Laboratorní diagnostika chlamydiových infekcí a její interpretace

Naděžda Sojková a kol.Zdravotní ústav se sídlem v Praze

Oddělení virologie

Unikátní biologické vlastnosti :

nitrobuněční „energetičtí parazité“

bez schopnosti syntetizovat ATP

Struktura podobná G- bakteriím, ale liší se:

nemají ve stěně k. muramovou

mají více lipidů

rigidní buněčná stěna LPS méně toxický a imunologicky méně účinný při indukci zánětu

Chlamydie

Růstový cyklus

I. Optimální růstové podmínky

infekční elementární tělísko (EB, 250-400 nm)

vstup do buněčného fagosomu

inhibice fagolysosomální funkce

EB se zvětší a transformují v metabolicky aktivní :

neinfekční retikulární tělísko (RB, 800-1000 nm)

binární dělení ( po 16-24 hod)

spotřeba ATP hostitelské b. a kondenzace opět v EB za 48-72 hod je cytoplasma naplněna EB a praská (popř.exocytóza)

výsev infekčních částic

II. Zhoršené růstové podmínky(Chybná strategie léčby, produkce prozánětlivých cytokinů- IFNgama)

Přerušení vývojového cyklu

vznik aberantních tělísek s alterovanou expresí genů

zejména cHSP- exprimován na úkor MOMP, OMP..

vznik chronických (perzistentních) infekcí

(deregulace imunity - fibroproduktivní zánět, reaktivita pacienta- genetika)

EB z chronicky infikovaných buněk se uvolňují exocytózou

Chlamydiacae – 2 rody: Chlamydia

Chlamydia trachomatis (1907) – 18 sérotypů Urogenitální trakt: lymfogr. venereum (L1-3),

negonokoková urethritis, epididymitis, cervicitis,

endometritis, salpingitis, periadnexitis (D-K) Oko: trachom , inkluzní konjunktivitis (A-C) Neonatální infekce: konjunktivitida, otitida, pneumonie

Projevy chronické infekce: chronický urogenitální zánět,

poruchy reprodukce, akutní perihepatitida, chronická

proktitida, chlamydiová a postchlamydiová reaktivní

artritida, Reiterův syndrom

Klasifikace a klinické projevy

Chlamydophila (od r. 1999)

Chlamydophila pneumoniae (1965): 50-80% promořenost dospělé populace Akutní infekce: nejčastěji HCD pneumonie, bronchitida, sinusitida ale také konjunktivitida běžné jsou reinfekce (uplatňuje se spíše sekreční imunita) Komplikace akutní infekce: infekční nebo reaktivní artritida meningoencefalitida endokarditis, myokarditis, perikarditis syndrom Guillain-Barré

Perzistentní infekce:

vztah k etiologii astma bronchiale, CHOPN,

arterioskleróze, aortálním aneurysmatům

Projevy chronické infekce:

exacerbace astma bronchiale, chron. obstr.

bronchitida, reaktivní artritida

Studován vztah k: arterioskleróze

bronchopulmonálnímu karcinomu

onemocněním CNS včetně indukce RS

Chlamydophila psittaci:

Antropozoonóza - „ornitóza“ (obecně)

- „psitakóza“ (papouščí nemoc)

nositelem infekce jsou ptáci (holubi, papoušci)

ale také savci ( koně, ovce, skot , kočky)

u člověka se nákaza vyskytuje sporadicky

atypická pneumonie, myokarditida, hepatitida,

hepatosplenomegalie

Základní zásady terapie chlamydiových nákaz:

Chlamydie – nejvyšší citlivost k makrolidům a tetracyklinům.Podmínky: co nejnižší MIC vysoký průnik do tkání (prostřednictvím makrofágů do místa zánětu) dosažení účinných hladin v endosomu dlouhodobé působení (2-3 týdny)Vše optimálně splňuje Doxycyclin a Azithromycin (Sumamed, Zetamac)Kombinace s metronidazolovými preparáty-EntizolPodpůrná enzymoterapie

Major outer membrane protein, MOMP:

druhově specifický antigen na povrchu EB

Lipopolysacharid, LPS:

rodově specifický , tj společný všem druhům Ch. působí prozánětlivě jako polyklonální aktivátor makrofágů a lymfocytů

Chlamydiový heat-shock protein, c-HSP:

fylogeneticky konzervovaný prozánětlivý protein indukce protrahované DTH schopnost navození autoimunitních procesů

Důležité chlamydiové antigeny

Jak? Antigen? Materiál?

1. Přímá hybridizace DNA výtěry, BAL, punktát

PCR moč, likvor, biopsie, etc.

DIF MOMP, LPS

2. Nepřímá KFR ELISA LPS (genus), MOMP,HSP krev

MIF MOMP (EB-species)

immunoblot MOMP,OMP2,TARP

CPAF, HSP60, YwbM

Laboratorní diagnostika

1. genus–specifický test : Anti-Chlamydia IgG, IgM and IgA - LPS antigen – LPS-

ELISA2. MIF SeroFia - species–specifický test : Anti-Chlamydophila pneumoniae (CP) a psittaci CPs ,

Chlamydia trachomatis (CT) IgG, IgM a IgA protilátky proti MOMP EB - MIF metoda.

3. recomLine Chlamydia IgG, IgA a IgM test.

Diagnostické metody, testy:

Přínos metody recomLine

vysoká specificita pro všechny 3 druhy chlamydií

species specifické antigeny CPAF-faktor virulence, TARP-vazba actinu

a YwbM pro CP

HSP60 indikátor chronických infekcí

vyšší senzitivita IgA protilátek, zejména u CP a CPs

jediná vysoce specifická metodika pro sérologii CPs

vedle IgG a IgA další třída protilátek IgM

možnost automatizace

současné použití jak pro screening , tak pro konfirmaci výsledků

jednokroková diagnostika všech 3 druhů chlamydií

rekombinantní antigeny vylučují zkříženou reaktivitu

New recomLine Chlamydia- examples of positive sera-

IgG

IgM

IgA

MO

MP

OM

P2

TA

RP

CP

AF

HS

P60

MO

MP

OM

P2

TA

RP

CP

AF

YW

BM

MO

MP

OM

P2

TA

RP

CP

AF

C. trachomatis C. pneumoniae C. psittaci

IgG

IgM

IgA

IgG

IgM

IgA

A

B

C

C. pneumoniae infection:IgG, IgA and IgM positive

C. psittaci infection confirmed by the MOMP reactivity in IgA and IgM; additional past infections with C. trachomatis and C. pneumoniae

C. trachomatis infection:IgG, IgA and IgM positive;

New recomLine ChlamydiaChlamydia trachomatis positive sera

IgG

IgM

IgA

MO

MP

OM

P2

TA

RP

CP

AF

HS

P60

MO

MP

OM

P2

TA

RP

CP

AF

YW

BM

MO

MP

OM

P2

TA

RP

CP

AF

C. trachomatis C. pneumoniae C. psittaci

IgG

IgM

IgA

IgG

IgM

IgA

A

B

C

typical past C. trachomatis infection with slight cross-reactivity to C. pneumoniae and C. psittaci

double infection with C. trachomatis and C. pneumoniae verified by TARP (C. trachomatis) and CPAF and YWBM (C. pneumoniae); IgA positive

C. trachomatis infection; might be a recent infection due to positive IgM

New recomLine ChlamydiaChlamydia pneumoniae positive sera

IgG

IgM

IgA

MO

MP

OM

P2

TA

RP

CP

AF

HS

P60

MO

MP

OM

P2

TA

RP

CP

AF

YW

BM

MO

MP

OM

P2

TA

RP

CP

AF

C. trachomatis C. pneumoniae C. psittaci

IgG

IgM

IgA

IgG

IgM

IgA

A

B

C

typical C. pneumoniae infection; IgA positive

typical C. pneumoniae infection; might be a recent infection due to positive IgM

double infection with C. pneumoniae and C. trachomatis verified by YwbM (C. pneumoniae) and TARP and CPAF (C. trachomatis)

New recomLine ChlamydiaChlamydia psittaci positive sera

IgG

IgM

IgA

MO

MP

OM

P2

TA

RP

CP

AF

HS

P60

MO

MP

OM

P2

TA

RP

CP

AF

YW

BM

MO

MP

OM

P2

TA

RP

CP

AF

C. trachomatis C. pneumoniae C. psittaci

IgG

IgM

IgA

IgG

IgM

IgA

A

B

C

C. psittaci infection confirmed by the MOMP reactivity in IgA; additional past infections with C. trachomatis and/or C. pneumoniae

acute infection with C. psittaci proven by MOMP IgM; past infection with C. pneumoniae that (TARP, CPAF and YwbM)

no C. psittaci infection (as has been determined by MIF); past infections with C. trachomatis and C. pneumoniae

1.Přítomnost protilátek anti LPS – rozdělení do infekčních stadií:

Pouze IgM popř. IgA – v.s. akutní infekce-primoinfekce/reinfekce

pouze IgG (+/++) – anamnestická odpověď

IgG (+++) a IgA (+/++) – recentní , v.s. aktivní infekce

2. Potvrzení/vyloučení aktivní infekce – stanovení anti MOMP:

Species-specifický test-MIF: titr IgG 1:512 a vyšší-známka aktivní infekce

Titr IgA 1:64 – potvrzení aktivní infekce

Sporné nálezy – konfirmace immunoblotem

3. IgG anti-cHSP60 protilátky: v.s. chronická infekce, potvrzení opakovaným

vyšetřením, popř. immunoblotem

Interpretace sérologických nálezů

Výsledky

MS CG MS CGn = 349 n = 103 n = 348 n = 348

Chronic persistent or

active infection

(exacerbation) (%)

106 (30,4 %) 34 (33,0%) 42 (12,1 %) 1 (1,2 %)

Statistical evaluation

Anamnestic response (%) 44 (53,0 %)Statistical evaluation

Infection stage

p = 0,80; ODR = 0,94p = 0,87; ODR = 0,96

p=0,003; ODR=11,25

179 (51,4 %)

MIF serologyELISA serology

22 (21,3%)72 (20,6 %)

p=0,61; ODR=0,89

Porovnání infekčních stádií u pacientů s MS a v CG – Elisa, MIF

MIF MS 12,1%

MIF CG 1,2%

ELISA MS 30,4%

ELISACG 33,0%

0

5

10

15

20

25

30

35

Comparison of chronic persistent or active infection in patients diagnosed with multiple sclerosis (MS) and in the control group

(CG)

%

p = 0,61; ODR = 0,89p = 0,003; ODR = 11,25

Závěr

1. Pro rychlou a přesnou diagnostiku akutních infekcí má větší význam přímý

průkaz patogena ve vhodně voleném materiálu.

2. Pro screeningové vyšetření je vhodná sérologie založená na protilátkové

odpovědi anti-LPS.

3. Průkaz protilátek proti MOMP je významně důležitějším markerem

v diagnostice chronických aktivních chlamydiových infekcí než protilátky

proti LPS.

4. IgG anti cHSP60 jsou významným markerem pro potvrzení a sledování

perzistentní infekce.

5. Dokladem neustálého zpřesňování diagnostiky je nový test recomLine s

rekombinantními antigeny TARP, CPAF a YWBM.

6. Výsledky naší spolupráce s klinickými pracovišti potvrzují, že stavům

chronické a perzistentní infekce lze předcházet systematickým

vyšetřováním, které společně s klinickým stavem pacienta pomáhá lékaři

stanovit správnou diagnózu a léčbu akutních infekcí.