Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin
10. RAPD, ISSR apod.
Petr Koutecký & Jiří Košnar, 2013
Vytvořeno v rámci projektu Molekularizace biologických
oborů PřF JU
reg. č. CZ.1.07/2.2.00/15.0364
RAPD – princip► Random amplified polymorphic DNA (Williams et al. 1990)► Hledáme polymorfismus DNA pomocí PCR reakce s
1 arbitrárním primerem► Sekvenci primeru volíme „náhodně“:
» obvykle dekanukleotid» počet různých dekanukleotidů: 410 = 1048576» volí se primery se zvýšeným (60-70%) obsahem GC
→ stabilnější vazba při PCR (annealing, extenze při 72°C)
► V praxi se sekvence primerů „naslepo“ zkouší:» test většího počtu primerů» výběr těch, které dávají vhodné banding pattern (dost variability
a zároveň jednoznačné vyhodnocení výsledků)
RAPD – princip► PCR reakce proběhne, pokud:
» jsou přítomny komplementární sekvence k primerům na protilehlých vláknech DNA
» jsou dostatečně blízko u sebe
► separace fragmentů elektroforézou na základě délky
► jsou vzorce na výpočet očekávaného počtu proužků (např. Williams et al. 1993), ale nefungují
nic(orientace)
nic(moc daleko)
RAPD gel► agarosa (horizontální) nebo polyakrylamid (vertikální)
► barvení EtBr, SYBR green, GelRed apod.» ideálně po proběhnutí ELFO, post-staining
(minimalizace deformací a posunů proužků)
► vyhodnocení: přítomnost / nepřítomnost proužku» dominantní data (0 / 1)
http://pgrc3.agr.ca/
RAPD – vznik varibility► Mutace v místě nasedání primerů (zánik / vznik místa)
většinou detekovatelný jen kratší produkt
► Inzerce / delece v amplifikovaném úseku
kodominantní
► Inverze apod.
RAPD – metodické problémy► Metoda velmi citlivá na reakční podmínky PCR
» koncentrace a čistota DNA» koncentrace primerů, Mg2+, polymerasy, složení pufru,…» konkrétní průběh teploty (rychlost zahřívání,…) → nutno používat
stejný cykler
► Relativně nízká teplota annealingu (35-45°C)» mismatched priming = amplifikace i z míst, kde primery nesedají
zcela přesně (mírně odlišná sekvence)» zásadních ± 8 nukleotidů na (3’ konci), zbytek nemusí nasedat
přesně» zejména u kratších fragmentů mohou vznikat stabilní smyčky z
daného vlákna DNA (konce mají komplementární sekvenci!) → horší amplifikace
RAPD – metodické problémy► Neznámá genetická podstata proužků
» nejistá homologie» dominance (nepoznáme heterozygoty), ale ne vždy
• až 5% kodominatních proužků (Williams et al. 1990)» neznámá dědičnost (nukleární vs. organelové)
• biperentální vs. uniparentální» kompetice primerů apod.
• ve směsi DNA dvou různých organismů se neamplifikují proužky z obou stejně (pokud se mírně liší sekvence v místech nasedání primeru)
• mohou vznikat heteroduplexy (2 různě dlouhá vlákna) → jiná mobilita při elfo
• může nastat v genomu hybridů, allopolyploidů,…» nespecifičnost – amplifikuje jakoukoliv DNA
• endofytické houby, epifytické řasy,…
RAPD - standardizace► vyhodnocujeme jako dominantní data (0 / 1)► intenzita proužků se neuvažuje
» mohou být heterozygoti, ale nemusí
► obecně slabé produkty se neuvažují» raději méně spolehlivých znaků než
více, ale nespolehlivých
► krátké fragmenty (< 100 bp) se většinou neuvažují» zvyšuje se nejistota homologie
► podobně i u příliš dlouhých fragmentů» 1700 bp je na agarose téměř nerozlišitelné od 2000 bp
► všechny analýzy provádět stejně a na stejném cykleru► všechny vzorky 2× (včetně extrakce!)
» uvažují se jen pozice, kde jsou opakování shodná
RAPD – srovnání s jinými metodami
Výhody► není nutná znalost genomu
(univerzální metoda)
► relativně málo DNA
► jednoduchost a rychlost
► cena
► fragmenty (teoreticky) rozmístěny po celém genomu
► velké množství (~ desítky až stovky) polymorfních fr.
Nevýhody► citlivost na reakční
podmínky, nesrovnatelnost mezi laboratořemi → někteří recenzenti zamítají publikace založené na RAPD...
► dominantní data
► nejistá homologie fragmentů atd.
► neznámá dědičnost fragmentů
ISSR► Inter-simple sequnce repeats (Zietkiewicz 1994)
► podobný princip jako RAPD
► jako primery slouží mikrosatelitové sekvence» mikrosatelit (= simple sequence repeat, SSR) je jeden z typů
repetitivních sekvencí - několikanásobné opakování krátkého (2-6 bp) sekvenčního motivu za sebou
► amplifikují se úseky mezi dvěma mikrosatelity stejné sekvence a opačné orientace
flanking sequence CACACACACACACACACA flanking sequence
nic(orientace)
nic(moc daleko)
ISSR► menší citlivost na reakční podmínky než RAPD
► primery delší (cca 18-20 bazí) než u RAPD» vyšší teplota annealingu (~45-60°C) → přesnější amplifikace (menší
intenzita mismatched priming)
► primery zahrnující několik bazí flanking sequence = anchored („ukotvené“, např. GAGAGAGAGAGAGAGAYC) vs. unanchored (GAGAGAGAGAGAGAGA)» anchored primers neamplifikují vždy („selektivní báze“)
► někdy používán touch-down postup» vyšší teplota annealingu v prvních cyklech PCR → specifičtější
amplifikace, i když menší výtěžek» v dalších cyklech nižší teplota → vyšší výtěžek, specifita zajištěna
předešlými cykly
ISSR - gely► separace fragmentů na gelu (agarosa n. polyakrylamid);
finální analýza:» dlouhé gely (aspoň ~40x40 cm); agarosa 1-1.5% w/v, 80V
přes noc
» post-staining
ISSR - gely11 1312 24 25 47 48 49
T
26 50 52 T
53 T
111
113
T
114
T12
3
124
125
131
132
159
160
164
112
KOR KAR BAL KEP SAF RYL SKA SKR
► separace fragmentů na gelu (agarosa n. polyakrylamid); finální analýza: všechny vzorky 2x
Carex, Jan Košnar1st run
ISSR - gely► separace fragmentů na gelu (agarosa n. polyakrylamid);
finální analýza: všechny vzorky 2x
11 1312 24 25 47 48 49 T
26 50 52 T
53 T
111
113
T
114
T12
3
124
125
131
132
159
160
164
112
KOR KAR BAL KEP SAF RYL SKA SKR
Carex, Jan Košnar2nd run
ISSR – fragmentační analýza► separace fragmentů v sekvenátoru → fragmentační analýza
► fluorescenčně značené primery» pozn.: optimalizace – značený a neznačený primer stejné sekvence
se může lišit v požadavcích na jednotlivé parametry PCR
► separace fragmentů kapilární elekroforézou v sekvenátoru» vzorky nemigrují v čase lineárně, proto přidáván velikostní
standard (směs fragmentů DNA o známé délce)» možnost kombinovat několik primerů značených různou barvou» v naší laboratoři až 4 barvy (6FAM, VIC, NED, PET) + 5 barva
size standard (LIZ)
ISSR – fragmentační analýza
Centaurea, J. Karásek & P. Koutecký
ISSR – srovnání s jinými metodami► jako RAPD, ale spolehlivější, méně citlivé na reakční podmínky
Výhody► není nutná znalost genomu
(univerzální metoda)► relativně málo DNA► jednoduchost a rychlost► cena► fragmenty (teoreticky)
rozmístěny po celém genomu
► velké množství (~ desítky až stovky) polymorfních fr.
Nevýhody► dominantní data► nejistá homologie a
neznámá dědičnost fragmentů
► somatické mutace (nadhodnocují diverzitu)
► do jisté míry citlivost na reakční podmínky, nepřenositelnost pro jiné studie, nutnost optimalizace primerů
Další podobné metody► DNA amplification fingerprinting (DAF)
» velmi krátké primery (5 nukleotidů)» různé teploty annealingu (vysoké i nízké)
► Arbitrarily primed PCR (AP-PCR)» delší primery (≥ 20 nukleotidů)» na začátku několik cyklů s nízkou t annealingu (mismatch), následně
cykly s vysokou t annealingu (přesná amplifikace)
► Sequence-characterised amplified regions (SCAR)» osekvenování vybraných RAPD proužků (vyříznutí, klonování)» specifické primery (≥ 20 nukleotidů) komplementární ke koncům» primery jsou specifické pro daný lokus – lze rozlišit i kodominantní
varianty» delší primery = vysoká reprodukovatelnost
Další podobné metody► random amplified microsatellite polymorphism (RAMP)
» kombinace 5‘-anchored ISSR primeru a RAPD primeru» složité PCR cykly (primery mají různé teploty annealingu –
střídání v různých cyklech)» ISSR primer značený (fluorescenčně n. radioaktivně) →
produkty amplifikované obou stran RAPD primerem nejsou vidět
► … a mnoho dalších metod využívajících jako primery:» specifické sekvence různých typů transpozonů» kombinace retrotranspozonů a mikrosatelitů» kombinace s restrikčním štěpením fragmentů
ISSR - aplikace► populační genetika (diverzita, fragmentace,…)
» ochranářská» invazní
► klonální a prostorová struktura populací
► hybridizace
► rozmnožovací systémy
► taxonomie (vymezení a podobnost taxonů,…)
► (fylogeografie)
► (mezidruhové vztahy, fylogeneze)
Populační a ochranářská genetikaCrema et al. 2009, Plant Syst. Evol. 280: 29–36
► Primula apennina, endemit► 6 populací „v řadě“, 9 primerů / 164 lokusů
► relativně velká variabilita – He,, Shanon. index(sexuál, hetorostylie, daleko létající opylovač)
► souvislost s pozicí populací (nejmíň na kraji,nejvíce v prostřední populaci)
► tři genetické skupiny (BAPS), zřetelný tok mezi populacemi► potvrzeno i Mante-
lovým testem(mírná pozitivní korelace)
www.primulaworld.com
TaxonomieJiménez et al. 2009, Folia Geobot. 44: 145-158
► Narcissus sect. Pseudonarcissi, Španělsko
► spousta „podezřelých“ endemických druhů► 6 primerů – 89 lokusů + ITS sekvence► PCoA, NJ strom, (+ parsimonie pro ITS)
► 3 výrazné skupiny v PCoA► nesoulad s morfologií► některé druhy nelze rozlišit► podpořeno také ITS► návrh revize taxonomie
(spojení některých druhů)
HybridizaceDucarme et al. 2010, Folia Geobot. 45: 387-405
► Rhinanthus minor, R. angustifolius► test 100 RAPD a 100 ISSR primerů, výběr 8
druhově specifických lokusů (4 pro každý druh) ► hybridní index: čisté druhy -4 a 4,
F1 hybrid má 0, zpětní kříženci něco mezi► 2 přírodní populace + 1 umělá
► vznik hybridů v umělé populaci► většina zpětných kříženců k Rh. angustifolius
vysvětlováno chováním opylovačů a většíautogamie u Rh. minor
► drobné meziroční fluktuace
HybridizaceLo 2010, J. Evol. Biol. 23: 2249–2261► mangrove rodu Rhizophora, 3 základní
druhy a 3 předpokládaní hybridi (morfologie, neklíčivost semen)
► 12 ISSR primerů (+ITS, cpDNA)
► privátní alely zákl. druhů; hybridi 0, ale celkově víc alel (součet rodičů)
► STRUCTURE identifikuje vždyhybrida (směs) i jeho rodiče
► NewHybrids: všechno F1 hybridi► každá lokalita svůj ISSR genotyp
→ opakovaný vznik hybridů► ITS, cpDNA: ukazuje na
obousměrnou hybridizaci
jedna z lokalit, 3 druhy + hybrid
Rozmnožovací systémyHan et al. 2009, Plant Syst. Evol. 277: 13–20
► Lotos nucifera v Číně► sběr semen (9-20) z 20 rostlin
+ dospělé rostliny, 10 populací► 5 / 12 primerů (28 / 173 lokusů)► porovnání potomstva a mateřský r.
v programu MLTR
► velká míra cizoprášení (>90%)► skoro žádný inbreeding (f ~ 0)► mírná autokorelace (podobné zdroje
pylu u blízkých mateřských rostlin)
+ obvyklá studie populací (AMOVA, Mantel test,…)
Identifikace klonůGross et al. 2012, Ann. Bot. 109: 331–342► Klonální struktura sterilních i fertilních popu-
lací Greivillea rhizomatosa (Proteaceae)► Simpsonův index, gene diversity, modely
příbuznosti jedinců► 4 ISSR primery / 120 lokusů
► velká klonální diverzita (>90%) i u sterilních populací (→ minulost)
► somatické mutace ! 10 ze 42 ramet spojených pod zemí mělojiný genotyp
► podle modelů 17-48% genotypů(v různých populacích) mohlo vzniknout somat. mutacemi
[pozor, jiný druh]
Prostorové závisloti (něco jako fylogeografie)Belluci et al. 2011, Plant Biol. 13: 381-390► Tripodion tetraphyllum (= Anthyllis
tetraphylla) v sev. Africe► sucho, včetně intenzivních pastvin► 36 lokalit Maroko-Tunisko, z každé
semena, z nich ale jen 2-3 kytky (celk. 94)► 5 ISSR primerů / 32 lokusů (+ cpSSR + 1 morfol. znak)
► zřetelně klesající variabilita od západu k východu► 2 extrémní genotypy (STRUCTURE) na okrajích gradientu západ-východ,
plynulý přechod (klinální variabilita)► relativně velké rozdíly mezi „populacemi“ (autogamie)► zřetelné autokorelace na škále <400 km► asi migrace od záp. k východu a selekce ve prospěch určitého genotypu na V
okraji gradientu
Prostorová struktura populaceMatesanz et al. 2011, J. Ecol . 99: 838-848► společná populace Thymus vulgaris (hojný)
+ Th. loscosii (endemit) na ploše 10 m2
► prostorové rozmístění jedinců v 1m2 plochách + faktory prostředí (vlhkost, půda, pokryvnost,…)
► genetická variabilita (5 ISSR primerů pro druh)
► obecně shlukovité rozmístění obou druhů a negativní vztah mezi nimi
► u Th. vulgaris žádné klony, u Th. loscosii 79 genotypů ze 100)
► korelace mezi genetickou podobností Th. loscosii a abundancí Th. vulgaris – asi selekce genotypů Th. loscosii specializova-ných na určitou míru kompetice Th. vulgaris