Konfokální mikroskopie

Pavel Svítil, Jan Kuchař

Klasická mikroskopie

Předpokládá nekonečně malou tloušťku preparátuPři zkoumání silných vzorků je kvalita zobrazení nepříznivě ovlivňována překrýváním obrazu roviny, do níž je mikroskop právě zaostřen, s neostrými obrazy rovin ležících nad ní a pod ní. Lze zkoumat jen vzorky o tloušťce menší, než je hloubka ostrosti objektivu, která závisí na jeho numerické apertuře (Zmin = 0,25 nλ/NA2).

Klasická mikroskopie

Obrazem bodu není bod, ale tzv. Airyho kroužkydifrakční obrazec vznikající ohybem zobrazujícího se světla na čočkách objektivu. Při zobrazení blízkých bodů se mohou jejich Airyho kroužky překrývat, až se stanou téměř nerozlišitelnými.

Zobrazení klasickou mikroskopií

Apertura 0,03

Apertura 0,2

Vznik konfokální mikroskopie

Marvin Minsky 1957 – patentoval nápad na konfokální mikroskopii, ale nenašel vhodný zdroj světalM. Petráň a M. Hadravský 1967 – Tandem Scanning Confocal Microscope Koncem 70. Let – první spolehlivý konfokální mikroskop s rozmítaným laserovým paprskem.

Laserový rastrovací konfokální mikroskop

Osvětlení: bodový zdroj světla (laserový paprsek fokusovaný na clonu)Clona: je objektivem mikroskopu zobrazena na vzorek, do bodu o průměru rovnajícím se rozlišovací schopnosti objektivu (difrakční mez). Objektiv: sbírá světlo vzorkem odražené nebo rozptýlené. Zpětný průchod objektivem: obraz bodové clonky => fotonásobič Druhá konfokální bodová clonka, blokující

Princip

čárkovaně: paprsky jdoucí z mimoohniskových rovin, zachycené clonou.

Rastrování

rozmítáním laserového paprsku příčným posouváním vzorku před objektivemposouváním objektivu nad vzorkem Počítačové zpracování:

Popis celého systému

Výhody konfokální mikroskopie

Potlačení mlhavého pozadí obrazuOptická tomografie Není limitována Rayleighovým kriteriem: (Obraz vzniká skládáním z jednotlivých bodů, které jsou navíc pozorovány přes clonku, jejíž rozměry bývají menší než průměr Airyho kroužků.)

Nevýhody konfokální mikroskopie

Zatíženost statistickým šumem, jehož velikost je úměrná √N/N, kde N je počet detegovaných fotonů. Nelze snadno řešit zvýšením intenzity záření

(Interakce s /fluorescenčním/ preparátem)

Počítačové zpracování

Rastrovací algoritmizaceProstorová rekonstrukceTvorba stereoskopických párůFluorescence v reálných barvách pomocí tří fotonásobičů (RGB)

Využití konfokální mikroskopie – technické

studium povrchových vlastností materiálůmikrotesty tvrdosti kovů i plastických materiálů měření se výšky strukturních elementů na polovodičových čipech v reflexním modu zobrazování se zkoumá textura a složení povrchů i eroze materiálů. zkoumání vlastností nových polymerů testování jídla, které obsahuje velké množství vody, nebo oleje.

Využití konfokální mikroskopie – Lékařské a biologické

studium složité architektury neuronových sítí v mozkové tkáni (Golgiho metoda kontrastování neuronů částečkami stříbra) studium intracelulární koncentrace fyziologicky významných iontů (např. K+, Ca2+) měření membránového potenciálu, studium struktury typu zubní skloviny měření vnitrobuněčného pH. Imunofluorescenčními metodami: rozložení receptorů v membránách, organizace cytoskeletu, mitotický aparát

Srovnání

A: nekonfokální mikroskop

B: konfokální mikroskop

Srovnání 2

Klasický fluorescenční vs. konfokální mikroskop

Ukázka

Literatura

Kočárek: Úvod do klinické cytogenetikyJaromír Plášek: Konfokální mikroskopie (in: Vesmír, 1995/9)www.wikipedia.czStránky výrobců (Leica)