28
Miroslava Vyvadilová a kol. Metodika produkce dihaploidních linií pro šlechtění řepky ozimé METODIKA PRO PRAXI VÝZKUMNÝ ÚSTAV ROSTLINNÉ VÝROBY, V.V.I. PRAHA – RUZYNĚ 2008
Miroslava Vyvadilová a kol.
Metodika produkce dihaploidních linií pro šlechtění řepky ozimé
METODIKA PRO PRAXI
VÝZKUMNÝ ÚSTAV ROSTLINNÉ VÝROBY, V.V.I. PRAHA – RUZYNĚ
2008
Miroslava Vyvadilová, Miroslav Klíma, Vratislav Kučera
Metodika produkce dihaploidních linií pro šlechtění řepky ozimé
METODIKA PRO PRAXI
VÝZKUMNÝ ÚSTAV ROSTLINNÉ VÝROBY, V.V.I. PRAHA – RUZYNĚ
2008
Metodika vznikla za finanční podpory MZe ČR a je výstupem řešení Výzkumného zá-měru MZe 0002700602 „Nové poznatky, metody a materiály pro genetické zlepšo-vání biologického potenciálu plodin a využití agro–biodiversity pro setrvalý rozvoj ze-mědělství“. Autoři: Ing. Miroslava Vyvadilová, CSc.
Ing. Miroslav Klíma Ing.Vratislav Kučera, CSc.
Vydal: Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. Drnovská 507, Praha 6 – Ruzyně Oponenti: RNDr. Miroslav Griga, CSc.
Agritec, výzkum, šlechtění a služby, s.r.o. Zemědělská 16 78701 Šumperk
Ing. Ivan Branžovský, CSc. Odbor rostlinných komodit Ministerstvo zemědělství ČR
Autor fotografií: Ing. Miroslav Klíma Kontakt na autory: [email protected], [email protected] Vydáno v počtu: 50 ks © Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., Praha, 2008
ISBN – 978-80-87011-80-5 Schváleno MZe, dopis č.j. 46274/2008-18020
- 3 -
Metodika produkce dihaploidních linií pro šlechtění řepky ozimé Dihaploidy (DH) vytvářené technikou mikrosporových kultur jsou využívány ve šlech-titelských programech, kde umožňují produkci homozygotních linií a výrazně zkracují dobu vyšlechtění odrůd ve srovnání s tradičními postupy. Tato publikace přináší sou-hrnný návod k produkci dihaploidních linií ozimé řepky. Pylová embryogeneze je ovlivňovaná řadou kritických faktorů, z nichž je nejvýznamnější genotyp, fyziologický stav donorových rostlin a vývojové stádium mikrospor. Optimalizace metody spočívá v pěstování donorových rostlin v klimatizovaných kultivačních komorách, ve zlepšení regenerace celistvých rostlin postupnou subkultivací kotyledonárních embryí na mé-dia s různými kombinacemi fytohormonů a odřezávání části jejich děloh. Účinnost diploidizace mikrosporových regenerantů byla značně zvýšena aplikací antimitotické látky trifluralinu do mikrosporových kultur. Modifikovaná metoda mikrosporových kultur je využitelná pro široké spektrum genotypů řepky ozimé.
Method of doubled haploid line production for winter oilseed rape breeding Doubled haploids (DH) derived from microspore culture are used in breeding pro-grammes where they enable the production of homozygous lines and significantly reduce cultivar development time. Doubled haploid system is really saving up two years in comparison to the conventional breeding work. This publication brings the comprehensive instruction for the production of oilseed rape DH lines. There are a number of critical factors affecting the efficiency of microspore embryogenesis. The most important are genotype, physiological state of donor plants and stage of micro-spore development. The improvement of DH methodology consists of donor plant growing in controlled conditions in cultivation room, the regeneration of plantlets by gradual subcultivation of cotyledonary embryos on media with various combinations of phytohormones and excision of the cotyledons from mature embryo. Chromosome doubling efficiency was considerably increased by trifluralin treatment of in vitro microspore cultures. The modified microspore culture technique is applicable to a wide spectrum of winter oilseed rape genotypes.
- 4 -
Obsah I) Cíl metodiky .................................................................................................................5 II) Vlastní popis metodiky................................................................................................5 1. Úvod..................................................................................................................................5 2. Metodické postupy ..........................................................................................................5 2.1. Příprava donorových rostlin ........................................................................................5 2.1.1. Technické vybavení a materiál..................................................................................5 2.1.2. Pracovní postup .........................................................................................................6 2.2. Odběr rostlinného materiálu.......................................................................................6 2.2.1. Materiál a vybavení ...................................................................................................6 2.2.2. Pracovní postup.........................................................................................................6 2.3. Stanovení vývojové fáze mikrospor ............................................................................6 2.3.1. Materiál a vybavení ...................................................................................................6 2.3.2. Pracovní postup.........................................................................................................7 2.4. Mikrosporové kultury ..................................................................................................7 2.4.1. Technické vybavení a materiál .................................................................................7 2.4.2. Pracovní postup.........................................................................................................7 2.4.2.1. Odběr a sterilizace poupat .....................................................................................7 2.4.2.2. Izolace mikrospor ..................................................................................................7 2.4.2.3. Diploidizace in vitro a kultivace mikrospor........................................................ 8 2.5. Regenerace celistvých rostlin ..................................................................................... 8 2.5.1. Technické vybavení a materiál ................................................................................ 8 2.5.2. Pracovní postup........................................................................................................ 8 2.6. Dopěstování regenerantů do generativní fáze ...........................................................9 2.6.1. Technické vybavení a materiál .................................................................................9 2.6.2. Pracovní postup.........................................................................................................9 2.6.2.1. Přesazení regenerantů do nesterilních podmínek ...............................................9 2.6.2.2. Kontrola ploidie regenerantů................................................................................9 2.6.2.3. Získání osiva R1 generace ......................................................................................9 2.7. Časový harmonogram přípravy donorových rostlin pro jarní odběry ...................10 poupat.................................................................................................................................10 2.8. Časový harmonogram vývoje embryí a regenerace celistvých rostlin ................... 11 III) Srovnání „novosti postupů“ ......................................................................................13 IV) Popis uplatnění metodiky .........................................................................................13 V) Seznam použité související literatury.......................................................................13 VI) Seznam publikací, které předcházely metodice....................................................... 15 VII) Příloha.........................................................................................................................16
- 5 -
I) Cíl metodiky
Cílem metodiky je podat ucelené informace o postupu tvorby dihaploidních linií, od přípravy donorových rostlin, založení mikrosporových kultur, regenerace celistvých rostlin až po převod regenerantů do nesterilních podmínek a získání osiva R1 genera-ce. II) Vlastní popis metodiky
1. Úvod Tvorba dihaploidů (DH) je v poslední době využívána ve šlechtění celé řady plodin. Tato metoda umožňuje vytvářet kompletně homozygotní genotypy z heterozygotních rodičů během jedné generace. Pomocí dihaploidů jsou fixovány rekombinantní game-ty přímo jako fertilní homozygotní linie. K produkci dihaploidních linií řepky je nyní rutinně využívána metoda pylové embryogeneze v mikrosporových kulturách in vitro. Pomocí indukce haploidů v mikrosporových kulturách a zdvojení chromozómové sád-ky lze získat zcela homozygotní neštěpící DH linie prakticky za jeden rok. Značnou výhodou DH systému je úspora času, vzhledem k tomu, že hodnocení výnosu a dal-ších hospodářských znaků je možné mnohem dříve ve srovnání s tradičními metoda-mi šlechtění. Zkoušky výkonu a přemnožení osiva mohou být provedeny během tří až čtyř let. Systém dihaploidů umožňuje efektivní tvorbu linií pro šlechtění jak tradič-ních odrůd, tak zejména komponent hybridů (Kučera et al. 2002). Další možnosti využití představuje časná selekce specifických znaků, stabilizace me-zidruhových hybridů, genetické analýzy, mutace a selekce in vitro (např. na obsah mastných kyselin, rezistenci vůči chorobám, mrazuvzdornost apod.). Pomocí diha-ploidů lze docílit kombinací znaků, tradičními metodami obtížně nebo zcela nedosaži-telných, jako je autoinkompatibilita (AI) a 00 kvalita semen. Haploidní či dihaploidní regeneranty se též mohou využívat k transformacím a molekulárním analýzám. Na pracovišti VÚRV, v.v.i. byla propracována a optimalizována metoda produkce di-haploidů pomocí mikrosporových kultur. Výrazným posunem bylo zejména zlepšení přímé regenerace celistvých rostlin z mikrosporových embryí metodou ořezávání dě-ložních segmentů (KLÍMA et al. 2004) a optimalizace metody diploidizace mikrospo-rových regenerantů za účelem získání fertilních celistvých rostlin (KLÍMA et al. 2008). 2. Metodické postupy 2.1. Příprava donorových rostlin
2.1.1. Technické vybavení a materiál
- Výsevní substrát - Květináče ∅ 8 cm a kontejnery 19 × 19 cm - Vícesložkové tekuté hnojivo - Klimatizovaná růstová komora – fotoperioda 16/8 h, teplota 22/20°C
(den/noc), intenzita osvětlení 84 µmol/m2/s - Skleník – fotoperioda 16/8 h, teplota 15–25/10–15°C (den/noc), s přisvětlová-
ním (sodíkové výbojky – 210 W)
- 6 -
- Jarovizační komora – fotoperioda 8/16 h, teplota 2–5°C, přisvětlování zářiv-kami
- Lednice – teplota 4–5°C
2.1.2. Pracovní postup
- Výsev semen vybraných genotypů ve dvou obdobích, dle etapy odběru poupat: a) Odběr poupat září–leden – výsev v průběhu června (rostliny ve fázi nástupu kve-tení umístit do klimatizované kultivační komory) b) Odběr poupat únor–květen – výsev září–říjen (odběry poupat lze provádět též ve skleníkových podmínkách, pokud teploty nepřesáhnou 25°C)
- Přepichování klíčenců do květináčků ∅ 8 cm s výsevním substrátem (10 rostlin od genotypu)
- Jarovizace rostlin ve fázi 6–10 pravých listů po dobu 7–8 týdnů - Přesazení jarovizovaných rostlin do kontejnerů 19 × 19 cm se zahradnickým
substrátem a pěstování ve skleníkových podmínkách (kontrola zdravotního stavu, případné ošetření pesticidy)
- Přemístění rostlin ve fázi prodlužování před tvorbou květenství do klimatizo-vané komory nebo do skleníku, pokud není k dispozici klimatizovaná komora
- Přihnojování v průběhu kvetení roztokem tekutého vícesložkového hnojiva 1–2× týdně
- Pravidelné odstraňování odkvetlých květenství, aby se podpořila tvorba no-vých poupat
2.2. Odběr rostlinného materiálu
2.2.1. Materiál a vybavení
- Nůžky - Kádinky (200–250 ml) s vychlazenou destilovanou vodou - Lihový fix na popis kádinek - Cestovní chladnička (termotaška)
2.2.2. Pracovní postup
- Odstřižení částí terminálních a axilárních květenství s neotevřenými poupaty - Umístění květenství jednotlivých genotypů v kádinkách do termotašky - Uložení květenství v lednici při 4–5°C až do vlastního odběru jednotlivých
poupat (po dobu maximálně pěti dnů) 2.3. Stanovení vývojové fáze mikrospor Nezralá pylová zrna jsou schopna procházet embryogenezí pouze v určité fázi svého vývoje – ve středně až pozdně jednojaderném stádiu. Proto se před založením mikro-sporové kultury stanovuje délka poupat, která je v korelaci s vývojovým stadiem mik-rospor
2.3.1. Materiál a vybavení
- Milimetrový papír - Pinzeta
- 7 -
- Podložní a krycí sklíčka - Roztok železitého acetokarmínu - Optický mikroskop
2.3.2. Pracovní postup
- Příprava roztlakových preparátů s acetokarmínem z prašníků vyjmutých z pou-pat tří až čtyř velikostí, obvykle v rozsahu 3–4 mm
- Hodnocení vývojového stádia mikrospor pod mikroskopem při zvětšení 400× až 600×
- Stanovení optimální velikosti poupat pro mikrosporové kultury jednotlivých genotypů (převažující zastoupení středně až pozdně jednojaderných mikro-spor, které se vyznačují kulovitým tvarem, čirou cytoplazmou, zřetelným já-drem v blízkosti exiny, obrázek č. 1 – viz příloha)
2.4. Mikrosporové kultury
2.4.1. Technické vybavení a materiál
- Flowbox pro práci ve sterilním prostředí - Stolní centrifuga - Laboratorní horizontální třepačka - Binokulární lupa - Inverzní mikroskop - Biologický termostat - Lednice - Stolní autokláv - Kultivační místnost – fotoperioda 16/8 h (den/noc), trubicové zářivky, světel-
ná intenzita 250 µmol/m2/s; 25°C ± 1°C - Kultivační místnost – fotoperioda 16/8 h (den/noc), trubicové zářivky, světel-
ná intenzita 250 µmol/m2/s; 19°C ± 1°C - Laboratorní sklo a pomůcky – plynový nebo lihový kahan, pipety, kyvety
(10–20 ml), sterilní Petriho misky o průměru 90 mm, parafilm, silné skleněné tyčinky, nylonové filtry (40 a 70 μm)
- Etanol (čistý a denaturovaný) - SAVO - Tekuté kultivační médium NLN (Tabulka č. 1 – viz příloha) - Roztok diploidizační látky trifluralinu (viz příloha, str. 18) - Redestilovaná voda
2.4.2. Pracovní postup
2.4.2.1. Odběr a sterilizace poupat
- Odběr poupat odpovídající velikosti do ledem chlazené kádinky v co nejkrat-ším možném čase, aby se předešlo dehydrataci
- Sterilizace poupat 70% etanolem 2 min. nebo 10% SAVO 10 min. při větším ri-ziku kontaminace
- Opláchnutí chlazenou sterilní destilovanou vodou 3× po 5 minutách
2.4.2.2. Izolace mikrospor
- Macerace poupat ve 20 ml kádince v chlazeném NLN médiu pomocí skleněné tyčinky
- 8 -
- Filtrace přes dvojitý nylonový filtr do 20 ml kádinky a doplnění na celkový ob-jem suspenze mikrospor 9–10 ml
- Purifikace mikrospor centrifugací v 10 ml kyvetách při 100 g (1000 RPM) po dobu 10 minut
- Odpipetování supernatantu a resuspendování sedimentu v čerstvém chlaze-ném médiu NLN
- Dvě další centrifugace po 5 minutách se stejným postupem
2.4.2.3. Diploidizace in vitro a kultivace mikrospor
- Příprava zásobního a pracovního roztoku diploidizační látky trifluralinu (viz příloha)
- Resuspendování pročištěných mikrospor v 10 ml roztoku trifluralinu (10 µmol/l) a v 90 mm sterilní Petriho misce uložení na 18 – 24 hodin v ter-mostatu bez osvětlení při 30°C
- Přepipetování suspenze do 10 ml centrifugační kyvety a odstředění při 1000 RPM po dobu 10 minut
- Resuspendování sedimentovaných mikrospor v temperovaném kultivačním NLN médiu v 50 ml Erlenmeyerově baňce a upravení hustototy na 104 mikro-spor na 1 ml média
- Kultivace mikrospor v 90 mm Petriho misce uzavřené parafilmem v termosta-tu při 30°C až do objevení globulárních embryí (10 –14 dní)
- Přemístění kultur na třepačku (70 RPM) do kultivační místnosti s kontinuál-ním osvětlením (250 µmol/m2/s) a teplotou 25°C ± 1°C, kde dochází k vývoji kotyledonárních embryí (Obrázek č. 7 – viz příloha)
2.5. Regenerace celistvých rostlin
2.5.1. Technické vybavení a materiál
- Flowbox - Kultivační místnost pro explantátové kultury - Lednice - Autokláv - Kultivační média (Tabulky č. 2, 3 a 4 – viz příloha) - Etanol čistý
2.5.2. Pracovní postup
- Subkultivace kotyledonárních embryí o délce 4–7 mm (Obrázek č. 7 – viz pří-loha) na agarové diferenciační (DM) médium v 90 mm plastových Petriho miskách po 20 ks
- Umístění kultur v kultivační místnosti při fotoperiodě 16/8 h (den/noc), inten-zitě osvětlení 300 µmol/m2/s a teplotě 19°C ± 1°C po dobu 8–14 dnů (Obrázek č. 8)
- Odříznutí části děložních lístků (1/2 až 2/3) pro podpoření vývoje vrcholového meristému a subkultivace embryí na regenerační médium (RM) v 90 mm plas-tových Petriho miskách po 20 ks (Obrázek č. 9)
- 9 -
- Subkultivace regenerantů s 1–2 pravými lístky na RM médium v Erlenmeye-rových baňkách
- Subkultivace regenerantů ve fázi 3–5 pravých lístků (Obrázek č. 10) na MS mé-dium (Obrázek č. 11)
- Vysazení regenerantů s dobře vyvinutým kořenovým systémem do nesterilních podmínek (Obrázek č. 12).
2.6. Dopěstování regenerantů do generativní fáze
2.6.1. Technické vybavení a materiál
- Skleník - Jarovizační komora - Výsevní a zahradnický substrát - Previcur - Vícesložkové tekuté hnojivo - Perforovaná fólie - Izolátory na jednotlivé rostliny z netkané textilie - Květináče ∅ 8 cm - Kontejnery 19 × 19 cm
2.6.2. Pracovní postup
2.6.2.1. Přesazení regenerantů do nesterilních podmínek
- Vyjmutí regenerantů z kultivačních nádob a opláchnutí pod tekoucí vodou a odstranění zbytků agarového média
- Ponoření celých rostlinek do 0,15% roztoku Previcuru na 20 minut - Vysazení rostlin do květináčů o ∅ 8 cm s výsevním substrátem a zalití rozto-
kem Previcuru - Zakrytí květináčů perforovanou fólií na 7–10 dní pro vytvoření vlhkého mikro-
klima a pěstování ve skleníku až do doby aktivního růstu rostlin (14–18 dní)
2.6.2.2. Kontrola ploidie regenerantů
- Přesné rozlišení haploidních a dihaploidních regenerantů se provádí karyolo-gickou analýzou nebo průtokovou flow-cytometrií. Tyto metody jsou však pra-covně i finančně náročné při větším počtu testovaných rostlin. V praxi se vyu-žívá především hodnocení rostlin podle morfologie květenství a fertili-ty/sterility květů (Obrázky č. 15, 16, 17).
2.6.2.3. Získání osiva R1 generace
- Jarovizace rostlin v klimatizované komoře po dobu 6 až 8 týdnů - Vysázení jarovizovaných regenerantů do kontejnerů o velikosti 19 × 19 cm, na-
plněných zahradnickým substrátem - Umístění vysázených rostlin do vytápěného skleníku s přisvětlováním (v zim-
ních měsících) nebo do venkovních izolátorů (Obrázek č. 14) - Provádění pravidelné kontroly zdravotního stavu a preventivní ošetření rostlin
proti chorobám a škůdcům (Obrázek č. 13) - Průběžná izolace celých rostlin před počátkem kvetení sáčky z netkané textilie
- 10 -
2.7. Časový harmonogram přípravy donorových rostlin pro jarní odběry poupat
Měsíc
IX.
X.
XI.
XII.
I.
II.
III.
IV.
V.
Výsev
Přepichování
Umístění do jarovizace
Vyskladnění z jarovizace, přesazení, ošetření proti patogenům
Odběry poupat
- 11 -
2.8. Časový harmonogram vývoje embryí a regenerace celistvých rostlin
Dny 1. 2. 3. 4. 5.
10.
15.
20.
25.
30.
35.
40.
2–4 buněčné útvary
Srdčitá proembrya (délka 0,2–0,3 mm)
Přenos na třepačku na světlo – délka proembryí 0,5–1 mm
Pasážování kotyledonárních embryí (délka 4–8 mm) na diferenciační médium (po 20–30 dnech od založení kultury); kultivace při 18–20°C
Globulární proembrya
Odříznutí 2/3 kotyledonů, pasážování embryí na regenerační médium RM v Petriho miskách, regenerace vzrostných vrcholů a vývoj pravých lístků
Založení kultury
Postupná subkultivace regenerantů na MS médium, vývoj kořínků
- 12 -
50.
60.
70.
80.
Pasážování prýtů ve stádiu 2–3 vyvinutých pravých lístků na pevné MS médium v Erlenmayerových baňkách, regenerace kořenového systému
Postupná výsadba regenerantů s dobře vyvinutým kořenovým systémem do nesterilních podmínek (rašelinový substrát)
Jarovizace regenerantů po 10–20 dnech od výsadby do substrátu (5–8°C, 6–8 týdnů)
- 13 -
III) Srovnání „novosti postupů“
Metodika je výsledkem experimentů, které probíhaly v laboratořích, sklenících a na pokusných pozemcích Výzkumného ústavu rostlinné výroby, v.v.i. Modifikace a optimalizace postupů spočívala především v pěstování donorových rostlin pro mikro-sporové kultury v klimatizovaných komorách s řízeným režimem, aplikaci diploidi-zační látky trifluralinu přímo do tekutého kultivačního média pro včasnou diploidiza-ci a v odřezávání 2/3 děložních lístků mikrosporových embryí pro zlepšení přímé re-generace celistvých rostlin.
Optimalizovaná metoda produkce DH linií ozimé řepky je úspěšná prakticky u všech genotypů, a proto umožňuje rutinní využití ve výzkumných a šlechtitelských programech. Většina zde zmíněných postupů byla u ozimé řepky aplikována v pod-mínkách České republiky poprvé a byla publikována v řadě článků (viz seznam litera-tury). Předkládaná metodika je svého druhu první česky vydanou, komplexní prací na dané téma. IV) Popis uplatnění metodiky
Metodika je určena především pro pracovníky výzkumných a šlechtitelských pra-covišť, kteří budou její výsledky využívat ve výzkumu a v zemědělské praxi. Metodika bude uplatněna ve šlechtitelských a výzkumných programech, zaměřených na efek-tivní produkci dihaploidních linií a komponent pro hybridní šlechtění ozimé řepky, časnou selekci specifických znaků, mutace a selekce in vitro (např. na obsah mast-ných kyselin, rezistenci vůči chorobám, mrazuvzdornost apod.). V) Seznam použité související literatury
CEGIELSKA–TARAS T., TYKARSKA T., SZAŁA L., KURAS M., KRZYMAŃSKI J., 2002. Direct
plant development from microspore–derived embryos of winter oilseed rape Brassica napus L. ssp. oleifera (DC.) Metzger. Euphytica, 124: 341–342.
CHEN J.L., BEVERSDORF W.D. (1992): Production of spontaneous diploid lines from isolated microspores following cryopreservation in spring rapeseed (Brassica napus L.). Plant Breeding, 108: 324–327.
CHEN Z.Z., SNYDER S., FAN Z.G., LOH W.H. (1994): Efficient production of doubled haploid plants through chromosome doubling of isolated microspores in Bras-sica napus. Plant Breeding, 113: 217–221.
CHUONG P.V., DESLAURIERS C., KOTT L.S., BEVERSDORF W.D. (1988): Effects of donor genotype and bud sampling on microspore culture of Brassica napus. Cana-dian Journal of Botany 66: 1653–1657.
COVENTRY J., KOTT L., BEVERSDORF W.D. (1988): Manual for Microspore Culture Tech-nique for Brassica napus. Department of Crop Science Technical Bulletin OAC Publication 0489. University of Guelph.
DUNWELL J.M., THURLING N. (1985): Role of sucrose in microspore embryo produc-tion of Brassica napus ssp. oleifera. Journal of Experimental Botany 36: 1478–1491.
EIKENBERRY E. (1994): Chromosome doubling of microspore–derived canola using trifluralin. Cruciferae Newsletter, 16: 51–52.
- 14 -
EVANS D.E., SINGH M.B., KNOX R.B. (1990): Pollen development and application in biotechnology. In Blackmore S., Knox R.B. (eds.) Microspores: Evolution and Ontogeny. Academic Press: California, pp. 309–338.
FERRIE A.M.R, KELLER W.A. (1995): Microspore culture for haploid plant production. In Gamborg O.L., Phillips G.G (eds.) Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: fundamental methods. Springer, Berlin, pp. 155–164.
FERRIE A.M.R., PALMER C.E., KELLER W.A. (1994): Biotechnological Applications of Haploids. In Shargool P.D., Ngo T.T. Biotechnological Applications of plant cultures. CRC Press, Inc.: Boca Raton, pp. 77–110.
FERRIE A.M.R., PALMER C.E., KELLER W.A. (1995): Haploid Embryogenesis. In T.A. Thorpe (ed.), In vitro embryogenesis in plants. Kluwer Academic Publisher: Netherlands. pp. 309–344.
GAMBORG O.L., MILLER R.A., OJIMA K. (1968): Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Experimental Cell Research 50: 155–158.
HANSEN N.J.P., ANDERSEN S.B. (1996): In vitro chromosome doubling potential of colchicine, oryzalin, trifluralin, and APM in Brassica napus microspore cul-ture. Euphytica, 88: 156–164.
HENDERSON C.A.P., PAULS K.P. (1992): The use of haploidy to develop plants that ex-press several recessive traits using light–seeded canola (Brassica napus) as an example. Theoretical and Applied Genetics 83: 476–479.
HUANG B., BIRD S., KEMBLE R., SIMMONDS D., KELLER W.A., MIKI B. (1990): Effects of culture density, conditioned medium and feeder cultures on microspore em-bryogenesis in Brassica napus L. cv. Topas. Plant Cell Reports 8: 594–597.
ILIC–GRUBOR K., ATTREE S.M., FOWKE L.C. (1998): Induction of microspore–derived embryos of Brassica napus L. with polyethylene glycol (PEG) as osmoticum in a low sucrose medium. Plant Cell Reports 17: 329–333.
KOTT L.S., POLSONI L., ELLIS B., BEVERSDORF W.D. (1988): Autotoxicity in isolated microspore cultures of Brassica napus. Canadian Journal of Botany 66: 1665–1670.
LICHTER R. (1985): From microspores to rape plants. A tentative way to low glucosi-nolate strains. In: Sorensen H. (ed.): Advance in the Production and Utilisa-tion of Cruciferous Crops. Martinus Dordecht, Boston, Lancaster, Nijhoff M., Junk W. Publishers, 268–277.
MATHIAS R., RÖBBELEN G. (1991): Effective diploidization of microspore–derived hap-loids of rape (Brassica napus L.) by in vitro colchicine treatment. Plant Breed-ing, 106: 82–84.
MÖLLERS C., IQBAL M.C.M., RÖBBELEN (1994): Efficient production of doubled haploid Brassica napus plants by colchicine treatment of microspores. Euphytica, 75: 95–104.
PECHAN P.M., KELLER W.A. (1988): Identification of potentially embryogenic micro-spores in Brassica napus. Physiologia Plantarum 74: 377–384.
RUDOLF K., BOHANEC B., HANSEN M. (1999): Microspore culture of white cabbage, Brassica oleracea var. capitata L.: Genetic improvement of non–responsive cultivars and effect of genome doubling agents. Plant Breeding, 118: 237–241.
TAKAHATA Y., BROWN D.C.W., KELLER W.A. (1991): Effect of donor plant age and inflo-rescence age on microspore culture of Brassica napus L. Euphytica 58: 51–55.
- 15 -
WEBER S., ÜNKER F., FRIEDT W. (2005): Improved doubled haploid production proto-col for Brassica napus using microspore colchicine treatment in vitro and ploidy determination by flow cytometry. Plant Breeding, 124: 511–513.
ZHAO J., SIMMONDS D.H. (1995): Application of trifluralin to embryogenic microspore cultures to generate doubled haploid plants in Brassica napus. Physiologia Plantarum, 95: 304–309.
VI) Seznam publikací, které předcházely metodice
KLÍMA M., VYVADILOVÁ M., KUČERA V. (2004): Production and utilization of doubled
haploids in Brassica oleracea vegetables. Horticultural Science (Prague), 31: 119–123.
KLÍMA M., VYVADILOVÁ M., KUČERA V. (2008): Chromosome doubling effects of se-lected antimitotic agents in Brassica napus microspore culture. Czech J. Genet. Plant Breed., 42: 30–36.
KUČERA V., SCHWARZBACH E., KLÍMA M., VYVADILOVÁ M. (2004): Agronomic perform-ance of doubled haploid lines and pedigree–derived lines of winter oilseed rape. Czech J. Genet. Plant Breed., 40: 127–133.
KUČERA V., VYVADILOVÁ M., KLÍMA M. (2002): Utilisation of doubled haploids in winter oilseed rape (Brassica napus L.) breeding. Czech J. Genet. Plant Breed. 38: 50–54
SMÝKALOVÁ I., VĚTROVCOVÁ M., KLÍMA M., MACHÁČKOVÁ I., GRIGA M. (2006): Efficiency of Microspore Culture for Doubled Haploid Production in the Breeding Project “Czech Winter Rape”. Czech J. Genet. Plant Breed., 42: 58–71.
VYVADILOVÁ M., ZELENKOVÁ S., TOMÁŠKOVÁ D., KOŠNER J. (1993): Diploidization and cytological control of Brassica napus L. haploids. Rostlinná výroba, 39: 129–137.
- 16 -
VII) Příloha
Tabulka 1. Médium NLN –13 (Lichter 1985)
Složka Složka
A) navážky [mg . l –1 média] pH 5,8–6,0 MgSO4 ⋅ 7H2O
125,0 navážky B) a C) (v mg na 100 ml zás. roztoku) KNO3 125,0 navážky mikroprvků KH2PO4 125,0 H3BO3 1 000,0 Ca(NO3)2 ⋅ 4H2O 500,0 MnSO4 ⋅ H2O 1 894,0 L–serin 100,0 ZnSO4 ⋅ 7H2O 1 280,0 L–glutamin 800,0 Na2MoO4 ⋅ H2O 25,0 L–glutathion 30,0 CuSO4 ⋅ 5H2O 2,5 myo–inositol 100,0 CoCl2 ⋅ 6H2O 2,5 sacharóza 130 000,0 navážky vitaminů
zásobní roztoky (po 1ml na l média) kys. nikotinová 500,0 B) zásobní roztok mikroprvků thiamin (I.) 50,0 C) zásobní roztoky vitaminů I. – IV. pyridoxin 50,0 D) ostatní složky kys. listová* (II.) 50,0
biotin* (III.) 5,0 Ferrous sulfate/chelate solution1)
10 ml (na l média) glycin (IV.) 200,0
Tabulka 2. Médium MS (Murashige a Skoog 1962)
Složka Navážka (mg/l) Složka Navážka (mg/l) NH4NO3 1 650,000 FeSO4 ⋅ 7H2O 27,800 KNO3 1 900,000 Na2 ⋅ EDTA ⋅ 2H2O 37,300
CaCl2 ⋅ 2H2O 440,000 kys. nikotinová 0,500 MgSO4 ⋅ 7H2O 370,000 pyridoxin ⋅ HCl 0,500 KH2PO4 170,000 thiamin 0,100 KI 0,830 glycin 2,000 H3BO3 6,200 inositol 100,000
MnSO4 ⋅ 4H2O 22,300 agar 8 000,000
ZnSO4 ⋅ 7H2O 8,600 sacharóza 30 000,000 Na2MoO4 ⋅ 2H2O 0,250 kasein 1 000,000
CuSO4 ⋅ 5H2O 0,025
CoCl2 ⋅ 6H2O 0,025 pH 5,8
– složky I. – IV. rozpustit samostatně * – rozpustit v 1N KOH 1) – firma SIGMA sterilizace filtrací
- 17 -
Tabulka 3. Diferenciační médium DM (Klíma et al. 2004)
Složka Navážka (mg/l)
Makroelementy (NH4) 2 SO4 134
KNO3 3000
NaH2PO4 . 2 H2O 150
MgSO4. 7 H2O 500
CaCl2 .2 H2O 750 FeNa–EDTA 40
Mikroelementy H3BO3 3
MnSO4 . 4H2O 10
ZnSO4. 7 H2O 2
Na2MoO4. 2 H2O 0,25
CuSO4 . 5 H2O 0,025
CoCl2. 6 H2O 0,025 Vitamíny Thiamin HCl 10 Pyridoxin HCl 1 Kys. nikotinová 1 Myo–inositol 100 Aminokyseliny Glutamin 800 Serin 100 Fytohormony 6–BAP 0,2 IAA 0,2 Sacharóza 20 g Agar 8 g pH 5,8 –6,0
- 18 -
Tabulka 4. Regenerační médium RM (Klíma et al. 2004)
Složka Navážka (mg/l)
Makroelementy (NH4) NO3 1650
KNO3 1900
KH2PO4 170
MgSO4. 7 H2 O 370
CaCl2 .2 H2O 440 FeNa–EDTA 36,7
Mikroelementy H3BO3 6,2
MnSO4 . 4 H2O 22,3
ZnSO4. 7 H2O 8,6
Na2MoO4. 2 H2O 0,25
CuSO4 . 5 H2O 0,025
CoCl2. 6 H2O 0,025 KI 0,83
Vitamíny Thiamin 0,1 Pyridoxin 0,5 Kys. nikotinová 0,5 Myo–inositol 100 Glycin 2
Sacharóza 10 g
Agar 10 g
pH 5,9
Příprava roztoku trifluralinu
- Rozpuštění 33,52 mg trifluralinu v malém množství acetonu ve sterilních podmínkách ve flowboxu
- Konečné rozpuštění v dimetylsulfoxidu (DMSO) a upravení koncentrace rozto-ku na 10 mmol/l
- Uložení zásobního roztoku ve sterilních Erlenmeyerových baňkách při teplotě 22°C
- Příprava pracovního roztoku o koncentraci 10 µmol/l přidáním NLN média těsně před použitím pro mikrosporové kultury
- 19 -
Obrázek 1. Vývojová stádia mikrospor (1 hod. od založení kultury)
Detail zobrazuje jádra mikrospor, zřetelná ve formě tmavších prstenců
M – mladé stádium O – optimální stádium S – starší stádium
Šipka označuje buňku po prvním mitotickém dělení
Obrázek 2. Vývojová stádia mikrospor (24 hod. od založení kultury)
- 20 -
Obrázek 3. Detail dělících se buněk (označeny šipkou) – 24 hod. od založení kultury
Obrázek 4. Časné globulární proembryo (6 dní od založení kultury)
100 µm
- 21 -
Obrázek 5. Kultura ve stádiu globulárních až torpédovitých embryí (18 dní od založení kultury)
Obrázek 6. Kultura ve stádiu globulárních až kotyledonárních embryí (20 dní od založení kultury)
10 mm
5 mm
- 22 -
Obrázek 7. Kultura ve stádiu, kdy se provádí subkultivace kotyledonárních embryí (25 dní od založení kultury)
Obrázek 8. Embrya po 12 dnech na DM médiu, před ořezáváním kotyledonů
5 mm
10 mm
- 23 -
Obrázek 9. Embrya na RM médiu po ořezání 2/3 kotyledonů
Obrázek 10. Regeneranty na RM médiu 18 dní po odřezání kotyledonů
Průměr Petriho misky 90 mm
10 mm
- 24 -
Obrázek 11. Regeneranty na MS médiu (60 dní od založení kultury)
Obrázek 12. Regeneranty 8 dní po vysázení do půdního substrátu (80 dní od založení kultury)
- 25 -
Obrázek 13. Jarovizované regeneranty před výsadbou do kontejnerů
Obrázek 14. Dihaploidní rostliny ve skleníku – 7 měsíců od založení kultury
- 26 -
Obrázek 15. Fertilní květ řepky ozimé
Obrázek 16. Sterilní květ řepky ozimé
- 27 -
Obrázek 17. Terminální květenství fertilní a sterilní rostliny řepky ozimé
