Microarray

Martin Erdös

Microarray

• Obecný pojem zahrnující více metod• Technologie umožňující provádět paralelně mnoho

molekulárně - biologických analýz.• Společný rys – využití čipu s navázanými „sondami“

různého charakteru (proteiny, DNA atd.), výjimka tkáňový microarray

• Array = sada, soubor, pole, též seřazení, uspořádání • Typy: - DNA microarray

– Tkáňový microarray– Proteinový microarray – např.protilátkový– Buněčný microarray

Historie

• 1975 – Southern Blot (Dr. Edward Southern)• - elektroforéza fragmentů DNA, následně přenos na nylonovou

membránu, hybridizace s radioaktivně nebo fl. Barvivem značenými sondami.

• Varianty: Northern Blot (analýza RNA), • Western Blot (analýza proteinů)• 1987 – využití při analýze exprese genů u nádorových buněk při

léčbě interferonem a bez léčby.• 1995 – miniaturizovaná forma array technologie – MICROARRAY• 1997 – sestavení celého genomu S.Cerevisiae a jeho umístění na

čip.

Southern Blot – obrázek

Komparativní genomická hybridizace- metoda detekující změny (ve smyslu

delece nebo amplifikace) v DNA u nádorových buněk

- Metoda neodhalí strukturální změny, při kterých se nemění množství DNA (translokace, inverze)

- Vzorky DNA jsou označené (fl.barvivo)

- hybridizace na metafazické chromosomy -fluorescent in situ hybridization (FISH)

- Z CGH vzniká CMA/array CGH (chromosomal microarray analysis)

DNA Microarray (DNA čip)• Využívá hybridizace vzorků neznámé DNA na DNA

sondy na čipu (rozdíl oproti CGH)• Umožňuje komplexní analýzu exprese genů• DNA Čip = Skleněná nebo silikonová destička

nesoucí na svém povrchu až tisíce vzorků DNA • Sondy = Specifické sekvence jednovláknité DNA

odpovídající jednotlivým genům nebo jejich částem kovalentně navázané na destičce

• Features = vlastnosti, jednotlivé okrsky na čipu obsahující sondy jednoho typu

• Destička je zabudována do plastové kazety, což usnadňuje manipulaci.

• využití v genetice, farmakologii, imunologii, mikrobiologii,…

• Komerční výroba – Affymetrix, Eppendorf,…

Průběh 1. – vytvoření čipu1)Výběr “sond“ – sondy získáme např. z cDNA knihovny

2)Uchycení sond na příslušná místa na destičce (vznik features – vlastností) – buď pouze přenesení na povrch čipu nebo syntéza in situ

Průběh 2. Vytvoření vzorku

• Vzorek – často mRNA• 1)izolace mRNA• 2)purifikace vzorku – např. elektroforeticky• 3)reverzní transkripce do cDNA (komplementání

vlákno DNA)• 4)amplifikace – pomocí PCR• 5)označení vláken cDNA – fluorescenční barvivo,

radioaktivní látka• 6)VÝSLEDEK = namnožená značená cDNA

Průběh 3. – Hybridizace vzorku se sondami

1)Hybridizace – navázání komplementárních sekvencí vzorku cDNA a sond na čipu- Čím podobnější sekvence, tím větší počet vodíkových můstků a silnější vazba

2)Opláchnutí čipu a odplavení nenavázaných sekvencí

VÝSLEDEK = čip obsahuje sondy s navázanými sekvencemi cDNA vzorku

Získávání a zpracování výsledků

• 1)Čip je vložen do speciální čtečky, která pomocí laseru excituje molekuly fl. barviva.

• 2)Vyzařovaná energie je zaznamenána, analyzována a výsledná informace o intenzitě a lokalizaci je uchována v počítači.

• VÝSLEDEK = zjistili jsme, které geny byly exprimovány u dané buněčné populace. Podle intenzity světla (barvy) máme představu o množství exprimovaného genu. Přesné určení množství je ovšem obtížné

Microarrayer

Dvoukanálový experiment

• Porovnáváme 2 vzorky.

• př.1 - dvě populace kvasinek – jedna rostoucí za aerobních, druhá za anaerobních podmínek – rozdílná exprese některých genů

• Př.2 – buňky napadené virem, zdravé buňky

• Značení dvěma barvivy – např. červeným a zeleným

Příklady - Genetická úprava potravin• Projekt úpravy citrusových plodů• Kalifornská univerzita Riverside ve spolupráci s firmou

Affymetrix - Vývoj GeneChip Citrus Genome Array• Stanovení genomu a asociace genů z různými

vlastnostmi – chuť, kyselost, atd.

Tkáňový microarray

• Zásadně odlišná metoda od DNA microarray. – jednotlivé okrsky na čipu obsahují vzorek tkáně.

• Urychlení analýzy tkání – možnost analýzy až 1000 vzorků v jednom mikroskopickém preparátu

• Odběr vzorků (např. nádorové tkáně) dutou jehlou ve formě válečků o průměru 0,6 mm z primárních parafinových bločků (z biopsií,…) a jejich přenos do recipientního bločku.

• Výhody – tkáň je po odebrání vzorků pro TMA použitelná na další vyšetření, nedochází k jejímu znehodnocení

• Využití zejména ve výzkumu rakoviny• Z jednoho TMA bloku je možné připravit až stovky řezů.

TMA – příprava

• 4 fáze• 1)Vybrání vhodných vzorků a

vytvoření plánu TMA ===========

• 2)Příprava recipientního bločku – probíhá za pokojové teploty, proto je nutné použít speciální parafín

• 3)Příprava TMA - tvorba dírek, do kterých se vloží vzorky tkání. Nutné vložit všechny vzorky stejně hluboko.

• 4)Rozřezání bločku a vytvoření preparátů.

Protein microarray (proteinový čip)

• Také biochip, proteinchip • Slouží k analýze proteinů

a jejich interakcí s jinými molekulami

• Jako sondy jsou využívány proteiny, protilátky, enzymy, receptorové molekuly,…

• Detekce pomocí fluorescenčních barviv

Typy proteinového microarray• Microspot ELISA• Detekce antigenu• Protilátka Imobilizovaná na podkladu• Detekce pomocí značené protilátky• Podobné klasické ELISA, ale v mikroskopických rozměrech• Protiláktový microarray – značení antigenu přímo, bez použití

protilátky.• Imunologie – stanovování autoprotilátek

Shrnutí a Závěr• Výhody: • možnost provádět velké množství analýz najednou. • Metoda je levná a rychlá

• Nevýhody:• velký objem dat, někdy sporná výpovědní hodnota.• Etické dilema

• Budoucnost: Potenciálně metoda rychlé a přesné diagnostiky chorob a odpovídající individuální léčba

Odkazy• http://www.youtube.com/watch?v=ePFE7yg7LvM • - DNA microarray - princip

• http://www.youtube.com/watch?v=VNsThMNjKhM&feature=related

• - aplikace u buněk napadených virem

• http://digiweb.ihned.cz/c1-23156255-geneticky-cip-alias-genechip

• - genetická úprava potravin

• http://www.youtube.com/watch?v=AsC3WzyNa_Y • -tkáňový microarray

Zdroje• http://digiweb.ihned.cz/c1-23156255-geneticky-cip-

alias-genechip• Klin. Biochem. Metab., 14 (35), 2006, No. 2, p. 89–

95.• Tissue Microarrays - Ronald Simon, Martina

Mirlacher, and Guido Sauter• http://www.ncbi.nlm.nih.gov/• http://www.pathologyoutlines.com • http://www.whatman.com/ProteinMicroarrays.aspx• Wikipedia (obrázková příloha)

Konec