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ELECTROFORESIS DE PROTEINAS
SERICAS Y URINARIAS
IMPACTO DE LAS NUEVAS TECNOLOGIAS Y SU CORRECTA INTERPRETACION
El término de electroforesis proviene de dos palabras griegas, elektro que significa electricidad y phoros que significa movimiento. Se trata de una técnica de separación de partículas basada en la velocidad diferencial de migración que se observa en las partículas cargas, neutras o pasivas dispuestas en un medio acuoso, debido a la atracción y/o repulsión que sufren en un campo eléctrico.
Arne Wilhelm Kaurin Tiselius, bioquímico sueco galardonado con el premio Nóbel de Química en 1948,considerado el padre de la electroforesis, técnica de separación de partículas.
1948 2019
La suma de todas estas fuerzas provoca que las moléculas no migren de una manera homogénea, de tal manera que, si la moléculas son colocadas en un cierto lugar de la solución, los iones comenzarán a moverse formando un frente cuya anchura aumentrá con el tiempo.
Para reducir la anchura de este frente podemos reducir el movimiento de las moléculas empleando un medio que oponga más resistencia a dicho movimiento. Una forma común de hacer esto es formar un gel. El gel consiste de un polímero soluble de muy alto peso molecular que atrapa moléculas de agua y forma un tamiz molecular que dificulta el movimiento de los solutos.
❖ PROTEÍNAS SERICAS: proteinograma electroforético, IF sérica
❖ PROTEÍNAS URINARIAS: uroproteinograma , IF en orina, BJ
Isoelectroenfoque: investigación de bandas oligoclonales en LCR y alteraciones
en la Alfa uno antitripsina .
✓ El método de elección para el estudio de las proteínas séricas es el
PROTEINOGRAMA ELECTROFORETICO
✓ METODOS: manuales, semi o totalmente automatizados
✓ Se sugiere soporte de agarosa o electroforesis capilar
( según la resolución del International Myeloma Workshop
Consensus -2009)
Es importante solicitar un estudio de electroforesis proteicas?Para que sirve?Como lo solicito??Como interpreto el informe??
❖ El proteinograma en suero es un retrato del contenido , distribución y balance de las proteínas del paciente en un momento determinado.
❖ Permite realizar una valoración semicuantitativa de las diferentes fracciones en las que se distribuyen las proteínas, ayudando a sospechar diferentes patologías, y en unos pocos casos siendo patognomónico de enfermedad.
❖ La solicitud del proteinograma en suero debería estar dentro de los análisis de rutina y/ o control de nuestros pacientes.
❖ La interpretación del proteinograma debe ser realizada por el profesional idóneo en la técnica utilizada en cada laboratorio, con el conocimiento de la misma y sus propios valores de referencia.
❖ A medida que las técnicas se han ido desarrollando, mejorando la sensibilidad y la automatización, los profesionales debemos capacitarnos para aprovechar dicha información y evitar falsas interpretaciones.
Principio técnico
➢ Se basa en la propiedad de las proteínas de moverse según su peso molecular y su carga eléctrica, al colocar el suero del paciente en una matriz ( acetato de celulosa , agarosa,otras) y aplicar un voltaje eléctrico
➢ En el suero ( pH hay proteínas con cargas positivas y negativas, pero a un pH alcalino de 8,9 todas las proteínas quedan con carga negativa y migrarán del Catodo (-) al Anodo (+).
FRACCIONES ELECTROFORETICAS
• TTR: Proteína ligada al retinol
• ALBÚMINA: alfa feto proteína
proteína ligada a la vitamina D
• ALFA 1: alfa 1 antitripsina
Alfa 1 glipoproteína ácida
Alfa 1 globulina ligada a la tiroxina
transcortina
• ALFA 2: haptoglobina
alfa dos macroglobulina
ceruloplasmina
• BETA 1 : transferrina
ferritina
beta lipoproteína
• BETA 2: fracción C3,( C4 y C5) del complemento
hemopexina
fibrinógeno ( plasma)
• GAMMAGLOBULINAS: IgG,IgA, IgM,IgD,IgE
PCReactiva
Cadenas livianas K y L
Fracción ALFA 1 GLOBULINASDEFICIT DE A1AT
✓ La deficiencia de alfa-1-antitripsina (A1AT) es un desorden hereditario causado por mutaciones en el gen SERPINA 1 , que puede desencadenar EPOC o enfermedades del hígado
✓ La A1AT es un inhibidor de serin proteasas producida por el hígado cuya principal función esproteger al pulmón contra el daño proteolítico de la elastasa secretada por los neutrófilosen respuesta a infecciones e irritantes inhalados, como el humo del cigarrillo.
✓ El gen SERPINA 1 es altamente polimórfico y está organizado en 4 exones codificantes(2, 3, 4 y 5) y 3 exones no codificantes . Se conocen al menos 100 alelos
✓ Los alelos más comunes en la población general son el M, el S y el Z.
ALFA 1 ANTITRIPSINA
ALFA 1 ANTITRIPSINA
FENOTIPO HETEROCIGOTA DE A1AT
SE SUGIERE REALIZAR ISOELECTROENFOQUE PARA FENOTIPIFICACION Y BIOLOGIA MOLECULAR PARA GENOTIPIFICAION
➢ DISPROTEINEMIAS: alteraciones de las proteínas plasmaticas con hipo o hiperproteinemia, y
modificación entre la realación albúmina/ globulinas
➢ SEUDODISPROTEINEMIAS: variaciones de la proteinemia total por hemodilución o
hemoconcentración, sin alteraciones de la proporcion en las fracciones.
➢ DISGAMMAGLOBULINEMIAS: son alteraciones cuali o cuantitativas de la fracción proteica de las
gammaglobulinas, con variaciones de las proteínas totales y de la realción alb/ glob. Las patentes o
perfiles puedes ser de características policlonales, oligoclonales o monoclonales.
disminuídas
POLICONALES dentro de los VR ( normales)
aumentadas
varias BH
OLIGOCLONALES presencia de IC
hipo,normo o hipergamma
MGUS
MONOCLONALES Mieloma múltiple
Macroglobulinemia
• El perfil policlonal generalmente esta aumentado a expensas de una de la
inmunoglobulinas:
Infecciones crónica (IgG)
Enfermedades autoinmunes ( IgG e IgA)
Algunos tumores ( IgG)
Enfermedades de la piel ( IgA)
Enfermedades pulmonares e intestinales (IgA)
Perfil policlonal
Perfil oligoclonal• Patologías más comunes que la presentan:
Hepatitis
Cirrosis
HIV
Infecciones crónicas
Enfermedades autoinmunes
Perfil oligoclonal
• El perfil monoclonal debe estudiarse para identificar el componente que
genera la banda proteica homogénea, y la patología asociada, para su
posterior seguimiento.
Puede ser un componente de alguna de las cinco inmunoglobulinas,
Enfermedad de cadenas livianas,
Enfermedades crónicas ( tumores, hepatitis C)
Perfil monoclonal
• La inmunofijación en suero consiste en la detección, mediante electroforesis alcalina en
gel de agarosa y uso de anticuerpos, de proteínas monoclonales en suero. Las proteínas
migran en la electroforesis y se inmunofijan con antisueros de diferentes especificidades.
Posterior a la inmunofijación, las proteínas que se precipitan y se tiñen con violeta ácido
para permitir su visualización.
INMUNOFIJACION
• La inmunofijación es una técnica que
permite que una proteína quede
anclada al sitio donde migró durante la
electroforesis, lo cual se logra a partir
de la formación de un complejo
insoluble con anticuerpos.
APLICACIONES DE ELECTROFORESIS EN PROTEINAS ESPECIFICAS
✓ HEMOGLOBINOPATIAS Y TALASEMIAS✓ VARIANTES GENETICAS DE LA ALFA UNO ANTITRIPSINA✓ ISOFORMAS DE LA TRASFERRINA ( CDT- Carbohydrate Deficient
Transferrin ) : abuso crónico del alcohol.✓ ISOFORMAS DE LA FOSFATASA ALCALINA (fracciones ósea, hepática,
placentaria e intestinal). ✓ ELECTROFORESIS DE LIPOPROTEINAS✓ DETECCION DE PROTEINA DE BENCE JONES✓ CUANTIFICACION DE HEMOGLOBINA GLICOSILADA
❖ La electroforesis (EF) alcalina (pH 8.5) en gel de agarosa, debido a su simplicidad, es uno de los métodos más populares para el screening de Hb. Es costo-efectiva para laboratorios de bajo volumen de muestras, sin embargo, es relativamente laboriosa
Hemoglobinopatías
❖ La electroforesis capilar (EC) es el método más recientemente desarrollado para la cuantificación y detección de hemoglobinas normales y anormales aprobado por la FDA y que constituye una ayuda en el diagnóstico de hemoglobinopatías y talasemias
❖ Debido a la baja precisión y exactitud de las Hb en bajas concentraciones, el Colegio Americano de Patólogos (CAP) ya no recomienda el uso de la exploración densitométrica para la cuantificación de HbA2. Además, algunas variantes comunes de Hb co-migran
Hemoglobinopatías y Talasemias
Algunas ventajas que ofrece la EC( electroforesis capilar) son:
1. La separación de Hb S de Hb D, HbE deHb C (y de Hb A2). 2. La cuantificación precisa y rápida de Hb F y Hb A2, incluso en la presencia de Hb S, E y C (Figuras 2 y
Las variantes post traduccionales de Hb (como glicosilada HbS1c) no se separan de las fracciones principales.
3. Variantes de la cadena Delta, variantes de la cadena alfa, y otras fracciones menores de Hb son fácilmente visualizadas.
4. Hemoglobinas rápidas, como la Hb H y Hb Bart son más fácilmente detectadas y medidas por CE que por HPLC.
5. Mayor Automatización y rendimiento, haciéndola ideal para un programa de screening.6. Volumen mínimo de 100 uL de muestra para realizar el estudio.7. El sistema es apto para el estudio del recién nacido a partir de elución de muestras de sangre seca.
ELECTROFORESIS DE PROTEINAS URINARIAS
ELECTROFORESIS DE PROTEINAS URINARIAS
ELECTROFORESIS DE PROTEINAS URINARIAS
ELECTROFORESIS DE PROTEINAS URINARIAS
ELECTROFORESIS DE PROTEINAS URINARIAS
ISOELECTROENFOQUE
ISOELECTROENFOQUE EN LCR
ISOELECTROENFOQUE DE A1AT
❖ La deficiencia de alfa-1-antitripsina (A1AT) es un desorden hereditario causado por mutaciones en el gen SERPINA 1 que puede ocasionar entre la tercera y cuarta década de vida una enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), como enfisema y bronquitis crónica
❖ La A1AT es un inhibidor de serin proteasas producida por el hígado cuya principal función es proteger al pulmóncontra el daño proteolítico de la elastasa secretada por los neutrófilos en respuesta a infecciones e irritantesinhalados, como el humo del cigarrillo.
❖ Los alelos más comunes en la población general son el M, el S y el Z. El alelo M es considerada la variante normaly se asocia con niveles normales de A1AT en plasma. Las variantes más comunes asociadas a enfermedad son elalelo deficiente S (E288V), asociado con niveles reducidos de A1AT; y el alelo Z (E366K) que codifica para una proteína inestable que se acumula dentro del hepatocito y que a su vez posee menor actividad enzimática.
❖ Laboratorio: análisis fenotípico por isoelectroenfoque o la secuenciación completa del gen SERPINA
ISOELECTROENFOQUE DE A1AT
❖ Laboratorio: análisis fenotípico por isoelectroenfoque o la secuenciación completa del gen SERPINA
ELECTROFORESIS CAPILAR
Definición: es una técnica que permite la separación de moléculas cargadas
en función de su movilidad electroforética, en un buffer a un pH determinado,
según el PI del electrolito y de un flujo electroendosmótico importante.
Es una técnica intermedia entre la electroforesis de zona en agarosa y la
cromatografía líquida (HPLC) .
Es un método totalmente automatizado ( lectura a 200 nm)
Las proteínas migran del Anodo al Catodo .
ELECTROFORESIS CAPILAR
ELECTROFORESIS CAPILAR
total
CationesNeutronesAniones
ELECTROFORESIS CAPILAR
De los medios de comunicación en este mundo tan codificado con internet y otras navegaciones yo sigo prefiriendo el viejo beso artesanal que desde siempre comunica tanto
Mario BenedettiMuchas gracias
