní potencionální nebezpečí pro konzumenta (specifická skupina) – ostatní

druhy chovaných ptáků (pernatá zvěř)druhy chovaných ptáků (pernatá zvěř)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Perc

enta

ge o

f res

ista

nt s

train

s

NAL CIP ERY TET AMP GEN CMP

Antibiotics

Antibiotic resistance of Campylobacter spp. isolated from healthy fowls

wild pheasants farmed pheasants farmed quails

PRASE DOMÁCÍPRASE DOMÁCÍ((Sus scrofa f. domesticaSus scrofa f. domestica))

vzorky odebírány z vnitřní vzorky odebírány z vnitřní části recta před vykolenímčásti recta před vykolením

nízké nálezy na mase u nízké nálezy na mase u prasatprasat

35 % vyšetřených kmenů 35 % vyšetřených kmenů C. coli - C. coli - multirezistentnímultirezistentní

Rok 2006Rok 2006 Počet Počet vyšetřenýchvyšetřených chovů*chovů* Campylobacter Campylobacter spp.spp. C. jejuniC. jejuni C. coliC. coli směsný výskytsměsný výskyt

((C. jejuni + C.coli)C. jejuni + C.coli)

nn 1212

( n = 140)( n = 140)

117117 1212 9999 66

CELKEMCELKEM 83.57 %83.57 % 10.26 %10.26 % 84.62 %84.62 % 5.12 %5.12 %

Tab. : Monitoring výskytu termofilních Campylobacter spp. u jatečních prasat (2006)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Proc

ento

rezi

sten

tníc

h km

enů

AMP TET NAL CMP ERY CIP GEN

Antibiotika

Monitoring ATB rezistence u izolovaných kmenů C. coli

HUMÁNNÍ KMENY HUMÁNNÍ KMENY CAMPYLOBACTERCAMPYLOBACTER SPP. SPP.

AMPAMP TETTET NALNAL CMPCMP ERYERY CIPCIP GENGEN

C. coliC. coli % R% R(n = 6)(n = 6) 3333 00 6767 1717 1717 6767 00

C. jejuniC. jejuni % R% R(n = 86)(n = 86) 3737 1212 4242 00 66 3636 00

Monitoring rezistence/senzitivity k vybraným ATB u kmenů C. coli and C. jejuni izolovaných z humánních pacientů

získány jako klinické izoláty (n = 213)

typizace mPCR, PCR/RFLP x biochemické testy

C. jejuni – 80 % C. coli - 10 % C. jejuni + C. coli – 10 %

subtypizace C. jejuni – vysoká variabilita genotypů

DĚKUJI VÁM ZA

POZORNOST