Laboratorní postupy testování toxicity průmyslových chemikálií – část I

Průmyslová toxikologie (C867)

Posouzení nebezpečnosti PrCHL pro lidské zdraví

CÍL

•odvodit hodnoty expozice látek, jež by pro člověka neměly být překročeny

CESTA

•získat informace o nepříznivých (toxických) účincích na zdraví způsobené expozicí látky nebo přípravku.

INFORMACE O

•toxikokinetice, metabolismu a distribuci•akutních účincích (akutní toxicita, dráždivost a žíravost) •senzibilizaci •toxicitě po opakovaných dávkách •účincích CMR (karcinogenita, mutagenita a toxicita pro reprodukci)•účincích na činnost hormonů

Strategie zkoušení - minimalizace počtu zvířat

Metody:

in silico – modelové systémy na počítačiin vitro – pokusy mimo živé tělo (vitrum = zkumavka) ex vivo – pokusy mimo živé těloin vivo – pokusy v živém organismu

Strategie zkoušení v praxi

• počítačové modely a databáze = predikce toxicity• alternativní metody in vitro = predikce dávky• nové metody in vivo = mechanismus působení v organismu, na omezeném počtu zvířat s použitím zobrazovací techniky

Strategie zkoušení - minimalizace počtu zvířatReplacement = nahrazení: • metody in vitro mimo živý organismus = ALTERNATIVY BEZ POUŽITÍ ZVÍŘAT

Reduction = redukce počtu:• in vivo = v živém organismu, na omezeném počtu pokusných zvířat

Refinement = zmírnění: • in vivo, ex vivo = živý organismus, upravené metody experimentování

Koncepci alternativ k pokusům na zvířatech položili Russel a Burch 1959 v knize „Principy humánní experimentální techniky“.

• Alternativy zahrnují všechny postupy, které mohou buď úplně, nahradit pokusy na zvířatech, nebo snižovat počet používaných zvířat, nebo alespoň zmenšovat jejich utrpení v pokusech, které podstupují zvířata proto, aby byly uspokojeny základní potřeby člověka, nebo jiných zvířat“. (Přesná definice Smyth, 1978 Fram, Bals 1983)

Toxikologické testování EXPOZICE - ČAS - CESTA

Podle času• Akutní jednorázová, krátkodobá• Subakutní opakovaná, 14; 28-denní• Subchronická opakovaná 90-denní• Chronická opakovaná 6; 12; 24 měsíců

Podle cesty vstupu do organismu –• Orální – do zažívacího traktu ve vodě; v krmení; sondou• Dermální – na kůži • Inhalační – do respiračního traktu

Způsob podání – přiblížit se možné expozici pro člověka !

Laboratorní zvířataKonvenční typ zvířat• otevřený chov za dodržení základních hygienických pravidel,• nedefinovaná mikroflóra.

SPF (Specific pathogen free)• bariérový chov – přísná hygienická pravidla, • Nesmí být přítomny specifické patogeny pro daná laboratorní zvířata

Axenická – Germ-free• chov ve sterilním prostředí v bezmikrobních izolátorech• bez mikroflóry v zažívacím traktu a na povrchu těla

Gnotobiotická zvířata• chov ve sterilním prostředí – bezmikróbní izolátory • + velmi dobře definovaná střevní mikroflóra• = očkování specifické mikroflóry axenickým zvířatům

Testování na zvířatech - Legislativa ČRZákon a. 246/1992 Sb., na ochranu zvířat proti týrání • přednostně používat alternativní metody.

Vyhláška o ochraně, chovu a využití pokusných zvířat• zajistit standardní podmínky pro experimentální zvířata

Nejčastěji používaná laboratorní zvířata• Myš laboratorní• Potkan laboratorní• Morče domácí• Křeček • Králík domácí• Pes domácí• Prase domácí• Ptáci• Ryby

Testy na zvířatech – podmínky ve viváriích

TEPLOTA• Zachování tepelné rovnováhy, v němž je organismus v klidovém stavu• Myš, Potkan, Morče – 22 + 2 °C, Králík, Pes 18 + 3 °C, Prase, Ovce 17 + 7 °C

VLHKOST VZDUCHU• V prostorách pro zvířata je nutná stálá relativní vlhkost cca 55 + 10 %.• Rozmezí 30 – 70% . Jiné po dobu delší než 48 hodin = nepřiměřený stres.

SVĚTLO: intenzita, kvalita, • Doporučen světelný režim 12 hodin světlo- 12 hodin tma• Intenzita osvětlení do 200 lx. Pouze při ošetřování 1000 – 1300 lx.• Citlivost u albinotických zvířat. Postupné stmívání vyžadují jen kuřata.• Denní světlo požadují: opice, pes, kočka. Nevhodné pro hlodavce.

Testy na zvířatech – podmínky ve viváriích AKLIMATIZACE• před experimentem minimálně 5 dnů po dodání z chovného zařízení

VODA• pitná voda (ad libitum), stálá kontrola kvality

POTRAVA• standardní peletovaná krmná směs určená pro daný druh zvířete

KONTROLA ZDRAVOTNÍHO STAVU• permanentní kontrola = bakteriologické a parazitologické vyšetření určitého vzorku experimentální zvířat

KONTROLA PROSTŘEDÍ • monitorování čistoty prostředí ve viváriu – mikrobiologické vyšetření stěrů z chovných nádob a jiného technologického zařízení

Akutní toxicita orální – OECD 420, 423, 425 DEFINICE• nepříznivé účinky látky, které se projeví po orálním podání jedné dávky nebo více dávek látky během 24h.

Strategie testování: 1. in silico 2. in vivo – v současné době není vhodná in vitro metoda

TESTOVACÍ METODA • pokusné zvíře – albinotický potkan (3 ks na dávku)• příprava zvířat - odebrání potravy – 24h před testem, vážení• limitní test – výchozí dávka 2000 mg/kg

a) negativní výsledek – test ukončenb) úhyn - úplná studie – následné dávky – 300, 50 a 5 mg/kg.

Akutní toxicita orální – OECD 420, 423, 425 KLINICKÁ VYŠETŘENÍ• příznaky toxicity – změny kůže, srsti, očí, sliznic, dýchání a krevníhooběhu, vegetativního a centrálního nervového systému, motorické aktivity a chování. Pozornost bude věnována také výskytu třesu, křečím, slinění, průjmu, letargii, spánku a kómatu.

MAKROSKOPICKÁ PITVA• u všech zvířat použitých ve studii (uhynulých i utracených). Utracení• bude provedeno vet. přípravkem T 61 inj. ad us vet. (15. den testu).

VÝSLEDEK TESTULD50 ekvivalentních dávek – kategorie• A 50 – 5 mg/kg – velmi toxický• B 300 – 50 mg/kg – toxický• C 300 – 2000 mg/kg – škodlivý• D 2000 – 5000 mg/kg - netoxický

Akutní toxicita inhalační – OECD 403• albinotický potkan - obojí pohlaví

• příprava test. látky – příslušná koncentrace v ovzduší

• inhalační box – průtok vzduchu, sledování koncentrace v dýchací zóně, měření teploty a vlhkosti

• limitní test – nejméně 4 hod expozice, c=20 mg/L plynu, par, aerosolu nebo 5 mg/L pevné látky

– toxické účinky nepozorovány - ukončení studie

– úhyn – celá studie, expoziční koncentrace – nejméně 3 hladiny (10 zvířat pro jednu dávku 5+5)

• pozorování – 14 dní , makroskopická pitva

• stanovení LC50 (letální koncentrace = 50% úhyn)

Akutní toxicita inhalační – OECD 403Systém pro inhalační expozici plynům a aerosolům

Akutní toxicita dermální – OECD 404• albinotický potkan - obojí pohlaví

• příprava zvířat – holení (24h. před začátkem testování), vážení

• aplikace rovnoměrně na plochu asi 10% celkového povrchu těla – látka navlhčena – zajištění dobrého kontaktu s kůží

S (mm2) = hmotnost (g) x 0,66 x délka těla (mm)

• doba expozice – 24h. – testovaná látka je fixována pomocí mulového obvazu a nedráždivé náplasti – zabránění orálnímu příjmu

• ukončení aplikace – zbytky odstraněny omytím vodou

• pozorování – 14 dní , makroskopická pitva

Testy kožní dráždivosti a leptavosti

DEFINICE

•stanovení dráždivých/leptavých účinků po jednorázovém nanesení testované látky na kůži.

Strategie testování:

1. In silico + pH testované látky

2. In vitro – modely lidské kůže EpiDerm, EPISKIN

3. In vivo – pokusné zvíře albinotický králík

Testy kožní dráždivosti a leptavostiIn-vitro – Modely lidské kůže EpiDerm a Episkin

Princip:

•trojrozměrný model lidské kůže - rekonstruované epidermis s funkční stratum corneum•účinek testované látky na životnost buněk •cytotoxicita je vyjádřena jako redukce aktivity mitochondriální dehydrogenázy

Provedení:

•testovaná látka je umístěny na stratum corneum epidermálního modelu ve 2 epozičních časech. Expozice je ukončena omytím fosfátovým pufrem. Poté jsou tkáně inkubovány s MTT (žlutá tetrazoliová sůl). Pokud jsou buňky živé, MTT je v mitochondriích redukován sukcinát dehydrogenázou na modrý formazanový precipitát. Ten je přes noc z buněk vyextrahován okyseleným izopropanolem a kvantifikován spektrofotometricky.

Použití:

•testy leptavých účinků na modelech lidské kůže jsou schopny rozlišit dráždivé a leptavé účinky.

Testy kožní dráždivosti a leptavostiEPISKIN

MTT Formazan

Testy kožní dráždivosti a leptavosti

Pozorovaná barevná změna při in-vitro testu na kožním modelu Episkin

Akutní toxicita dráždivé a leptavé účinky na kůži - OECD 404

• In vivo test nelze použít pro látky s pH menším než 2 a vyšší než 11,5

TESTOVACÍ METODA

• pokusné zvířa – albinotický králík plemene Novozélandský bílý bez rozlišení pohlaví

- dávka – 0,5 ml nebo 0,5 g (zaleží na skupenství)

- před aplikací oholení kůže ve hřbetní krajině, vážení zvířete

• aplikace testované látky (6cm²) - fixace pomocí mulového obvazu a nedráždivé náplasti (u pevných testovaných látek – smočení vodou – lepší kontakt s kůží)

Akutní toxicita dráždivé a leptavé účinky na kůži - OECD 404

Počáteční zkouška – 1 zvíře – expozice: 3 min., 1h., 4h.

Potvrzující zkouška - 2 zvířata - expozice: 4h.

•pozorování - stupeň podráždění kůže - příznaky erytému a edému za 1 hod, 24, 48, 72 hodin a dále pokud je nutné 1x denně po dobu 14 dnů

•jiné toxické účinky (pitva jen v závažných případech toxicity)

HODNOCENÍ VÝSLEDKU TESTU

•stupeň podráždění kůže, vratnost či nevratnost kožních lézí

Testy oční dráždivosti a leptavostiDEFINICE

•stanovení dráždivých a leptavých účinků na oči po jednorázové aplikaci testované látky do oka

Strategie testování:

1. In silico

2. In vitro – modely EpiOcular

3. Ex vivo – metoda BCOP – test na hovězí rohovce

4. In vivo – pokusné zvíře - albinotický králík

Testy oční dráždivosti a leptavostiIn-vitro – Modely lidské kůže EpiOcular

Princip testu:

•trojrozměrný model umělé tkáně EpiOcularTM z lidských keratinocytů kultivovaných do podoby vrstevnatého dlaždicovitého epitelu podobného lidské rohovce

•zjišťuje se účinek látky na životnost buněk, cytotoxicita je vyjádřena jako redukce aktivity mitochondriální dehydrogenázy

Provedení:

•testovaná látka je umístěna na povrch modelu ve 3 expozičních časech

•inkubace v 37°C, 5%CO2 inkubátoru v intervalech – 3 min., 30 min., a 60 min)

•do testu vloženy i tkáně inkubované s pozitivní (Triton X-100) a negativní kontrolou (destilovaná voda)

Testy oční dráždivosti a leptavosti

Ex-vivo – Metoda BCOP – Bovine Corneal Opacity and Permeability – OECD 437

•BCOP je alternativní metoda pro testování oční dráždivosti/žíravosti in-vitro. Účelem zavedení BCOP testovací metody je snaha o redukci množství použitých laboratorních zvířat (králíků) nahrazením jiným testovacím systémem, tj. použití tkání z poraženého hovězího dobytka (ex-vivo).

•Míra poškození rohovky způsobeného testovanou látkou je vyjádřena kvantitativně IVIS (in vitro irritancy score) pomocí něhož je přiřazena kategorie dráždivosti pro odhad in-vivo očního dráždivého potenciálu testované látky.

Testy oční dráždivosti a leptavosti

Ex-vivo – Metoda BCOP – Bovine Corneal Opacity and Permeability – OECD 437

•Rohovky bez defektů jsou odříznuty (2 až 3 mm prstenec bělimy). Izolované rohovky jsou umístěny do speciálně navržených držáků. Držáky jsou naplněny mediem (EMEM).

Testy oční dráždivosti a leptavostiEx-vivo – Metoda BCOP – Bovine Corneal Opacity and Permeability – OECD 437

Opacita:

•množství světla prošlého rohovkou (opacitometr), průměrná hodnota opacity

Permeabilita:

•množství fluoresceinu sodného, které proniklo všemi buněčnými vrstvami rohovky. Roztok fluoresceinu (4[l] nebo 5[s] mg/ml) je přidán do přední komory držáku (epithelialní strana rohovky). Koncentrace fluoresceinu, která pronikla do zadní komory (endoteliální strana rohovky) je měřena pomocí UV/VIS spektrofotometru při 490 nm

Testy oční dráždivosti a leptavostiEx-vivo – Metoda BCOP – Bovine Corneal Opacity and Permeability – OECD 437

průměrná hodnota permeability OD490 - IVIS (in vitro irritancy score)

IVIS = průměrná hodnota opacity + (15x průměrná hodnota permeability OD 490 )

IVIS Klasifikace

≥55,1 Dráždivé nebo žíravé

Akutní toxicita dráždivé a leptavé účinky na oči – OECD 405

In vivo test

TEST JE PROVÁDĚN V NÁVAZNOSTI NA TEST DRÁŽDIVÉ A LEPTAVÉ ÚČINKY NA KŮŽI

provedení testu je možné jen při znalosti účinků testované látky na kůži

pozitivní test na kůži – předpoklad pozitivního účinku i na oko

(oko citlivější) – netestuje se na zvířatech

Akutní toxicita dráždivé a leptavé účinky na oči – OECD 405

In vivo test

TESTOVACÍ METODA

•pokusné zvířa – albinotický králík plemene Novozélandský bílý bez rozlišení pohlaví

•24 hodin před aplikací vyšetření obou očí, vážení zvířete

•dávka – 0,1 ml nebo 0,1 g (zaleží na skupenství)

•aplikace testovaného materiálu do spojivkového vaku levého oka (pravé oko – kontrola)

Počáteční zkouška – 1 zvíře

Potvrzující zkouška - 2 zvířata

Akutní toxicita dráždivé a leptavé účinky na oči – OECD 405

In vivo test

TESTOVACÍ METODA

•výplach – 24h. po aplikaci testovaného materiálu

•pozorování

– oči se vyšetřují po 1, 24, 48 a 72 hodinách

– oční léze – intenzita (rohovka, duhovka, mžurka, spojivka),

– vratnost nebo nevratnost změn (pozorování až 21 dní)

– jiné projevy toxicity (denně)

HODNOCENÍ VÝSLEDKU TESTU

•stupeň vzniku očních lézí na rohovce, duhovce, mžurce, spojivce