1

W. T. Astbury – zasloužil se o to, že se zná struktura DNA (první pozoroval repetice o velikosti 3,4 Å uvnitř struktury DNA, z čehož usoudil, že báze jsou poskládány jako mince nad sebou) a jakou má funkci; položil základy molekulární biologie (poprvé použil tento pojem, nedostal Nobelovu cenu); vydal obsáhlý článek o významu analýzy biologických makromolekul pomocí roentgenova záření. Před smrtí prohlásil: „ani tak technika, jako přístup, přístup z hlediska takzvané základní vědy s vedoucí myšlenkou hledat pod makroskopickými projevy klasické biologie odpovídající molekulární plán. To se týká zejména vzniku biologických molekul a … je převážně trojrozměrná a strukturální - což neznamená, že to je pouze rafinovanou morfologií - musí se současně zkoumat vznik a funkce“ (1961) Molekulární biologie = způsob nahlížení na svět z jiné perspektivy; je to obor, který dal vzniknout jiným oborům Centrální dogma = základní pravidlo toku genetické informace, která je uložena v molekule DNA a

jako taková se v ní replikuje - projevuje se na úrovni RNA nebo na úrovni proteinů -> neexistuje, že by se

genetická informace přenášela rovnou na proteiny, ale potřebuje jako prostředníka RNA (u virů může být RNA nositelkou genetické informace)

- genetická informace může být přenesena zpětně = reverzní přepis (transkripce) z RNA do DNA

1676 Anthony van Leeuwenhoek Objev prvoků a bakterií - mikroskop pol. 18. stol. Carl Linné systém, pohlavnost u rostlin 1858 Charles Darwin

Alfred Russel Wallace Teorie přirozeného výběru

1859 Charles Darwin Publikuje “The Origin of Species” 1865 Gregor Mendel (1822 – 1884) Období pokusů s dědičností u hrachu - štěpení

vloh, elementes, objev genetických zákonitostí (1866 publikace „Versuche über Planzen-Hybriden“)

Z experimentů Gregora Mendela byly formulovány 3 základní zákony genetiky: 1. ZÁKON O JEDNOTNOSTI PRVNÍ GENERACE KŘÍŽENCŮ = Při vzájemném křížení homozygotů (F1 generace) vzniká potomstvo, které je svým genotypem i fenotypem jednotné. 2. ZÁKON O SEGREGACI ALELY A JEJICH KOMBINACI VE DRUHÉ GENERACI KŘÍŽENCŮ = Při vzájemném křížení heterozygotů (F2 generace) vzniká potomstvo, které je genotypově i fenotypově různorodé, přičemž poměrné zastoupení homozygotů i heterozygotů v tomto potomstvu (proto i dominantních a recesivních fenotypů) je pravidelné a stálé. 3. ZÁKON O VOLNÉ (NEZÁVISLÉ) KOMBINOVANOSTI ALEL RŮZNÝCH ALELOVÝCH PÁRŮ = Při vzájemném křížení heterozygotů (F3 generace) ve více genových párech vzniká genotypově i fenotypově různorodé potomstvo, v němž je pravidelné a stálé zastoupení (poměrné zastoupení) genotypů všech možných kombinací mezi rozdílnými alelami všech heterozygotních alelových párů (9 : 3 : 3 : 1). 1866 Gregor Mendel publikace „Versuche über Planzen-Hybriden“ 1869 Friedrich Miescher Izolace DNA, nuklein (později kyselina

thymonukleinová) konec 19. stol. A. Weismann Sídlem “dědičnosti” – chromosomy 1900 Carl Correns

Hugo de Vries Erich von Tschermak

Nezávislé objevení a potvrzení Mendelových zákonů

1902 C. E. McClung Zjistil existenci pohlavních chromosomů u kobylky Anasa tristis

1905 Nettie Stevens Edmund Wilson

Popsali chování pohlavních chromosomů a determinaci pohlaví kombinací XX, resp. XY

1908 Archibald Garrod Navrhl, že některé lidské choroby jsou způsobeny “vrozenými chybami metabolismu” jako výsledek ztráty určitého enzymu

1912 Max Von Laue William a Lawrence Braggovi

První roentgenové difrakční obrazce krystalů a jejich vztah k uspořádání atomů.

20. léta 20.století (1926)

Thomas Hunt Morgan a spolupracovníci

Morganovy zákony, teorie genu, vazba genu, genetika octomilky

1926 The Svedberg První analytická ultracentrifuga - určení MW

2

hemoglobinu 1927 Hermann J. Muller Paprsky X způsobují arteficiální mutace u

octomilky - indukovatelnost mutací 1928 Fred Griffith Transformace nevirulentní formy R Diplococcus

pneumoniae na virulentní S formu

Inaktivovaný S kmen + aktivovaný R kmen dali do myši -> umřela byl izolován mnohem virulentnější S kmen => objevení molekuly, která nese genetickou informaci. V té době se myslelo, že to jsou proteiny nebo polysacharidy (DNA jako nositelku genetické informace objevil až Astbury a kolektiv) 30. a 40. léta Linus Pauling Teorie o úloze kovalentní vazby, slabých interakcí

a komlementárních struktur při interakcích biologicky aktivních molekul.

1931 Harriet B. Creighton Barbara McClintock

Demonstrace “crossing-overu” cytologicky

1931 Ruska a kolektiv První elektronový mikroskop 1938 - 1941 W.T. Astbury První difrakční obrazce DNA, navržení struktury

obsahující ploché jednotky umístěné kolmo k ose helikální struktury (odhad, že báze = jednotky). Zjistil, že obsah pyrimidinů = obsah purinů (v každém organismu) a že A = T, G = C

1941 George Beadle Edward L. Tatum

Teorie jeden gen = jeden enzym (ozařování Neurospora crassa)

Geny jsou uloženy na chromosomech a jsou uspořádány lineárně. Mezi chromosomy může docházet ke specifickým zlomům a znovuspojením – rekombinace. K rekombinaci nedochází vždy, geny nejsou vždy volně kombinovatelné = vazba genů; definice vazbových skupin 1944 Oswald Avery

Colin MacLeod Maclyn McCarty

Rozřešení Griffithova experimentu – transformující molekulou je vysokomolekulární DNA

1945 Keith R. Porter Albert Claude Ernest F.Fullam

První elektronová mikrofotografie intaktní buňky – kuřecího fibroblastu

konec 40. let Barbara McClintock Teorie transposabilních elementů vysvětlující barevné variace u kukuřice

1950 Erwin Chargaff Obsah pyrimidinů v DNA = obsahu purinů 1951 Linus Pauling

Robert B. Corey Modely struktur α - šroubovice a β - listu bílkovin

1951 Rosalind Franklin Ostré difrakční obrazce DNA

3

1952 Martha Chase Alfred Hershey

Definitivní důkaz, že za přenos genetické informace je zodpovědná nukleová kyselina (fág T2)

Hershey-Chase experiment - bílkoviny – v primární struktuře (bez specialit a modifikací) neobsahují fosfor - nukleové kyseliny – v primární struktuře neobsahují síru - namnožím bakteriofága: a) na médiu s radioaktivní sírou s izotopem 35S -> označí se pouze bílkoviny b) na médiu s fosforečnany (izotop 32P) -> označí se pouze nukleové kyseliny - vezmu bakteriofága, který nevstupuje do buňky ale poutá se na ní a injikuje do ní obsah své genetické informace (zbytek, tj. proteiny zůstává na povrchu buňky) – cílem je zjistit, kde zůstala radioaktivita. Zjišťuje se centrifugací – v supernatantu zůstala radioaktivita ze síry, proteiny nevstupují do buňky, radioaktivita v buňkch pochází z fosforečnanů nukleové kyseliny bakteriofága. - z těchto buněk se vyizoluje nová generace bakteriofágů a sleduje se, jestli jsou radioaktivní – významná porce radioaktivity zůstala tam, kde značení probíhalo 32P fosforečnanem. Naopak žádná radioaktivita není tam, kde se použilo značení sírou 35S => DNA v p řípadě bakteriofágu funguje jako nositelka genetické informace. - nutnost ověření, že DNA = genetická informace -> nutnost dalších experimentů 1953 Francis Crick

James Watson Trojrozměrný model DNA – model umožnil vysvětlení, jak probíhá replikace DNA a další biologické procesy.

1957 Francis Crick George Gamov

Formulace “Centrálního dogmatu molekulární biologie”

1958 Matthew S. Meselson Frank W. Stahl

Experimentální důkaz semikonzervativní replikace DNA

1958 Arthur Kornberg Purifikace DNA polymerasy I, Escherichia coli - syntéza DNA in vitro

1960 - 1966 Marshall Nirenberg H. Gobind Khorana S. Ochoa Sydney Brenner Francis Crick a mnozí další

Rozluštění genetického kódu

4

1961 C.B. Anfinsen a E. Haber Proteiny nesou informaci o svém správném

“sbalení” ve své primární struktuře (RNasa) 1961 Francois Jacob

Jacques Monod Operónový model regulace bakteriálních genů.

1962 Arber První důkaz o existenci restrikčních enzymů 1967 Gellert Objev DNA ligasy 1970 Hamilton Smith

Kent Wilcox Izolace první restrikční endonukleasy - Hind III

1970 Howard Temin David Baltimore

Objev reverzní transkriptasy

1972 - 1973 Paul Berg Herb Boyer Annie Chang Stanley Cohen

První rekombinantní DNA molekuly, jejich klonování v E.coli

1973 Jozeph Sambrook Zdokonalení DNA elektroforézy - agarosový gel, ethidium bromid

1975 E.M. Southern Metoda pro detekci specifických fragmentů DNA 1975 George Köhler

Cesar Milstein Monoklonální protilátky

1975 - 1977 Frederick Sanger Walter Gilbert Barrell Maxam

Metody sekvenování DNA

1976 Aaron Klug Kim Rich

Detailní třírozměrná struktura tRNA

1977 Založena první komerční geneticko-inženýrská společnost – Genentech

1978 Rekombinantní DNA poprvé použita komerčně – výroba lidského somatostatinu

1978 - 1980 Suzuma Tonegawa Objasnění organizace genů pro imunoglobuliny,

5

počátek vyřešení problému rozmanitosti protilátek 1981 - 1982 Palmiter

Brinster Spradling Rubin

Transgenní myši a octomilky

1981 Objev lidských onkogenů. 1982 Výroba rekombinantního lidského inzulinu 1983 Publikována úplná sekvence bakteriofága λ - 48

502 bp 1983 Thomas Czech

Sidney Altman Objev enzymové aktivity u některých RNA molekul - ribozymy

1985 Sir A.J. Jeffreys Objev mikrosatelitů, DNA fingerprinting 1985 Karry B. Mullis Využití termostabilní DNA polymerasy pro

polymerasovou řetězovou reakci - PCR 1985 Charles Cantor Vývoj elektroforetické metody umožňující dělení

velkých molekul DNA - chromosomů 1988 Založení HUGO - “Human Genome Organization” 90. léta Mnohobuněčné organismy s deletovanými geny

(“knock out”) 1991 S.B. Prusiner

D.C. Gajdusek a další Priony - proteiny jako nový typ infekčního agens

1992 J. Craig Venter Založení TIGR - The Institute for Genome Research

1995 R.D. Fleischmann a kolektiv Úplná sekvence genomu baktérie Haemophilus influenzae – 1,83 Mbp

1997 Úplná sekvence genomu kvasinky Saccharomyces cerevisiae – 13 Mbp

1997 F.R. Blattner a kolektiv Úplná sekvence genomu baktérie E. coli – 4,6 Mbp

1999-2000 Dokončena sekvenování genomů prvních metazoí (Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, Arabidopsis thaliana)

1998 Craig C. Mello, Andrew Fire Objev RNA interference u C. elegans 2001 Human Genome Sequencing Consortium & Celera

Genomics – Zkompletování a anotace většiny lidského genomu

2001 T. Tuschl siRNA může být využita pro řízené umlčení savčích genů

2003 ENCODE Program Start programu ENCyclopedia Of DNA Elements

Jako zvláštní mezník je třeba uvést konferenci v Asilomaru (Kalifornie) v únoru 1975, kde se poprvé diskutovalo o možném nebezpečí vyplývajícím z experimentů s rekombinantní DNA. Hlavní etapy molekulární biologie souhrn: - do 40. let hlavně klasická genetika (Astbury – první difrakční obrazce DNA; Avery a kol. – vyřešení Griffithova experimentu) - 50. až počátek 70. let – základní studia struktur a regulací; mutované organismy; užití metod ostatních oborů (chemie, fyzika, biochemie...) - 70. až polovina 80. let – rekombinantní DNA, počátek 80 let – transgenní organismy, rozvoj vlastních technik; - 80. léta – expanze metodik molekulární biologie do jiných oborů; start velkých sekvenačních projektů; komercionalizace - 90. léta až počátek 21 století – mnohobuněčné organismy s deletovanými geny (“knock out”), genomika; start a dokončování velkých projektů sledujících funkci genů; genová terapie; klonování; zrychlené komerční využití poznatků Zkoumání živých systém ů na molekulární úrovni - odlišení obecného a speciálního; závislost na vhodné volbě modelu

6

Obecné vlastnosti ideálního modelu: • vhodný pro řešení námi položené otázky, tedy pro typ experimentu (výzkumu), který hodláme provádět (vzít si obecný model) • krátká generační doba • lehce kultivovatelný a množitelný • s dobrým (známým) genetickým pozadím • maximálně probádaný (nabídka experimentálních technik, mutantů, kmenů, fyzikální a genetické mapy atd.) • s možností kontroly párování • s možností využití genetického inženýrství • ve středu zájmu společnosti – tj. umožňující získání finančního prostředků Viry (*) Escherichia coli Člov ěk Kultivace často lehce kultivovatelné v

čisté kontrolované kultuře lehce kultivovatelná v čisté kontrolované kultuře

kontrola nemožná

Generační doba často velmi krátká desítky minut relativně dlouhá Životní cyklus často dobře definovatelný velmi dobře známý dobře známý Genetické pozadí často snadná příprava

cílených mutací mnoho mutantních kmenů k dispozici, relativně snadná příprava mutantů

mnoho nemocí dobře charakterizováno

Stupeň charakterizace genomu

Není problém rychle sekvenovat kterýkoliv nový druh

Je známa celá nukleotidová sekvence. Kompletní fyzikální mapa.

Většina genomu sekvenována. Dobře zmapovaný genom. Velké populační studie.

Velikost genomu malý 4,6 Mbp 3 300 Mbp Genticky modifikovatelný

ano ano nepřípustné

Kontrola k řížení sledování rekombinace – ano ano nepřípustné Šance získání financí na výzkum

někdy, zvláště u různých patogenů, velmi vysoká

postupně klesá velmi vysoká

Zvláštnosti Často kódují jen několik proteinů – možnost vytvoření dobře definovaného systému. Velká rozmanitost – výsledky často nelze jednoduše zobecnit. Možnost využití jako vektorů nebo při výzkumu některých funkcí u jejich hostitelů.

Buněčný cyklus je velmi dobře definován, stejně jako genom a mnoho proteinů a buněčných struktur. Výsledky často nelze jednoduše zobecnit pro vyšší organismy.

Mnoho výzkumu lze provádět pouze nepřímo pomocí dalších modelů nebo s využitím buněčných kultur

(*) Viry jsou velmi rozmanitá skupina. Tyto údaje lze uvažovat pouze jako časté. Rozdělení model ů Taxonomické hledisko: - nejjednodušší formou života je buňka - většina žijících organismů je jednobuněčných - buňky mohou být sdruženy do shluků vzájemně kooperujících buněk - buňky mohou být vysoce specializovány a mohou tvořit mnohobuněčné organismy - buňky mohou být dvou základních typů:

- bez jádra a membránových kompartmentů = prokaryota (Bacteria, Archaea) - dlouho chyběly modely pro zkoumání Archaea

- jaderné se složitými membránovými strukturami = eukaryota (Eukarya) - dnes už známe díky metodám spoustu genomů – z fyzikálního i chemického hlediska (aradopsis

thaliana – květina, jejíž genom byl poprvé osekvenován) velikost genom ů: (mít trochu přehled) Řasy Pyrenomas salina 6,6 x 105

7

Mykoplasmata Mycoplasma pneumoniae 1,0 x 106 Baktérie Escherichia coli 4,6 x 106 Kvasinky Saccharomyces cerevisiae 1,3 x 107 Hlenky Dictyostelium discoideum 5,4 x 107 Nematoda Caenorhabditis elegans 8,7 x 107 Hmyz Drosophila melanogaster 1,4 x 108 Ptáci Gallus domesticus 1,2 x 109 Obojživelníci Xenopus laevis 3,1 x 109 Savci Homo sapiens 3,3 x 109 - škatulkování podle velikosti genomu, dobré pro orientaci. - nejmenší bakterie okolo 106, obratlovci 109-10 bází na nukleotid v genomu Úrovn ě charakterizace modelových organizm ů – co všechno je o modelu známo, co je zkoumáno • Genom (veškerá DNA organismu) – struktura primární, sekundární a vyšší, její funkce, regulace, interakce vnitřní i s dalšími molekulami a strukturami atd. • Transkriptom (veškerá přepisovaná RNA organismu) – jako genom + úroveň exprese (diferenciální exprese)

Analýza transkriptomu nám například dovoluje najít geny, které způsobují rakovinu, nebo jsou specificky umlčeny daným nádorem – poté proti nim lze zacílit výzkum nebo terapii

Rozdíly v expresi mRNA mezi různými typy lidských nádorových buněk. Tento obrázek shrnuje velmi rozsáhlý soubor měření, při kterých byly stanoveny hladiny mRNA vybraných 1800 genů (uspořádány shora dolů) u 142 různých lidských nádorů (uspořádány zleva doprava), každý od jiného pacienta. Každý malý červený pruh ukazuje, že daný gen v daném nádoru je přepisován na úrovni, která je výrazně vyšší než je průměr ve všech buněčných linií. Každý malý zelený pruh indikuje menší než průměrnou úroveň exprese a každý černý proužek označuje hladinu exprese blízkou průměru napříč nádory.

• Proteom (proteiny organismu – produkty translace) – jako transkriptom + tvorba, modifikace a interakce se složkami metabolitomu a vytváření vnitřního prostředí v buňce, respektive organismu • Metabolom (veškeré nízkomolekulární látky – produkty metabolismu) → databáze: Human Metabolome Database: 6500 přirozených nízkomolekulárních látek, 1500

nepřirozených látek, 2000 složek potravy a potravinových přísad Nový obor – genomika, bioinformatika Rozvoj nastartován sekvenačními programy a dán spolu s rozvojem techniky sekvenování i rozvojem informatiky v i mimo obor. Budoucí biologie bude porovnávat velikost geonomů, struktur, proteomů,… - kolem roku 2002 – sekvenace genomů – nejvíce osekvenováno eubacteria, archaea a nejméně eucaryotes (kvůli velikosti a uchopitelnosti genomu) – spousta genomů je poskládáno dohromady, ale nejsou popsány - 2004 – přesně a totálně osekvenováno 134 mikrobinálních genomů (eucarya i bacteria) - 2008 -> 205 genomů

8

- sekvenování – automaticky nebo manuálně; existují databáze, kde lze najít jak je který organismus osekvenovaný (jak velký genom je “rozluštěn”) Plně osekvenované genomy: Organismus Kmen Doména Genom

(Mbp) 1 Aquifex aeolicus VF5 Bacteria 1,50 2 Bacillus subtilis 168 Bacteria 4,20 (4100) 3 Borrelia burgdorferi B31 Bacteria 1,44 4 Buchnera sp. APS Bacteria 0.64 5 Campylobacter jejuni NCTC 11168 Bacteria 1.70 6 Deinococcus radiodurans R1 Bacteria 3.20 7 Escherichia coli K-12 Bacteria 4,60 (4288/1800) 8 Haemophilus influenzae KW20 Bacteria 1,83 (1743) 9 Helicobacter pylori 26695 Bacteria 1,66

10 Helicobacter pylori J99 Bacteria 1,64 11 Chlamydia pneumoniae CWL029 Bacteria 1,23 12 Chlamydia pneumoniae AR39 Bacteria 1,23 13 Chlamydia pneumoniae J138 Bacteria 1,23 14 Chlamydia muridarum Bacteria 1,07 15 Chlamydia trachomatis serovar D(D/UW-3/Cx) Bacteria 1,05 16 Mycobacterium tuberculosis H37Rv Bacteria 4,40 17 Mycoplasma genitalium G-37 Bacteria 0,58 (470) 18 Mycoplasma pneumoniae M129 Bacteria 0,81 19 Neisseria meningitis MC58 Bacteria 2,27 20 Neisseria meningitis Z2491 Bacteria 2,18 21 Pseudomonas aeruginosa Bacteria 6,26 22 Rickettsia prowazekii Madrid E Bacteria 1,10 (834) 23 Synechocystis sp. PCC 6803 Bacteria 3,57 24 Thermotoga maritima MSB8 Bacteria 1,80 25 Treponema pallidum Nichols Bacteria 1,14 26 Ureaplasma urealyticum Bacteria 0,75 27 Vibrio cholerae Bacteria 4,03 28 Xylella fastidiosa Bacteria 2,68 29 Aeropyrum pernix K1 Archaea 1,67 30 Archaeglobus fulgidus DSM4304 Archaea 2,18 31 Methanobacterium

thermoautotrophicum delta H Archaea 1,75

32 Methanococcus jannaschii DSM 2661 Archaea 1,66 (1738) 33 Pyrococcus abyssi GE5 Archaea 1.8 34 Pyrococcus horikoshii OT3 Archaea 1,80 35 Caenorhabditis elegans Eukarya 87,56 (6 ch, 19100) 36 Saccharomyces cerevisiae S288C Eukarya 13,00 (16 ch, 6034/3600) 37 Drosophila melanogaster Eukarya 137,00 (5 ch, 12000/3100) 38 Arabidopsis thaliana Eukarya 70,00 (5 ch.25000)

Tvorba databází a program ů na práci s databázemi a pro anotaci sekvencí - studium genom ů • Homolog od řeckého homos = stejný, rovný • u mikrobiálních genů cca 70 % homologie, mezi kvasinkou a člověkem cca 40 % mezi C. elegans člověkem až > 60 % homologních genů ⇒ boom evoluční molekulární biologie, srovnávacích studií a databází (COGs – Clusters of Orthologous Groups; nyní > 4873 shluků o > 138000 proteinech ze 66 druhů – 75 % pokrytí ze 185 tisíc předpovězených proteinů; KOGs 4852 shluků – 7 eukaryontních genomů, 54 % ze 110 tisíc předpovězených proteinů)

Pojem homolog (struktura, sekvence) podle Fitche a dalších št ěpí na funk ční pojmy:

9

• ortholog (homolog u dvou organismů odvozený od společné vlastnosti atd. u společného předka – odraz evoluce, mohou mít stejnou funkci)

• paralog (homolog odvozený genovou duplikací – myoglobin, α-hemoglobin, β-hemoglobin) • xenolog (homolog získaný horizontálním přenosem – řada genů pro rezistenci k antibiotikům, ATPasy vakuolárního / archealniho typu u Gram+ bakterií, archealní lysyl-tRNA synthetasa u Borrellia burgdorferi) • synolog (homolog v jednom organismu získaný po fúzi dvou nepříbuzných organismů – mitochondrie, chloroplasty v eukaryontní buňce) X, Y, Z jsou paralogy – vznikly z jednoho předka, speciací vznikly druhy A, B, C. V jednotlivých druzích se můžeme podívat, co se dělo s geny X, Y, Z. Geny XA, XB, XC jsou si navzájem morfology a každý z těchto genů je paralogem genů větví 2 a 3 - ortholog a paralog => určitá cesta v evoluci - genovou duplikací se gen uvolnil i pro jinou funkci např: ZA1, ZA2, ZA3 - předpokládá se, že funkce paralogu bude podobná, ale jiná (lidský hemoglobin a myoglobin jsou si navzájem paralogy, lidský myoglobin a kuřecí myoglobin jsou si

navzájem orthology)

Rodina homologních genů (hemoglobin – Hb, myoglobin, globin) � tím, že si můžeme geny takto rozškatulkovat, tak nám to umožňuje predikovat jakou funkci může

mít zatím třeba neznámý protein � Také nám to umožňuje přemýšlet o evoluci genomů Na základě těchto skupin si můžeme geny rozdělovat do dalších skupin:

10

Rodiny evolučně příbuzných genů v genomu Bacillus subtilis - na tomto grafu je možné vidět, jak mohlo k rozrůznění docházet, jak reálně to v tomto

organismu vypadá (polovina nepatří do žádné rodiny – nedošlo během evoluce k duplikaci, ale pokud došlo, tak došlo ke ztrátě, na druhou stranu druhá polovina je součástí rodin – až o 77 členech, strukturně i funkčně podobných genů – např. transportéry)

Řazení událostí dle relativního významu v evoluci ge nu / proteinu: - mutace – především záměny bází, nukleotidů – možné záměny AK - speciace – rozrůznění na úrovni druhů, které následně vede k rychlejšímu získávaní a udržení

specifických mutací - genová duplikace – jak celého genu, nebo jen části, ztráta genu, ztráta časti genu - horizontální přenos genu – častá událost v prokaryotech, bakterie jsou schopné posbírat genovou

informaci kolem sebe a využít ji (různé rezistence vůči antibiotikům a chemoterapeutikům) - fúze genů a další přestavby � při porovnávání různých, ale konzervovaných částí buněk, ve velkém souboru zástupců,

s nukleovými kyselinami, nebo i s funkčními NK – rRNA,… → evoluční stromy dopadnou většinou přibližně stejně, ale s různými výjimkami – dochází v místech funkčních nik k neorthologním výměnám – funkce jednoho proteinu je nahrazena jiným proteinem → kontinuita od posledního dávného předka není nepřerušovaná jednotlivými současnými druhy

Klastry skupin – vznikají tak, že si vezmeme celý genom, v něm nějaký gen a porovnáváme strukturu genu se všemi geny v genomu – vyhledáme nejpodobnější a ostatní zahodíme (= ortholog i ve významu strukturním) (COGs – Clusters of Orthologous Groups; nyní > 4873 shluků o > 138000 proteinech ze 66 druhů – 75 % pokrytí ze 185 tisíc předpovězených proteinů; KOGs 4852 shluků – 7 eukaryontních genomů, 54 % ze 110 tisíc předpovězených proteinů)

- pro prokaryota bylo použito 66 genomů, následně byla udělaná analýza u eukaryotního genomu – požito 7 genomů → na základě podobnosti se anotuje další genom → automaticky obrovské množství chyb – některé anotace musejí být udělány ručně použitím starých katalogů

→ databáze: NCBI, Stanford Genomic Resources, SWISSPROT, PDB, → centrální dogma – vzniká RNA – kopie u prokaryot více méně stejná, ale u eukaryot jsou jednotlivé geny ukončeny introny – RNA je určitým obrazem částí, které se pospojují dohromady → různé sekvence na DNA a RNA mohou dát stejnou sekvenci bílkoviny – sekvence pořadí AMK je udržována v rámci evoluce mnohem přísněji než sekvence NK, genomu – může jít více cestami → řada protein ů se skládá ze strukturních domén – může existovat i duplikace jednotlivých domén, stejně jak to bylo u genů, všechny proteiny (když se na ně podíváme strukturně) zapadají do tří skupin – alfa helixy, beta skládané listy, obě tyto struktury

11

- existuje 1400 domén (strukturních) - bakterie – více než 70 % bílkovin má více než jednu doménu - eukaryota – více než 90 % (člověk 98 %)

o každá doména má duplikovanou doménu, nebo doménu jiného typu

� Živý svět začínal u společného předka a vyvíjel se na základě kombinatoriky, využití relativně omezeného počtu prvků,které se násobily a rozrůzňovaly

� Z 1400 domén, pouze 200 domén tvoří polovinu všech domén ve všech známých organismech

Zkoumání živých systém ů na molekulární úrovni – odlišení obecného a speciálního Úrovn ě charakterizace modelových organizm ů – přechod od strukturní charakterizace genomů k funkční analýze - srovnávací genomika - studium reorganizace genomů v průběhu evoluce – „synteny“ Vývoj vysoce pr ůchodných metod pro zkoumání: Genomu, Transkriptomu, Proteomu a Metabolitomu Jaký je minimální po čet genů nezbytný pro život? - cca 250 genů odhadnuto jako minimální počet genů nutných pro život za optimálních podmínek – všechny výživové faktory + žádný stress (funkční hledání esenciálních genů u Bacillus subtilis, Mycoplasma genitalium, M. pneumoniae, Haemophilus influenzae + porovnání a analýza sekvencí.) - pouze asi 80 genů jsou orthology u všech forem života! Zbytek nahrazen neorthologní výměnou a adaptací jiných proteinů k dané funkci - vzhledem k časté neorthologní výměně – lépe idea minimálního počtu funkcí (odhad cca 50 orthologů – translační faktory, aminoacyl-tRNA-synthetasy, RNA polymerasy) a lépe vzhledem k určitým podmínkám (nika) Organismy s nejmenším genomem: - Sulcia muelleri s genomem 245 kb potřebuje ještě jeden organismus – kódují si funkce navzájem – spolupráce - Carsonnella – veliký jako vir, má 152 genů = míň genů, než je umožněný k životu – nemá kompletní sadu transferových DNA … vypadá jako endosymbiont

typ organismu funk ční třída voln ě žijící autotrofní chemoautotrofní termofilní

12

translace, biogenese ribosom ů 57 64 68 62 transkripce 4 9 11 6 replikace, rekombinace, opravy 9 14 18 14 metabolismus 62 152 171 89 bun ěčné procesy: chaperony, sekrece, dělení bun ěk, biogenese bun ěčné stěny

17 48 50 30

různé 13 46 74 44 celkem 158 320 379 237

Osekvenovaný lidský genom – publikováno v Science a Nature v únoru 2001

Co to reáln ě znamená? • Soustředěné úsilí > 2500 vědců z > 20 výzkumných center • U eukaryontních organismů je komplikované, ne-li nemožné, v dnešní době klonovat a sekvenovat

všechny části genomu. Octomilka – cca 1/3 genomu není osekvenována. Ovšem je přečteno cca 97 % euchromatinu.

organismus rok milióny

osekvenovaných bází

celkové pokrytí

[%]

pokrytí euchromatinu

[%]

předpov ězený počet genů

počet genů na milión

bází S. cerevisiae 1996 12 93 100 5800 483 C. elegans 1998 97 99 100 19099 197 D. melanogaster

2000 116 64 97 13601 117

A. thaliana 2000 115 92 100 25498 221 člověk HGC 2001 2693 84 90 31780 12 člověk Celera 2001 2654 83 88-93 39114 15 • Člověk = 2 851 330 913 párů bazí, 22 287 strukturních genů, geny nově „zrozené“ duplikací a nově

umlčené, sekvenováno téměř 99 % euchromatinu, přesnost < 1 chybná báze na 105 b, neosekvenované části < 150 kbp (150 000 bp!), 341 přerušení

• + cca 740 genů pro různé RNA • Zpřesnění odhadu počtu genů = po srovnávací analýze dalších genomů obratlovců (ryba, pes,

šimpanz, klokan)

Co dál? Co to p řineslo? • pouze 94 z 1278 proteinových rodin je specifických pro obratlovce (rozdíly především v genech pro

neuronální komplexitu, srážení krve, imunitní odpověď, intra a interbuněčný přenos signálů, ontogenese, programovaná buněčná smrt, kontrola transkripce)

• největší rozdíl je v komplexitě proteinových domén • cca 60 % genů má alternativní sestřih – tvorba více variant • 10 až 100 genů přenesených horizontálně z bakterií v průběhu evoluce • 1,42 miliónu SNP (single nucleotide polymorphism) (ABO) – odhad 8 SNP na 104 b (X chromosom

– 4,69, Y – 1,51 SNP / 10000 b), objevy nových geneticky podmíněných (dědičných) chorob (nárůst z 269 na 923), etické hledisko (APOE, CCR5)

• celková mutační rychlost u mužů je cca 2x vyšší než u žen • analýza DNA a mitochondriálního chromosómu má využití ve společenských vědách – Y se dědí

po paternální linii a mitochondriální DNA po maternální – můžeme sledovat příbuzenské vztahy po obou liniích (archeologie, antropologie, etnografie)

13

Společný předek Adam a dělení jednotlivých haploskupin

Srovnání barev se světem � přestože toho začínáme vědět o genomech hodně, je to stále málo, abychom mohli sestavit

genom podle svého gusta, láká to k vytvoření plně syntetických genomů a jejich výměně v buňce � pracuje se na vytvoření organismu, který bude mít jiný genetický kód než je universální genetický

kód – přechod z RNA do proteinů by byl jiný → za určitých podmínek by mohly vznikat bílkoviny z jiných AMK

� charakterizací genomu lze dojít ke stromu, který ukáže příbuznost jednotlivých vakcín např. proti tuberkulóze – do 1960 se u všech vakcín prováděly mutace → studium genomů nám umožní zjistit patogenní determinanty např. mykobakterií

Metagenomika: � izolujeme veškerou DNA ve vzorku a rozdělíme na malé kousky, které přímo charakterizujeme

nebo je vložíme do “ochočených” bakterií � podle jejich chování a analýzou objevíme jejich funkci - pro některé konkrétní příklady se nemusí izolovat zkoumaný organismus, jeho genom, stačí vědět,

jak se chová → chci-li vědět, jak probíhá metabolismus dusíku, nebo koloběh uhlíku v oceánech nebo v půdě, kromě všech příslušných měření, bez izolace jednotlivých komponentů, organismů, se může vyřknout hypotéza, které známé geny, proteiny, enzymy se toho můžou účastnit – známých sekvencí je plno

14

� řada mikroorganismů žije ve společenství, které je navzájem propojené a nelze je bez těchto společenství kultivovat

Příklady „služeb“ poskytovaných mikroorganismy. Po směru hodinových ručiček odshora: - mikroorganizmy v moři odstraňují oxid uhličitý z atmosféry a produkují kyslík - ozonová vrstva ve stratosféře, která chrání Zemi před škodlivým ultrafialovým zářením, byla vytvořena reakcemi molekul kyslíku produkovaných mikroby na počátku Země - lidské tělo obsahuje více bakteriálních než lidských buněk a většina z nich žije v trávicím traktu - některé bakterie přeměňují plynný dusík na amoniak ve speciálních strukturách na kořenech luštěnin - půdní bakterie jsou zdrojem většiny antibiotik a mnoha jiných léků používaných dnes v medicíně - mikroorganismy zajišťují kvasné procesy v potravinářství - střed: mikroorganismy jsou mnoha tvarů a velikostí

A) B)

(A) Levá deska neobsahuje antibiotika, pravá deska obsahuje b-laktamové antibiotikum. Klon 'C' nese gen pro rezistenci E. coli k b-laktamovým antibiotikům. (B) Klon vlevo neobsahuje heterologní DNA. Další čtyři klony nesou fragmenty DNA metagenomicky z půdy, které předávají E. coli schopnost produkovat pigmenty.

- taxosomální hledisko – hledáme všechny ribosomální RNA - některé typy Archae se nikdy neizolovaly, podle RNA z horkých pramenů - můžeme konkrétně hledat geny, které něco kódují Hlavní komponenty bu ňky:

15

- buňka je složena z poměrně limitovaného množství prvků – cca 99 % hmotnosti tvoří 12C, 1H, 14N, 16O

- nejčastější molekulou je H2O: • polární charakter

• schopnost tvořit vodíkové vazby („flickering clusters“)

• vysoké povrchové napětí

• vliv na polární (obklopuje a rozpouští je) a nepolární molekuly (nutí je ke shlukování a uspořádávání do vyšších celků – „clathrates“)

16

Molekuly, které jsou nepolární a nemohou tvořit vodíkové můstky (jako uhlovodíky) mají pouze omezenou rozpustnost ve vodě a nazývají se „hydrofobní“. Ve vodě se kolem nich vytváří pravidelné klece. Tyto ledu podobné klece nazývané „klathrátové struktury“ jsou relativně mnohem pravidelnější než voda a snižují entropii směsi. Na obrázku část klathrátové klece (červeně) obklopuje uhlovodík (černě). V intaktní kleci každý atom kyslíku (červené kolečko) může být čtyřstěnně koordinován ke čtyřem dalším.

- zjednodušeně řečeno, buňka je složena ze čtyř základních organických molekul: cukry, mastné kyseliny, aminokyseliny, nukleotidy

- tyto dále tvoří polymery a jiné složitější molekuly a struktury vyššího řádu -> vysoká variabilita

Například:

Ze dvou glukosových podjednotek je možné vytvořit 11 různých disacharidů.

17

Z 20 základních aminokyselin je možné vytvořit 204 =160000 tetrapeptidů. Pro běžný protein o délce 300 aminokyselin tedy platí 20n = 20300 = 10390 variant. Molekuly reálně zastoupené – pouhý zlomek z obrovského počtu možných.

Přibližné složení bakteriální bu ňky (Escherichia coli ) o průměrné hmotnosti 9,5 x 10 -13g

procento celkové

hmotnosti bu ňky

přibližný po čet jednotlivých druh ů molekul

voda 70 1

anorganické ionty 1 20

cukry a jejich prekursory 1 250

aminokyseliny a prekursory 0,4 100

nukleotidy a prekursory 0,4 100

mastné kyseliny a prekursory 1 50

další malé molekuly 0,2 300

makromolekuly (bílkoviny, nukleové kyseliny, polysacharidy)

26 3000

18

Jednotlivé typy makromolekul v procentech celkové suché hmotnosti bu ňky (2,8 x 10 -13g)

proteiny 55

DNA 3,1

ribosomální RNA 16,7

tRNA 3

mRNA 0,8

lipidy 9,1

lipopolysacharidy 3,4

peptidoglykan 2,5

Biopolymery, jejich části, domény atd. jsou dále modifikovány, interagují intra- a

intermolekulárně a tvoří vyšší organizované struktury. Na tvorbě polymerů se účastní především kovalentní vazby a pak slabé interakce. Na jejich funkci a vnitřní dynamice se účastní především slabé interakce.

Život je založen na stabilitě kovalentních vazeb (15 – 170 kcal/mol) za fyziologických podmínek (průměrná tepelná energie molekul při +25 °C = 0,6 kcal/mol) a zárove ň na možnosti jejich „snadného štěpení a přeskupování“ kontrolovanou cestou; např. enzymovou katalýzou.

Typ vazby síla vazby (kcal/mol)

kovalentní 15 – 170

iontová 3 – 7

vodíková 1 – 7

van der Waals 0,5 – 1

hydrofobní interakce 0,5 – 3

Ve vakuu je síla iontových a vodíkových vazeb mnohonásobně vyšší (např. pro iontové vazby cca 80 kcal/mol).

STRUKTURA NUKLEOVÝCH KYSELIN

19

Struktura nukleových kyselin Z hlediska primární struktury jde o nevětvené lineární molekuly složené z nukleotidů, přičemž nukleotid sestává z: - organické báze - cukru β-D-pentofuranosy - zbytku kyseliny trihydrogenfosforečné Základní báze v deoxyribonukleové kyselině (DNA) jsou: - puriny – adenin (A) a guanin (G) - pyrimidiny – cytosin (C) a thymin (T) V ribonukleové kyselině (RNA) je pak místo thyminu uracil (U). Slovem základní se myslí, že to jsou báze vyskytující se buďto v DNA nebo v RNA. Kromě výše uvedených bází se zvláště v RNA objevuje řada jejich derivátů.

Další součástí ribonukleových kyselin je ββββ-D-ribóza (β-D-furanóza; na uhlíku 2‘ a 3‘ je hydroxylové skupina ). Její odvozeninou je deoxyribóza , která má na uhlíku 2‘ místo hydroxylové skupiny vázaný pouze vodík. A to je jediný rozdíl mezi ribonukleovou a deoxyribonukleovou kyselinou!!! Všechny ostatní rozdíly jsou minoritní (například rozdíly v bázích). Primární struktura nukleových kyselin je tvořena páteří (deoxy)ribózových jednotek pospojovaných 3’-5’ fosfodiesterovými vazbami. Na C1’ atomy (deoxy)ribózy jsou N-glykosidickou vazbou připojeny jednotlivé báze. Báze v jednotlivých polynukleotidech se mohou navzájem spojovat vodíkovými vazbami a tvořit tak strukturu o dvou lineárních řetězcích. Párování je možné v rámci jednoho řetězce nebo dvou nezávislých řetězců. Názvosloví: báze + ribóza (deoxyribóza) = nukleosid (adenosin, guanosin, thymidin, cytidin a uridin) báze + ribóza (deoxyribóza) + zbytek kyseliny trihydrogenfosforečné = nukleotid (cytidin-3‘-monofosfát, cytidin difosfát, deoxycytidin trifosfát apod.)

Pokud mluvíme o fosfátech, tak můžeme jednotlivé nukleosidy ve fosfátech popisovat též takto: v případě monofosfátů jako např. AMP, GMP…; v případě difosfátů jako ADP, GDP… a v případě trifosfátů jako ATP, GTP... Podle toho, jestli mluvíme o prekursorech či složce ribonukleové kyseliny; nebo zda mluvíme o prekursorech či složce deoxyribonukleové kyseliny, je značíme AMP/dAMP, ADP/dADP, ATP/dATP. Jednotlivé nukleotidy jsou v nukleových kyselinách nějakým způsobem pospojovány. Pokud zapisujeme sekvenci nukleových kyselin pomocí písmenek (například AGUC), tak ten zápis bude chápán ve sm ěru od 5’fosfát ke 3’OH. Prekurzorem syntézy nukleových kyselin (RNA i DNA) jsou 5’trifosfáty. Jednotlivé nukleotidy jsou pospojovány fosfodiesterovými vazbami. Řetězec má určitý směr, který bereme opět od 5‘fosfátu ke 3’OH skupin ě. Z obrázku je na první pohled patrné, že se jedná o RNA. A jediným důvodem pro to, abychom to mohli tvrdit, je ten, že na uhlíku 2‘ je OH skupina! Koncentrace purin ů se rovná koncentraci pyrimidin ů (Chargaffovo pravidlo), a platí to pro veškerou DNA všech organismů. Konc. (A) = konc.

(T); konc. (G) = konc. (C). Watson s Crickem navrhli, že dva řetězce nukleových kyselin spolu interagují na základ ě komplementárního párování pomocí vodíkových m ůstků, a to tak, že spolu párují adenin s thyminem a guanin s cytosinem . Vždy páruje purin s pyrimidinem. Při Watson-Crickovském párování adeninu s thyminem , je to párování tvořeno dvěma vodíkovými

20

vazbami . Při Watson-Crickovském párování guaninu s cytosinem , je to párování tvořeno třemi vodíkovými vazbami . Watson-Crickovské párování poskytuje jistou symetrii, která znamená, že ty dva typy párů bází, mají v podstatě přibližně stejně daleko od sebe ty C1‘ uhlíky (ty N-glykosidické vazby). N-glykosidická vazba je vazba mezi dusíkem báze a C 1‘ uhlíkem ribózy. Je popisovaná

torzními úhly χ zahrnujícími atomy O4’-C1’-N1-C2 u pyrimidinů a O4’-C1’-N9-C4 u purinů.

Vzdálenost jednotlivých C1‘ vazeb je přibližně stejná jak u párování A s T, tak u párování G s C. Symetrie má vliv na to, jak bude vypadat další uspořádání. Asymetrické (reverzní) Watson-Crickovské párování vede k tomu, že vzdálenosti N-glykosidických vazeb jsou v případě párování A s T a G s C různé. Jedinou možností symetrie tedy je, že ty dva řetězce budou antiparalelní. Takovéto šroubovice se ve fyziologických podmínkách u normálních sekvencí vyskytují jako šroubovice pravoto čivé . Protože páry

bází neprocházejí přesně středem podélné osy dvoušroubovice a protože N-glykosidické vazby jsou u jedné strany páru bází, není dvoušroubovice na příčném řezu vzhledem k podélné ose zcela pravidelná a obsahuje dva žlábky: velký a malý žlábek . Definice malého a velkého žlábku je daná tím, jaké skupiny se vyskytují na které straně šroubovice. Rozdělení velkého a malého žlábku je dáno N-glykosidickou vazbou. U malého žlábku je to oblast od uhlíku C4 u purinů po N1 u pyrimidinů a zahrnuje O2 pyrimidinovou a N3

purinovou stranu páru bází. U velkého žlábku je to oblast od N9 u purinů po N1 u pyrimidinů. Vzdálenost mezi páry bází je dána hydrofobními, elektrostatickými interakcemi a Van der Waalsovskými interakcemi. U B konformace DNA je vzdálenost p řibližn ě 3,4 Å (což je Van der Waalsovský poloměr jednotlivých bází).

Možnosti párování; modifikace nukleotid ů Možnosti párování jsou různé a vyskytují se i v biologických systémech. Pokud smícháme 4 základní nukleosidy, tak můžeme volně v roztoku dostat 28 různých typů párování. Podobná párování můžeme dostat i u jiných struktur nukleových kyselin (např. u tRNA při tvorbě nějakých jiných vyšších struktur). Nukleové kyseliny mohou být i jedno řetězcové. Zpravidla nemají tvar natažené tyčky, ale tvoří klubko, v němž určité části párují Watson-Crickovsky a jiné části Watson-Crickovsky nepárují. Častým typem párování je i Hoogsteenovo párování , kdy adenin páruje s uracilem jiným zp ůsobem než u symetrického Watson-Crickovského párování. Do vodíkových vazeb vstupuje C6 a N7. Řetězce jsou paralelní. Existují i jiné typy Watson-Crickovského párování, kde může spolu párovat i purin s purinem.

21

22

Strukturní rozdíly v sekundárních strukturách nukleových kyselin jsou dále způsobeny například modifikacemi bází, alternativním párováním bází, konformační flexibilitou ribózy a N-glykosidické vazby, vzájemným natočením resp. interakcí sousedních párů bází, různým natočením bází uvnitř jednoho páru, koncentrací a druhem přítomných solí, hydratací molekuly, interakcí s některými malými molekulami či s proteiny, vznikem dalších vodíkových vazeb uvnitř molekuly atd. Nejčastěji se vyskytující modifikace nukleotidů, které se vyskytují v nukleových kyselinách, můžeme najít především v tRNA. Ze 75 bází může tRNA obsahovat až 20% modifikovaných nukleotidů. Některé z modifikovaných bází, jako jsou pseudouridin a dihydrouridin , se vyskytují téměř ve všech tRNA. DNA je též modifikovaná. Rozdíl mezi uracilem a thyminem je, že thymin je 5-methyluracil. Jak v bakteriální DNA, tak v eukaryotní DNA můžeme najít modifikace. Nejčastěji to jsou methylace. Obvykle je to methylace cytosinu (5-methylcytosin hraje důležitou roli v epigenetických procesech). Rotace vazeb Třírozm ěrná struktura molekuly je dána délkou vazeb, vazebn ými úhly a rotací skupin atom ů okolo vazeb. Tyto rotace jsou popisovány torzními úhly Θ nebo dihedrálními úhly Φ. Většinou jsou preferovány jen některé torzní úhly v rámci určitých rozsahů torzních úhlů. Heterocykly jsou planární (nejsou flexibilní). U ribózy je určitá flexibilita; ribóza může nabývat různých konformačních forem. Největší flexibilita je kolem fosfoesterových vazeb. Jednotlivé báze volně rotují právě kolem těchto vazeb. Vazby lze popisovat torzními nebo dihedrálními úhly . Důležitý je torzní úhel N-glykosidické vazby, který je důležitý pro rozdělení konformačních rodin u 3D struktury DNA. Úhel je vždy popisován vazbou, která tvo ří průnik dvou rovin (puriny: jednu rovinu tvoří N-glykosidická vazba s kyslíkem O4‘ ribózy, a druhou rovinu tvoří N-glykosidická vazba s C4 uhlíkem purinu; pyrimidiny: jednu rovinu tvoří N-glykosidická vazba s kyslíkem O4‘ ribózy, a druhou rovinu tvoří N-glykosidická vazba s C2 uhlíkem pyrimidinu). Nomenklatura: ~ 0° = syn = cis ~ 180° = anti = trans ~ +/- 60° = synclinal = +/- gauche ~ +/- 120° = anticlinal Rotace vzdálenější vazby po směru hodinových ručiček = (+).

23

Pokud se díváme skrz N-glykosidickou vazbu, směrem od C1’ uhlíku na N9 dusík purinu, podél průsečíku těch dvou rovin, tak se nám obě roviny téměř spojí, a to se pak označuje jako syn . Pokud je N-glykosidická vazba v anti konformaci, tak ta ribóza má na jedné straně k dispozici volné uhlíky C2‘ a C3‘ a na druhé straně jsou k dispozici skupiny, které se účastní tvorby vodíkových vazeb. Zatímco v případě syn je báze stočená směrem k C5‘, a v některých konkrétních případech jako u G může být vazba fixována dalším vodíkovým můstkem. Obecn ě v roztocích (ve fyziologickém prostředí) mají základní nukleosidy a odpovídající nukleotidy tendenci se vyskytovat v anti konforamci N-glykosidické vazby. Avšak guanosin má i

v roztoku tendenci být alespo ň z 15 % v konformaci syn N-glykosidické vazby. Tendence může být dále posílena nějakým substituentem na C6 pyrimidinů a C8 purinů (bromace na C8 uhlíku – 8-bromoguanosin má ještě větší tendenci se stáčet do syn konformace) nebo volnou O5’H skupinou (tvorba H-vazeb s N3 purinů a O2’ pyrimidinů). Rotace okolo glykosidické vazby • χ u nukleosidů = především anti u pyrimidinů; u purinů je syn a anti rovnocenně zastoupeno • χ u 5’-nukleotidů a polynukleotidů = především anti • guaninové nukleosidy a nukleotidy preferují syn konformaci a to i v krátkých polymerech, např.

alternujících G a C (CpGpCpGp tetra- a hexaoligonukleotidy) Rotace okolo C4’-C5’ vazby: Popis zahrnuje buď úhel O5’-C5’-C4’-O4’ nebo O5’-C5’-C4’-C3’. • v nukleosidech obvykle + sc, někdy i - sc a ap • v 5’-nukleotidech dominantní + sc Rotace okolo esterových vazeb: • vazba C-O je ve srovnání s vazbou P-O velmi rigidní. P-O tak tvoří hlavní čep kostry polynukleotidu Vzájemné pohyby bází ve dvoušroubovici: • vrtulovité zkroucení • rolování • ohyb • nachýlení Konformace ribózy Pětičetný furanózový cyklus není komplanární a může nabývat dvou forem – obálkové (“envelope”) nebo židličkové (“twist”) (resp. nějaké její přechody). Na jedné straně ribózy máme N-glykosidickou vazbu a C5‘ uhlík a potom relativně rigidní vazby s O4‘ kyslíkem. Představíme-li si to jako systém souřadnic, tak se můžeme dívat, jestli je uhlík C3‘ nebo C2‘ spíše nad touto rovinou (C1‘ O4‘ C4‘) nebo spíše pod touto rovinou. Pokud je nad rovinou, pak se uspořádání nazývá C3‘-endo nebo C2‘-endo , a naopak C3‘-exo a C2‘-exo . Velké množství variant se snižuje s počtem substituentů. Konformace ribózy hraje roli při konformacích nukleových kyselin. Když je v DNA konformace ribózy C2‘-endo , umožňuje to natažení celé šroubovice a snadnější uspořádání bází. Co se týče RNA, tak tam dochází k odpuzování C2‘ OH skupiny a C3‘ fosfátu. Celý tento C3‘,C5’-

24

fosfátdinukleotid je pak tlačen do C3‘-endo konformace; to vede k tomu, že helix je stlačen k sobě, což má za následek mírné elektrostatické a Van der Waalsovské odpuzování na úrovni bází. To má za následek roztažení helixu, vedoucí ke změně celé konformace a vzniku konformace rodiny A . Stav s nejnižší energií v nukleosidech a nukleotidech je C2’-endo a C3’-endo. Přechod z jedné do druhé přes O4’-endo. Typ konformace je ovlivněn hydratací molekuly (hl. DNA), modifikací báze atd. C3’-endo : • tím pravděpodobnější, čím elektronegativnější substituent na C2’; především tedy u RNA, vliv

možné vodíkové vazby mezi O2’-H jako donorem a O4’ či P-O sousední báze jako akceptory • především u anti konformace C2’-endo : • rovnocenně u syn i anti konformace Interakce pár ů bází Další významnou roli v konformaci nukleových kyselin hrají interakce jednotlivých párů bází. Báze jsou planární molekuly a to včetně aminoskupiny, ale jednotlivé báze nemusí být uspo řádány planárn ě. Mohou být různě nakloněny, mohou rotovat či tam může být nějaké vrtulovité zkroucení. Tyto interakce určují výsledný vzhled nukleových kyselin. Ve dvoušroubovici spolu interagují jednotlivé báze nad sebou, a jednotlivé páry bází nad sebou. Jednotlivé páry bází spolu interagují hydrofobními a elektrostatickými interakcemi. AT bohaté oblasti (kde nám v DNA páruje adenin s thyminem) jsou mén ě stabilní například při vyšší teplotě, než oblasti GC bohaté. Jedním z důvodů je, že GC páry mají t ři vodíkové m ůstky , které jsou stabilnější než dva vodíkové m ůstky obsažené v AT párech. Realita je taková, že na příspěvku pro interakci těch dvou řetězců, které tvoří dvoušroubovici, se účastní celá řada dalších sil. Interakce je možná i díky specifičnosti a stabilitě dvoušroubovice. Specifičnost je dána párováním a stabilita je dána nejen párováním, ale i silami hydrofobními a elektrostatickými, které se účastní vrstvení bází. Vložíme-li samotné nukleosidy do roztoku, tak ony se sami o sobě začnou na sebe vrstvit. To platí i pro báze. Interakce je závislá i na pozici pár ů bází v té dané sekvenci. Síly uplatňující se při asociaci (interakci) bází v roztoku: • vodíkové vazby (především v nepolárním rozpouštědle) • vrstvení (“stacking”) (především v polárním rozpouštědle) Oba druhy interakcí jsou významné i při uspořádávání DNA do sekundárních a vyšších struktur. Vrstvení je způsobeno planárním tvarem bází a jejich hydrofóbními a van der Waalsovskými interakcemi. • Van der Waalsův poloměr bází je cca 3,4 A. • Stabilita sousedních párů bází klesá v pořadí purin-purin > pyrimidin-purin > pyrimidin- pyrimidin. • Methylace zvyšuje stabilitu. Toto vše odpovídá rozdílu stability jednořetězcové molekuly poly(A) (především šroubovice) a poly(U) (především náhodné klubko) při teplotě místnosti. U NK je tvorba vodíkových vazeb jednotlivých párů bází závislá především na složení, zatímco vrstvení (stacking) kromě toho i na sekvenci. Pro párování dvou řetězců je důležitá tvorba vodíkových m ůstků. A pro stabilitu je d ůležitá i celá řada jiných sil, jako jsou p ředevším hydrofobní interakce, elektrostatické inter akce jednotlivých bází a párování bází!!! Interakce nukleových kyselin s kationty kov ů NK obsahují 4 hlavní vazebná místa pro kovové ionty (zbytek kyseliny trihydrogenfosforečné, hydroxyly ribózy, ketoskupiny, N heterocyklu bází). Nukleové kyseliny v roztocích DNA stočená do dvoušroubovice je více polární než jednořetězecová DNA nebo denaturovaná dsDNA. DNA ve vodě na sebe váže (poměrně pevně) značné množství vody (11 až 12 [20] molekul

25

vody na jeden nukleotid). Tento primární hydrata ční obal nemá clathrátovou strukturu a je tém ěř nepropustný pro kationty nebo další soli. Naopak vnější obal, kam patří i zbytky kyseliny fosforečné, je více méně přístupný tomu vnějšímu okolí. Voda jako taková má výrazný vliv na to, jak ta šroubovice bude uspořádána: • Při 60 % relativní vlhkosti jsou stále ještě v primárním obalu hydratovány kyslíky fosfodiesterové

vazby a O4’ kyslík furanózy. • Při 65 % relativní vlhkosti jsou již hydratovány amino-, imino- a ketoskupiny. • Při 80 % relativní vlhkosti dsDNA obsahuje cca 20 molekul H2O na nukleotid. Hydrofobní části nukleové kyseliny v tomto případě jsou ty planární báze, které jsou tlačeny k sobě, interagují spolu elektrostatickými a především hydrofobními interakcemi; a dostávají se jakoby dovnitř. Směrem k povrchu hydratované dvoušroubovice zaujímají 45 % fosforečnanové zbytky, 35 % ribóza a 20 % báze. Kolem tohoto primárního obalu je sekundární hydrata ční obal , kde lze rozpoznat vyšší uspřádání okolní vody. Je propustný pro ionty (je to obal, kterým dvoušroubovice komunikuje s dalšími ionty). Ve vodném prostředí a fyziologickém pH jsou všechny zbytky kyseliny fosforečné plně disociovány (= nukleová kyselina se opravdu chová jako kyselina). Záporný náboj musí být v buňce nějakým způsobem „neutralizován“. Jednou z možností je přítomnost monokationtů, monobivalentích kationtů, polyaminů či bazických proteinů (např. histony u eukaryot nebo malé bazické aminokyseliny u bakterií a Archae). U RNA je to ještě složitější, díky přítomnosti 2’OH skupiny, která šroubovici přímo stabilizuje. Voda m ůže dál stabilizovat strukturu RNA p řes vodíkové m ůstky. DNA přechází z jednotlivých konformačních rodin do jiných na základě toho, jak je hydratována a v jaké je iontové síle (v jaké koncentraci solí se vyskytuje). Přičemž základní konformací je pro DNA rodina konformace B a pro RNA je to konformace rodiny A . Hydratace stabilizuje B konformaci dsDNA díky: • snížení odpuzování dvou sousedních negativně nabitých fosforečnanových zbytků (15 kcal/mol pro

pár bází) • zvýšení přitahování mezi bázemi a fosforečnanovými zbytky (12 kcal/mol pro pár bází) • zvýšení účinnosti vrstvení bází (stacking) (7 – 10 kcal/mol pro sousední pár bází) Vodíkové vazby Pokud uvažujeme 2 vodíkové vazby jako minimum pro stabilní komplex, pak A, G, C, U umožňují 28 různých párů. • Hoogsteenovo párování (objeveno při studiu krystalu 1-metyltyminu : 9-metyladeninu.) • V roztoku se tvoří směs Watson-Crick, Hoogsteen a dalších typů párování. Stabilita párů 5’-nukleotidů je ve vodě následující:

GMP s CMP > UMP >IMP >>AMP AMP s UPM ~ CMP > > IMP, GMP CMP s GMP ~ CMP >> UMP > AMP, IMP

Řetězce DNA mohou reversibiln ě disociovat a op ět reasociovat • Separace řetězců (denaturace, tání) je nezbytná pro řadu buněčných procesů (např. replikace,

transkripce, DNA opravy...). DNA řetězce mohou opět vysoce specificky reasociovat (renaturovat). • Tání DNA lze navodit experimentálně (vysoká teplota, >pH, látky destabilizující H-vazby -

formamid, močovina ...) a sledovat měřením absorbance v UV oblasti. • Vhodné maximum absorbance DNA je při cca 260 nm. • Zvýšení absorbance (A260) při denaturaci dvoušroubovice = hyperchromní efekt. Díky tomuto

efektu možnost měření Tm = teploty při které je 1/2 všech párů ve dvoušroubovici denaturována. Báze ve fyziologických podmínkách Za fyziologických podmínek je většina bází v amino nebo keto form ě. Se změnou pH se budou různé skupiny protonovat a deprotonovat, podle toho kam se pH bude pohybovat:

• Připojením fosforečnanového zbytku se zvyšuje hodnota pK o asi 0,5. • V alkalickém prostředí jsou N3 uracilu (tyminu) a N1 guaninu deprotonovány. • Ve slabě kyselém prostředí (pH < 3) jsou protonovány N3 cytosinu a N1 adeninu. • V prostředí o pH < 2 jsou již protonovány i N7 adeninu a guaninu a O4’ uracilu. • Při nízkém pH dochází preferenčně k protonaci N v heterocyklu a ne N aminoskupin.

Může docházet k určité migraci vodíků v rámci bází i ve fyziologickém prostředí. Část bází se může vyskytovat dokonce i ve šroubovici nebo i v DNA v enol nebo imino formě. To znamená, že pokud se

26

báze přesmykne z keto formy do enol formy, tak se změní vzorec skupin, které jsou akceptory nebo donory vodíkového můstku. Ve fyziologickém prost ředí se může vyskytnout jakákoliv báze v enol nebo imino form ě s pravd ěpodobností 10 -4 – 10-5 (a to je možnou příčinou toho, proč během replikace vznikají mutace v DNA s pravděpodobností přibližně 10-10). Pokud jsou báze modifikovány (viz tRNA), pak v některých případech stoupá výskyt imino a enol forem až o dva řády.

Heterocykly v roztoku tvoří směsnou populaci molekul, kdy H vázaný na N je schopen rychle migrovat na keto- a aminoskupiny. • U bází bez substituentů možná migrace H mezi N1 a N3, resp. N9 a N7. • Za fyziologických podmínek je 99,99 % bází v amino a keto formách. • Modifikace bází a intermolekulární H- vazby zvyšují procento řídce se vyskytujících tautomerů (u

tRNA až na 5 – 15 %). • Některé tautomery mohou nahradit jiné báze při Watson – Crickovském párování (možný vliv při

vzniku mutací). Jiné typy párování I v běžné šroubovici může někdy párovat guanin s jinými nukleotidy než je obvyklé a to především s uracilem. Tento typ párování se uplat ňuje p ři čtení genetického kódu (při párování tRNA s mRNA). Při čtení vznikají krátké helixy. Kolísání párování bází (wooble) Typ párování přípomínající standardní Watson-Crickovo párování. Preferenčně purin-pyrimidin nebo purin-purin. Pyrimidin- pyrimidin nepravděpodobný kvůli zkrácení vzdálenosti mezi glykosidickými vazbami o 2 A na cca 8,6 A

27

Konforma ční rodiny DNA RNA a DNA polynukleotidy lze nejčastěji zařadit do dvou hlavních konformačních rodin – A a B. Jeden z hlavních vlivů na konformaci NK má konformace ribózy: A rodina - C3’-endo B rodina - C2’-endo, resp. podobná C3’-exo (obsahuje přibližně 10,5 bází párů na jednu obrátku, Van der Waalsovský poloměr je 3,4Å)

Struktura B-DNA; boční a horní pohled na B-DNA v kuličkovém a kalotovém modelu

Helix nakloněný o 32° ukazuje malý (m) a velký (M) žlábek

28

Struktura G-C páru bází v Z-DNA. Šipky označují rozdílnou orientaci cukerných poloměrů, které prochází skrze syn-deoxyguanosin a anti-deoxycytidin a ruší dvojitou symetrii pozorovanou ve Watson-Crickovském párování.

Cik-cak průběh linie spojující fosfátové skupiny v Z-DNA. Vertikální linie reprezentuje osu helixu; blízko horizontální linie jsou naznačeny páry bází a cukry. Cesta je vertikální po guanosinech a horizontální, když prochází cytosiny.

Molekulová struktura levotočivé dvoušrobovice poly(DG-dC)-poly(dG-dC). Na obrázku je Z1-DNA odvozená z bází hexanukleotidu d(CGCGCG) z boční a horní strany

29

Trojšroubovice DNA poly(dT)-poly(dA)-poly(dT). Dvoušroubovice A-DNA s Watson-Crickovským párováním bází a antiparalelními polynukleotidy má ve svém velkém žlábku umístěný extra poly(dT) řetězec nakreslený světlou barvou. Tento řetězec je vázán Hoogsteenovým párováním bází s poly(dA), dva řetězce jsou paralelní.

B-DNA P-DNA

Srovnání A a B rodiny pravoto čivých helix ů

A rodina B rodina výskyt dsRNA , RNA:DNA, DNA při

nižší relativní vlhkosti DNA

konformační polymorfismus malý velký konformace ribózy C3’-endo C2’-endo vzdálenost P – P v jednom řetězci

5,9 Å 7,0 Å

osa helixu prochází ve velkém žlábku (D = 4,4 - 4,9 Å)

přes střed páru bází (D = -0,2 Å u “D” konformace -1,8 Å)

stoupavost na pár bází 2,56 - 3,29 Å 3,03 - 3,37 Å (3,4) rotace na pár bází 30° - 32,7° 36° - 45° počet párů bází na jeden závit 11 10,3 - 10,6 průměr helixu cca 23 Å cca 19 Å Další rodiny DNA C - DNA - například dsDNA jako litná sůl v prostředí o nízké relativní vlhkosti (44 - 66 %).

- 9,33 bází na závit; symetrie 283; podobná B - DNA; D = -1 Å D - DNA - pouze střídavé dAdT sekvence a vysoce glykosilovaná (> 70 %) DNA bakteriofága T2

obsahující též 5-hydroxymethylcytosin při nižší relativní vlhkosti (cca 65 %) - 8 bází na závit; podobná B - DNA; D = -1,8 Å

30

Z - DNA - levotočivá dvoušroubovice - u střídavých sekvencí d(CGCGCG), 12 bází na závit - purinové nukleotidy – syn a C3’-endo - pyrimidinové nukleotidy – anti a C2’-endo - osa dvoušroubovice prochází menším žlábkem; větší žlábek je téměř neznatelný - stoupavost na dva páry bází = 7,4 Å - může hrát roli při rekombinaci, regulaci genové exprese (dm5CdG sekvence), interakcích

mezi makromolekulami a při změně topologie (nadšroubovic) DNA Trojitá šroubovice - u sekvencí s delšími úseky purinů v jednom řetězci možno vložit třetí

homopyrimidinový řetězec - tzv. Hoogsteenovo párování - možný výskyt během rekombinací a DNA oprav

Denaturace DNA = odd ělení řetězců dvoušroubovice od sebe na dva jednoduché řetězce. Denaturaci DNA lze provést teplem, močovinou, formamidem, enzymem, změnou pH, chemickým agens (např. methylmerkurychlorid). Denaturace je reverzibilní. Renaturace probíhá na základě komplementarity. Má dvě fáze, jednu pomalou a druhou rychlejší. Procesů denaturace a renaturace se využívá v genovém inženýrství. Využívá se toho, že báze nukleových kyseliny absorbují velmi specificky; absorp ční maximum je p řibližn ě ve 260 nm. Pokud zahříváme nukleovou kyselinu, tak čím víc ji denaturujeme, tím víc se zvyšuje absorbance. V inflexním bodě denaturační křivky je Tn bod, který vyjadřuje pro danou DNA stav, kdy polovina párů bází v roztoku je denaturována nebo naopak je náhodně spárována. Jak se uvolňují jednotlivé báze (dostávají se z vrstvení a ze vzájemných interakcí) a dostávají se do roztoku, tak se nám zvyšuje absorbance, i když jsme nezvýšili látkové množství DNA. To se nazývá hyperchromní efekt . Teplota tání t t je parametr, který je zásadní pro hybridizační experimenty, experimenty typu PCR, hybridizace s oligonukleotidy apod. závisí na řadě parametrů: na iontové síle prostředí, na pH, na sekvenci nukleové kyseliny (závisí na množství GC a AT párů a jejich posloupnosti ). Teplotu tání lze vypočítat i na základě určité sekvence, nebo ji lze změřit. Do značné míry je teplota tání empirická hodnota. GC bohaté oblasti mají vyšší teplotu tání. Teplota tání je parametrem stability!

31

32

Degradace DNA = rozštěpení DNA až na nukleotidy. Topologie molekul DNA Lineární molekula DNA Cirkulární molekula DNA

- častá forma (plastidy, mitochondriální DNA) - kovalentně uzavřená kružnice - ccc, otevřená (relaxovaná) kružnice - oc - v důsledku pnutí uvnitř molekul vznik nadobrátek a ohybů - cirkulární forma tvoří nadsmyčky; když se působí na stabilitu dvoušroubovice, tak přejde do stavu nadsmyček (= supercoil) – je to jako, když se uchopí gumička na obou stranách a stáčí se → natočí se nadobrátky, vzniká pnutí, které se uvolní vznikem nadšroubovice - když je kružnice v nadobrátkách a jeden řetězec se přestřihne, pnutí se uvolní a jeden řetězec zrotuje kolem druhého → denaturuji jeden řetězec z dvouvláknové DNA. Tak vznikne jedno kruhové vlákno a druhé lineární vlákno; může se toto zpětně denaturovat - většina buněk je schopna ve svém genomu tyto nadšroubovice tvořit a relaxovat je zpět. Buňka spotřebovává energii na oddělování vláken - energie částečně končí v nadšroubovici pouze do určité míry, pak by tyto struktury mohly „prasknout“ → buňka musí umět tyto nadšroubovice relaxovat

33

- má vytvořeny enzymy, které relaxaci umí katalyzovat → topoizomerázy → jsou schopny měnit topologii DNA, tím že přeruší jedno vlákno a navážou se na něj → vznikne kovalentní intermediát, přehodí přerušené vlákno a naváže ho zpět na druhé vlákno. Cílem je uvolňovat obrátky kontrolovaně. - DNA se pohybuje v gelu při elektroforéze pomocí svého záporného náboje, který je tvořen navázanými fosfáty (chová se jako anion) - jedna kruhová molekula DNA se pohybuje dvěma způsoby: když je stočená, tak má malou velikost a prochází elforézou rychleji než jako dlouhá molekula - dlouhá molekula je v relaxovaném stavu a zůstává blízko startu. Krátká molekula je v nadšroubovicovém stavu. Když do roztoku s nadšroubovicovou molekulou přidáme topoizomerázu a inkubujeme je po různou dobu, vznikne „žebřík“ → za 3 min. bude většina DNA v nadšroubovicové formě; po 30 min. se ale většina DNA přemění do relaxovaného stavu.

Topoizomerázy - dva typy = typ I. a typ II.; jedná se o dvě skupiny enzymů různé funkce vyskytují se u všech organismů (bakterií, archae, eukaryot, virů) - enzymy měnící topologii nadobrátek DNA molekul – mohou přidávat nebo ubírat nadobrátky

- Topoizomerázy I. = tvoří jednořetězcová přerušení; jeden řetězec přehodí kolem nepřerušeného řetězce a tak změní nadobrátku; záleží na jakou stranu řetězec přehodí, tím se DNA buď utáhne, nebo povolí (štěpí jeden řetězec, rotuje jej okolo druhého a spojí konce) - Topoizomerázy II. = dokáže přerušit oba řetězce najednou za spotřeby ATP, provleče je a spojí (DNA gyrasa), tím je změna nadobrátky rychlejší

34

- když si představíme, jak dvouvláknovou DNA prochází osa helixu, všimáme si nadobrátek - když proložíme čáru nesmotaným helixem a díváme se, kolikrát se tato čára protne, kolik udělá celých obrátek – toto číslo se nazývá twist (= Tw; po čet obrátek řetězce DNA kolem osy helixu) ; většinou je 10 bp na jednu obrátku - když se podíváme na osu helixu, kolikrát je stočená, dostaneme číslo „wright“ = svinutí (= Wr; počet obrátek osy kolem sebe) - součet Tw + Wr dává vznik Lk číslu = linking, které udává kolikrát je překřížená osa uvnitř helixu - číslo Lk0 = páry bází/počet bází na obrátku (Lk0 = N(bp) / h(bp) ) - můžeme porovnávat číslo LK a LK0 -> nadšroubovice vzniká tehdy, když Lk ≠ Lk0

- je-li za standardních podmínek Lk – Lk0 menší než 0 → vzniknou negativní nadobrátky, tzn. že celkové stočení je menší než by bylo, kdyby tam nebyly nadobrátky (uvnitř je helix relaxován a není k sobě pevně vázán) - je-li LK – Lk0 větší než 0 → vzniknou pozitivní nadobrátky; vznikne tam spousta nadšroubovic - většina genomu všech organismů je v negativních nadobrátkách, aby se mohli geny lépe transkribovat a replikovat - součástí každého replikačního komplexu je topoizomeráza; u bakterií se nazývá giráza (za spotřeby ATP nahazuje negativní nadobrátky a tím relaxuje helix a umožňuje tak replikaci) - při replikaci musí dojít k roztažení helixu; to vede ke vzniku pozitivních nadobrátek na druhé straně helixu - u termofilních organizmů existují reverzní girázy, které tvoří pozitivní supercoil a tím pomáhají, aby se vytvořila dvouvláknová DNA v extrémních podmínkách a aby byla stabilní - topoizomerázy jsou u bakterií a eukaryot odlišné

- eukaryota mají topoizomerázu I. typu - bakterie mají topoizomerázu II. typu (= topoizomeráza IV a giráza)

- při přetáčení řetězců mohou vzniknout zřetězení, spojením dvou cirkulárních řetězců vznikne „katen“ → druhou funkcí topoizomerázy II. je možnost dekatenace = rozdělení dvou kroužků, které byly spojené

35

- inhibitory topizomeráz se využívají v lékařství

- kamptothecin ze stromu pocházející z Číny - používá se na léčení nádorových nebo autoimunitních onemocnění)

- chinoliny používají se jako antibiotika (cíleně napadají bakteriální topoizomerázy)

• jednořetězcová DNA a především RNA strukturně bohatší – vlásenky, bubliny, ....- pseudouzly ... DNA v bu ňce DNA se nalézá v buňce ve formě vyšších uspořádaných struktur a asociovaná s proteiny, RNA a nízkomolekulárními látkami. Genomy Prokaryotický genom – chromosom, plasmidy Eukaryotický genom – chromosomy, DNA v organelách (mitochondrie, chloroplasty) Virové parazitické genomy Bakteriální chromosom (E. coli) – nukleoid • cirkulární molekula, která je přes proteiny připojena k cytoplasmatické membráně • volná DNA, neobalená v jaderném obalu; zaujímá asi 1/3 objemu buňky • tvořen asi 30 až 100 smyčkami (doménami) v negativních nadobrátkách uspořádanými kolem

centra • DNA asociována s proteiny a RNA • neutralizace negativního náboje DNA zajištěna nízkomolekulárními látkami jako Mg2+ ionty,

polyaminy, bazickými proteiny atd. (pokud se přidá do buňky chloramfenikol, který brání syntéze proteinů, tak se genom srazí do kompaktního tvaru -> na strukturu chromozomu mají velký vliv proteiny, které s NK asociují)

• REP elementy (sekvence) - role ve stavbě nukleoidu? REP elementy (repetitive extragenic palindrome) jsou tvořeny dlouhou palindromatickou sekvencí (38 bp - konsensus) schopnou tvořit vlásenku. V genomu E. coli v 500 - 1000 kopiích. Vazba Pol I a DNA gyrasy na REP in vitro.

36

Proteiny asociované s nukleoidem protein (podjednotky) gen MW funkce mutace Hu α-podjednotka β-podjednotka

hupA hupB

9 000 9 000

strukturní funkce v nukleoidu, iniciace replikace

Dvojitá mutace v genech pro obě podjednotky způsobuje problémy v buněčném dělení, rozchodu chromosomů a nadšroubovicové struktuře nukleoidu.

IHF himA hip

role při rekombinaci fágů a transpozici, koordinace s hupA

H1 (H-NS) hns 15 000 strukturní a regulační funkce, afinita k ohybům na DNA

Vliv v různých regulačních drahách.

Další významné bazické proteiny vázající se na DNA - P protein, Fis, FirA

37

a)

b) Imunobarvení DNA. (a) Různé aspekty exponenciálního růstu E. coli B s navázanými myšími anti-ds DNA IgM, poté byly přidány kozí IgG protilátky proti myším IgM obarvené směsí 2% KMnO4 a 2% uranyl acetátem v poměru 1:2. Vazba je znázorněna jako šedě zbarvená místa v DNA bohatých oblastech. (b) Exponenciální růst E. coli B v prostředí s chloramfenikolem po dobu 1 hodiny a zbarvené postupem výše.

Eukaryotický chromosom složen z: vlákno DNA, histony, proteiny nehistonové povahy • heterochromatin - kondenzovaný, silně se barvící (konstitutivní = především satelitní DNA; fakultativní = podle buněčné linie) • euchromatin - dekondenzovaný, slabě se barvící

38

Rostoucí Euglena gracilis Fluorescence mitochondrií a jádra po barvení 1. ethidium bromidem - červená 2. DiOC6 - zelená Řez kmenovou buňkou kostní dřeně

tmavě (mimo jadérko) = heterochromatin • DNA je v buňce uspořádána; je vázána na proteiny zvané histony. Spolu s navázanou DNA tvoří

nukleosom . Jednotlivé nukleosomy se také nazývají jako „10nm vlákno“ (základní nukleozomový řetězec). Nukleosomy jsou ještě dále sbaleny do kompaktnějšího vlákna za účasti H1, které se nazývá „30nm vlákno“ (6 nukleozomů na obrátku). Toto vlákno se srovnává na další proteinovou kostru = chromozomové lešení a to se stáčí do chromozomu (v metafázickém chromosomu je tloušťka vlákna až 700 nm).

39

• základní jednotkou chromatinu = nukleozom (oktamer nukleozomálních histonů H2A, H2B, H3, H4;

histon H1, DNA cca 200 bp)

• jádro nukleozomu = 146 bp DNA + tetramer 2 x (H3 + H4) + dva dimery H2A - H2B • nukleozomální histony = evolučně velmi konzervovány, 102 - 135 AK • histony H1 = méně konzervovány, cca 220 AK • nukleozomové vlákno je přes specifické oblasti DNA (MAR - matrix attachment regions - až 70 %

AT) v jádře navázáno na jadernou matrix (aktin a řada dalších proteinů, včetně “scaffold” proteinů); při kondenzaci pak přes SAR (scaffold attachment regions) na proteinové lešení, jehož součástí jsou různé proteiny, ale vždy např. topoizomeráza II, aby bylo zajištěno správné pnutí řetězce

40

Oblasti hypersenzitivní k nukleázám (DNasa I) - obsazeny jinými proteiny než histony Skládání a rozpad nukleozomů ovlivněn modifikací histonů: • acetylace • metylace (Lys, Arg, His) • fosforylace (Ser, His) v S - fázi histony acetylovány a metylovány v transkribovaných oblastech acetylovány Umístění nukleozomů na vlákně DNA je nenáhodné, při tvorbě účast specifických sekvencí (struktur) DNA a proteinových faktorů. Faktor CAF1 (více než 5 podjednotek) váže H3 a H4 a ukládá je do replikační vidličky. Stavba genom ů - nukleosomy jsou tvořeny z histonů H2A, H2B, H3 a H4 a navzájem jsou spojeny histonem H1. U nižších organismů H1 neexistuje, ale místo něj tam jsou jiné proteiny. Histony vystupují jako heterodimery – dimer H3+H4 a dimer H2A+H2B; tvoří se z nich oktamer; člověk má 146 nukleotidů na jeden nukleosom - všechny histony mají stejnou AMK sekvenci i strukturu - rozdílné jsou N-konce a C-konce u H2A a H2B a všechny N-konce u všech histonů

- N-konce jsou bohaté na Lysin, který je bazický a tím interaguje s nukleovou kyselinou. Lysin může být snadno modifikován glykosilací, fosforylací, metylací nebo acetylací. Modifikací se ovlivní pevnost utažení DNA kolem histonů a též jak aktivně budou exprimovány geny na DNA. Když je nukleosom acetylován, je tato oblast hodně transkripčně aktivní, protože acetyl má kladný náboj a tím interaguje se záporným nábojem nukleové kyseliny a rozvolňuje vlákno.

Schéma core histonového oktameru (centru) s DNA superhelixem (modře) a N-konce core histonů v plné délce. Lysinové zbytky, které mohou být modifikovány acetylací, jsou označeny hvězdičkou.

41

Posttranslační modifikace uvnitř N-terminálních konců čtyř jader histonů. Místa, která jsou acetylovaná v lysinovému zbytku (K) jsou zobrazena modře, fosforylované serinové zbytky (S) červeně a methylace v dalším lysinu (K) nebo argininu (R) zeleně. Povšimni si, že Lysin-9 v H3 může být jak acetylován, tak methylován. Dále je zobrazena ubichitinová modifikace blízko C-termálního konce H2A a H2B histonů (žlutě). - pokud je metylace histonů, tak je DNA úplně neaktivní - pokud má být DNA „uspaná“, dojde k tvorbě proteinů, které modifikují DNA = tyto procesy se nazývají epigenetické

Souhra mezi modifikací histonů a DNA methylací. Na obrázku je nukleosom, ve kterém jsou histonové oktamery zobrazeny cylindricky. DNA je zobrazena jako červená linie zvýrazněná okolu histonového cylindru. Histonové konce jsou zobrazeny jako prodloužená šedá linie vedoucí z oktamerů. Histonové konce obsahují acetylaci na lysinu 9 histonu 3 (AcH3K9) a methylaci na lysinu 9 histonu 3 (MetH3K9). Malé kolečko označuje DNA methylaci. - modifikace se mohou dědit podle toho, jestli jsou od otce nebo od matky. Vznikají nové informace, které ovlivňují genovou expresi, aniž by tyto informace byly zapsány v genech. - existují enzymy, které modifikují histony → histon-acetyl-transferázy a histon-deacetylázy . Jejich patologie vedou ke vzniku karcinomů a leukemií

42

Extrachromosomální DNA Prokaryotické plasmidy • Přenos DNA u prokaryot (konjugace donorové a recipientní buňky, transformace, transdukce) • Plasmidy obvykle dsDNA cirkulární replikony. Spirochety (Borrelia) - lineární plasmidy. Terminologie: episomy, konjugativní (F -”fertility”, Hfr, transferové geny) x nekonjugativní x mobilní (ColE1) plasmidy, R plasmidy, kryptické plasmidy, inkompatibilita plasmidů, stringentní (nízkokopiové) x relaxované (vysokokopiové) plasmidy Eukaryotní organely • nemendelovská dědičnost • somatická segregace Mitochondrie • mtDNA kružnicová o velikosti 16 – 20 kbp (živočichové) až > 100 kbp (rostliny); též lineární ss a

dsDNA (některé houby, prvoci a rostliny); kvasinková mtDNA (cca 84 kbp) větší než mtDNA živočichů, ale s přibližně stejnou kódující kapacitou – méně kompaktní genom a introny u kvasinek. Nově zjištěno, že mtDNA S. cerevisiae jak v cirkulární, tak i v lineární (převážně) formě. Často tvoří lineární konkatemery o velikosti až 1 Mbp.

• mtDNA obvykle v několika kopiích (20 – 40) na organelu; více kopií mitochondrií na buňku (20 – 40 u rostlin, několik set u živočichů)

• vedle organelové DNA často přítomny i zkrácené subgenomové produkty rekombinace • mtDNA obvykle obsahuje všechny RNA geny (rRNA, tRNA – kvůli přenosu přes membránu, který

je dost energeticky náročný) + kóduje některé subjednotky enzymových komplexů mitochondrií (ATPáza, cytochrom c-oxidáza, NADH-dehydrogenáza, cytochrom bc1 komplex) + někdy i další proteiny (Var1 u kvasinek). mtDNA Trypanosoma brucei nekóduje žádné tRNA.

43

Mitochondriální genom S. Cerevisiae (vlevo) obsahuje dvě přerušení a nepřerušené geny kódující proteiny, rRNA a tRNA geny (pozice nevyznačeny). Okolo vyznačen směr transkripce. Lidská mitochondriální DNA (vpravo) má 22 tRNA geny, 2 rRNA geny a 13 protein-kódujících oblastí. 14 z 15 protein-kódujících nebo rRNA-kódujících oblastí jsou transkribovány stejným směrem. 14 tRNA genů jsou exprimovány ve směru hodinových ručiček a 8 je čteno proti směru hodinových ručiček. Chloroplasty • kružnicová ctDNA (150 – 200 kbp), obsahuje dvě invertované repetice (IR) a dva unikátní úseky

DNA – SSC (short single copy) a LSC (long single copy) • Kóduje více genů než mtDNA asi díky pozdější symbióze s eukaryotními buňkami • Byla vyslovena možnost, že DNA je tvořena spíše z dlouhých vláken než, že by byla kružnicová.

Kružnicová se většinou tvoří jako experimentální artefakty. ctDNA tabáku: IR = 25 339 bp SSC = 18 482 bp LSC = 86 684 bp ctDNA= 155 844 bp ctDNA obsahuje rRNA, tRNA a kóduje až cca 100 proteinů (strukturní bílkoviny, ribozomální bílkoviny, podjednotky RNA polymerázy, podjednotky enzymových komplexů ...) Kompartment Tvar Velikost Druh nukleové kyseliny Délka Velikost

[kbp] TMV filamentární 0,008 x 0,3 µm 1 ssRNA 2 µm 6,4

Fág φd filamentární 0,006 x 0,85 µm 1 ssDNA 2 µm 6,0 Adenovirus icosaedr průměr 0,07 µm 1 dsDNA 11 µm 35,0

Fág T4 icosaedr 0,065 x 0,10 µm 1 dsDNA 55 µm 170,0 Escherichia coli válcovitý 1,7 x 0,65 µm 1 dsdNA 1,3 mm 4200,0

Mitochondrie (člověk)

oválný 3,0 x 0,5 µm cca 10 kopií dsDNA 50 µm 10 x 16,0

Jádro (člověk) kulatý průměr 6 µm 46 chromosomů dsDNA 1,8 m 600000,0 Archae - podobný jak bakteriím, tak eukaryotům - nemají jaderný obal; mají cirkulární NK, která je rozdělena na další NK (podobné plasmidům,

44

ale jsou velké) - mají některé typické proteiny pro bakterie a pro eukarya - DNA je s histony; histony jsou podobné eukaryotům, ale jsou tetrametry, někdy jsou homodimery, někdy heterodimery; jsou menší (nukleosomy jsou také menší a vlákno namotané na histonech je kratší)

Enzymová syntéza nukleových kyselin

Replikace DNA

Buněčný cyklus

• celý genom musí být replikován precizně během jednoho buněčného dělení • prokaryota = jednoreplikonový genom x eukaryota = mnohoreplikonový genom • Archaea = jedno- i více- replikonový genom

Dva hlavní principy vztahu replikace a buněčného cyklu:

1. iniciace replikace uvádí buňky obvykle (Archae, Eukarya) do dalšího buněčného dělení 2. buněčné dělení nemůže proběhnout bez dokončené replikace

• Bacteria (E. coli ) - doba zdvojení T = 18 – 180 min.

- doba replikace (syntetická fáze) C = 40 min. (42 min., 4639221 bp = 1840 bp x s-1)

- doba mezi dokončením replikace a dokončením dělení buňky D = 20 min.

- interval mezi dokončením dělení buňky a zahájením replikace = B

B + C + D = T

C + D > 60 min pokud T > 60 min

- replikace trvá déle než dělení buňky, díky překryvným cyklům; poměr hmotnost buňky / počet originů = konstantní

- cirkulární chromozom s dvěma počátky (obousměrnými) → replikace i obou počátků

- buňka dosáhne velikosti, kdy je schopna spustit další replikaci (replikace do zásoby) → tyto replikace jsou kontrolovány mechanismy (jestli buňka má na to, replikovat dál)

- když jsou živiny vyčerpány, tak se genom rozdělí do jednotlivých dceřiných buněk

- u eukaryot a archaea nebyly tyto překryvné cykly pozorovány

45

Kritická velikost (kritická hmotnost) bakterie: jen v určité velikosti je buňka schopna si říct, že se dělí dostatečně rychle a mohla tedy spotřebovat to velké množství energie

Eukarya

G1 (Gap 1 = kontrolní bod, jestli replikace bude probíhat) →→→→ S (syntéza DNA) →→→→ G2 (Gap 2 = místo, kde se buňka rozhoduje, jestli replikace proběhla v pořádku) →→→→ M (mitóza) →→→→ cytokineze

G0 (Gap0)

Archaea

- velmi různorodé, neprobádané

- existují buňky, které nerostou (stacionární fáze buněk), buňka neumírá, ale jsou vyčerpány živiny

- správně jen jedna kopie genomu, archaea ale mají různý počet genomových ekvivalentů

Rozchod chromosom ů:

Eukarya – centromery (heterochromatin) + dělící vřeténko (tubulinu):

Druhově specifické sekvence; chráněné silnými terminátory transkripce z obou stran

Bacteria – vliv vazby na membránu v oblasti počátku? Účast jakési bakteriální obdoby cytoskeletu. U prokaryot – FtsZ protein (funkční a strukturní, nikoliv sekvenční homolog tubulinu). Další zúčastněné proteiny u E. coli: ParC, ParE (podjednotky topoizomerázy IV); MukB

Archaea – Euryarchaea – FtsZ protein

Kompartment Tvar Velikost Druh nukleové kyseliny

Délka Velikost [kbp]

TMV filamentárn

í

0,008 x 0,3 µm 1 ssRNA 2 µm 6,4

Fág φd filamentárn

í

0,006 x 0,85

µm

1 ssDNA 2 µm 6,0

46

Adenovirus icosaedr průměr 0,07 µm 1 dsDNA 11 µm 35,0

Fág T4 icosaedr 0,065 x 0,10

µm

1 dsDNA 55 µm 170,0

Escherichia coli válcovitý 1,7 x 0,65 µm 1 dsdNA 1,3 mm 4200,0

Mitochondrie (člověk) oválný 3,0 x 0,5 µm cca 10 kopií dsDNA 50 µm 10 x 16,0

Jádro (člověk) kulatý průměr 6 µm 46 chromosomů

dsDNA

1,8 m 600000,0

Replikace DNA

• replikace nukleové kyseliny (NK) = vznik dvou stejných dceřiných kopií (replik) z jedné mateřské molekuly NK

• slouží k uchovávání genetické informace, která je rozdělena mezi dceřiné molekuly; musí být přesná

• princip replikace DNA navržen Watsonem a Crickem na základě modelu dvoušroubovice DNA s dvěma antiparalelními řetězci

Enzymová syntéza NK probíhá vždy ve sm

47

Syntéza DNA probíhá přidáváním nukleotidů na 3´-OH konec rostoucího řetězce, takže nový řetězec ve směru od 5´ k 3´. Prekurzorem syntézy DNA je nukleosidtrifosfát, který pztrácí terminální dvě fosfátová skupiny.

Exonukleázová a polymerázová strana soutěží o vazbu na primer. (Exo strana je vlevo a pol strana je v pravo na obrázku.) Naváže-li se primer 3´koncem na pol stranu, nastává polymerizace. Vazba na exonukleázové straněupřednostňována, když se primerový řetězec oddělí od templátového současně se natáhne jako krátká jednovláknová DNA. Odděřetězců nastává, když páry bazí nejsou správně spárovány. Dojde kexonukleázové aktivity a nastávánesprávných spojení. Malá koleznázorňují fosfáty na dNTP. Po inkorporaci nukleotidu se uvolňuje anorganický pyrofosfát.

Enzymová syntéza NK probíhá vždy ve směru od 5’ konce k 3’ konci

Syntéza DNA probíhá přidáváním OH konec rostoucího

etězec je syntetizován 3´. Prekurzorem syntézy

DNA je nukleosidtrifosfát, který při reakci fosfátová skupiny.

Exonukleázová a polymerázová strana ží o vazbu na primer. (Exo strana je

pravo na obrázku.) li se primer 3´koncem na pol

stranu, nastává polymerizace. Vazba exonukleázové straně je

, když se primerový templátového řetězce a

se natáhne jako krátká vá DNA. Oddělení dvou

, když páry bazí nejsou ojde k přerušení a nastává vystřižení

spojení. Malá kolečka ují fosfáty na dNTP. Po inkorporaci

uje anorganický

48

Prekursory jsou (deoxy)nukleosidtrifosfáty

Replikace ve smyslu enzymové syntézy:

- syntéza NK běží vždy ve směru 5´ → 3´ konce; proč???: prekurzory syntézy u DNA jsou 5´dNTP a u RNA jsou 5´NTP; makroergní vazba mezi α-fosfátem a pyrofosfátem je využita na zařazení nukleotidu do řetězce, protože syntéza NK je velmi energeticky náročná; tato vazba se štěpí pyrofosfatázou

- fosfát tvoří fosfodiesterovou vazbu s 3´-OH očkem

- reakce probíhají hodně rychle

Jaké enzymy katalyzují replikaci?

Syntéza NK je katalyzována enzymy:

Tyto enzymy můžeme dělit do dvou skupin:

1) proteiny, které katalyzují na základ ě nějaké p ředlohy

1. DNA programovaná DNA polymerasa = předlohou je DNA a polymerázou je DNA; tato polymeráza je použita v replikaci

2. RNA programovaná DNA polymerasa = reverzní transkriptasa, telomerasa 3. DNA programovaná RNA polymerasa = je použita při transkripci genů 4. RNA programovaná RNA polymerasa

ad 1. - ad 4. vyžadují templát

ad 1. a ad 2. nezahajují syntézu de novo, ale vyžadují 3´-OH očko (primer), které je původem RNA; DNA; protein (u některých virů, např. adenovirů, nebo plazmidů – ale pouze v případě, že na nějakou aminokyselinu s volnou OH skupinou, tj. tyrosin nebo serin, je navázán nějaký nukleotid, jehož 3’OH skupina ribózy pak funguje jako očko)

ad 3. a ad 4. umí sami začít replikaci – jsou používány jako primázy, které vytvoří primer a na něj nasedne DNA-polymeráza

Některé DNA polymerasy nesou i exonukleasové aktivity:

5’ → 3’ exo (polymeráza jede a před sebou odbourává řetězec)

častější 3’ → 5’ exo (opravná = “proofreading” aktivita)

- opravná aktivita funguje tehdy, když DNA-polymeráza rozpozná špatně navázaný nukleotid

49

- rozpoznání se děje pomocí 2 aktivních míst: na jedno se váže nový nukleotid (= syntetické místo) a na druhé se váže špatně párovaný nukleotid (= exonukleázové místo)

„Mutace jsou známkou rakoviny. Normální buňky minimalizují spontánní mutace skrze kombinaci akcí polymerázové selektivity bazí, 3´ → 5´ exonukleolytické aktivity, opravy nesprávných spojení a opravy DNA poškození. K určení důsledků defektní opravné aktivity („proofreading“) u savců jsme vytvořili myš s bodovou mutací (D400A) v „proofreading“ doméně DNA polymerázy δ (polδ, kódovaná pold1 genem). Prokázali jsme, že tato mutace inaktivuje 3´ → 5´ exonukleázovou aktivitu polδ a působí jako mutátor rakovinného fenotypu u recesivních nosičů. V 18 měsících věku se u 94 % homozygotních Pold1D400A/D400A myší rozvinula rakovina a zemřely (medián přežití = 10 měsíců). Naproti tomu pouze 3 – 4 % Pold1+/D400A a Pold1+/+ myší prodělalo rakovinu ve stejném časovém období. Ze 66 tumorů, které se vyvinuly u 49 Pold1D400A/D400A myší, bylo 40 epitheliálního původu (karcinomy), 24 bylo mezenchimálního původu (lymfomy a sarkomy) a 2 byly složené (teratomy); třetina těchto zvířecích tumorů se vyvinulo ve více než jedné tkáni. Nejběžnějším tumorovým typem byl karcinom z kožních dlaždicových buněk, objevil se u 60 % všech Pold1D400A/D400A myší a u 90 % těchto myší bylo přežití delší než 8 měsíců. Tato data ukazují, že „proofreading“ polδ potlačuje rozvoj spontánních tumorů a silně podporuje, že neopravené DNA polymerázové chyby přispívají ke karcinogenezím. Myšší deficience v polδ „proofreding“ poskytuje tvárný model ke studiu mechanismů epiteliální tumorigeneze vyvolané mutátorovým fenotypem.“

„Mutace na polymerázové straně myší DNA polymeráze δ vnáší genomovou nestabilitu a akceleruje tumorigenezi

Savčí DNA polymeráza δ (Pol δ) je předpokladem pro replikaci velké části genomu a pro syntézu DNA při opravách DNA a genetických rekombinací. Efekty mutací v polymerázové doméně tohoto esenciálního enzymu nejsou známy. Připravili jsme myší mutanty s L604G nebo L604K substitucí ve vysoce konzervovaném motivu A na polymerázové straně Pol δ. Myší homozygoti Pold1L604G/L604G a Pold1L604K/L604K zemřely in utero. Nicméně heterozygotní zvířata byla životaschopná a nejevila celkově zvýšenou incidenci nemocí, což značí efektivní kompenzaci defektní mutované polymerázy. Délka života běžného a heterozygotního Pold1+/L604G myší není rozdílná, avšak u myší Pold1+/L604K byla snížena o 18 %. Vypěstované embryonální fibroblasty z heterozygotních jedinců ukazují srovnatelné zvýšení spontánních mutačních poměrů a chromozomálních aberací. Nepozorovali jsme signifikantní zvýšení v incidenci rakoviny, avšak Pold1+/L604K myši umíraly s histologicky diagnostikovanými tumory v mladším mediánu věku než běžné myši. Naše výsledky ukazují, že heterozygotní mutace v L604 v polymerázové straně DNA polymerázy δ snižuje délku života, zvyšuje genomovou nestabilitu a akceleruje tumorigenezi ve všech alela-specifických nosičů. Neobvyklé nálezy mají vztah k lidské rakovině.“

2) proteiny, které katalyzují bez p ředlohy

50

Enzym katalyzující syntézu DNA bez předlohy – terminální nukleotidyltransferasa

Replikace DNA je semikonzervativní (Meselson, Stahl – 1958)

Když Watson s Crickem navrhli způsob jak bude DNA syntetizována, tak zároveň tímto návrhem ukázali, že nová DNA bude replikována semikonzervativním způsobem. Co to znamená? To znamená, že při replikaci vznikají dva replikované řetězce, složené z jednoho původního (mateřského) řetězce a jednoho komplementárního nově vzniklého řetězce. Existují však systémy, například virové, kde může být replikace konzervativní. Existují RNA viry s dvouřetězcovým RNA genomem, u kterých probíhá produkce nových genomů na virové RNA polymeráze. Tato produkuje jednotlivé řetězce, které slouží jednak pro syntézu proteinů a jednak jako nové jednořetězcové templáty genomu – v jiné partikuli se poté k nim dosyntetizuje druhý řetězec. Jeden čas se uvažovalo například o tom, že v některých konkrétních případech, například v mitochondriích, může být replikace takzvaně disperzivní, to znamená že ty řetězce jsou jakoby duté. Není to však pravda. Je to jenom otázka toho, že v krátké době po replikaci proběhne celá řada rekombinačních procesů a vlastně semikonzervativní replikace následovaná vyšší úrovní rekombinace vám dá tuto molekulu, která vypadá jako kdyby replikace byla disperzivní. Replikace, jako taková, je u všech organismů semikonzervativní. Meselson a Stahl udělali jeden moc pěkný experiment. Představte si bakteriální kulturu, kterou nakultivujete na médiu, kde jediným zdrojem dusíku je například síran amonný s těžkým izotopem dusíku 15N. Výsledkem bude, že veškerá DNA, kterou vyizolujete z těchto bakterií, bude mít označený svůj genom těžkým izotopem dusíku. Pokud použijete zvláštní druh centrifugace ve gradientech solí, jako je třeba cesium chlorid, kde při velmi vysokém přetížení a dlouhé době dojde k ustanovení gradientu a DNA, stejně jako řada dalších molekul, se tam objeví ve formě tenkého pásku v místě své tzv. vznášivé hustoty. Když porovnáme tu vznášivou hustotu DNA s těžkým izotopem dusíku s DNA vyizolovanou z normální kultury zjistíte, že se liší. To je důležitá zpráva pro to, jak naplánovat tento experiment. A teď si představte, že máte bakteriální kulturu, kterou synchronizujete (všechny buňky, nebo větší část těch buněk, roste a dělí se synchronizovaně, tj. ve stejném okamžiku). Tím pádem můžete z toho, jak se chovají biomakromolekuly v kultuře, extrapolovat, jak vypadá DNA nebo biomakromolekuly v jedné jediné buňce. Pokud mám takto synchronizovanou kulturu, která byla kultivovaná na těžkém izotopu dusíku, a pak ji dám do normálního média, tak v první generaci dostanu DNA se vznášivou hustotou, která je někde mezi proužkem normálním a proužkem těžkého izotopu dusíku. To už nám napovídá, že replikace je pravděpodobně semikonzervativní. Už v druhé generaci dostanu dva proužky a jeden proužek bude odpovídat těm řetězcům, které jsou z řetězce s těžkým izotopem dusíku a pak tam bude proužek normální DNA. Teoreticky, kdyby nebyly žádní ztráty, tak množství lehké DNA bude narůstat, těžké zůstane konstantní. Tento experiment vedl k závěru, že replikace je semikonzervativní.

51

Molekula DNA může sestávat z jednoho (A) nebo několika (B) nezávisle replikovaných úseků – replikonů (= oblast, které je ovládaná jedním replikačním počátkem):

A) viry, malé plasmidy, bakteriální chromosom

B) velké plasmidy, eukaryontní chromosomy

Replikační počátek (origin) = start replikace

Replikační konec (terminus) – nalezen u bakterií, u eukaryotních systémů replikační konce příliš analyzovány nebyly

Replikační uzel = místo replikace na DNA v daném okamžiku (replikační vidlice)

Směr replikace = směr pohybu replikačního uzlu (replikace jednosměrná, dvousměrná – obě varianty se vyskytují, ale naprostá většina replikačních počátků v buňkách jsou dvousměrné)

Pokud máme antiparalelní mateřské řetězce, tak dceřiné komplementární řetězce musí být také antiparalelní. Syntéza tím pádem probíhá vždy ve směru 5‘→3‘, replikační vidlička se pohybuje jedním směrem.

Máte buňku, a určitě víte, že zahájila S-fázi, že zahájila replikaci a přidáte ji radioaktivně značené prekurzory syntézy NK, a přidáte ho tam jen na kratičkou chvilku, řádově minuty, a pak tam přidáte nadbytek neznačených prekurzorů, vyizolujete příslušnou DNA, dáte na ni fotografickou emulzi, necháte vyvolat a pod mikroskopem se podíváte co se dělo na jednotlivých vláknech DNA, tak můžete najít příklady, kdy byla zahájena replikace z replikačního počátku, kde jste přidali radioaktivní sloučeninu a někde jste přidali nadbytek neznačené sloučeniny. Z každého replikačního počátku se přibližně stejně účinně značí DNA na obě strany, to znamená že replikační počátky v toto případě jsou obousměrné. Replikační vidlička se posunuje jedním směrem, ale syntéza NK ve smyslu vzniku nového řetězce musí probíhat dvěma směry. Pan Okazaki ukázal, že syntéza jednoho řetězce probíhá kontinuálně, tzn. probíhá ve směru čtení. Zatímco syntéza toho dalšího řetězce probíhá diskontinuálně.

52

Paradox současné syntézy obou řetězců DNA:

• vedoucí („leading”) – kontinuální syntéza • opožďující se („lagging”) – Okazakiho fragmenty (přibližně stejně velké vždycky u daného

organismu, 1000 až 2000 nukleotidů u prokaryot, 100 až 200 nukleotidů u eukaryot)

Jak vypadají replika ční po čátky?

• E. coli - 13 bp a 9 bp repetice, AT bohatá oblast, jeden origin na genom (ori C) • S. cerevisiae - 15 bp AT bohatý konsensus, repetice, ≈ 400 počátků na genom (ARS –

autonomously replicating sequence) • S. pombe - cca 1000 bp, AT bohaté úseky • SV40 - ≈ 65 bp konsensus • člověk 104 až 105 počátků na genom • Archaea neprobádáné, nalezeny krátké repetice, AT bohaté

Replikační počátky se druhově velmi liší, ALE mají řadu společných znaků:

• unikátní krátké repetice ⇒ umožňují vazbu multimerních iniciačních faktorů (komplexů proteinů, které rozpoznávají počátek a které jsou složitě regulovány v průběhu buněčného cyklu – opakující se jeden protein nebo řada podobných proteinů)

• AT bohaté oblasti (v těchto oblastech je dvoušroubovice méně stabilní) • DUE (oblast helikální nestability)

• v blízkosti A/T bohatých oblastích, jsou vždy ohnuté a umožní vytvoření bubliny, která vytváří jakési napětí a právě potom tání těch A / T oblastí

• palindromatické oblasti (= sekvence, které se dají číst z obou stran stejně) – mají schopnost tvořit jakoby křížovou strukturu a ta většinou bývá součástí oblasti určité nestability dvoušroubovice DNA

Nicméně replikační počátky bakterií jsou rozpoznávány úplně jiným komplexem enzymů, jiným komplexem proteinů, jinak vypadajících než ty u eukaryot a archaea. Ale všechny mají celou řadu podobných věcí, nicméně jsou vždycky tak specifické, že se druhově velmi liší. Např. replikační počátky kvasinek Saccharomyces cerevisiae a Saccharomyces laktis se liší v jedné bázi a navzájem nefungují.

Bakteriální (prokaryotní) genomy jsou v naprosté většině cirkulární a původně se tvrdilo, že mají jenom jeden počátek. Velikost bakteriálního genomu u Escherichia coli je cca 4×106

53

bazí, savčí, rostlinné atd. genomy jsou výrazně vyšší s velikostí 109 až 1010 párů bazí, což má vliv na dobu nutnou pro replikaci. Replikace bakteriálního chromozomu trvá 40 minut, u Escherichia coli, s tím se nedá hnout. Pokud by eukaryotní genom byl také jednoreplikonní, tak by bylo problémem více chromozómů (Existují sice vyšší eukryota třeba nějaký mravenec má jenom jeden chromozom, tak v takovýchto případech by to šlo. Ale i kdyby byl na každém chromozomu jeden počátek, tak byste se dostali do nesmyslných čísel, že by replikace jedné buňky měla trvat 1000x déle než replikace chromozómu u bakterií). Genomy eukaryot mají více počátků, třeba u kvasinky Saccharomyces cerivesiae se odhaduje, že těch počátků je asi 400. U člověka je to 104 až 105 počátků.

Mapa lokalizace a struktury replikačního počátku E. coli, oriC. Trojúhelníky označují promotory. FIS = faktor stimulující inverzi; IHF = integrační host faktor. Toto je detailnější pohled na počátek chromozómu bakterie E. coli. Jsou tady A/T bohaté oblasti, oblasti repetitivních sekvencí, na které se vážou různé proteiny (světle růžové šipky jsou oblasti na které se váže DnaA protein, významný regulátor zahajování syntézy na všech bakteriálních počátcích). Pak tu jsou regulační oblasti, které umožňují například rozlišení mateřského a dceřinného řetězce methylací, to jsou ty GATC místa.

Replikace chromosomu má t ři základní fáze:

Každý proces má tři různé fáze:

1. Iniciace – u replikaci je nejjednodušší 2. Elongace 3. Terminace + rozchod dceřinných chromosomů

Replikace bakteriálního chromosomu ( E. coli )

ad. 1. Iniciace replikace

Dvě hypotézy regulace iniciace replikace:

1. hromadění pozitivního regul2. vyřeďování inhibitoru (IciA?)

Navrhovaný sled událostí vedoucích k iniciaci replikace:

1. Vyřeďování negativního regulátoru2. Vazba DnaA do oblasti oriC3. Tvorba agregátů 20 – 40 molekul DnaA

vazbu počátku → díky tomu vznikne po4. Vytvoření otevřeného komplexu v oblasti L, M, R 5. Tvorba komplexu DnaB (helikasa) DnaC6. Obsazení ssDNA SSB1 proteinem 7. Tvorba iniciátorové RNA (RNApol nebo

degradací RNasou H - regula8. Tvorba replikačních uzlů →

oblasti počátku (dam, mN6 pozice A v GATC)Seq A (sequestration)

9. Syntéza inhibitoru iniciace 10.Odpojení “originu” od membrány 11. Vyřeďování negativního a syntéza pozitivního regulátoru b

54

ní pozitivního regulátoru (DnaA?) ování inhibitoru (IciA?)

Navrhovaný sled událostí vedoucích k iniciaci replikace:

negativního regulátoru oriC (9 bázové repetice)

40 molekul DnaA (jejich hromadění pozitivně reguluje díky tomu vznikne počáteční bublina)

eného komplexu v oblasti L, M, R Tvorba komplexu DnaB (helikasa) DnaC

1 proteinem – rozšíření a stabilizace ssDNA oblastiTvorba iniciátorové RNA (RNApol nebo DnaG primasa), chráněna DnaA proteinem p

regulační role RNasy H → syntéza DNA Pol III komplexem → hemimetylace DNA v

N6 pozice A v GATC) → vazba počátku na membránu, protein

Odpojení “originu” od membrány → metylace počátku

ování negativního a syntéza pozitivního regulátoru během růstu bu

Toto je příklad bakteriálního replikauzlu (přibližně podobněeukaryotní model). Tady u bakterií vidíte replikační vidličku. Je zde syntetizovaný vedoucí řetězec a po Okazakiho kouscích syntetizovaný opožřetězec. Podstatné je, že opožřetězec musí být syntetizován tak, že pokaždé znova začíná. To znamená, že pokaždé se tam musí objevit osyntetizované RNA polymerázou, tzv. primázou . Pak tu jsou dvpolymerázy. Polymerázy u bakterií jsou poněkud jednodušší než u eukaryot, nicméně i tak se sestávají zpřibližně asi deset různých bílkovin.

reguluje postupnou

ení a stabilizace ssDNA oblasti na DnaA proteinem před

hemimetylace DNA v átku na membránu, protein

stu buňky

íklad bakteriálního replikačního podobně vypadá i

eukaryotní model). Tady u bakterií vidíte ku. Je zde syntetizovaný

zec a po Okazakiho kouscích syntetizovaný opožďující se

zec. Podstatné je, že opožďující se zec musí být syntetizován tak, že

íná. To znamená, že pokaždé se tam musí objevit očko syntetizované RNA polymerázou, tzv.

. Pak tu jsou dvě velké polymerázy. Polymerázy u bakterií jsou

kud jednodušší než u eukaryot, i tak se sestávají z celé řady,

zných bílkovin.

55

Základní organizace replikačního počátku. Červeně označeny sekvence elementů, které jsou vyžadovány za všech podmínek (tzv. core komponenty), žlutě jsou označeny sekvence elementů (strany vázající transkripční faktor), které za určitých podmínek napomáhají replikaci (auxiliární komponenty). Počátky obsahují AT bohaté elementy (A/T) s adeninem na jednom řetězci a thyminem na druhém řetězci, počátek rozpoznávající element (ORE) a DNA-neohýbající element (DUE).

ad. 2. Základní enzymy v replikaci (elongace)

• Bakterie mají více polymeráz, asi pět nebo šest, které se účastní různých fází replikace nebo které se účastní různých rekombinačních procesů. Hlavní jsou: Dna polymeráza III a DNA polymeráza I • DNA polymerasa I

• cca 600 b / min.; 400 molekul / buňku • má aktivitu polymerační a obě dvě exonukleázové aktivity, tzn. 5’ → 3’ exo (před

sebou odbourává řetězec); 3’ → 5’ exo (opravná aktivita) • po proteolytickém štěpení Klenowův fragment 68 kD – pouze pol. a 3’ → 5’ exo

aktivita • funkce – dokončení Okazakiho fragmentů, opravy • DNA polymeráza využívá 3’OH očko a před sebou umazává RNA vlákno a

postupně jede do DNA, kterou taky umazává • v tomto místě soutěží zároveň s enzymem ligázou (→ nízko procesivní enzym,

protože musí soutěžit – kdy ž by byl vysoce procesivní, tak by to, co DNA polymeráza III nasyntetizuje, tak by to před sebou odboural, jejím úkolem je jen doplnit několik nukleotidů a odpadnout)

• DNA polymerasa II (cca 50 b / min.; 100 molekul / buňku; 3’ → 5’ exo, funkce – opravy • DNA polymerasa III

• cca 15 000 – 30 000 b / min.; 10 molekul / buňku; 3’ → 5’ exo; 5’ → 3’ exo specifická pro ssDNA substrát

• hlavní replikační enzym, který opravdu je v té replikační vidličce a má obrovskou procesivitu a obrovskou rychlost (její rychlost narůstá od aktivního jádra, když se k tomu přidávají další a další bílkoviny)

• kompletní enzym je složen z více než 10 proteinů • když se sestavuje ten komplex na replikačním počátku, tak postupně se zvyšuje

aktivita a procesivita polymerázy • Procesivita polymerázy je parametr, který určuje jak dlouho polymeráza vydrží

syntetizovat nový řetězec než odpadne. Řada polymeráz je málo procesivní. Syntetizuje podle templátu nový řetězec a nasyntetizuje třeba 20 nukleotidů, spadne, musí přijít nová polymeráza, využije 3’OH očko, nasyntetizuje 100 nukleotidů, odpadne. To jsou málo procesivní enzymy. Vysoce procesivní enzymy jako je kompletní enzym DNA polymeráza III, jsou schopny zahájit syntézu na počátku replikace a odreplikovat minimálně jednu polovinu bakteriálního chromozómu.

56

• zvýšení procesivity dimerizací pomocí τ, interakcí se svíracím proteinem β (δγ komplexem rozeznávajícím primer ...)

• katalytické jádro αεΘ – nízká procesivita – cca 10 b • DNA polymerasa IV (DinB) – opravy DNA • DNA polymerasa V (UmuD, UmuC) – opravy DNA

• δγ umísťovací komple • ββββ svírací protein (beta clamp, u eukaryot se nazývá PCNA)

• u bakterií funguje jako homodimer a to sice „head to tail“ homodimer, to znamená že je propojená od N-konce bílkoviny k C-konci. Beta svorka funguje jako klapka lanovky, jako kroužek může obepínat dvouřetězcovou DNA a zároveň interaguje s DNA polymerázou. Vy ji posadíte na to lano a ona tam drží a syntetizuje, drží tam tu polymerázu. Výrazně zvyšuje procesivitu DNA polymerázy. Beta svorka je tam přinášena tzv. ββββ clamp loaderem

• syntéza opožďující se ho řetězce je vždy doprovázena periodickým uvolňování beta svorky

• ββββ clamp loader • heteropentamer vyskytující se u všech skupin organismů, který je schopen interagovat:

• s jednořetězcovou DNA • s beta svorkou • s DNA polymerázou

• schopen v místě originu přidat beta svorku • ττττ dimeriza ční protein – udržuje dvě aktivní polymeázy spolu v replikační vidličce • DNA gyrasa gyrA a gyrB

• topoizomerázy, která jsou v komplexu před helikázou • DnaB helikáza (helikáz je v buňce obrovské množství)

• replikativní helikáza je bílkovina, u bakterií homohexamer (DnaB helikáza) u eukaryot heterohexamer (NCM 2-7)

• vliv na zahájení replikace (replikační počátky) – odděluje od sebe silou dvoušroubovici za spotřeby energie z ATP • různé modely fungování helikázy, např. že helikáza čeká, až se tepelným pohybem

rozhýbne dvoušrobovice a jakmile se tam vytvoří místo, tak do toho místa strčí nohu • replikační vidlička (eukar.) → helikázu+ primázy(s polymerázou alfa) + vazebný

protein+dimerpolymeráza

• ssb-1 (single strand binding protein, u eukaryot se tent o protein nazývá RPA) • specificky rozpoznává jednořetězcovou DNA, převádí rovnováhu od dvoušroubovice

k jednořetězci • zabraňuje vláknům, aby znovu vytvořili dvoušroubovici, neboť v roztoku je preferována

dvoušroubovice • protein interaguje s jednořetězcem a pak tyto proteiny interagují sami se sebou –

kooperativně se navazují jeden na druhý, vzniká dlouhý obsazený úsek jednořetězcové nukleové kyseliny.

• DnaG primáza • jednořetězcová nukleová kyselina se stává templátem pro primázu, která nasyntetizuje

primer RNA sloužící pro zahájení syntézy Okazakiho fragmentů • DNA ligáza lig (NAD+), obecně jiné ligázy ATP nebo NAD+ jako zdroj energie pro vazbu

• spojuje fragmenty, takže vznikne řetězec bez přerušení • ve chvíli, kdy přerušení není mezi DNA a RNA, ale je to přerušení mezi DNA a DNA

(tzn. už je odbouraný RNA primer), se toto místo stává substrátem pro enzym ligázu, která tyto dva řetězce spojí • substrátem pro ni je jedna nepřerušená NK a pak druhý řetězec, kde je

jednořetězcové přerušení

• pro svou práci vyžadují energiiVzniká kovalentní intermediát jednak mezi AMP nebo nikotinmononukleonásledně kovalentní intermediát mezi tímto komplexem a DNA• energie, která tam byla vložena z

jednořetězcového přerušení• některé mohou fungovat bez templátu, n

Holoenzym DNA polymerázy III zachycený ve stádiu tvorby enzymového komplexu, který syntetizuje oba nové řetězce DNA

57

adují energii, kterou berou z ATP nebo, u E. coli, napVzniká kovalentní intermediát jednak mezi AMP nebo nikotinmononukleo

kovalentní intermediát mezi tímto komplexem a DNA nergie, která tam byla vložena z ATP nebo NAD+ je využita pro spojení toho

řerušení které mohou fungovat bez templátu, některé, důležité pro replikaci, vyžadují templát

Holoenzym DNA polymerázy III

enzymového komplexu, který DNA

Beta svorka funguje jako klapka lanovky, jako kroužek obepíná dvouřetězcovou DNA a zároveinteraguje s DNA polymerázou. Vy ji posadíte na to lano a ona tam drží polymerázu, která syntetizuje nové vlákno.

například z NAD+. Vzniká kovalentní intermediát jednak mezi AMP nebo nikotinmononukleotidem a

yužita pro spojení toho

ležité pro replikaci, vyžadují templát

Beta svorka funguje jako klapka lanovky, jako zcovou DNA a zároveň

DNA polymerázou. Vy ji posadíte na to lano a ona tam drží polymerázu, která syntetizuje

58

Procesivita polymerasy je přímo úmnasednutí enzymu na substrát.

59

římo úměrná délce sekvence syntetizované během jednoho nasednutí enzymu na substrát.

rná délce sekvence syntetizované během jednoho

60

Další podjednotky polymerasy - tedy δγτ (RF-C, PCNA u eukaryot) – zvýšení procesivity.

ad 3. Terminace

- u eukaryot není příliš prozkoumáno

- u bakterií se ukázalo, že na chromozómu existují série sekvencí, které se nazývají terminátory

- u gram negativních i u gram pozitivních bakterií se vyvinulo něco, kde jsou různé sekvence a na ně se váží různé proteiny, jejichž struktura je přibližně stejná a fungují stejně

- dva terminátory T1 a T2 fungující protisměrně

- umožňují projet replikačnímu komplexu skrz a replikační komplex se zastaví až na druhé straně

- když byly připraveny genomy, kde terminační sekvence nebyly, tak bakterie rostly poměrně v pohodě (je tedy otázka k čemu tam terminátory jsou)

- zřejmě tam nějaká evoluční výhoda bude, protože když se podíváme na jednotlivé geny, tak geny, které jsou silně přepisovány RNA polymerázou (např. nějaké geny pro ribozomální RNA), tak jsou vždycky u všech bakterií orientovány ve stejném směru jako běží replikace. RNA polymeráza při transkripci je výrazně pomalejší než replikující DNA polymeráza. DNA polymeráza je schopna přes RNA polymerázu přejet a nic se nestane pokud jede ve stejném směru. Pokud jedou proti, tak to skončí „čelní srážkou“. Evidentně je evoluční výhodou nevyhazovat si RNA „ze sedla“. Proto genom, který nemá terminační sekvence a zdá se opticky, že se nic neděje, tak v drsných podmínkách přírody to má význam.

- jak taková bílkovina na terminátoru vypadá? Vypadá jako když má taková rozevřená ramena (taková rukavice), která je schopna se nechat z jedné strany se přimáčknout a nechat celou DNA polymerázu a komplex přejet. Aby to účinně fungovalo je třeba mít jich více za sebou.

- požadavek na protein Tus (tus = termination utilization substance, rtp = replication terminator protein)

61

Tus-Ter vidličku zadržující komplex. Perpendikulární pohled na osu šroubovice DNA (červeně). Tus protein je složen ze široké N-terminální domény (modře) a malé C-terminální domény (zeleně)

62

s mezidoménovou oblastí (zlatě), která je složena ze dvou velmi dlouhých β řetězců obklopených třemi menšími řetězci. Na tomto obrázku se replikační vidlička, přibližující se z levého konce DNA, může projít skrze komplex…

Replikace eukaryontní DNA

Srovnání eukaryotických replika čních faktor ů s faktory E. coli

U eukaryot to vypadá velmi podobně, je tam helikáza, topoizomeráza, primáza. U eukaryot DNA replikační polymerázy, syntetizující Okazakiho fragmenty, zahajují už na DNA očko. Dále je tu nějaká ligáza. Rozdíl je ten, že očko je zde odstraňováno komplexem proteinů FEN1, RTH1, které mají funkci ribonuklázy H. Ribonukleáza H je obecný název pro bílkoviny, enzymy, které odstraňují RNA z hybridu DNA-RNA.

• ORC (origin recognition complex) = analogie DnaA – komplex proteinů, který rozpoznává počátek • ve vhodnou chvíli je ORC rozpoznán Cdc6 proteinem, který je syntetizován ve

funkčním stavu pouze v G1 fázi (regulace zahájení syntézy), následně modifikován fosforylací, vyměněn za Cdc45 protein (signál pro navázání primázy)

• MCM (minichromosome maintenance) = analogie DnaB (helikasa) • DNA polymeráza δ • DNA polymeráza εεεε (analogie DNA polymerázy III) – nejspíše odpovědná za syntézu

opožďující se ho řetězce • Faktor PCNA (proliferating cell antigen) tvoří trimer, připomíná β dimer E. coli, funguje

jako beta clamp • RF-C (replication factor C) = analogie δγτ komplexu – clamp loader • Polymeráza αααα

• analogie DnaG (primasa) • větší bílkovina, která se sestává ze dvou proteinů • tato polymeráza sama syntetizuje nejprve kratičké vlákno RNA a pak k tomu přidá

několik nukleotidů DNA • RF-A (RP-A = replication protein A) = analogie SSB proteinu • CR1 komplex – účastní se zpětného namotávání DNA na nukeozom (u bakterií není),

tzn. nandavání histonů na DNA, zpětný zisk histonového řetízku

63

• Podstatnou vlastností proteinů zúčastněných při iniciaci replikace jsou: vliv ATP na aktivitu, vliv fosforylace na aktivitu, kooperativní způsob vazby.

Jednořetězcová nukleová kyselina, obsazená RPA proteinem, je templátem pro polymerázu α. Pokud polymeráza α vytvoří primer, tak se substrát změní a najednou už k němu nemá takovou afinitu a jakoby soupeří (některé k sobě lepí víc, jiné míň, asociační a disociační konstanty). V tuto chvíli se stává spíše substrátem pro RFC protein a PCNA (clamp loader a svorka). V případě, když je tam primer a SSB (nebo RPA) protein, tak takovýto substrát se stává templátem, výhodným substrátem pro polymerázu δ. Clamp loader asociuje celý tento substrátový komplex s polymerázou δ. Substrátem jsou vždy jednotlivé spolu interagující a nově vzniklé biopolymery.

Další frekventované skupiny protein ů:

- helikázy

- buňka pořád potřebuje nějak manipulovat s nukleovou kyselinou, ať už je to DNA nebo RNA

- různého typu, DNA helikáz je celá řada, hexamery (heterohexamery)

- zajímavé DNA helikázy:

- PRN helikáza

- interaguje s mnoha proteiny replikačního aparátu jako je polymeráza δ, PCNA, topoizomeráza I, RPA

- WRN helikáza

- reaguje s mnoha molekulami

- objevena jako bílkovina, která je zodpovědná za nemoc Wernerův syndrom

- jedna z chorob předčasného stárnutí – lidé vypadají do puberty normálně a pak najednou začínají rychle dospívat, rychle stárnout (např. v 48 letech vypadají ženy jako osmdesátileté stařeny)

- tito lidé mají veškeré symptomy stárnutí, včetně stárnutí, stařecké demence atd.

- už jenom tím, na kolik molekul se váže, má zřejmě DNA helikáza celou řadu funkcí → není to jenom replikační DNA helikáza, ale je to zřejmě helikáza, která kromě jiného umožní replikačnímu komplexu překonat nějaké složité struktury, nějaké mutace, chemické přídavky na DNA, případně složité struktury, které není schopen replikační aparát sám jednoduše překonat. To znamená, že tam vznikne problém doprovázený třeba nějakou mutací

- pokud buňka nemá tuto helikázu, tak je tam určitá šance, že bude hromadit mutace. Hromadění mutací může být zřejmě jedním z důvodů pro předčasné stárnutí (helikáza se váže i na telomery, takže tam těch důvodů může být víc)

- protein KU7086

- heterodimer, bílkovina, která se

- vyskytuje se v telomerách a má celou

- protein p53

- hlídá to, zda je dobře zreplikován v

- mutace v tomto proteinu k rakovinnému bujení

Polymer áza

Podjednotky

(E. coli , MW v kDa)

α 165, 67, 58, 48

64

heterodimer, bílkovina, která se často váže na eukaryotní replikační poč

telomerách a má celou řadu regulačních funkcí

e zreplikován v eukaryotní genom

tomto proteinu vede ke zvýšenému počtu mutací v

Eukaryotické DNA polymerasy

Podjednotky

MW

Rodina Enzymová aktivita

165, 67, 58, 48 B DNA pol, primasa

Iniciace replikace, fragmentů

zlomů, regulace délky telomer, regulace

ní počátky

tu mutací v genomu a dále

Funkce

Iniciace replikace, „priming“ Okazakiho fragmentů, opravy dvouřetězcových

, regulace délky telomer, regulace

65

buněčného cyklu

β 39 X DNA pol,

5’ fosfatasa

Opravy vystřižením bází

γ 125, 35 A DNA pol,

3’ 5’ exo

Replikace mitochondriální DNA

δ 125, 66, 50 B DNA pol,

3’ 5’ exo

Elongace chromozomové replikace, opravy vystřižením nukleotidů nebo bází,

opravy nesprávných spojení, opravy dvouřetězcových zlomů, regulace

buněčného cyklu

ε 261, 59 B DNA pol,

3’ 5’ exo

Elongace chromozomové replikace opožďujícího se řetězce, opravy vystřižením nukleotidů, opravy nesprávných spojení, opravy

dvouřetězcových zlomů

ζ 353 B DNA pol Opravy, „translesion“ syntéza

η 78 Y DNA pol Opravy, „translesion“ syntéza

θ 198 A DNA pol, helikasa

Opravy DNA

ι ? Y DNA pol Opravy, „translesion“ syntéza

λ X Opravy vystřižením bází

µ X Spojování nehomologních konců

σ X Soudržnost sesterského chromatinu

Telomeráza RT Udržení telomer

κ Y „Translesion“ syntéza

Rev1 116 (S. cerevisiae) Y Deoxycytidylová transferasa

Opravy, „translesion“ syntéza

Archaea: Cdc6 homolog, DNA pol typu B (eukaryontní), RF-C (“clamp loader”), PCNA (“clamp”) a další proteiny spíše eukaryontního typu

66

Sada kompetitivních „přepínačů“ determinujících povolání primující strany. Pol α je pskrze soutěžení o interakci s RPA. Pol přemísťuje RFC skrze druhou kompetici o RPA.

čů“ determinujících je přemístěna RFC

RPA. Pol δ poté uje RFC skrze druhou kompetici o RPA.

67

Proteiny ú častnící se eukaryotní replikace DNA

Lidský protein Velikost lidského proteinu (kDa)

E. coli protein Aktivita

DNA polymeráza α, primáza

165, 70, 58, 49 Primáza a DNA polymeráza I nebo III

Syntéza RNA primeru, DNA polymeráza

DNA polymeráza δ, DNA

125, 48, 255, 55

Core polymerázy III, (podjednotky αθε)

DNA polymeráza, 3´-5´ exonukleáza

DNA polymeráza ε* Opravy

RF-C (replikační faktor C)

140, 40, 38, 37, 36

γ komplex polymerázy III (podjednotky γδδ´χψ)

DNA-dependentní ATPáza, PCNA loading

PCNA (jaderný antigen proliferace buněk)

36 β podjednotka polymerázy III

DNA polymeráza processivity faktor

RPA (replikační protein A)

70, 32, 14 SSB (protein vázající jednovláknovou DNA)

vazba na ssDNA, stimulace polymerázy, přepnutí polymerázy

68

MCM komplex? (minichromozomální údržba)

? dnaB protein DNA helikáza

(T antigen) (SV40 široký T antigen)

(95)

FEN1/RTH1 (záklopka exo/endonukleázy 1 / RAD dvouhomologní)

44 POLI RNA primer nukleáza

Ribonukleáza H1 49, 39 RNAáza H RNA primer nukleáza

DNA ligáza 1 102 Ligáza Ligace DNA

CAF-1 (chromatin shromažďující faktor 1)

150, 62, 60, 58, 50

– Shromažďování chromatinu

* DNA polymeráza δ a DNA polymeráza ε jsou dva kandidáti na replikační DNA polymerázu eukaryotních buněk. Homology DNA polymerázy δ u dalších druhů jsou složeny z více než dvou podjednotek.

Jak zabránit vícenásobné replikaci?

• více počátků na jednom chromosomu – zapínají se pouze jednou. Proč? • klíčová molekula Cdc6 – aktivní pouze od M do pozdní G1 fáze, poté deatkivace

fosforylací CDK (cyklin-dependentní kinasy) • kontrolní mechanismy jsou dány funkcí kináz, které jsou modifikovány dle interakcí s cyklinama,

cyklin dependentní kinázy inhibují tvorbu prereplika čního komplexu (inhibice vazby MCM proteinu, dokud neproběhne mitóza)

• CDK28 → aktivují prereplikační komplex s navázanýma MCM proteiny, zároveň inhibují sestavení komplexu dalšího

• CDK7 → účast při aktivaci pre-komplexu, vliv na fosforylaci MCM proteinu → neschopnost se vázat do komplexu

• některé proteiny (DnaA, Cdc6) aktivní pouze s navázaným ATP (Např: u eukaryot, proteinové modifikace, interakce s ATP protein DnaA, ORC se váží na počátek ve formě s navázaným ATP → ve chvíli aktivace, se z nich stane malá ATPáza a je změněna konformace, rozpad na ADP atd. → nemůže se navázat aktivovaná forma)

• titrace iniciačních faktorů jinými vazebnými místy mimo počátek (DnaA) • řešení u E. coli:

• Replikace chromozómu E. coli se vyskytuje vždy jen jednou na jedno dělení buňky, tzn. že tento proces musí být striktně kontrolován. Doba zdvojení E. coli je v závislosti na vnějších podmínkách od 20 min. do 10 hodin (+37 °C, do statek substrátu). Porovnání rychlosti replikace (1000 n/s) a velikosti genomu bakterie (4.6 × 106 bp) poskytuje replikační čas (tj. doba zdvojení chromozómu) » 40 min. Z porovnání doby zdvojení a replikačního času plyne logický závěr, že buňka musí zahájit replikaci ještě před ukončením předchozího cyklu dělení. Výsledkem je chromozóm s více replikačními vidličkami, které zaručují vznik nové kopie chromozómu vždy těsně před následujícím

69

buněčným dělením. Ačkoliv každý chromozóm tak obsahuje více OriC počátků, přesto v rámci jedné generace buňky dochází k zahájení vždy jen jedné replikace. Chromozómy jsou separovány do dceřinných buněk vazbou na membránu bakterie. Přednostně se na membránu vážou tzv. hemimethylované OriC. OriC přitom obsahuje methylační sekvence GATC přístupné pro tzv. Dam methyltransferázu, která methyluje A v této sekvenci. U čerstvě zreplikovaných dsDNA je jeden A v sekvenci GATC v OriC nemetylován, tj. vlákno je tzv. hemimethylované. Právě vazba těchto hemimethylovaných OriC na membránu zabraňuje iniciaci další replikace a zároveň garantuje rozchod čerstvě zreplikovaných chromozómů do dceřinných bakterií. Vazba chromozómu na membránu je zprostředkována proteinem SeqA, produktem tzv. seqA genu

Aktivace počátku nastává podobnými cestami u (a) E. coli a (b) eukarIniciátor (DnaA nebo ORC) se váže na počátek a umožňuje vazbu helikázy (DnaB nebo MCM) na počátek. Helikázy jsou vázány na počátek za pomoci tproteinu (DnaC nebo Cdc6).

70

átku nastává podobnými cestami u (a) E. coli a (b) eukaryotní buňky. Iniciátor (DnaA nebo ORC) se váže na

uje vazbu helikázy (DnaB átek. Helikázy jsou

átek za pomoci třetího

71

Sestavení a aktivace prereplikačních komplexů v pučící kvasince Saccharomyces cerevisiae a ve vajíčkách žáby Xenopus. ORC = počátek rozpoznávající komplex, Cdc = geny cyklu buněčného dělení, Cdc28 = Cdk1.

Model replisomu (The factory model)

Problém zakon čení, resp. postupného zkracování replikované DNA – důvody:

• syntéza DNA vždy od -OH primeru • na opožďujícím se (lagging) řetězci chybí očko na 3’-OH konci (zpožďující se řetězec

s primerem by vytvořili jednořetězcovou DNA, která by se následně odstřihla, což je nežádoucí)

Řešení:

1. cirkulární molekuly DNA - u cirkulárních DNA molekul není problém se zkracováním, ale s ukončením replikace – viz např. terminace replikace nukleoidu E. coli.

- problém vzájemné orientace směru replikace a transkripce (u E. coli – většina silně transkribovaných genů orientována po směru replikace)

- cirkulární plazmidy replikovány metodou valivé kružnice (bakteriofágy)

2. lineární molekuly • cirkularizace nebo vznik konkatemér• zakončení vlásenkou – Paramecium• většina eukaryot – telomery

se sekvence nukleotidu) • proteinové primery – adenoviry, lineární DNA bakteriofágy a plasmidy

72

irkulární plazmidy replikovány metodou valivé kružnice (bakteriofágy)

cirkularizace nebo vznik konkatemérů – bakteriofágy Paramecium

telomery (variabilní konce, dlouhé úseky genomu, obsa

adenoviry, lineární DNA bakteriofágy a plasmidy

irkulární plazmidy replikovány metodou valivé kružnice (bakteriofágy)

dlouhé úseky genomu, obsahující opakující

73

Telomery:

• brání zkracování konců chromosomů při replikaci • stabilizace konců chromosomů (konce bez telomer – např. vzniklé zlomem chromosomů –

mají tendenci rekombinovat) • struktura – tandemově uspořádané krátké repetice, jednořetězcová přerušení a

nepravidelnosti v uspořádání řetězců, specifické ukončení (např. vlásenka, G – kvartet) Telomera Repetice (ve sm ěru 5’ →→→→ 3’ od telomery k

centromé ře)

Tetrahymena – makronukleus CCCCAA

Oxytricha – makronukleus CCCCAAAA

Trypanosoma CCCTA

Dictyostelium rDNA CCCTA

Saccharomyces C2-3A(CA)1-3

Arabidopsis C3TA3

Homo sapiens C3TA3

• syntetizovány ribonukleoproteinem – telomerázou • specifický enzym (reverzní transkriptáza), který syntetizuje telomery • musí rozpoznat konec telomer a zároveň fungovat jako templát → reverzní

transkriptáza • asociovány se specifickými proteiny • poziční vliv na expresi přilehlých genů • řada somatických buněk je bez aktivní telomerázy ⇒ postupné zkracování telomer při

buněčných děleních ⇒ korelace mezi stářím buněk (jedince) a délkou telomér (určují tak délku života buňky a jedince) • použití při detekci nádorů • Telomerázy v aktivní formě v pluripotentních a germanálních buňkách

Struktura telomerázy

Telomeráza je protein-RNA komplexpřenáší RNA templát pro syntézu a opakování G-bohaté DNA sekvence telomery. Zde je zobrazena pouze telomerázového proteinu homologního k reverzní transkriptáze (zelenětranskriptáza je speciální druh polymerázového enzymu, který používá templát RNA k tvorbě řetězce DNA. Telomeráza je jedinečná v přenášení své vlastní RNA po celou dobu.

74

RNA komplex, který enáší RNA templát pro syntézu a

bohaté DNA sekvence telomery. Zde je zobrazena pouze část telomerázového proteinu homologního

reverzní transkriptáze (zeleně). Reverzní a je speciální druh

polymerázového enzymu, který používá zce DNA. řenášení své

T-smyčka na konci sav čího chromozom

(A) Elektronová mikrofotografie DNA na konci interfázního lidského chromozomu. Chromozom byl před zviditelndeproteinován a arteficiálnězobrazená smyčka je dlouhá ppárů nukleotidů. (B) Model struktury telomery. Vložení jednovláknového konce do obousměrných opakování tvokterá je přenášena a udržovánaspecializovanými proteiny, schematiznázorněno zeleně. Navíc je možné, jak je vidět, že konec chromosomu protočen na sebe prostřednictvím tvorby heterochromatinu přilehlého

čího chromozom ů

(A) Elektronová mikrofotografie DNA na konci idského chromozomu.

ed zviditelněním fixován, deproteinován a arteficiálně zahuštěn. Zde

ka je dlouhá přibližně 15.000 . (B) Model struktury

vláknového konce do rných opakování tvoří t-smyčku,

ována proteiny, schematicky

. Navíc je možné, jak je t, že konec chromosomu je ještě jednou

ednictvím tvorby ho k t-smyčce.

75

Dyskeratosis congenita – poruchy funkce telomerasy

- X-vázaná recesivní choroba p ředstavující více než 80 % p řípadů poruchy funkce telomerasy

- 91 % pacient ů jsou muži

- krátká postava (16 %)

- kožní příznaky: hyperpigmentace, dystrofní nehty

- selhávání kostní dřeně, periferní pancytopenie (93 %)

- další příznaky: narážka jícnu (14 %), plicní fibróza (19 %), cirhóza jater (5 %), hypogonadismus (8 %)

- imunitní abnormality: snížená nebo zvýšená hladina imunoglobulinů, nedostatek T- a/nebo B-lymfocytů

- mírná mentální retardace, poruchy učení (21 %)

- u většiny pacient ů nemoc propukla p řed 20. rokem života, p řevážně z infek čních komplikací deficitu imunity

- 90 % pacient ů mají ve 30 letech hematologické abnormality , selhávání kostní dřeně je hlavní příčinou předčasné nemocnosti u 71 % případů. Může se vyvíjet směrem k aplastické anemii nebo myelodysplasii

U cirkulárních DNA molekul není problém se zkracováním, ale s ukončením replikace – viz např. terminace replikace nukleoidu E. coli.

Problém vzájemné orientace směru replikace a transkripce. U E. coli – většina silně transkribovaných genů orientována po směru replikace.

76

Centromery:

Heterochromatin, který zajišťuje správný rozchod homologních chromosomů

Místo vazby dělícího vřeténka (tubulinu)

Druhově specifické sekvence

Chráněné silnými terminátory transkripce z obou stran

Minimální požadavek na typický lineární eukaryotick ý chromosom:

1. telomery – zajišťují stabilitu a nezkracování (stabilitu konstruktu) 2. centromera – zajišťuje segregaci (rozdělení do buněk) 3. replikační počátek – uchování informace (syntéza kopie) 4. schopnost replikovat se

Replikace u Archaea

Genomy obvykle cirkulární a jednoreplikonové. Nalezeny homology Cdc6 proteinu (chybí protein podobný DnaA proteinu). DNA polymerasa je eukaryotického typu (rodina B) nebo unikátní. Obecně jsou proteiny replikační mašinérie více podobné funkčním homologům eukaryot. U Euryarchaea (nikoliv však Crenarchaea) nalezeny proteiny podobné histonům a nukleozomy.

Tabulka faktorů, které katalyzují různá stádia DNA replikace

Faktor Archae a Eukarya a Bakterie (E. coli)

Iniciátor Orc1/Cdc6 ORC DnaA

Zavaděč helikázy Orc1/Cdc6 Cdc6 + Cdt1 DnaC

Helikáza MCM MCM komplex DnaB

Vazba jednoho řetězce (SSB)

Různéb RPA SSB

Primáza Primáza (2) Primosom (4) DnaG

Replikační DNA polymeráza

B-typ (C+E)c D-typ (E)

Pol δ a ε DNA Pol III

Klouzající svorka PCNA PCNA β-svorka

Zavaděč svorky RF-C RF-C γ-komplex

Ligáza DNA lig 1 DNA lig 1 Ligáza

77

Zpracování RNAáza H/Fen 1 RNAáza H/Dna 2/Fen 1

RNAáza H

a) Eukaryotní ORC komplex má 6 podjednotek, Orc1 až Orc6. Archaea má proteiny, které jsou homologní k Orc1 a Cdc6 a jsou nazývány Orc1/Cdc6

b) Různé archeální druhy mají jedinečné SSB, proto je zde „různé“

c) Zde je bifurkace („bod zvratu“) v distribuci polymeráz u Crenachraeota (C) a Euryarchaeota (E). Crenarchaea má pouze B-typ replikačních DNA polymeráz, zatímco euryarchaea mají obě, B- i D-rodinu enzymů.

Replikace mitochondriální DNA

• ČLOVĚK – transkripce všech genů z jednoho hlavního promotoru na každém řetězci mtDNA (LSP = light-strand promoter, HSP = heavy-strand promoter), replikace jednosměrná, iniciována transkriptem z LSP v tzv. D-loop (displacement loop) • model pro jejich replikaci vychází z D-smyčky (obecně u savců); RNA polymeráza, která se

účastní transkripce mtDNA, může být za určitých okolností použita pro syntézu nového řetězce • pokud k tomu dojde a řetězec je replikován, tak po chvíli je odhalen skutečný počátek, který je

rozpoznán mtPrimázou , která zahájí syntéza na počátku • KVASINKA – 19 promotorů, replikace obousměrná, složitější regulace replikace (více

replikačních počátků) • hlavní enzymy: primasa, RNasa H, DNA polymerasa γ

Chloroplast

• jeho replikace není moc prozkoumána • využívají komplementarity a rekombinací úseků na invertovaných repeticích → vznik

složité invertované molekuly

Kvasinka

Opravy DNA

• Buňka je schopná rozpoznatnějaké chyby → její aparát je schopen tyto chyby rozpoznat a opravit je

• DNA je vždy dvouvláknová (až na ndá opravit podle druhého vlákna. Ppodle čeho ji opravit

• funkce proteinu p53 → buňka signál a dle velikosti problémureplikace)

• u jednobuněčných bakterii se dle míry signálu spouští rsložitější, po opravy aby buňtřeba i mutanti

• u jednobuněčných je strategie populanebezpečí

Vznik poškození a) Při replikaci → zařazení nestandardní bázeb) Rekombinační chyby → mutace, pc) Působení fyzikálních vlivů →d) Vliv oxidace → modifikace bází, e) UV záření, ionizující záření, interkala

78

Člověk

poznat, jestli se replikovat bude (body G1, G2) či nikoliv a tedy jestli má aparát je schopen tyto chyby rozpoznat a opravit je

(až na některé bakterie), díky tomu, pokud se vyskytnepodle druhého vlákna. Pokud by byla jednovláknová, nelze ji opravit

buňka je schopna rozlišit přerušení vlákna či jiné problémy, pak pproblému DNA opravit či nikoliv (nastává buď apoptoza

ných bakterii se dle míry signálu spouští různé dráhy od jednoduchých oprav, pjší, po opravy aby buňka alespoň přežila a aby se oddělily chromozomy a vznikly 2 bu

strategie popula ční → namnožit co nejvíc buněk, vysílání SOS v

azení nestandardní báze mutace, přeskupení genu, inzerce transpozibilních element→ Př: alkylace (kouření)

modifikace bází, největší škody vlivem oxidace způsobují mitochondrie , interkalační látky atd.

i nikoliv a tedy jestli má

vyskytne chyba, tak se ová, nelze ji opravit, protože není

problémy, pak předat nebo zastavení

zné dráhy od jednoduchých oprav, přes lily chromozomy a vznikly 2 buňky,

k, vysílání SOS v případě

bilních elementů

mitochondrie

79

f) Mutace (substituce, delece, inzerce) → škodlivé, neutrální, výhodné… atd. Př. Mutace pro vstup viru HIV do buňky, mutace pro srpkovitou anemii, cystická fibróza

Mutace mohou byt opraveny 1) fotoreaktivace → mutace, které vznikly ze dvou pyrimidinů vedle sebe

- oprava pyrimidinových dimerů mechanizmem fotochemického štěpení dimerů za účasti enzymu DNA fotolyázy (fotoreaktivní enzym). Tento enzym vyžaduje pro svoji aktivaci viditelné světlo a přímá enzymatická reparace se nazývá fotoreaktivace . Většina poškození DNA nemůže ale být přímo opravována, poškozená místa jsou opravena mechanizmem excisní reparace - pokud vznikne cyklopropanový kruh, tak DNA polymeráza to není schopna přečíst

2) alkylační agens → oprava pomocí enzymů (alkyltransferázy ), schopny odstranit adukt na DNA 3) bázová oprava (excize), báze jsou specifickými glykosilázami vyštěpeny (vzniká apurinní nebo

apypirimidinní místo) 4) nukleotidová excize → vyštěpení delšího úseku DNA, jeho degradace a nahrazení 5) postreplika ční oprava chybného párování („mismatch repair“) → závislé na rozpoznání

nového a původního vlákna na základě methylace (původní vlákno je methylováno, nové ne), u eukaryot a archaea rozlišeno, dle toho, které má Okazakiho fragmenty

Nejčastější poškození: - 104 až 105 v každé buňce vzniklých chyb jsou vlivem mitochondrií - vznik apurinních mist Jiným příkladem možného poškození DNA je deaminace cytosinu. Cytosin obsažený v DNA

spontánně deaminuje na uracil. Deaminace, resp. její produkt - uracil – je potencionálně mutagenní. U se páruje s A, naopak C s G. Této mutaci je ale předcházeno schopností reparačního systému rozpoznat uracil jako součást cizí pro molekulu DNA a nahradit nesprávný nukleotid správnou sekvencí.

- deaminace cytosinu → probíhá jako hydrolýza, vznikne enol forma uracilu, která se tautomerním přechodem na tento uracil skutečně přemění - cytosin bývá často v pozici 5 methylován, jakmile je ale methylovaný cytosin deaminován, mění se na 5-methyl uracil (což je thymin) → signalizace, že chromatin bude umlčen (nebude transkripčně upotřeben) → paruje G-T - tato chyba se dá rozeznat speciální glykosilázou , která tento thymin je vyštěpí (u obratlovců je ale neúčinná) - tato chyba je velmi častá v CpG ostr ůvcích , proto je v zájmu buňky tyto ostrůvky nemít, protože deaminace je velmi častá. Z toho důvodu se CPG ostrůvky těsnají do oblasti promotoru, které jsou transkripčně aktivní pouze v embryonálním období.

Opravy nejvíce prozkoumány u bakterií: K odstranění poškození u E. coli jsou indukovány 3 enzymatické aktivity: • enzymatický komplex – proteiny kódované UvrABC geny detekují poškození řetězce (struktury

dvojité šroubovice DNA) způsobené dimery • proteiny UvrA a UvrB se váží na DNA a částečně rozplétají poškozený úsek DNA • UvrC enzym štěpí DNA řetězec – 8 nukleotidů od dimeru směrem k 5’ konci a 4 nukleotidy směrem

ke 3’ konci • 12mer – oligonukleotid vyštěpený touto vysoce specifickou exonukleázou je helikázou II odstraněn

od řetězce DNA (štěpí se pouze 1 vlákno – nesoucí poškození, dimer) • DNA polymeráza I vyplní vzniklou mezeru, jako primer slouží vlákno DNA předcházející

vyštěpenému fragmentu • DNA ligáza spojí kovalentní vazbu DNA řetězce

80

Princip u eukaryot je stejný. Štěpení je signál pro navázání dalších bílkovin, které vytěsní jednořetězcovou DNA, která je degradováná → vznik nekompletního dvouřetězce. 3´OH očko je použito DNA polymerázou pro doplnění řetězce. Mismatch repair → postreplikační, specifická pro nově syntetizovaný řetězec, poškozené místo je

rozpoznáváno sérií bílkovin, které aktivují další bílkovinu, ta rozštěpí nově syntetizovaný řetězec i s proteinem, řetězec je následně degradován a opraven.

Opravy rekombina ční: provádí se, když dojde k replikaci a těsně po ní je v řetězci více podobných částí sekvencí (více kopií nějakého úseku). Účastní se ji další bílkoviny RAK → schopna vytvořit troj řetězec, kdy se v určitém místě navzájem propojí „hollyday junction“ , toto spojení se může posunovat a může být rozpojeno: a) buď opět na dva původní řetězce b) za vzniku dvou rekombinovaných řetězců

Nehomologní propojení konc ů: časté u rakovinných buněk; pokud buňka nemá k dispozici jiný chromozom a má nějaké volné konce, které jsou lepivé, snadno tak mohou tyto dva konce (vzniklé rozpojením) být zpět propojeny. Pokud nějaká báze přibyla, tak vznikne mutace, pokud rozpojeno víc kousků, možnost jiného napojení za vzniku chromozomových p řestaveb → dává to buňce možnost přežít.

Nukleotidová excize u Archaea: u organismu s vyšší optimální teplotou (víc jak +55 C° – termoplazma, archaeoglubus, pyrokokus) mají jinou nukleotidovou excizní opravu.

Rekombina ční oprava u dvou řetězcového p řerušení: Eukaryota (klíčová molekula RAF51), bakterie (protein REK-a), archaebakterie (protein RAK-a) → podobný eukaryotnímu

Praxe: Často dochází v buňce k chybám, testuje se spousta léčiv a chemikálií, jestli nejsou kancerogeny (nebo mutageny na základě 1) něčeho co zname, 2) in vivo (bakterie), 3) in vitro „Ames ův test“ používá několik kmenů bakterie Salmonella typhimurium, nesoucí mutace v genech, účastnících se syntézy aminokyseliny histidinu. Tyto mutované kmeny tedy vyžadují externí zdroj histidinu. Sleduje se schopnost testované látky způsobit reverzní mutaci a obnovit růst bakterie v mediu bez přídavku histidinu. Bakteriální kmeny jsou speciálně vytvořeny tak, aby obsahovaly jak bodové mutace, tak mutace posunující čtecí rámec. To umožňuje detekci mutagenů, působících různými mechanismy. Některé specifické sloučeniny způsobují reverzní mutaci pouze u jednoho či dvou kmenů. Testované bakteriální kmeny jsou navíc mutovány v genech, zodpovědných za syntézu lipopolysacharidů, což usnadňuje prostup mutagenu buněčnou stěnou a také mutace v reparačním systému buňky, čímž se zvyšuje senzitivita testu. Pro stimulaci metabolismu se přidává extrakt z krysích jater, jelikož některé sloučeniny samy o sobě nejsou mutagenní, ale jejich metabolity již ano. Bakterie jsou kultivovány na agaru s malou dávkou histidinu, která umožňuje nastartovat růst. Po vyčerpání této iniciační dávky, přežívají pouze reverzně mutované bakterie, které jsou schopny autonomní syntézy histidinu. Mutagenní potenciál sloučeniny se stanoví na základě počtu pozorovaných kolonií po 48 hodinách.

Vznik mutací má za následek vznik rakoviny (ne u všech stejně), pozitivní mutace….

Přepis informace z DNA do RNA (transkripce) RNA se přepisuje podle DNA. Důvod je evoluční, původní molekula RNA (nebo její předchůdce) se vyvinuly do DNA, funkční nukleové kyseliny zůstaly RNA. Buňka musí regulovat přepis nukleových kyselin.

Mechanický pohled

Regulace na úrovni p řepisu:

a) Zahájení

81

b) Prodlužování c) Úpravy vzniklé RNA

Dřívější hypotézy transkripce u eukaryot tvrdily, že všechny RNA kódující proteiny jsou do určité míry přepisovány. Později e učilo, že některé RNA jsou v dané buňce v daném okamžiku přepisovány silněji, jiné slaběji, jiné nejsou přepisovány vůbec. Díky pokroku je potřebné množství RNA pro RNA analýzu menší než dřív a tak lze v buňce nalézt RNA, kterou jsme tam dříve nenašli. V každé buňce se tedy i v nepatrných množstvích produkují všechny RNA.

Vlastnosti buňky dány vlastnostmi biopolymerů a biopolymerních struktur vyššího řádu. Ve smyslu původu struktur pak především proteinů.

Definice genu:

Organizovaný úsek nukleové kyseliny projevující se a přenášející se jako základní jednotka dědičné (genetické) informace.

Strukturní gen – kóduje polypeptid, rozlišovány objeviteli díky genetickým závislostem (Mendel, Morgan, Beadle, Tatum ...)

Gen kódující funkční RNA – kóduje tRNA, rRNA a řadu dalších RNA, jsou stále přepisovány

Gen jako regulační nebo strukturní oblast – promotory, enhancery, centromery, telomery ...

Gen jako dědičná variabilní oblast nukleové kyseliny – satelitní polymorfní DNA ...

Nejekonomičtější způsob regulace projevu (exprese) genů kódujících proteiny je na samém počátku = regulace syntézy mRNA, tedy regulace transkripce. Regulace probíhá i na dalších krocích (Dystrofin nejdelší lidský gen (2Mpb) se přepisuje několik hodin).

Jak se liší jednotlivé “druhy” genů z hlediska toku genetické informace?

Přepis probíhá pouze u strukturních genů a genů pro různé RNA. Pouze u strukturních genů na přepis navazuje překlad (translace) RNA do polypeptidu.

82

Složení chromosomu I mezi 141453 – 230203 bp.

Transkripce z DNA do RNA je katalyzována DNA programovanou RNA polymerázou, probíhá vždy ve směru 5’ → 3’ nově syntetizovaného řetězce a je nesymetrická, tj. je přepisováno pouze jedno vlákno DNA ([-], nekódující, antisense). [+] vlákno, kódující, sense má sekvenci shodnou s přepisovanou RNA.

Oblast přepisovaná do jedné RNA = transkripční jednotka. Je ohraničena regulačními oblastmi:

• promotorem – regulační oblast zodpovědná za zahájení transkripce • terminátorem – ukončení přepisu

První nukleotid přepisované RNA odpovídá bodu startu transcription-start site) na DNA (+1). Sekvence před tímto bodem, tj. proti proudu transkripce = “upstream”, (-1, -2,-3, …).

Sekvence za tímto bodem, tj. po proudu transkripce = “downstream”, (+2, +3, …).

Čerstvě přepsaná RNA (primární transkript) je obvykle v této formě velice nestabilní:

• mRNA prokaryot – často rychle degradována • mRNA eukaryot a ostatní přepisovaná RNA (tRNA, rRNA) prokaryot a eukaryot –

posttranskripční modifikace

83

Transkrip ční jednotka – celá oblast, která je kopírována, monocystroní obsahují 1 gen, u bakterií polycystroní jednotky (více transkriptů regulováno najednou)

Eukaryota obvykle monocystroní (u Caenorhabditis několik tisíc polycystroních transkripčních jednotek)

rRNA - syntetizována ve formě prerRNA a úpravy, výjimka eukaryotní 5S rRNA (syntéza zvlášť)

- syntéza rRNA je mnohem intenzivnější než mRNA pro bílkoviny → buňka potřebuje hodně proteinů, proto musí syntetizovat hodně rRNA

RNA polymeráza Archaea je více podobná eukaryotní polymeráze, i iniciace je podobná.

Eukaryota mají pro různé geny různé RNA polymerázy, Archaea mají, stejně jako bakterie, jednu RNA polymerázu.

Prokaryotický typ p řepisu

• přepis strukturních genů je úzce spojen s translací, přepsaná RNA je zároveň překládána • Jediná RNA polymeráza, relativně nízká variabilita v promotorech a omezený počet

dalších transkripčních faktorů • Primární transkripty jsou obvykle polycistronní. • mRNA obvykle není posttranskripčně modifikována (u eukaryot ano – nástroj modifikace

projevů genů a pro zahájení transkripce) • Velké rozdíly v sekvencích promotorů a v AMK sekvencích RNA polymeráz a

transkripčních kofaktorů mezi jednotlivými druhy bakterií.

Podjednotkové složení RNA polymeráz. Velikosti podjednotek jsou přibližné; obrázek je generalizován a není určen k přesnému zobrazení interakcí podjednotek nebo enzymové struktury.

Prokaryotická RNA polymeráz

Složení katalytického jádra enzymu

Podjednotka

α vazba β a βněkterých aktivátor

β katalytická podjednotka

β’ vazba k templátu

Katalytické jádro bakteriální RNA polymerázynáhodně. Za specifitu k promotoru je zodpovpolymerázy na DNA, dojde k otevPo infekci T4 fágem dochází k ADPbakteriálním promotorům.

Regulace genové e xprese vpolymerázy

- u eukaryot je tzv. aktivační typ transkripce, eukaryotní RNA polymeráza nemá afinitu k

Sekvence skládání RNA polymeráz

- 2 dimerizační podjednotky α,

84

Promotor je ,,vpravo“ začátku krátká RNA, na konci genu dlouhá

polymeráz a

Složení katalytického jádra enzymu

funkce gen velikost (kD

β’ k sobě, vazba kterých aktivátorů

rpoA 36

katalytická podjednotka rpoB 150

vazba k templátu rpoC 160

bakteriální RNA polymerázy má afinitu k DNA templátu, ale nasedá Za specifitu k promotoru je zodpovědný faktor σ. Dojde–li k navázání

otevření DNA, usazení RNA polymerázy a zahájení transkripce. Po infekci T4 fágem dochází k ADP-ribosylaci α podjednotky → snížená afinita k

xprese v bakteriální bu ňce – represory – brání nasednutí RNA

ční typ – promotor se obsadí celou škálou faktorůeukaryotní RNA polymeráza nemá afinitu k DNA

polymeráz y:

, katalytické jednotky β, β‘, ω a σ faktor

Promotor je ,,vpravo“ – nejdřív je na krátká RNA, na konci genu

velikost (kD)

má afinitu k DNA templátu, ale nasedá navázání σ faktoru a

ení DNA, usazení RNA polymerázy a zahájení transkripce. snížená afinita k

brání nasednutí RNA

promotor se obsadí celou škálou faktorů, aby mohla začít

85

- α + α → α2 + β → α2β + β’ → α2ββ’ = katalytické jádro + σ = α2ββ’σ = funkční iniciační komplex (holoenzym – cca 3000 molekul na buňku) + ω

Bakteriální σσσσ faktory

- odpovědné za rozlišení konkrétního promotoru – základní je σ70

- bakteriální buňka má ještě jiné σ faktory (pokud nejsou nepříznivé podmínky)

- u sporulujících bakterií je sporulace řízená kromě jiného kaskádou syntézy různých σ faktorů

- např. σ faktor 54 neumožňuje zahájení transkripce RNA polymerázy, ale umožní rozpoznat konkrétní promotor, pak v závislosti na interakci s proteiny, které umožní zahájení transkripce, spustí transkripci

Příklady σσσσ faktor ů u E. coli

faktor funkce gen velikost (kD)

σ70 normální iniciace rpoD 83

σ32 teplotní šok rpoH 32

σ28 (F) geny pro chemotaxi a pohyb fliA 28

σ38 (S) stacionární fáze a stres rpoS 38

σ54 hladovění na dusík rpoN 54

Fáze transkripce:

1. rozpoznání templátu a iniciace 2. elongace 3. terminace

Rozpoznání templátu + iniciace

• nalezení promotoru – vazba na DNA, syntéza prvního nukleotidu Typický prokaryotický promotor obsahuje -10 konsensus (Pribnowovu) a -35 konsensus sekvence, kde -10 sekvence začíná 7 bází od +1 nukleotidu (obvykle purin) a -35 sekvence začíná 17 b od -10 oblasti.

-10 konsensus*

86

T80A95T45A60A50T96

-35 konsensus*

T82T84G78A65C54A45

* čísla u jednotlivých bází znamenají výskyt dané báze v procentech (u promotorů závislých na σ70)

Pro různé příležitosti – různá síla promotorů.

Množství primárního transkriptu je určeno a) silou promotoru (někdy i dva v tandemu), b) genovou dozí (počet kopií genů, většina strukturních genů je unikátních)

• RNA polymeráza v komplexu se σ faktorem nasedá na promotor do -35 oblasti a posunuje se k -10 oblasti. V této fázi chrání sekvenci v rozmezí -55 až +20. Vytvoření iniciační bubliny na DNA.

• Negativně nadšroubovicová DNA = lepší templát pro zahájení transkripce, je uvolněnější • Kaskáda specifických σ faktorů využívána např. při sporulaci B. subtilis nebo některými

bakteriofágy (např. SPO1 B. subtilis)

Elongace

• vznik ternárního komlexu • syntéza 40 až 60 bází / sekundu (48 b.s-1 respektive až 90 b.s-1 pro rRNA) • po syntéze cca 9 bází (5’ → 3’, NTPs, uvolnění pyrofosfátu) uvolnění σ faktoru (u B.

subtilis zůstává asociován s RNA pol. po celou dobu) a případné navázání dalších faktorů účinkujících při elongaci a terminaci (NusA, NusB, NusG) a “proofreading” aktivitě? + uvolnění z míst předčasného zastavení (GreA, GreB); do uvolnění σ faktoru = tzv. abortivní iniciace (RNA pol. chrání cca 60 bp) Abortivní iniciace transkripce – všechny RNA polymerázy jsou schopny stálé syntézy malého množství nedokončené RNA i když transkripce ještě neběží (jako když se zahřívá motor). U Gram- bakterií σ faktor po ukončení abortivní fáze opouští komplex, u Gram+ se předpokládá, že tam zůstává.

• po syntéze cca 15 – 20 b další konformační změna RNA pol. (chrání cca 30 až 40 bp) • RNA pol. má větší afinitu k sense řetězci DNA • RNA polymeráza se pohybuje “píďalkovitě” v krocích 7 – 8 b nascentního transkriptu • odvíjení a zavíjení DNA během elongace – šířka bubliny 12 – 20 bp

Elonga ční faktory

Nus faktory (A, B, G) – u bakterií esenciální, zvyšují rychlost polymerace u RNA polymerace, účastní se transkripce na genech pro ribozomální RNA

GreA, GreB faktory – malé proteiobnovit syntézu (když RNA polymeráza pvyšší než 10-6, než DNA polymerázy)

Když RNA polymer áza udě

a) RNA polymeráza tam ch

b) RNA polymeráza odpadne

c) oprava – RNA polymeráza se zastaví a pak posune zpproteiny, které způsobily zastavení

Terminace

• ukončení transkripce a disociace ternárního komplexu• terminace vždy závislá na struktu

ITP) • dva typy terminátorů, fungují na úrovni RNA ( syntézu

87

proteiny, umožní RNA polymeráze při zastavení nebo zpomalení u (když RNA polymeráza přeskočí – RNA polymerázy mají vyšší chybovostnež DNA polymerázy)

áza udělá chybu jsou 3 možnosti:

hybu nechá a pokračuje

b) RNA polymeráza odpadne → vzniká nefunkční transkript

RNA polymeráza se zastaví a pak posune zpět, dojde o odštsobily zastavení – vytvoří se nové 3’OH očko a zaháj

ení transkripce a disociace ternárního komplexu terminace vždy závislá na struktuře a sekvenci nascentního transkriptu (zám

, fungují na úrovni RNA ( syntézu zastaví nově nasyntetizovaná RNA)

i zastavení nebo zpomalení vyšší chybovost,

t, dojde o odštěpení 3‘ řetězce ko a zahájí se trankripce

sekvenci nascentního transkriptu (záměna GTP za

nasyntetizovaná RNA)

88

• a) závislé na ρ (50 – 90 b oblast primárního transkriptu bohatá na C, “upstream” od konce) • faktor ρ funguje jako hexamer, má ATPázovou (helikázovou) aktivitu, interakce s

NusA, NusG a β podjednotkou RNA pol. • pokud ρ fakor narazí na sekvenci, která je ρ faktorem rozpoznávána, tak je schopen

se navázat na RNA polymerázu a pomocí helikázové aktivity „vytáhne“ RNA z RNA polymerázy

• oblasti, které fungují jako ρ závislý terminátor jsou bohaté na cytosin • RNA polymeráza se dále zastaví v oblastech DNA, které jsou strukturně složité • pokud je RNA rychle syntetizována a obsazena ribozomy, tak se ρ faktor nemá kam

navázat. Jakmile se v blízkosti RNA polymerázy objeví větší úsek, který je neobsazený ribozómy, tak se ρ faktor může navázat

• pokud se tam objeví potenciální terminátor závislý na ρ faktoru, může být využit a RNA polymeráza zastaví činnost

• nonsense mutace mají polární efekt na transkripci distálních genů = ρ zprostředkovaná terminace • polární efekt mutací = mutace, která by se měla projevit na úrovni translace,

může ovlivnit transtrikpci genů, které jsou uvnitř jedné transkripční jednotky • antagonista ρ – antiterminační protein (bakteriofágy atd.)

• b) nezávislé na ρ = obligátní (vlásenka bohatá na GC, 4-8 U na konci) • bohaté na GC páry a jsou schopny tvořit stabilní vlásenku • ve směru 3‘ obsahují úsek, kdy do nascentní RNA je zabudováno několik zbytků

kyseliny urydilové (uridin fosfát)

Vnitřní terminátory obsahují palindromické oblasti, které tvoří vlásenky různé délky (7 – 20 bp). Struktura vlásenky se smyčkou obsahuje G-C bohaté oblasti a je následována vláknem s U-zbytky

89

ρ závislý terminátor má sekvenci bohatou na C a chudou na G, která předchází skutečné straně (stranám) terminace

ATP

ADP + P

90

ρ faktor: transkripce terminace ve 4 krocích

1) N-terminální doména ρ faktoru (modře), která obsahuje 1´ mRNA vazebné místo, se váže na „rut“ sekvenci mRNA transkriptu. ρ faktor je zobrazen jako otevřený kruh, ale může být stejně tak v tomto kroku jak otevřený, tak uzavřený. 2) C-terminální doména ρ (oranžově), která obsahuje 2´ mRNA vazebné místo, váže mRNA po směru („downstream“) od „rut“ a ρ hexamerový kruh se uzavírá. 3) C-terminální doména ρ cyklicky váže a hydrolyzuje ATP k pohánění sebe po mRNA ve směru 5´ k 3´. N-terminální doména se může v tomto kroce uvolnit z „rut“. 4) ρ faktor působí jako helikáza na pár vázající ATP a hydrolyzuje uvolnění nukleové kyseliny. Výsledkem toho je uvolnění mRNA z genomové DNA a RNA polymerázy (růžově).

Obrat RNA v bu ňce (“turnover”)

rRNA ~ 70 – 80 % celkového obsahu RNA

tRNA ~ 15 %

mRNA ~ 3 – 4 %

• rRNA a tRNA – stabilizovány modifikacemi, terciární strukturou, asociací s proteiny • mRNA – nestabilní; průměrný T1/2 = 40 sekund • degradace mRNA většinou nastartována endonukleotickým štěpením od 5’ konce a

následným 3’→ 5’ štěpením vzniklých fragmentů • účast enzymů aktivních v posttranskripčních úpravách

Posttranskrip ční úpravy

• rRNA

91

jednotlivé rRNA vystřiženy z polycistronního primárního transkriptu (35S) a dále modifikovány

5’ vedoucí sekvence – 16S rRNA – mezerník (často tRNA) – 23S rRNA – 5S rRNA – koncová sekvence 3’

některé bakterie (např. Salmonella typhimurium) obsahují v genu pro 23S další vložené sekvence tzv. “intervening sequence”

• tRNA vystřižení z polycistronní RNA, maturace konců a modifikace

u některých tRNA ještě přisyntetizování CCA-OH na 3’ konec tRNA nukleotidyltransferasou

• mRNA obsahují nepřekládané oblasti (Shine - Dalgarno, atenuatory atd.)

většinou žádná modifikace, některé nesou krátké poly(A) sekvence na 3’ koncích (nalezeny především u mutantů bez 3’-exonukleasových aktivit)

• některé enzymy zúčastněné v maturaci a obratu prokaryotických RNA RNáza P ribonukleoprotein skládající se z polypeptidu (gen rnpA) a

katalytické RNA (gen rnpB)

RNáza III štěpí dsRNA

RNáza E štěpí pouze 9S prekursor 5S rRNA a RNA I regulující iniciaci replikace ColEI plasmidu

RNáza D Maturace CCA-OH konce tRNA exonukleasa

tRNA nukleotidyltransferáza viz výše

Eukaryotický typ p řepisu

• Přepis jaderných strukturních genů je oddělen od translace – kompartmentace • Model zahájení transkripce je jiný než u bakterií • Více RNA polymeráz, vysoká variabilita mezi promotory, rozsáhlé promotorové oblasti a řada dalších regulačních sekvencí, velké množství transkripčních faktorů.

• Primární transkripty jaderných strukturních genů v naprosté většině monocistronní • Eukaryontní geny jsou často přerušeny introny • mRNA obvykle posttranskripčně modifikována

92

• T1/2 = obvykle delší • Častější regulace i na úrovni translace • Kombinatorický a kooperativní způsob regulace transkripce • Navíc transkripce v organelách.

Typy bun ěčných RNA

• Heterogenní jaderná RNA (hnRNA) = prekursorová mRNA • Ribozomální RNA = 5,8S, 18S, 28S, 5S rRNA (savci) • Transferová RNA (tRNA) • Malé buněčné RNA (snRNA, snoRNA, scRNA, miRNA)

Buněčné RNA polymerázy

Eukaryotní buňky mají mnohem více RNA polymeráz (dají se rozlišit podle citlivosti k α amanitinu, ale se spoustou výhrad – druhová specifita)

- dogma 3 polymerázy – RNA polymeráza I, RNA polymeráza II, RNA polymeráza III, každá je specializovaná na přepis určitých RNA

syntetizuje citlivost k

α-amanitinu

potřeba ATP

pro iniciaci

RNA polymeráza I ribozomální RNA v jadérku ne ne

RNA polymeráza II hnRNA (strukturní geny) a řada malých RNA

ano ano

RNA polymeráza III tRNA, 5S rRNA a řada malých RNA

druhově specifické ne

Podobné s bakteriálními polymerázami = struktura RNA polymeráz je evolučně velmi stará na rozdíl od DNA polymerázy

• Typicky velké proteiny o 8 – 14 podjednotkách (S. cerevisiae RNA pol. II 10 – 11); největší podjednotka RNA pol. II nese CTD (“carboxy-terminal domain”) • mnohonásobná repetice motivu 7 AMK – YSPTSPS (cca 26x u kvasinek, 34x u

Caenorhabditis, 43x u octomilky a 55x u savců) • 2 proliny udělají zlom, fosforylovatelné aminokyseliny dávají výrazný záporný

náboj • unikátní pro eukaryontní RNA polymerázu II, katalytické jádro je homologní k α2ββ’ E.

coli • esenciální, její nepřítomnost u všech eukaryot je neslučitelná s životem buňky

• kvasince, když odstraníte 2/3 CTD, tak kvasinka zahyne

• v průběhu evoluce

Délka C-terminální domény (CTD) a sekvence vreprezentuje 1 CTD heptapeptid, podjednotku aminokyselin RNA polymerázy II pSaccharomyces cerevisiae CTD (zvýraznkonsenzuální sekvence), která je bvariabilní řetězec zahrnující 26 nebo 27 opakování.

93

hu evoluce se počet těchto jednotlivých repetic velmi zvě

terminální domény (CTD) a sekvence v RNA polymeráze II. Každá prázdná kostireprezentuje 1 CTD heptapeptid, černé obdélníky (nestejné měřítko) reprezentuje velkou podjednotku aminokyselin RNA polymerázy II před CTD. Je zobrazena sekvence Saccharomyces cerevisiae CTD (zvýrazněné zbytky znázorňují rozdíl od kanonické konsenzuální sekvence), která je běžně používána v laboratoři. Kvasinková CTD ukaz

zec zahrnující 26 nebo 27 opakování.

jednotlivých repetic velmi zvětšuje

RNA polymeráze II. Každá prázdná kostička reprezentuje velkou

ed CTD. Je zobrazena sekvence ují rozdíl od kanonické

i. Kvasinková CTD ukazuje

94

Transkrip ční faktory (TF)

RNA polymeráza se sama neváže na DNA templát, nutná pomoc transkrip čních faktor ů (fungují jako aktivátory nebo jako represory)

• obecné („general“, provozní = “housekeeping” geny); spolu s RNA polymerázou tvoří základní transkripční aparát – vyskytují se ve všech buňkách, kde dochází k transkripci a jsou zásadní pro přepis konkrétního typu genu konkrétní RNA polymerázou

• speciální - speciální pro určitou tkáň (v jaterních a mozkových buňkách se přepisují jiné geny – jsou tam jiné produkovány jiné mRNA)

- konstitutivní × indukovatelné

Iniciace transkripce u eukaryot vyžaduje řadu TF fungujících v definovaném sledu a s definovanými a přesně určenými vazebnými specifitami.

Transkripce RNA polymerázou I

rRNA přepisována jako velká prekursorová RNA (45S u savců) a poté rozstříhána na jednotlivé 18S, 5,8S a 28S rRNA

Geny pro 45S pre-rRNA a jednotlivé rRNA uvnitř této jednotky jsou odděleny mezerníky.

Promotor má dvě hlavní konsensus oblasti

• -45 až +20 = základní oblast; dostačující pro zahájení transkripce • -180 až -107 = regulační oblast (UCE - “upstream control element”) Obě oblasti z cca 85% identické a velice GC bohaté. Sekvence obou oblastí rozeznává UBF1 faktor a váže se na ně. V přítomnosti UBF1 se váže SL1 (4 polypeptidy = 3 + TBP)

Transkripce RNA polymeráz

Dva základní druhy promotorů

• pro 5S RNA a tRNA – interní• pro snRNA

Hlavní faktory účastnící se iniciace transkripce RNA pol. III na interních typech promotor

• TFIIIA, rozeznává Box C • TFIIIB (TBP + 2) jednou navázaný nepot

iniciaci transkripce • TFIIIC (> 500 kD a > 5 polypeptid• vždy TFIIIC umožňuje nasednutí TFIIIB• promotor pro tRNA vyžaduje TFIIIC a TFIIIB, pro 5S rRNA navíc ješt

Promotory pro přepis snRNA jsou strukturou podobné promotorII.

95

polymeráz ou III

Dva základní druhy promotorů:

interní (1 a 2 typ)

astnící se iniciace transkripce RNA pol. III na interních typech promotor

jednou navázaný nepotřebuje navázané faktory TFIIIA a TFIIIC pro

500 kD a > 5 polypeptidů), rozeznává Box B uje nasednutí TFIIIB

promotor pro tRNA vyžaduje TFIIIC a TFIIIB, pro 5S rRNA navíc ještě TFIIIA

epis snRNA jsou strukturou podobné promotorům rozeznávaným RNA pol.

astnící se iniciace transkripce RNA pol. III na interních typech promotorů

TFIIIA a TFIIIC pro

ě TFIIIA

m rozeznávaným RNA pol.

96

--- OCT --- PSE --- TATA --- + 1 ---

Iniciace skrze vnitřní promotory polymerázy III zahrnující nahromaděné faktory TFIIIA a TFIIIC, iniciační faktor TFIIIB a RNA polymerázu III

Transkripce RNA polymerázou II

Struktura promotor ů rozeznávaných RNA pol. II: (řada krátkých specifických sekvencí)

97

Promotory obsahují různé kombinace TATA boxů, CAAT boxů, GC boxů a dalších elementů

• konsensus v oblasti startu = Inr – “initiator” – (Py2CAPy5); +1 obvykle A; geny bez Inr – často alternativní 5’ konec mRNA (101 až 102 bp)

• cca -25 oblast = TATA box; často ohraničený GC bohatou oblastí; oblast vazby TFIID (obsahuje cca 30 kD veliký TBP = “TATA binding protein” a řadu TAF = “TBP associated factors”); TFIID = cca 800 kD (TBP + cca 9 TAF); mutace nezabrání iniciaci, ale mají vliv na pozici startu

• cca -75 oblast = CAAT box; funkční v obou orientacích, mutace mají vliv na sílu promotoru • cca -90 oblast = GC box; funkční v obou orientacích, často ve více kopiích, vliv na sílu

promotoru, vazba faktoru SP1; GpC = “marker” promotorové oblasti savců • cca -120 oblast = promotorové proximální oblasti (oktamery, κB, ATF...) • promotorové distální oblasti – enhancery • kombinování různých kontrolních elementů

TBP protein

• vazba do menšího žlábku DNA,?umísťovací faktor? funkční pRNA polymeráz, chrání cca 1 obrátku DNA (typicky

• má 2 domény, jedna rozpoznává TATA box a • význam: nalezení přesné pozice RNA polymerázy• pokud je v komplexu s proteiny, které ho

zapotřebí • za určitých okolností může být sou

základních polymeráz

98

Fosforylace CTD RNA polymerázy kinázovou aktivitou TFIIH může být důležitá kpolymerázy na začátku transkripce

menšího žlábku DNA, způsobuje ohyb a rozšíření menšího žlábkuční při iniciaci přepisu u většinu promotorů všech eukaryotických

, chrání cca 1 obrátku DNA (typicky -37 až -25), celý TFIID pak rozpoznává TATA box a druhá udělá ohnutí DNA řesné pozice RNA polymerázy, vytvoření pnutí a vytvo

proteiny, které ho přímo navedou na pozici, TATA boxu

ůže být součástí obecných transkripčních faktorů

Fosforylace CTD RNA polymerázy kinázovou ležitá k uvolnění RNA

átku transkripce

žlábku, funguje jako všech eukaryotických

25), celý TFIID pak -45 až -10

ení pnutí a vytvoření bubliny TATA boxu není

ních faktorů všech třech

Iniciace transkripce RNA pol. II

1. vazba TFIID (sestává z TBP 2. vazba TFIIA, ?aktivace TBP?3. vazba TFIIB, váže se na komplex více po proudu transkripce, komplex chrání c

+10, rozeznáván RNA pol. II??4. vazba RNA pol. II zprostředkovaná faktorem

s ATPasovou / helikasovou aktivitou, druhá s afinitou ke katalytickému jádru RNA pol. II), komplex chrán

5. ?vytvoření první fosfodiesterové vazby = vznik ternárního komplexu6. vazba TFIIE – posun komplexu až k 7. vazba TFIIH (ATPasa, helikasa, kinasa

z více podjednotek a vyskytuje s8. fosforylace CTD RNA pol. II řadu dalších proteinových a ribonoproteinových komplexdějů, je to taková značka v

99

Dva pohledy na trojitý komplex TFIIBukazuje, že se TFIIB váže podél zakDvě vlákna DNA jsou zobrazena zelenTBP je modře a TFIIB je červen

Iniciace transkripce RNA pol. II (posloupnost krok ů):

(sestává z TBP + 11 TAFs; cca 750 kDa) na TATA box, chrání cca ?aktivace TBP? váže se na komplex více po proudu transkripce, komplex chrání c

10, rozeznáván RNA pol. II?? ředkovaná faktorem TFIIF (dvě podjednotky – jedna

ATPasovou / helikasovou aktivitou, druhá – homologní k bakteriálnímu afinitou ke katalytickému jádru RNA pol. II), komplex chrání cca -45 až

ení první fosfodiesterové vazby = vznik ternárního komplexu posun komplexu až k +30, předpoklad pro vazbu TFIIH

ATPasa, helikasa, kinasa - fosforylace CTD konce RNA pol. II, sestává skytuje s v různých formách) a TFIIJ

fosforylace CTD RNA pol. II – zahájení syntézy RNA (fosforylace je signálem pro celou adu dalších proteinových a ribonoproteinových komplexů, které se pak ú

místech kde probíhá transkripce)

Dva pohledy na trojitý komplex TFIIB-TBP-DNA ukazuje, že se TFIIB váže podél zakřivení DNA.

vlákna DNA jsou zobrazena zeleně a žlutě, erveně a fialově.

chrání cca -45 až -10

váže se na komplex více po proudu transkripce, komplex chrání cca -10 až

jedna bakteriálnímu σ-faktoru

45 až +20

fosforylace CTD konce RNA pol. II, sestává

fosforylace je signálem pro celou , které se pak účastní dalších

100

TFIIH

• Může hrát roli i při elongaci • Hydrolýza ATP a funkce TFIIH a TFIIE jsou nezbytné pro pohyb RNA pol. II na lineárním

templátu. Na DNA v nadšroubovicové formě tomu tak není. • Vliv na opravy DNA asociované s transkripcí (mutace v TFIIH = zvýšená citlivost k UV a častější výskyt rakoviny)

Na promotory bez TATA boxu (některé provozní geny) se váží některé TF do oblasti Inr = podobný model iniciace jako u promotorů RNA pol I a interních promotorů RNA pol. III.

Zesilova če (enhancery)

• často repetice nebo tandemové uspořádání • i velmi daleko od vlastního promotoru • základní role enhanceru spočívá ve zvýšení koncentrace TF v oblasti promotoru • specifický příklad enhanceru = kvasinkové UAS (“upstream activating sequence)

Eukaryotické TF mají často n ěkolik nezávislých domén

• DNA vazebnou • aktivační – velmi nespecifické, obsahují bazické oblasti bílkovin, mohou reagovat stejně • regulační (interakce s dalšími proteiny) • “upstream TF” nejčastěji interagují s TF, které účinkují v časné iniciaci transkripce (TFIID,

TFIIB, TFIIA) a to buď přímo nebo přes kofaktory • některé TF mají “kyselou” aktivační doménu = tzv. kyselé TF (Gal4, Gcn4, VP16 Herpes

simplex viru atd.); zvyšují koncentraci v oblasti promotorů, ?vazba TFIIB a dalších

RNA polymerázy jsou umístěny na všechny promotory faktorem, který obsahuje TBP.

Terminace transkripce

RNA pol. I

Terminace končí na cca 18 bp terminátorové sekvenci ve vzdálenosti konce pre-rRNA a vyžaduje pomocný faktor.

Faktor se na rozdíl od prokaryotického faktoru

RNA pol. III

Terminace připomíná ρ nezávislou terminaci u prokaryot. RNA konpřepsány z GC bohaté oblasti. Vlásenka bývá p

RNA pol. II

101

ny na všechny promotory faktorem, který obsahuje TBP.

Terminace transkripce

í na cca 18 bp terminátorové sekvenci ve vzdálenosti > 1 kbp od reálného 3duje pomocný faktor.

od prokaryotického faktoru ρ váže na DNA.

nezávislou terminaci u prokaryot. RNA končí 2 – 4 U, které jsou GC bohaté oblasti. Vlásenka bývá přítomna, ale není podmínkou

kbp od reálného 3’

4 U, které jsou ítomna, ale není podmínkou.

102

Dlouhé “terminační oblasti”. 3’ konec je generován štěpením syntetizované hnRNA (faktory CFI, CFII- “cleavage factors” a CStF – “cleavage stimulatory factor”) cca 11 až 30 b za polyadenylačním signálem AAUAAA + GU nebo U bohatá oblast po proudu transkripce (rozeznáván CPSF – “cleavage and polyadenylation specifity factor”) a následnou polyadenylací (PAP = poly(A) polymeráza)

Model štěpícího komplexu („cleavage complex“). Uspořádání poly(A) polymerázy (PAP), štěpících faktorů I a II (CF I a CF II) na RNA není známo. Jsou uvedeny pouze dvě podjednotky CF II. DSE = downstream element.

Polyadenylace probíhá ve dvou krocích:

1. závislá na rozpoznávacím faktoru CPSF a tedy i AAUAAA sekvenci – prvních cca 10 b 2. nezávislá na CPSF; vyžaduje další faktory rozpoznávající oligo(A) konec (PABP =

“poly(A)-binding protein” a další) – dalších cca 200 b

mRNA pro replikativní histony obratlovců nejsou polyadenylovány. Tvoří vlásenku na 3’ konci a reasociuje s U7 snRNA v místě konsensus sekvence 5’-AAGAAAGA-3’ (na mRNA)

Polyadenylace má vliv na maturaci hnRNA, transport mRNA z jádra do cytoplasmy, stabilitu mRNA a iniciaci translace.

103

104

3´ zpracovávající komplex se skládá z několika aktivních CPSF a CStF, každá se dále skládá z několika podjednotek. Ostatní složky jsou monomerní. Celková hmotnost je >900 kD.

Transkripce v organelách

• Polymerázy i regulace transkripce připomínají transkripci u prokaryot • mitochondrie – malá RNA pol. (kvasinky 145 + 43 kDa) • chloroplasty – RNA pol. více připomíná polymerázy moderních prokaryot

Transkripce u Archaea

• jedna RNA polymeráza, ale 13 až 14 podjednotek, některé homologie s podjednotkami eukaryotických RNA pol.

• TF homologní k eukaryotickým TFIIB a TBP se váží na A/T bohatou oblast promotoru

105

• transkripční jednotky obvykle polycistronní, tzn. že způsob regulace transkripce, i ve smyslu, že se přemísťují celé dráhy, je spíše podobný bakteriálnímu typu • u archaea bakterií najdeme transkripční aktivátory a transkripční represory • dále celá řada helix proteinů, které rozpoznávají konkrétní elementy v oblasti

promotorů, které se vyskytují u všech typů organismů, jsou typické represory u bakterií

Podjednotková struktura RNA polymeráz (RNAP). Největší podjednotka u Eucarya a β´ u Bacteria je u Archaea rozdělena do dvou podjednotek A1 a A2. U methanogenů je podjednotka B také rozdělena na dva polypeptidy B´ a B´´. Různé části bakteriální podjednotky α jsou kódovány geny pro archaeální podjednotky D a L. Podjednotky E1, F, H, N a P jsou společné mezi Archaea a Eucarya. Obrázek je založen na rozdělení podjednotek elektroforézou na polyakrylamidovém gelu za denaturačních stavů. Čísla u podjednotek eukaryotních RNA polymeráz A (I), B (II) a C (III) značí molekulovou hmotnost.

106

Strukturální podobnost Pyrococcus furiosus (produkuje jednu z kvalitních, stabilních polymeráz užívaných pro ,,PCR“) RNAP (A) a kvasinkové RNAPII (B). Srovnání interakcí archaeální RNAP se usuzuje z Far-Western analýzy interakcí kvasinkové RNAPII, pozorovaných v krystalové struktuře enzymu. RNAPII má více podjednotek, barevné kodování připomíná eukaryota. Všimněme si, že velká katalytická podjednotka RNAPII je jedním enzymem, kdežto u archaeální RNAP je ten protein je rozdělen na 2 části. Uspořádání proteinů a jejich závislé interakce jsou naznačeny silnějšími čarami (šířka čar vyznačuje sílu vzájemných interakcí). Protein H odpovídá proteinu 5. Prostorové uspořádání archaeální polymerázy a vzájemné interakce podjednotek je i z tohoto hlediska velmi podobné eukaryotní. U všech archaea najdeme TBP, který když odstraníme, tak jeho funkci jsme schopni nahradit lidským TBP (tzn. že podobnost funkční a strukturální je tak značná, že můžeme vzít lidský TBP protein, dát ho do archaea a nahradit jím funkci odstraněného archaeálního proteinu. Dále je zde TATA box, na který se váže TBP protein a oblast rozeznávaná transkripčním faktorem ,,b“, což je protein zodpovědný za přinesení RNA polymerázy do oblasti promotorů a iniciátorů.

107

Iniciace transkripce u archaea. Prvním krokem rozpoznání promotoru je vazba TBP na archaeální TATA box. Tento komplex je stabilizován asociací s TFB. Vazba TFB interaguje s purin-bohatou BRE sekvencí 5´ TATA boxu. Tento komplex připojuje RNA polymerázu, která se váže na oblast DNA po proudu („downstream“) TATA boxu a překrývá transkripční start stranu a oblast po proudu DNA do pozice +18.

Post(ko-)transkrip ční úpravy v eukaryotické bu ňce

hnRNA

• přítomna v jádře jako hnRNP • jádro hnRNP tvoří > 20 proteinů (30 – 120 kDa); asociovány další faktory účastnící se

posttranskripčních modifikací, exportu (CBC...) a degradace • RNP motiv – (RNP1 a RNP2 domény) – nejčastější motiv RNA vazebných proteinů (4 x β

skládaný list) • je dále modifikována (jednou z modifikací je sestřih) a poté exportována do cytoplasmy

Komplex U1A protein-RNA (RNA tvo

Základní typy úprav hnRNA

108

Jedna z funkcí RNP – zrychlují interakci s jinými nukleovými kyselinamiterciární strukturu syntetizované modifikacím, nebo pro nějakou f

RNA tvoří smyčku)

Základní typy úprav hnRNA

RNP motiv

zrychlují interakci RNA kyselinami, zpřístupňují

terciární strukturu syntetizované RNA k dalším jakou funkci

109

1. Vazba do RNP 2. Polyadenylace pre-mRNA 3. Syntéza čepičky na 5’ konci pre-mRNA 4. Sestřih pre-mRNA (vyštěpení jednotlivých exonů a jejich spojení dohromady) 5. Sestřih pre-rRNA a pre-tRNA – dále modifikovány, objevuje se zde řada modifikovaných

bází 6. Modifikace rRNA a tRNA 7. Úpravy primárních transkriptů v organelách (sestřih a modifikace) 8. Další úpravy (editace ...)

ad 2. Polyadenylace pre-mRNA

• polyadenylace (polyA) souvisí s ukončením transkripce • na RNA polymeráze II jsou celá řada bílkovinových faktorů, které se účastní rozpoznání

klíčových signálních sekvencí • většina těchto faktorů je závislá na interakci s fosforylovanou C-terminální doménou

• na nově vzniklém transkriptu, kde je RNA polymeráza, která stále syntetizuje, dojde k odštěpení vzniklé RNA a k uvolnění celého komplexu RNA polymerázy II

• syntéza polyA řetízku je kooperativní a závisí na polyA vazebném proteinu • délka toho polyA řetízku určuje, jak dobře bude příslušná RNA překládána, tzn. jak moc

se z ní budou tvořit proteiny, s jakou frekvencí a jak bude stabilní • při každém průběhu translace se tento řetízek o něco zkracuje → je to jakási značka,

kolikrát byla polymeráza přeložena, jakýsi signál pro účinnost translace • ne všechny geny mají polyA řetízek –typickým příkladem jsou RNA pro replikativní

histony u obratlovců (histony, které se syntetizují v masivní míře v průběhu buněčného cyklu) • histony, které se dosyntetizovávají ve chvíli, kdy neběží replikace, tzn. neúčastní se

replikace, tak obvykle polyA řetízek mají

110

3´ zpracovávající komplex se skládá z několika aktivních CPSF a CStF, každá se dále skládá z několika podjednotek. Ostatní složky jsou monomerní. Celková hmotnost je >900 kD.

ad 3. Syntéza 5’ čepičky

• 5´ čepička je syntetizována několika enzymatickými reakcemi ve chvíli, kdy je nasyntetizováno prvních 20 – 30 nukleotidů

• enzymové aktivity nezbytné při syntéze čepičky “cap0” = 7mGpppA • vznik 7-methylguanosin-5’-5’-trifosfátpurinu:

• první nukleotid RNA s 5´ trifosfátem (další nukleotidy jdou směrem k 3´ konci) • RNA trifosfatáza – odštěpuje poslední gama fosfát • guanylyltransferasa • 7N-methyltransferasa • někdy samostatné proenzymy, které ve spojení vytváří trienzymovou aktivitu v jedné

bílkovině

• buňka má jen omezené množství enzydegradovat a umí je regulovat

• 5´čepička je zároveň RNA, která byla přepsána RNA polymerázou exportována z jádra (

Ad 4. Sestřih jaderné hnRNA

• přerušené geny – nalezené u všech typněkterých bakterií, Archae

• množství přerušených genů• exony (přítomny pouze v maturované mRNA) x introny (vyst• účelem je, že RNA může vypadat r

umožní, aby v různých tkáních vznikali r

Obecné vlastnosti:

111

ka má jen omezené množství enzymových aktivit, které umí tuto strukturu degradovat a umí je regulovat → takto modifikovaná RNA se stává velmi stabilní

ň jakousi značkou (praporkem), který říká, že tady je 5´ konec řepsána RNA polymerázou II. Tato RNA musí být

(k tomu také slouží ta čepička)

ih jaderné hnRNA

nalezené u všech typů organismů (především eukaryota nebo v genomu některých virů včetně bakteriofága

erušených genů stoupá od nižších k vyšším eukaryotům maturované mRNA) x introny (vystřiženy)

že vypadat různě v různých tkáních → další úrovezných tkáních vznikali různé proteiny – ale vlastní gen je všude stejný

mových aktivit, které umí tuto strukturu takto modifikovaná RNA se stává velmi stabilní

že tady je 5´ konec být „chycena“ a

edevším eukaryota, ale také u bakteriofága λ)

í úroveň regulace, která ale vlastní gen je všude stejný

112

• geny jsou přerušeny, ale pořadí exonů je zachováno, tzn. nemůže se stát, že výsledná RNA od 5´ konce bude obsahovat nejdříve exon 3, pak exon 1 a pak exon 2

• může však obsahovat pouze exon 1 a exon 3 • introny mají obvykle terminační kodóny ve všech čtecích rámcích • přerušený gen má stejnou strukturu ve všech tkáních

Introny :

• nalezeny i u bakterií, fágů, archae • v tRNA, rRNA, pre-mRNA • různé délky (od < 0,1 - > 100 kbp) • na začátku každého intronu je invariantní GU a na konci každého intronu je invariantní AG • kvasinka má zhruba 6100 genů, obsahuje pouze 239 intronů na celý genom, přičemž

naprostá většina genů má jen jeden intron • u hmyzu a savců tvoří introny velká část genů, tak jejich délka se zvyšuje, genom se

zvětšuje a geny obsahují 7 až 8 exonů • když je na tom buňka špatně (zažívá nějaký stres nebo je napadena, otrava atd.), potom

některé z klíčových bílkovin mají málo intronů nebo nemají introny vůbec • pokud nedojde k vystřižení intronů, RNA je sice exportována ven z jádra, ale s velkou

pravděpodobností RNA nebude dávat vznik funkční bílkovině • důvodem je vyšší pravděpodobnost výskytu STOP kodónu

Exony:

• většina ve velikostech okolo N x 102 bp • zlom v počtu a velikosti exonů v jednom genu po jednobuněčných houbách (průměrná

velikost genu u kvasinek je 1,4 kbp [239 intronů / genom], hmyz a savci – většina genů od 5 kbp výše s 7 – 8 exony); gen pro dystrophin v oblasti Xp21 je extrémní případ (gen > 2000 kbp, > 60 exonů, mRNA cca 14 kb, protein cca 500 kDa, Duchennova svalová dystrofie u cca 1 z 3500 mužů)

113

A) Distribuce velikosti exonů

B) Distribuce velikosti intronů

Všimněme si, že délka exonů je mnohem uniformnější, než délka intronů

Základní rozd ělení systém ů pro sest řih RNA

1. Vystřižení intronů komplikovaným systémem rozeznávajícím krátké sekvence na hranicích exon-intron a uvnitř intronu. Účastní se řada proteinů a snRNA tvořících tzv. spliceosome.

2. Vystřižení intronu je vlastností samotné RNA. Autokatalytické RNA se dělí na dvě hlavní skupiny.

3. Vystřižení intronu je zajištěno enzymatickými aktivitami proteinů zahrnutých v dalších úpravách tRNA.

Ad 1. a 2. Introny jsou odstraněny transesterifikační reakcí

Ad. 3. Introny jsou odstraněny enzymatickým štěpením a ligací (pre-tRNA)

Introny vyšších eukaryot:

Introny jsou velmi heterogenní ve velikosti a sekvencích. Jaderné introny vyšších eukaryot obsahují pouze několik krátkých invariantních sekvencí:

- 5’-GU -...- AG-3’ (Chambonovo pravidlo)

- polypyrimidinový úsek u 3’ konce

- invariantní A (místo větvení) = místo, které je atakováno 5‘ koncem intronu za vzniku lasovité struktury (lariátu )

Místa pro sestřih jsou obecná, nejsou sp

Introny jsou odstraňovány ve více ménkonformace pre-mRNA na sestř

Všechny funkční globinové geny mají pobrázku označují použití savčích b

114

ih jsou obecná, nejsou specifická pro daný typ pre-mRNA.

ovány ve více méně definovaném sledu ⇒ pravděpodobný vliv mRNA na sestřih.

ní globinové geny mají přerušovanou strukturu se třemi exony. Délky na ují použití savčích b-globinových genů

podobný vliv

emi exony. Délky na

115

Northern blotting jaderné RNA s ovomukoidovou sondou identifikuje diskrétní prekurzory na mRNA. Obsah nápadnějších pruhů je vyznačen.

Radioaktivně značená RNA obsahující dvou-exonovou část z lidského beta-globinu. Fragment 252 je nenormálním produktem in vitro reakce

116

Mechanismus sest řihu:

• během sestřihu se nespotřebovává energie – celá energie je uložena v řetězci nukleových kyselin, kdy se při zabudovávání nukleotidů spotřebovávají 2 makroergní vazby a odštěpuje se pyrofosfát

• tímto přenosem esterových vazeb mezi 5´ koncem intronů a následným atakem s 3´ koncem exonu, dochází k přenosu těchto 2 esterových vazeb → sled transesterifikací, nepřidává se tam žádná energie z vnějšku – dochází pouze k přenosu esterové vazby za vzniku lasovité struktury • reálně se tam energie přidává, protože se toho účastní řada bílkovin, které u eukaryot

umožňují i změny uspořádání 2 transesterifika ční reakce!

• sestřih probíhá přes lasovitou strukturu (lariat) • účastní se jej řada malých RNA organizovaných snRNPs (U1, U2, U5, U4/U6); mutace

jsou často letální • místo větvení méně konzervováno u vyšších eukaryot než např. u kvasinek, důležité je

umístění v blízkosti akceptorového (3’) místa; místo větvení je tak odpovědné hlavně za identifikaci nejbližšího 3’ místa pro připojení 5’ donorového místa

• sest řih neprobíhá po řadě (tak jak je RNA transkribována), ale probíhá spíše tak, jak jsou postupně odhalována jednotlivá exon-intronová rozhraní

• podle toho, jak je regulován sestřih na jednotlivých místech spojení exonů (exon-intronových rozhraních), tak může docházet k různým alternativám • z jednoho genu můžeme dostat celou řadu produktů mRNA a tím pádem i produktů

proteinů • v extrémních případech u člověka mají některé geny několik desítek sestřihových

variant • katalytické místo sest řihu je při sestřihu jaderných intronů tvo řeno molekulami

RNA, které se různě přeskupují (různě se váží na jednotlivá místa intronů) • vlastní aktivní centrum je také tvořeno RNA

Posloupnost d ějů:

• Vazba U1 snRNP + další faktory na 5’ konec intronu • Vazba U2 snRNP do místa větvení + další faktory. Podstatné je, že dvě místa v intronu

jsou rozeznána bez nutnosti rozpoznání jakékoliv sekvence uvnitř exonů. • Vazba U4, U6, U5 snRNP • První transesterifikační reakce je spuštěna po uvolnění U4 snRNP (změna párování U4-

U6 snRNA na U6-U2 snRNA); U6 páruje s 5’ místem a spolu s U2 připomíná strukturou introny II skupiny

• Druhá transesterifikační reakce následuje rychle po první. Podmínkou je vazba U5 snRNP do 3’ místa

• Sestřih je energeticky náročný – spotřeba ATP! • Proteinové komponenty spliceosomu – PRP (pre-RNA processing) • “Debranching enzyme” – hydrolýza smyčky

117

118

119

120

Autokatalytické introny

121

Produkt reakce katalysované in vitro

komplexem U2 a U6 p řítomných ve spliceosomech

Atak katalytické domény U6 RNA 2´OH skupinou adenosinu → kovalentní fosfotriesterová vazba mezi adenosinem Br a fosfátem nukleosidu A53 a G54 U6 RNA

Struktura ve tvaru X

Br – (branche) – umělý oligonukleotid s adenosinem, na kterém vzniká lariat

Konsensus sekvence a párování bazí mezi „splicing“ konsensus sequencemi a malými jadernými RNA (snRNA).

(a) Frekvenční matice představující 5´ splice site, 3´ splice site a „branchpoint“ konsensus sekvence.

(b) Párování bází mezi konsensus sequencemi a U-RNA (U1: 5´ splice site; U2: Branch site). Jediným nespárovaný nukleotidem v párování bází mezi U2 snRNA a branch site je A, na kterém nastává branch formování. Zobrazené U snRNA sekvence jsou fylogeneticky invariantní a zobrazený konsensus sekvencí je podobný u všech eukaryotů. Nicméně sekvence jakékoli individuální splice site je pravdod zde uvedené sekvence. Důže rozsah párování bází je obecnzde znázorněno. Dodatečné interakce bází mezi snRNA a pre-mRNA nebo mezi snRNA, které se vyskytují v pozdním procesu nejsou zobrazeny.

- u cca 0,5 % lidských genů 5 e/i místo zmna GC

- též alternativní dráhy (AT-AC) introny, U12 dráha etc.

Produkt reakce katalysované in vitro

ítomných ve

Atak katalytické domény U6 RNA 2´OH skupinou kovalentní fosfotriesterová vazba

mezi adenosinem Br a fosfátem nukleosidu A53

lý oligonukleotid s adenosinem, na kterém vzniká lariat

Konsensus sekvence a párování bazí mezi „splicing“ konsensus sequencemi a malými

edstavující 5´ splice site, 3´ splice site a „branchpoint“ konsensus

zi konsensus sequencemi a RNA (U1: 5´ splice site; U2: Branch site).

Jediným nespárovaný nukleotidem v párování bází mezi U2 snRNA a branch site je A, na kterém nastává branch formování. Zobrazené U snRNA sekvence jsou fylogeneticky invariantní a

konsensus sekvencí je podobný u sekvence jakékoli

individuální splice site je pravděpodobně odlišná od zde uvedené sekvence. Důsledkem toho je,

je obecně nižší, než je interakce párování

mRNA nebo mezi , které se vyskytují v pozdním splicing

5 e/i místo změněno

AC) introny, U12

122

• dvě skupiny – I. a II. • výskyt u bakterií (T4 fág), v organelových mRNA, rRNA, tRNA (mitochondrie u hub) a

introny I. skupiny i v jádře nižších eukaryot (rRNA Tetrahymena, Physarum) • introny I. a II. skupiny se liší svojí sekundární strukturou a účastí kofaktorů (GMP... u

skupiny I.) • introny II. skupiny často kódují další enzymové aktivity (endonukleasy, reverzní

transkriptasy, maturasy) • Autokatalýza v ětšinou probíhá za zna čně nefyziologických podmínek (např.: 1

molární NH4(SO4)2 a 500 molární MgSO4) • probíhá většinou za vysokých koncentracích dvojmocného kationtu, za značné iontové

síly, za zvýšené teploty... • buněčné prostředí a další bílkoviny, které se váží na RNA, pomáhají remodelovat

strukturu, aby ta autokatalytická reakce vůbec proběhla • vlastní katalýza je zřejmě vedená RNA (jak malých RNA, tak těch součástí exonů a

intronů), ale jsou k tomu potřeba proteiny a celý komplex spliceosomů

Introny I. skupiny

• kofaktor může být GTP, GDP ... i guanosin + jednomocný a dvojmocný kationt • vyštěpení je provázeno minimálně třemi transesterifikačními reakcemi (26S rRNA

Tetrahymena) • sekundární struktura zahrnuje 9 vlásenek (P1 – P9) • katalytickou aktivitu RNA u intronů I. skupiny rRNA prvoka Tetrahymena thermophila

objevil Thomas Czech • Jeho skupina zkoumala různé proteinové extrakty z toho prvoka; přidávali je k různým

variantám RNA, která se měla sestřihávat (obsahovala intron) • prováděli zároveň kontroly, kdy jedna z kontrol obsahovala ve směsi úplně všechno a

druhá obsahovala pouze RNA bez bílkovin • s překvapením zjistili, že jim v té druhé kontrole dochází k sestřihu – vznikal jim zde

produkt, a oni zkoumali, kde jim vznikla chyba • postupně přišli na to, že tam žádná chyby není, a že když přepíšou RNA in vitro úplně

arteficiálně, tak tam bude postupně docházet k sestřihu, i když tam nejsou žádné proteiny z Tetrahymeny

• zkoumali dále, za jakých podmínek dochází k tomuto štěpení a zjistili, že k vyšt ěpování autokatalytického intronu dochází jedin ě za přítomnosti kofaktor ů • jedním z kofaktorů jsou dvojmocné kationty zejména hořčíku • v místě kofaktoru bylo cokoliv, co má guanosin (tzn. guanosin, GMP, GDP nebo

GTP), tzn. funkční částí té molekuly byl guanosin s funkčními skupinami na ribóze • takto funguje skupina I samo se sest řihujících intron ů, kdy intron (RNA jako

taková) tvo ří vazebné místo pro kofaktor (pro guanosin) a guanosin svojí 3’OH skupinou atakuje 5’exon-intronové rozhraní, kdy se váže na konec toho intronu

• 3’konec 5’exonu potom atakuje 3’exon-intronové rozh raní a dochází k vyšt ěpení intronu a ke spojení exon ů

Introny II. skupiny

• výskyt v pre-mRNA, pre-rRNA a pre-tRNA mitochondrií a chloroplastů některých rostlin a hub

• sestřih velmi podobný jaderným intronům eukaryot – ?konzervovaný evoluční krok vývoje snRNA?

123

124

Na obrázku můžeme vidět exon-intronová rozhraní, párování a naznačené katalytické centrum se dvěma atomy hořčíku, které představují katalytické skupiny. Vytvořením krystalové struktury aktivního centra tohoto intronu a aktivního centra T7 DNA polymerázy , která patří mezi fosforibosyltransferázy, se porovnaly jejich centra (porovnaly se vzdálenosti těch dvou hořčíků). Ačkoliv jedno centrum je tvořeno bílkovinou a druhé RNA, tak v obou dvou případech se v podstatě jedná o fosforibosyltranseferázu, tudíž i to aktivní centrum vypadá podobně.

“Trans-splicing”

• sestřih probíhá obvykle v cis, výjimečně i v trans, kdy jsou dv ě molekuly RNA • sest řih mezi t ěmito molekulami p řenese 5’konec molekuly 1 na 5’konec

molekuly 2 • trans sestřih je některými organismy využíván, aby byla unifikovaná produkce

některých proteinů • umožňuje translaci u dicistronních nebo vícecistronních RNA u eukaryot (transkripční

jednotka je vícecistronní) • U eukaryot je nezbytné, aby byl pro translaci volný 5’konec, v ětšinou má navíc

i čepičku. • SL RNA (spliced leader)

125

• např. u nematoda C. elegans (cca 25 % genů [mRNA pro aktin], 1000 dicistronních operonů), trypanosom, euglen

• psa gen v chloroplastu Chlamydomonas

Úpravy rRNA a tRNA

• v rychle rostoucí buňce obratlovců – cca 80 % rRNA (molekulární stroje vyrábějící bílkoviny), 15 % tRNA

• Úpravy nemají nic spole čného se splicingem (transesterifikační spojování), ale je to sled n ějakých akcí celé řady enzym ů jako jsou endonukleázy a následn ě ligázy

• Dochází tam ke št ěpení dovnit ř, k úpravn ě konc ů, ke spojování fragment ů po štěpení atd.

rRNA

• U všech organism ů je více kopií genom ů ribozomálních RNA • ve všech bu ňkách se rRNA p řepisuje jako dlouhý prekurzor, který je posléze

rozšt ěpen • 45S pre-rRNA (tandemové repetice -18S-5,8-28S-mezerník-18S-5,8-28S-...) • mezi základní úpravy pre-rRNP pat ří:

• metylace na 2’OH skupin ě ribózy • pseudouridinylace (rotace uridinu tak, že je vázán skupinou C5 na ribózu) • sest řih za účasti řady snoRNA, RNasy P, endo- a exonukleas • jak u bakterií, tak u Archae i u eukaryot nalezneme metylaci i pseudouridinylace, ale

v různém množství (např. u eukaryot je několik desítek bází rRNA modifikováno jak metylací, tak pseudouridinylací; u bakterií a Archae je pseudouridinylace výrazně nižší, metylací rRNA je poměrně dost u Archae, u bakterií jich je řádově méně)

• chyby v metylaci i v pseudouridinylaci mají vliv na přesnost ribozomu • asociace s ribosomálními proteiny, tvorba malé a velké ribosomální podjednotky a export

z jádra • řada snoRNA kódována introny ribosomálních nebo i nefunkčních genů • pořadí genů pro jednotlivé rRNA v prekurzorech je zachováno v průběhu evoluce

tRNA

• malé molekuly (typicky 74 až 95 b) • často kódovány někde uvnitř přepisovaných dlouhých úseků rRNA • vždy přepisovány jako větší úsek a následně jsou dotvořeny • některé eukaryotické i archaebakteriální geny pro tRNA – introny (u eukaryot zejména

v oblasti antikodonové smyčky) • komplikovaný enzymový systém exo- a endonukleas, ligas, maturas... • 3’ a 5’ konce bývají rozpoznány specifickými endonukleázami (RNAsa P , RNAsa Z u

eukaryot, Archae mají mimo těchto ještě další enzymy) a bývají modifikovány • funkční katalytickou složkou RNAas je RNA

• odštěpení 5’ konce Rnasou P • RNAas P je větší množství a vypadají u různých organismů jinak (u bakterií je to RNA

+ protein, u Archae a eukaryot je to RNA + několik proteinů, přičemž katalytickou složkou je právě RNA)

126

• téměř u všech tRNA téměř u všech organismů není 3’konec syntetizován podle předlohy v genomu • RNAsa Z (případně další enzymy) rozpozná 3’konec proto, že není v prekurzoru

spárován (je vystřižen) • každá tRNA má na 3’konci specifickou sekvenci CCA, která je syntetizována

zvláštním způsobem tRNA-nukleotidyl-transferázou –syntetizuje tento ús ek bez předlohy RNA • jedna z dalších bílkovin, která umí syntetizovat nějakou nukleotidovou kyselinu bez

předlohy (bez předlohy funguje i poly-A-polymeráza , která syntetizuje poly-A na 3’konci u eukaryot)

• enzym má na svém povrchu v blízkosti aktivního centra aminokyselinové zbytky, které mimikují Watson-Creekovské párování s přicházejícími prekurzory

• po každém připojení se změní konformace enzymu (protože se mění substrát) a tím se odkryje další místo pro párování (takovýmto způsobem je tRNA-nukleotidyl-transferáza schopná nasyntetizovat celé vlákno)

127

Prodloužené osy rDNA transkripstřídající se s ménprodlouženými netranskribovanými mezerníky

Prodloužené osy rDNA transkripční jednotky

ídající se s méně prodlouženými netranskribovanými mezerníky

128

Virusoidy a viroidy

• malé, cyklické RNA, které m ůžeme nalézt u rostlin (někdy jsou významné z hospodářského hlediska)

• většina t ěchto RNA se replikuje systémem valivé kružnice. Tato kružnice je po spárování sestříhána zvláštními ribozymy a katalytickými RNA, které jsou uvnitř viroidu či virusoidu

• aktivní místo jen cca 58 b • tyto viroidy patří do skupiny malých ribozom ů zvané též Hammerhead (= hlava kladiva,

podle tvaru smyčky) – tři vlásenkovité struktury • vědci na základně znalostí toho, jak vypadají ribozymy, a jak se dají připravit, navrhli

DNA, která má katalytickou funkci (může něco štěpit) a nazvali ji DNAsa • když najdeme tuto funkci u viru nebo bakteriofága, tak můžeme přemýšlet, jestli se

podobná struktura nevyskytuje jinde v buňce (v normálních transkriptomech nebo proteomech) • vědci přemýšleli, jestli by bylo možné najít strukturu (např. jako hammerhead)

v transkriptomu rostlin. Dívali se do genomu Arabidopsis thaliana (huseníček rolní), provedli bioinformatickou analýzu a podařilo se jim v genomu najít struktury, které jsou schopné fungovat po transkripci jako ribozym

• ribozymy typu hammerhead se tedy nemusí nutně vyskytovat pouze u viroidů nebo virusoidů

• stejně tak se vědci pokusili najít v lidském genomu strukturu, která by vypadala a mohla fungovat podobně jako ribozym viru hepatitidy D – podařilo se jim to u jednoho genu.

129

Genomové vyhledávání Ribozym ů odhaluje HDV-podobné sekvence v lidském CPEB3 genu

Uvažuje se, ž ribozymy hrály klíčovou roli v brzké evoluci života, ale relativně málo byly zjišťovány u moderních organismů. Provedli jsme in vitro selekci, jejíž cílem bylo izolovat sebe-štěpící RNA z lidského genomu. Selekce přinesla několik ribozymů, z nichž jeden je

zakonzervovaná savčí sekvence, která se nalézá v intronu CPEB3 genu, který patří do rodiny genů regulujících polyadenylaci mRNA. CPEB3 ribozym se strukturálně a

biochemicky vztahuje k ribozymům lidského viru hepatitidy D (HDV). Výskyt tohoto ribozymu výlučně u savců naznačuje, že se mohl vyvinout před 200 miliony lety. Můžeme

předpokládat, že HDV povstal z lidského transkriptomu.

Struktura virusoidů

130

131

132

Sekundární struktura genomového HDV ribozymu (A) a lidského CPEB3 ribozymu (B). P = párování, L = smyčka, J = spojené oblasti. Čísla reprezentují pozici v řetězci, vztaženou k odštěpené straně (označená 5´). (B) Varianty CPEB3 ribozymu nalezeného u savců (Hs = člověk; Mm = myš; Rn = krysa; Oc = králík; Cf = pes; La = slon; Bt = kráva a Md = vař¨čice) a mezi 41 sekvenovanými klony z lidské genomové selekce popsané v textu (Sel). In vitro sebe-štěpící poměry U38A a C57 mutantů jsou zobrazeny relativně k běžnému ribozymu.

Leadzymy

• Součástí katalytických center jsou dvojmocné kationty (především kationty hořčíku). Nicméně pokud použijeme jiné dvojmocné kationty (například kationty

133

stroncia nebo olova ), tak můžeme nalézt struktury, které je využijí pro nějakou funkci. V případě olovnatých kationt ů se ukázalo, že existují malinké struktury RNA o dé lce 12 nukleotid ů, které jsou schopny po navázání t ěchto iont ů štěpit vlastní RNA. Tyto struktury byly nazvány leadzyme (je jich obrovské množství). 5S rRNA obsahuje leadzyme (při otravě olovem se to projeví degradací RNA a zastavením proteosyntézy).

Frekvence leadzymových motivů v genomových sekvencí vybraných eukaryotů

Organismus Genom mRNA

Velikost genomu

(kb)

Počet leadzymových

motiv ů

Frekvence (Mbp -1)

velikost mRNA

(kb)

Počet unikátních leadzymových

motiv ů

Homo sapiens 3058208 11247 73489 666

Arabidopsis thaliana

118133 276 43901 121

Caenorhabditis elegans

99900 278 28157 118

Drosophila melanogaster

72440 657 42436 293

(A) Sekundární struktura klasického leadzymu. Skládá se z jedno- a dvouvláknových RNA částí. Asymetrická smyčka se skládá ze šesti nukleotidů; čtyři v substrátu a dva v ribozymu. Nestandardní párování bází C23-A45, viditelné v krystalové struktuře, je ukazováno jako tečkovaná čára. (B) Kratší verze leadzymu se substrátovým řetězcem dlouhým tři nukleotidy. Šipky označují štěpící stranu.

RNA editace

• další postranskripční úprava různého typu • substituce – gen pro apolipoprotein B ve střevě savců (C→U, respektive CAA[Q]→UAA =

vznik zkráceného proteinu ve střevním epitelu x hepatocyty), receptor pro glutamát v mozku (A→I, respektive CAG[Q]→CIG[R] = změna specifity iontových kanálů z Na+ a Ca2+ pouze na Na+). Oba případy = deaminace

134

• delece, inzerce (kinetoplast prvoků, mitochondrie strunatců a vyšších rostlin, chloroplasty); editace je zprostředkována tzv. “guide RNA” (gRNA); vkládání U je katalyzováno enzymy (endonukleasa, terminaluridyltransferasa, RNA ligasa)

• tuto editaci m ůžeme najít u Trypanosom a Leishmanií, kdy v kinetoplastu se syntetizují guide RNA , na jejichž základě je v komplexní struktuře editozomu opravována a měněna mRNA, která se páruje v té konkrétní gRNA • gRNA je celá řada (na každou mRNA) • dochází k inzercím uridinfosfát ů a k delecím

• RNA editace , pomocí jiných mechanismů, se vyskytuje i v lidských bu ňkách • RNA editace je v tomto p řípadě vždy závislá na deaminaci cytosinu nebo

adenosinu • v případě že je deaminován cytosin , tak vzniká uracil

• pokud se to se to stane na RNA, tak k žádné opravě už nedochází a může dojít ke změně smyslu genetické informace

• systém pro deaminaci na cytosinu se jmenuje APOBAC I • tento komplex proteinů rozpoznává na mRNA jakousi sekvenci, váže se na ni a

po tom je schopen deaminovat konkrétní cytosin • pokud je deaminován adenin , tak vzniká hypoxanthin nebo inosin (v případě

deaminace adenosinu), který má jiné možnosti párování (páruje s cytosinem) • → může dojít ke vzniku tripletu, který znamená ukončení syntézy proteinů (stop

kodonu UAA, UAG, UGA ) nebo může dojít ke změně aminokyseliny (může dojít např. ke změně specifity receptorů nebo iontových kanálů, což může vést k epilepsiím nebo nádorům mozku)

• systém adenosin deamináz ADAR deaminuje nespárované adenosiny ve dvouřetězcových úsecích, kde páruje exonová a intronová sekvence (v určitém konkrétním časovém úseku RNA)

• tyto systémy nejsou většinou úplně stoprocentní. Oba dva odvozené systémy může buňka použít jako antivirové systémy.

Část mRNA sekvence T. brucei ukazuje mnoho uridin(zobrazeny červeně) nebo které jsou odstran

Obrat a stabilita mRNA v

• koncentrace dané mRNA = rovnováha mezi syntézou a degradací• mRNA s různou stabilitou; též v• hlavní dráha – po deadenylaci následuje odstran• stabilizující a destabilizující sekvence

135

ást mRNA sekvence T. brucei ukazuje mnoho uridinů, které nejsou kódovány v DNA ) nebo které jsou odstraněny z RNA (zobrazeny jako T).

Obrat a stabilita mRNA v eukaryotické bu ňce:

koncentrace dané mRNA = rovnováha mezi syntézou a degradací znou stabilitou; též v závislosti na stavu a typu buňky

po deadenylaci následuje odstranění čepičky a odbourávání z 5zující a destabilizující sekvence

, které nejsou kódovány v DNA obrazeny jako T).

ávání z 5’ konce

136

ARE destabilizující sekvence - konsensus [AUUUA]n na 3’ nepřekládaném konci; vazba ARE vazebného proteinu ⇒ rychlá deadenylace Poly(A)ribonukleasou a následně endo- a exonukleasami.

Transferinový receptor: mRNA - IRE (iron response element) na 3’ nepřekládaném konci; v nedostatku železa vazba IRE vazebného proteinu (IRE-BP) a stabilizace mRNA

TRANSLACE

• Překlad genetické informace z mRNA do polypeptidového řetězce probíhá ve směru 5‘→ 3‘

• DNA → RNA 4 znaky; proteiny 20 základních aminokyselin ⇒ minimální jednoznačný zápis pro všechny aminokyseliny (AK) je tripletový (42 = 16; 43 = 64) a je jednosměrný

• zásadním objevem bylo rozluštění genetického kódu. K vyluštění přispěl i objev syntézy organických látek. Syntetizovaly se stejné nukleové kyseliny a vznikly homopolymery. Když se daly do roztoku s bakteriemi, tak vznikly nové oligopeptidy • začalo se zkoumat, kolika X-pletový je genetický kód. Vědci udělali heteropolymer, kde

se střídalo ACACACACAC: kdyby byl kód dupletový, tak by se tato sekvence četla po AC nebo CA a do polypeptidu by se řadily neustále stejné AMK. Ale vznikl polypeptid se dvěma různými AMK → proto musí genetický kód být tripletový

• 1960 – 1966 Marshall Nirenberg, H. Gobind Khorana, S. Ochoa, Sydney Brenner, Francis Crick a mnozí další rozluštili genetický kód

137

Tato tabulka ukazuje všech 64 možných kodón ů a aminokyseliny, které kódují (univerzální pro všechny organismy na světě – neexistuje samostatná tabulka pro koně, myš, bakterie,…)

2. báze

U C A G

1.

b

á

z

e

U

UUU (Phe/F)Fenylalanin UUC (Phe/F)Fenylalanin UUA (Leu/L)Leucin UUG (Leu/L)Leucin, Start2

UCU (Ser/S)Serin UCC (Ser/S)Serin UCA (Ser/S)Serin UCG (Ser/S)Serin

UAU (Tyr/Y)Tyrosin UAC (Tyr/Y)Tyrosin UAA Ochre (Stop) UAG Amber (Stop)

UGU (Cys/C)Cystein UGC (Cys/C)Cystein UGA Opal (Stop) UGG (Trp/W)Tryptofan

C

CUU (Leu/L)Leucin CUC (Leu/L)Leucin CUA (Leu/L)Leucin CUG (Leu/L)Leucin, Start2

CCU (Pro/P)Prolin CCC (Pro/P)Prolin CCA (Pro/P)Prolin CCG (Pro/P)Prolin

CAU (His/H)Histidin CAC (His/H)Histidin CAA (Gln/Q)Glutamin CAG (Gln/Q)Glutamin

CGU (Arg/R)Arginin CGC (Arg/R)Arginin CGA (Arg/R)Arginin CGG (Arg/R)Arginin

138

A

AUU (Ile/I)Isoleucin, Start2 AUC (Ile/I)Isoleucin AUA (Ile/I)Isoleucin AUG (Met/M)Methionin, Start1

ACU (Thr/T)Threonin ACC (Thr/T)Threonin ACA (Thr/T)Threonin ACG (Thr/T)Threonin

AAU (Asn/N)Asparagin AAC (Asn/N)Asparagin AAA (Lys/K)Lysin AAG (Lys/K)Lysin

AGU (Ser/S)Serin AGC (Ser/S)Serin AGA (Arg/R)Arginin AGG (Arg/R)Arginin

G

GUU (Val/V)Valin GUC (Val/V)Valin GUA (Val/V)Valin GUG (Val/V)Valin, Start2

GCU (Ala/A)Alanin GCC (Ala/A)Alanin GCA (Ala/A)Alanin GCG (Ala/A)Alanin

GAU (Asp/D)Kys. asparagová

GAC (Asp/D)Kys. asparagová GAA (Glu/E)Kys. glutamová GAG (Glu/E)Kys. glutamová

GGU (Gly/G)Glycin GGC (Gly/G)Glycin GGA (Gly/G)Glycin GGG (Gly/G)Glycin

1Kodón AUG kóduje methionin a slouží jako iniciační místo: první AUG v mRNA je místo, kde translace začíná 2Toto je startovní kodón pouze u některých prokaryot

• Jedna ze tří možností čtení nukleotidové posloupnosti = čtecí rámec • AMK nejsou schopny rozeznat triplety (kodóny) samy o sobě; adaptorovou molekulou je

tRNA a molekulárním strojem pro zprostředkování kontaktu mRNA s aminoacyl-tRNA a následnou syntézu polypeptidu je ribozóm

139

Experiment: máme vazebně kompetentní látku, která umožňuje navázání tRNA a trinukleotid do ribozómu. Všechny tRNA jsou nabité AMK, pouze jedna je radioaktivně označena. Tento systém se filtruje přes filtry s otvory, které propouští tRNA s AMK, ale nepropouští ribozom. Když přefiltrujeme tento roztok skrz filtr, usadí se nám na něm radioaktivní látka, tak se nám AMK-tRNA navázala na ribozom → takto byly určeny triplety a k nim jejich AMK

• pravidlo pro převod posloupnosti nukleotidů do posloupnosti AMK = genetický kód • největší variabilita je na třetím místě kodónu. AMK je nejvíce determinována druhým

nukleotidem kodónu (převážně polární AMK – purin, nepolární AMK – pyrimidin). • některé AMK jsou kódovany pouze 1 tripletem = methionin, tryptofan; jiné AMK jsou

kódovány 2 triplety; jiné AMK mají více tripletů = jsou synonymní → genetický kód je degenerovaný. Byly objeveny triplety, které jakoby nic nekódovaly (= nonsence). Později se objevilo, že kódují ukončení polypeptidu → jsou to UAA, UGA, UAG = stop-kodóny

• Nadbytek tripletů (kodónů) znamená, že některé kódují stejnou AMK – jsou synonymní a. • Genetický kód je univerzální a změny jsou zakázány (odchylky existují např.

v mitochondriích) • dříve byl společný předek, u kterého byla translace stejná, jakou známe dnes →

translační aparát je podobný u archae, bakterií a eukaryot • vývoj se musel zastavit v určitém období, kdy by další vývoj vedl k velkému poškození

organismů, tj. v období, kdy podstatnou roli začali hrát proteiny • kdyby byl vývoj nepřestal, tak by dosud vzniklé proteiny byly poškozené

• existují výjimky, kde se translace trochu liší od ostatních organismů • mitochondrie – mají jednodušší translaci a některé své funkce mají přeneseny do

jádra „hostitelské“ buňky • některé kvasinky –mají výjimky v rozpoznávání kodonu a AMK (normálně se za

CUG zařazuje leucin, ale ony zařazují serin) • Všechny nascentní polypeptidové řetězce jsou zahájeny N-formylmetioninem (prokaryota)

nebo metioninem (eukaryota) určeným iniciátorovým kodónem AUG resp. výjimečně GUG (prokaryota). GUG uvnitř polypeptidu kóduje valin

• Syntéza polypeptidu je ukončena na nesmyslném (nonsense, terminačním) tripletu: UAA = ochre

UAG = amber; výjimečně kóduje pyrolysin

UGA = opal; výjimečně kóduje selenocystein

• mezi 20 základních AMK se dnes začínají počítat další 2 AMK: selenocystein a pyrolysin

• základní (přirozené) AMK jsou definovány jako AMK, které se vkládají do polypeptidového řetězce během translace (po skončení syntézy polypeptidu probíhají posttranslační úpravy, které mění základní AMK na další nestandardní AMK)

• přes cis-element se selenocystein vkládá do řetězce polypeptidu; jeho kodónem je UGA; selenocystein se vyskytuje ve všech organismech, ale pouze v málo proteinech

140

• u archae byl nalezen pyrolysin ; jeho kodónem je UAG • když se uprostřed proteinu objeví stop-kodón, tak si buňka pomůže tak, že místo, aby

ukončila syntézu proteinu, tak tam vloží nějakou AMK → vznikne trochu pozměněný protein, který ale bude aspoň trochu funkční, než kdyby vznikl krátký a nefunkční protein

• translace polypeptidu má fixní počátek • dostatečně velký úsek, který a je ohraničen start a stop-kodónem s největší

pravděpodobností kóduje nějaký protein = otevřený čtecí rámec

Základní transla ční aparát

• dělí se na dvě části: • 1) ribozomální část – zahrnuje mRNA, tRNA a ribozomy • 2) neribozomální část – aminoacyl-tRNA-syntetázy, řada dalších faktorů (iniciačních,

elongačních, terminačních) a proteinů, které nabijí tRNA aminokyselinami • Aminoacyl-tRNA nese trojci bází komplementární ke kodónu = antikodón • Počet druhů tRNA v buňce není 61 (eukaryota cca 45, bakteria cca 40, chloroplasty 30,

mitochondrie obratlovců 22, některé organismy až 100). To je možné díky někdy značným modifikacím bází na první pozici antikodónu a díky kolísání párování bází (wobble)

• Aminoacyl-tRNA-syntetázy jsou enzymy, které katalyzují vazbu AMK na odpovídající tRNA = aktivace aminokyselin jejich vazbou na tRNA.

• Ribozóm je supramolekulární útvar složený z rRNA a řady proteinů katalyzující přenos informace z posloupnosti bází v nukleových kyselinách do posloupnosti AMK v polypeptidech.

• Sekvence kódující > 100 základních molekul překladatelského aparátu (tRNA, rRNA, proteiny) zabírají cca 5 % bakteriálního genomu.

Struktura a funkce tRNA

Primární struktura:

• Dlouhé typicky 74 až 95 b, číslování ve směru od 5’ k 3’, na 3’konci ukončeny sekvencí -C-C-A3’OH, 5 až 20 % minoritních bází

Sekundární struktura:

• Struktura jetelového listu tvořená 4 + 1 ramenem. Všechny kromě akceptorového ramene jsou vlásenky sestávající z příslušného stonku a smyčky):

1. akceptorové rameno – obsahuje 5’ i 3’ konec a v “nabitém stavu” nese navázanou příslušnou AMK

2. D (dihydrouridinové) rameno – obsahuje invariantní (neměnící se) bázi dihydrouridin

3. antikodónové rameno – nese antikodónový triplet ve středu antikodónové smyčky 4. TΨC rameno – obsahuje invariantní triplet TΨC, kde Ψ je pseudouridin

141

5. variabilní smyčka - dlouhá obvykle 4 až 5 bází (tRNA třída I. – 75 % všech tRNA), někdy 13 až 21 bází (třída II.)

• Variabilita v délce tRNA je způsobena variabilitou v délkách D ramene a variabilní smyčky.

Terciární struktura:

• “L struktura”; akceptorové a pseudouridinové rameno tvoří dvoušroubovici a jednu stranu písmena L, D a antikodónové rameno tvoří společně též dvoušroubovici a druhou stranu písmena L

• struktura L je tvořena W-C i non W-C párováním a je silně stabilizována vrstvením bází (“stacking”); invariantní báze jsou především zahrnuty při vzniku terciární struktury

• tRNA je posttranskripčně modifikována (bylo nalezeno až 100 modifikací); modifikace jsou nejčastěji na pseudouridinu a dihydrouridinu (chyby v pseudouridinylaci vedou k závažným chorobám)

142

Molekula tRNA. Na sérii těchto obrázků je zachycena různými způsoby tRNA specifická pro fenylalanin (Phe). (A) Struktura jetelového listu používaná pro demonstraci komplementárního párování bází (červené čáry), které vytváří dvoušroubovicové úseky. Antikodon je sekvence tří nukleotidů, které se párují s kodonem v mRNA. Aminokyselina, určená daným kodon/antikodonovým párem, je připojena na 3´-konec tRNA. Molekuly tRNA často obsahují atypické báze, které vznikají chemickou modifikací hotové tRNA. Báze označené jako Ψ (pseudouridin) a D (dihydrouridin) jsou odvozeny od uracilu. (B) a (C) Skutečný L-tvar tRNA podle rentgenostrukturní analýzy (X-ray diffraction). (D) Lineární nukleotidová sekvence tRNA, barevně označené sekvence odpovídají úsekům na obrázcích A, B a C.

143

Funkce

• adaptor umožňující a určující přesné přiřazení určité AMK k určitému tripletu bází • pravidlo o kolísání párování na 1. pozici antikodónu a třetí kodónu (wooble) umožňuje

snížit počet nezbytných druhů tRNA molekul v buňce

obsazení 1. pozice antikodónu možné párování na 3. pozici antokodónu

G U nebo C

U A nebo G

I (inosin) U, C, A

5-metoxyuridin nebo uridin-5-oxyoctová kyselina

A, G, U

Další modifikace a varianty jsou možné ⇒ existuje více způsobů jak sestrojit sadu tRNA rozeznávajících všech 61 smysluplných kodónů. Aplikace základního pravidla o kolísání (G, U v první pozici antikodónu) znamená teoretickou potřebu minimálně 31 tRNA + 1 iniciátorová. Reálně má ale buňka pro častěji se vyskytující kodóny více tRNA. tRNA má dále další funkce , které umí opravovat mutace → počet tRNA navyšuje na 61. Změna pyrimidinu za pyrimidin na 3 pozici kodónu neznamená změnu kódované aminokyseliny.

Odchylky od universálního genetického kódu mají tendenci zasahovat především čtení terminačních kodónů:

Kodón Universální kód

Odchylka Výskyt

UGA STOP Trp Mycoplasma, Spiroplasma, mitochondrie

UAA a UAG STOP Gln Acetabularia, Tetrahymena,

UGA STOP Cys Euplotes

UAG STOP sense Candida

CUG Leu Thr, Ser mitochondrie u hub

mitochondrie obratlovců

144

větší změny v genetickém kódu spolu s dalším zjednodušením (jediná tRNA rozeznává všechny členy kodónové rodiny a UAA, UAG + AGA a AGG jsou STOP kodóny) ⇒ 22 druhů tRNA

Aminoacyl-tRNA-syntetázy

• Aminoacyl-tRNA-syntetázy = enzymy zásadně zodpovědné za přesnost překladu a “stabilitu” genetického kódu. Strukturně i sekvenčně značně heterogenní skupina: mono-, di- i tetramery; MW 40 až 110 kD. Dvě hlavní skupiny lišící se uspořádáním domén a způsobem interakce s tRNA. • syntetáza proto, že spotřebovává energii z ATP

• Mají tři vazebná místa: 1) pro ATP, 2) pro AMK, 3) pro tRNA • Syntéza probíhá ve 2 krocích

1. aktivace aminokyseliny: AMK + ATP ⇒ aminoacyladenylát + P~P 2. aktivace tRNA: AMK~AMP + tRNA ⇒ AMK~tRNA + AMP

• Jedna syntetáza rozeznává jedinou AMK + celou sadu příslušných tRNA (tzv. izoakceptorových).

• AMK může být připojena jak na 3’ (II. skupina), tak i na 2’ -OH (I. skupina) ribózy koncového adenylu příslušné tRNA.

145

Aminoacyl-tRNA syntetáza spojuje tRNA s aminokyselinou

146

147

Vlastnosti tRNA z hlediska funkce

společné: rozeznatelné ribozómem (A a P místa), rozeznatelné elongačními faktory (EF-Tu, eEF-1), iniciačními faktory IF-2, eIF-2)

rozdílné: rozeznávané rozdílnými aminoacyl-tRNA-syntetázami

Přesnost syntézy aminoacyl-tRNA je zajištěna podobně jako v případě syntézy nukleových kyselin nebo při ribozomální fázi překladu specifitou vazebných míst a opravnou postsyntetickou aktivitou enzymu (“proofreading”)

• opravná aktivita je možná ve dvou krocích – buď po syntéze aminoacyladenylátu nebo po syntéze aminoacyl-tRNA; v obou případech je obvykle vyžadována vazba správné tRNA

148

• rozlišení správné tRNA je usnadněno změnou konformace aminoacyl-tRNA-syntetázy a následným značným urychlením reakce tRNA s AMK~AMP. Špatná tRNA nezpůsobí změnu konformace a tím je více času na její disociaci od enzymu.

• když dojde k poškození tRNA, buď je tRNA degradována, nebo je enzymem tRNAnukleotidyl-transferázou dosyntetizováno příslušné poškození; tím se udržuje určitý počet tRNA; upravuje se CCA konec, aby byla tRNA funkční

• každá chyba, kterou amino-acyl-tRNA-syntetáza udělá, vede k poškození polypeptidu

Přesnost syntézy tRNAIle závisí na dvou krocích – měřeno podle nesprávné inkorporace valinu

1. aktivace valinu na Val-AMPIle 1/225

2. uvolnění Val-tRNAIle 1/270

celková chyba syntézy 1/225 x 1/270 = 1/60000

• chybovost určuje velikost proteinu – aby byly proteiny větší, musí se chybovost při translaci zmenšit

• tRNA musí být rozpoznána celým aparátem v ribozomální části. Musí mít: • podobné rysy, aby byly rozpoznány prvním místem na ribozomu, elongačními a

iniciačními faktory • musí být specifické, aby byly rozpoznány různými amino-acyl-tRNAsyntetázami a

navázaly na sebe různé AMK • tRNA, které přenáší stejnou AMK, mají nejvíce konzervovaný antikodon a akceptorový

konec • amino-acyl-tRNA-syntetáza se orientuje hlavně pomocí akceptorového konce a

antikodónu

Ribozom

• tvořeny rRNA a ribozomálními proteiny; rRNA je tam daleko více než proteinů; jsou složeny z malé a velké podjednotky

• bakteriální ribozomy jsou menší než eukaryotní • Archae jsou více podobné eukaryotům; byla u nich nalezena 5,8 S rRNA • počet ribozomálních proteinů narůstá od bakterií, přes archae k eukaryotům = B < A < E

149

• kompletní ribozom má jinou hodnotu sedimentace, než je sedimentace u jednotlivých podjednotek

• 3 základní stavební „druhy“ funkčních, hotových ribozomů: a) celé, nedisociované ribozomy, b) translatující ribozomy v komplexech, c) ribozomy disociované na podjednotky

Složení ribozomů

obsah rRNA podjednotky rRNA proteiny

Prokaryota = 70S 66 % 50S 23S (2904 b) 31

(E. coli) 5S (120 b)

30S 16S (1542 b) 21

Eukaryota = 80S 60 % 60S 28S (4718 b) 49

(savci) 5,8S (160 b)

5S (120 b)

40S 18S (1874 b) 33

Organely = ribozomy připomínají prokaryotický ribozom; velikost 60 až 70S; obsah rRNA velice variabilní – od 70 % po méně než 30 %

150

Bakteriální 16S rRNA, konzervované sekvence jsou vyznačeny červeně

rRNA je modifikována metylací

151

152

• jedna z forem onemocnění disceratis congenita je způsobena mutací discerinu = pseudouridin-syntáza • protein, který interaguje s snRNA • je-li mutace v tomto proteinu, nastává problém s modifikací rRNA • tyto mutace dále vedou ke snížené schopnosti ribozomů překládat mRNA tvořící

proteiny, které hrají hlavní roli při apoptóze nebo při proliferaci → zvýšený výskyt nádorových onemocnění

Vazebná místa na ribozomu

[A] místo (aminoacylové) = oblast vstupu aminoacyl-tRNA, vazba tRNA na antikodón

[P] místo (peptidylové) = oblast vazby peptidyl-tRNA

[E] místo (výstupní) = místo odkud opouští ribozom “vybitá” tRNA

Peptidyltransferasová doména = katalytické místo peptidyltransferasy (syntéza peptidové vazby)

• A- a P-místo jsou tvořeny malou a velkou podjednotkou • E- místo a peptidyltransferasová doména jsou součástí velké podjednotky • pohyb ribozomů podél mRNA je provázen rychlou vazbou nabitých a uvolněním vybitých

tRNA spolu s cyklickým uvolňováním elongačních faktorů • mRNA je při syntéze asociována s malou podjednotkou. Ribozom kryje cca 30 b ≈ 10

kodonů • kanál, kudy prochází nově vytvořený polypeptid, je tvořen tak, aby polypeptid procházel

rovný (teprve po uvolnění se polypeptid stáčí do svého správného tvaru); kanál je proto úzký a mohou se na něj vázat různé inhibitory

153

Srovnání velikosti ukazuje, že ribozom je dostatečně veliký pro vazbu dvou tRNA (stejně jako pro 35 bází mRNA)

tRNA a mRNA se pohybují skrze ribozom stejným směrem

154

Fáze translace

1. iniciace = sestavení iniciačního komplexu z mRNA, obou podjednotek ribozomu, iniciační tRNA; relativně pomalá fáze

2. elongace = prodlužování peptidu; nejrychlejší fáze, nejméně regulovaná (je zde výrazně méně regulačních možností, také je zde méně iniciačních faktorů, zvláště u eukaryot)

3. terminace = disociace ribozomu, mRNA, polypeptidu • Energie v ribozomální fázi translace – z GTP

155

Ribozom má 2 místa pro vazbu aminoacyl-tRNA

Iniciace vyžaduje 30S podjednotku, která přináší IF-3

Prokaryotický typ p řekladu

• Ribozomy jsou v buňce jednak volné, jednak vázané. • Volné ribozomy se nacházejí v kompletované formě (70S) a jako volné podjednotky (30S

+ 50S), mezi těmito dvěma stavy existuje dynamická rovnováha. Regulátorem je iniciační faktor IF-3

• 5 % genomu bakterií je vyhrazeno pro translační aparát; 90 % energie metabolismu, který bakterie tvoří, je využito na proteosyntézu • → většina antibiotik je zacílena na translaci; dalším důvodem tohoto zacílení je, že

bakteriální translace je hodně rozdílná od eukaryotní translace • některá antibiotika jsou cílená proti všem jednotlivým částem translace

• tetracykliny fungují tak, že brání navázání amino-acyl tRNA do A místa ribozomu • streptomycin působí na přesnost proteosyntézy podobně jako některá

aminoglynosidová antibiotika • makrolidová antibiotika (erytromycin) fungují na velké ribozomální podjednotce –

blokují ten poměrně dlouhý úzký kanál (zhruba pro 30 – 40 aminokyselinových zbytků), kterým nesbalený polypeptid opouští ribozom

156

• puromycin je především antibiotikum, které se využívá ve vědě a při studiu translace a které mimikuje CCA konec amino-acyl tRNA • zastaví proteosyntézu tak, že se váže do A místa, umožní přenesení peptidylu na

puromycin a uvolnění a rozpad celého translačního komplexu ribozomu → výsledkem je, že máte v buňce spoustu zkrácených polypeptidů, které mají na C konci puromycin → buňka velmi rychle energeticky vyčerpá své energetické zdroje a nesyntetizuje nové bílkoviny

• u aminoglykosidů jsou významné karamicin, deptamicin • thiostrepton působí na translokaci

• je zacílen na více míst, jedna z jeho funkcí je ta, že blokuje vnitřní GTPázovou aktivitu EF-G

• EF-G kompetuje s ternárním komplexem (EF-Tu + amino-acyl tRNA + GTP) o A místo na ribozomu, které ovšem vypadá pokaždé trochu jinak. Ve chvíli kdy toto místo není úplně prázdné, tak se tam váže EF-G za štěpení GTP na GDP, fosfát umožní translokaci toho ribozomu. Jestliže nedojde ke štěpení GTP na GDP a fosfát, dojde k zastavení proteosyntézy v translokačním kroku a ribozomy zůstávají stát s nerozpadlým komplexem, proteosyntéza se zastavuje

• další zacílení antibiotik je na syntézu bakteriální stěny

1. Iniciace: • první a základní věc společná pro všechny organismy: běžný typ translace je vždy

zahajován malou ribozomální podjednotkou v komplexu s různými translačními iniciačními faktory • volné podjednotky a složené ribozomy jsou v buňce v jakési dynamické rovnováze, to

znamená mohou být, především u bakterií, asociovány a disociovány • zahájení translace malou ribozomální podjednotkou je jedna z možností regulace

celkové úrovně proteosyntézy v buňce • rovnováha směrem k disociaci se převádí změnou podjednotek

• bakterie to dělají tak, že pozmění malou ribozomální podjednotku navázáním (interakcí) translačního iniciačního faktoru 3 (IF-3)

• u eukaryot je to komplikovanější, tam se váží tyto faktory jak na velkou tak na malou ribozomální podjednotku

• iniciační komplex = 30S podjednotka, iniciační faktory [IF-1 (stabilizace komplexu), IF-2 (vazba iniciační fMet-tRNAf), IF-3 (vazba 30S na mRNA)]

157

Iniciátor N-formyl-methionyl-tRNA (fMet-tRNAf) je tvořen formylací methionyl-tRNA za použití formyl-tetrahydrofolátu jako kofaktoru.

• Iniciační fMET-tRNAf rozeznává kodóny AUG (správný iniciační kodón, který je signálem pro zahájení syntézy polypeptidů) a méně často GUG nebo UUG • rozpoznává jej na základě komplementárního párování mezi určitým úsekem na mRNA

a částí na 3´konci 16S ribozomální RNA na malé ribozomální podjednotce • u bakterií a částečně i archae iniciace probíhá na principu jakéhosi komplementárního

párování • Posloupnost dějů

• 1) IF-3 + 30S se váže na mRNA • 2) IF-1 se váže na tento komplex a stabilizuje jej • 3) za přítomnosti IF-2 se naváže GTP a iniciační tRNA nasedne do částečného P místa

na 30S podjednotce → vzniká ternární komplex (IF-2 + N-formyl methionyl tRNA + GTP) • iniciační tRNA kóduje methionin, u bakterií N-formyl methionin • iniciační tRNA je jiná než normální methionyl tRNA, má sice stejný antikodón

(rozpoznává také AUG), ale je rozpoznávána jinými, tzv. translačními iniciačními faktory, zatímco normální methionyl tRNA, která kóduje methionin uvnitř polypeptidu, je rozpoznávána elongačními faktory, které se účastní průběhu elongace (průběhu vnitřní syntézy polypeptidu)

• bakteriální IF-2 zajišťuje funkci několika iniciačních faktorů u eukaryot, poměrně komplikovaný faktor

• 4) dochází k rozpoznání velké ribozomální 50S podjednotky, která se naváže, hydrolyzuje se GTP na GDP + P a uvolní se iniciační faktory.

• 30S podjednotka se váže do RBS (ribozome binding site), jehož součástí je iniciační kodón a tzv. Shine-Dalgarno sekvence.

• Konsensus Shine-Dalgarno sekvence (cca -10 b od AUG) 5’ - AGGAGG - 3’

je komplementární k části konzervované sekvence na 3’ konci 16S rRNA

3’ -UCCUCC -5’

158

• u bakterií, nikoliv však u archae, je po aktivaci iniciační (někdy se značí Fmet tRNA I) tRNA je methionin blokován na N-konci, takže je méně reaktivní → vyznačuje N-konec polypetidu • iniciační tRNA se nazývá N-formyl iniciátorová tRNA právě podle té skupiny

• aby mohla být za iniciátorový kodón AUG připojena další aminokyselina, musí iniciátorová tRNA rozpoznávat AUG kodón v P místě malé ribozomální podjednotky → musí zůstat spojení dvou podjednotek a A místo musí zůstat volné • iniciační tRNA je jediná aktivovaná tRNA, která do ribozomu přichází do P místa • podle toho, jaký je další kodón na mRNA, tak první další amino-acyl tRNA přichází do

A místa, přenesení peptidu na tuto další amino-acyl tRNA je vlastně prvním elongačním krokem

IF-2 je potřebný k vazbě fMet-tRNAf na 30S-mRNA komplex. Po vazbě 50S jsou všechny IF faktory uvolněny a GTP je rozštěpeno

2. Elongace: • “Nabité” amino-acyl tRNA přináší do A místa ribozomu elongační faktor EF-Tu; EF-Tu se

aktivuje navázáním GTP; recyklován je pomocí faktoru Ts; (EF-Tu tvoří cca 5 % celkového proteinu buňky, cca 70 tisíc molekul / buňku, EF-Ts = cca 10 tisíc molekul /

159

buňku, tj. přibližně molární množství elongačního faktoru Ts by mělo odpovídat zhruba počtu ribozomů) • řada regulačních bílkovin má vždycky dva stavy lišící se podle toho, jestli mají na sobě

navázaný GTP nebo GDP • vazba GTP nebo GDP je velmi obecná, buňkami používaná pro změny stavu bílkovin • skoro vždy s takovýmto systémem souvisí další bílkovina, v tomto případě je to

elongační faktor Ts (EF-Ts), který je tzv. GTP-GDP výměnný protein • má vyšší afinitu pro EF-Tu, nemá tRNA a je v té formě s GDP

• Syntéza – peptidyltransferasa 50S podjednotky (23S RNA jako katalytické centrum) • Translokace vyžaduje EF-G a hydrolýzu GTP na GDP + P • Ribozom nemůže vázat najednou EF-Tu a EF-G ⇒ nutnost cyklického střídání obou

faktorů (fází); struktury ternárního komplexu EF-Tu připomíná strukturu EF-G/GTP (kompetice o místo?) • GTP aktivovaný EF-Tu je schopen rozpoznat amino-acyl tRNA → opět vzniká ternární

aktivovaný komplex amino-acyl tRNA, EF-Tu, GTP, který je schopen vázat se do A místa ribozomu

• po vazbě ternárního komplexu dochází k rozpoznávání jestli kodón a antikodón páruje správně → další místo, kde se určuje přesnost syntézy

• vazba aminoacyl-tRNA i translokace jsou vlastnosti ribozomu urychlené (katalyzované) elongačními faktory • rychlost a síla s jakou je schopen párovat kodón a antikodón určuje, jestli dojde

k uvolnění elongačního faktoru Tu a k hydrolýze GTP na GDP a usazení amino-acyl tRNA uvnitř ribozomu, nebo jestli dojde k uvolnění celého komplexu

• vzniká vazba mezi AMK a polypeptidem → tRNA se přesune na P-místo • NH skupina AMK atakuje C-konec peptidu na P-místě a vznikne peptidová vazba; aktivní

místo je tvořeno 23S rRNA v ribozomu; nejblíže aktivnímu místu je adenin 2451 – moderuje přenos peptidylu • vědci připravily ribozom, který má mutaci v tomto adeninu a nic se nestalo → tento

adenin je důležitý pro fungování místa, ale není esenciální • je-li mutace v 2´-OH skupině, která se účastní přenosu skupin, aktivita

peptidyltransferázové domény klesne až 106 krát • tRNA je aktivním hráčem v této doméně – rozpoznává kodón, dříve se účastnila i

přenosu AMK na peptidy • když dojde k přenou peptidylu na amino-acyl tRNA, tak je třeba, aby ribozom změnil vůči

sobě své postavení o jeden triplet • toho se účastní elongační faktor G (EF-G, GTP-GDP vazebný protein) • EF-G v podstatě soutěží o P místo s ternárním komplexem • P místo vypadá pokaždé trochu jinak v závislosti na tom, co se v tu chvíli dělo na

ribozomu → vždycky je výrazně vyšší pravděpodobnost, že se tam váže buď EF-G nebo ternární komplex • takto dochází k postupnému střídání elongačních faktorů v P místě • buď dochází k vnášení nové aminokyseliny do peptidového zbytku a nebo

k translokaci ribozomu po mRNA • jiná situace nastane ve chvíli, kdy se na mRNA objeví některý ze stop kodónů, který

nemá proti sobě příslušnou amino-acyl tRNA

160

EF-Tu-GTP umísťuje aminoacyl-tRNA do ribozomu a poté je uvolněn jako EF-Tu-GDP. EF-Ts je vyžadován ke zprostředkování náhrady GTP za GDP. Reakce spotřebovává GTP a obnovuje GDP. Jediná aminoacyl-tRNA, která nemůže být rozpoznána EF-Tu-GTP, je fMet-tRNAf, jejíž nemožnost vazby chrání před odpovědí na vnitřní AUG nebo GUG kodony

3. Terminace: • terminace zprostředkována RF (“release”) faktory:

• RF-1 rozpoznává UAA a UAG • RF-2 rozpoznává UAA a UGA • RF-3 je GTP vazebný protein podobný EF-G a spolupracuje s RF-1 nebo RF-2

• jeho změna za přispění hydrolýzy GTP na GDP vede k rozpadu celého komplexu (mRNA, obou ribozomálních podjednotek nebo celého ribozomu, tRNA) a především k hydrolýze polypeptidu z peptidyl tRNA

• stop kodóny znamenají ukončení růstu polypeptidů, disociaci ribozomu mRNA a polypeptidu • jestliže nemá stop-kodón proti sobě příslušnou amino-acyl tRNA, tak v P místě soutěží

s EF-Tu a EF-G další bílkovinné faktory RF-1 nebo RF-2 • ve výjimečných případech, jestliže se stop kodón vyskytne uprostřed genu, umožní

buňce nasyntetizovat alespoň část těchto proteinů • další výjimkou je, když je stop kodon rozpoznáván za nějakým účelem, za

supresorovou DNA a nebo kdy je tam zařazován selenocystein

161

RF1 ⇔⇔⇔⇔ UAA, UAG

RF2 ⇔⇔⇔⇔ UAA, UGA

Struktura ternárního komplexu aminoacyl-tRNA-EF-Tu-GTP (vlevo) se podobá struktuře EF-G (vpravo). Strukturálně konzervované domény EF-Tu a EF-G jsou červeně a zeleně. tRNA a doména podobná v EF-G je fialově.

Molekulární mimikry umožňují vazbu elongačního faktoru Tu-tRNA komplex, translokačního faktoru EF-G a uvolňovacího faktoru RF1/2-RF3 na stejnou ribozomální stranu

Eukaryotický typ p řekladu

• velmi podobné prokaryotům s výjimkou iniciace

162

• eukaryotní mRNA je specifická a je naprosto rozdílná od všech bakteriálních a archaeálních mRNA • jednak má polyA konec na 3´ konci a jednak má methylovou čepičku na 5´ konci

• tato čepička je zásadní pro translaci naprosté většiny eukaryotních mRNA → musí tam být něco zvláštního, nějaký jiný komplex iniciačních faktorů, který umí rozpoznat tuto speciální strukturu a umí přitáhnout celý ten pre-iniciační komplex malé ribozomální podjednotky a ternárního komplexu

• dále má eukaryotní mRNA dost často, hlavně u vyšších eukaryot, poměrně dlouhé 5´ i 3´ nepřekládané sekvence, tzv. untranslated region • tyto sekvence mají dost často regulační funkci, umožňují, že se na ně naváže celá řada bílkovin, a umožní buď zvýšit / snížit účinnost translace nebo zvýšit / snížit stabilitu mRNA nebo umožní mRNA aby byla transportována někam jinam v buňce

• energetická náročnost translace u eukaryot se pohybuje okolo 5 až 10 % • eukaryota produkují dlouhý prekurzor pro-rRNA, ten se štěpí a dále upravuje metylací,

atd. • těchto pochodů se účastní snRNA • v jadérku se tvoří rRNA, vznikají ribozomy a probíhá zde jejich maturace a modifikace • ribozomální proteiny přechází z cytoplazmy do jadérka pro syntézu ribozomů: pre-

ribozom se rozdělí na pre-malou a pre-velkou podjednotku; tyto pre-podjednotky přechází z jadérka do jádra, kde proběhne další syntéza

• pak přechází tyto téměř hotové podjednotky z jádra do cytoplazmy

1. Iniciace: • navlékací mechanismus; pravděpodobně chybí přímá interakce 18S rRNA s mRNA, pro

migraci 40S podjednotky k AUG je třeba ATP • preiniciační komplex (malá ribozomální podjednotka a všechny ty různé faktory), se

váže pomocí dalších faktorů na 5´ konec před čepičku • pak se musí nějak dostat přes nepřekládanou oblast = skenování

• komplex rozpozná čepičku, 5´ terminus mRNA, a jede (skenuje) po té mRNA až narazí na AUG iniciační kodón • obvykle to bývá první iniciační kodón, ale není to pravidlo, může to být nějakým

způsobem regulováno, až je vybrán ten správný iniciační kodón, který umožní syntézu polypeptidu

• mRNA monocistronní (obvykle) • iniciační aminoacyl-tRNA není formylována = Met-tRNAi • více iniciačních faktorů, z hlediska funkce: eIF-2 ≈ EF-2 • vazba na “cap” zprostředkována eIF-4... • spotřeba ATP i GTP • účast poly(A) konce

• 3´ polyA konec je obsazen polyA vazebnými proteiny, které interagují s některými iniciačními faktory rozpoznávajícími 5´ konec, konkrétně s komplexem eIF4F a eIF-3

• přes polyA konec a polyA vazebný protein může interagovat 5´ a 3´ konec • množství polyA vazebných proteinů může zvyšovat efektivní koncentrace

preiniciačních komplexů • zvýšená koncentrace těchto faktorů umožní vyšší a častější zahájení translace na 5´

konci • čím je delší polyA konec, tím je mRNA lépe překládána

• u eukaryot se ukázalo, že když chybí polyA konec, tak řada těchto mRNA je slabě nebo vůbec překládána, a nebo je odsouzena přímo k degradaci – záleží na tom, v jakém kontextu v jaké buňce se vyskytují

• např. v oocytech, ve chvíli kdy zde neprobíhá transkripce, regulace polyadenylace maternálních mRNA, které tam jsou ještě od matky, je často

163

závislá na regulaci polyadenylace těchto konkrétních mRNA → pokud je tady nějaká polyadenylovaná mRNA, tak to vede k její vyšší translaci

• v průběhu každého cyklu translace je polyA řetízek o něco málo zkrácen • u eukaryot je polyA řetízek dlouhý třeba 200 zbytků kyseliny adenylové, u kvasinek

je to třeba 60 • pořád je dostatečně dlouhý, protože jeden polyA vazebný protein obsadí přibližně

15 – 20 nukleotidových zbytků • když dojde k určitému zásadnímu zkrácení polyA, tak se to stává signálem pro

enzym „Decapping“ komplexem („odčepičkovací enzym“), který ustřihne tuto strukturu • jediná nukleáza, která je v buňce schopná rozpoznat čepičku a odštěpit ji • degradace odštěpením čepičky vede k degradaci celé mRNA • u eukaryot majoritní dráha degradace mRNA je přes 5´ konec • tomuto modelu, který byl dokázán elektronmikroskopicky, se říká model

uzavřené smy čky • pro iniciaci důležité i okolí AUG – konsensus Kozakové (ACCAUGG)

• podstatné je, že u eukaryot je sekvence (konsensus Kozakové), která zvyšuje pravděpodobnost, že konkrétní AUG bude rozpoznáno preiniciačním komplexem a bude použito pro zahájení syntézy

• faktory, které jsou unikátní pro eukaryota a které rozpoznávají čepičky jsou tzv. faktory skupiny 4, to znamená eIF4E, eIF4G, eIF4A, eIF4B, celkově se ta skupina nazývá eIF (eukaryotní iniciační faktor) 4F

• tento komplex, rozpoznávájící čepičku, umožňuje navázání tohoto preiniciačního komplexu a umožňuje zahájení skenování až je nalezen první AUG kodón

• RNA není žádná tyčka, ale je to jakási struktura, která velmi snadno páruje i intramolekulárně a nejen Watson-Crikovsky, zvláště guanosin umí párovat s „kde s čím“ • může se stát, že 5´ nepřekládaná oblast je velmi strukturně bohatá, zvlášť když je

oblast mezi 5´ koncem a AUG kodónem je dlouhá • taková průměrná délka u kvasinek je něco kolem 60 nukleotidů, u některých genů

vyšších eukaryot je to ale třeba 300, 1000 nebo 1200 nukleotidů • proto jsou součástí 4F komplexu proteiny 4A, 4B, což jsou helikázy, a dále protein,

který rozpoznává čepičku • helikáza umožňuje skenujícímu ribozomu rozmotávat za spotřeby ATP tu

případně složitou strukturu na 5´ nepřekládané oblasti • zároveň si můžeme v tuto chvíli představit že to, jak moc je ta 5´ nepřekládaná

oblast strukturovaná, tak to už je určitým regulačním prvkem pro konkrétní mRNA – jak intenzivně bude překládaná, jak účinně, jak moc dobře se bude skenovat

164

iniciace translace u eukaryot

„model uzavřené smyčky“

2. Elongace: • Z hlediska funkce: EF-1α ≈ EF-Tu, EF-1βγ ≈ Ts, EF-2 ≈ EF-G

3. Terminace: • Pouze jeden terminační faktor pro všechny STOP kodóny eRF1 + eRF3 (GTPasa)

Archaeální typ p řekladu

165

• translační iniciační faktory archae a eukaryot jsou si velmi podobné • IF-2 je složený ze tří podjednotek alfa, beta a gama (archae i eukaryota) a přináší ternární

komplex • u bakterií se navíc ještě účastní spojení velké a malé ribozomální podjednotky a svoji

strukturou spíše připomíná eukaryotní eIF-5B, stejně jako archaeální aIF-5B, které se u eukaryot a u archae podílejí na spojení ribozomálních podjednotek

• řada mRNA u archae obsahuje Shine-Delgarnovovu sekvenci nebo něco jí podobného → není tam čepička, nejsou tam faktory skupiny 4F

• bakterie a archae mají společné alespoň z části zahajování translace pomocí komplementárního párování v Shine-Delgarnovově sekvenci

• naopak RNA malé ribozomální podjdnotky je schopna párovat v blízkosti iniciačního kodónu u archae s mRNA, je to vlastně analogie Shine-Delgarna

• u části archae je velká část mRNA (až 50 %) polycystronní a je úplně jiná než jak ji známe z bakterií a eukaryot – tyto mRNA jsou bez jakékoliv nepřekládané oblasti

• na 5´ konci je AUG kodón a žádná modifikace, prostě jenom AUG kodón • jak je rozpoznáván takovýto konec a jak je zde zahajována translace, které faktory se

toho účastní se v současné chvíli neví

Rychlost a energetika p řekladu ( E.coli )

• cca 20 AMK / sekundu • zařazení 1 AMK = 4 makroergní vazby (2 z ATP – aktivace amino-acyl tRNA, 2 z GTP) +

po 1 z GTP na iniciaci a terminaci překladu ⇒ na připojení jedné AMK (energie vazby ≈ 21 kJ) se spotřebuje cca 30,7 x 4 = 122,8 kJ

• regulační energie, která je použita pro přestavby a posun po ribozomu je z GTP • energie na syntézu peptidové vazby je z ATP, protože ta byla použita už při aktivaci tRNA

amino-acyl tRNA syntetázou • proteosyntéza spotřebuje až 90 % biosyntetické energie rychle rostoucí bakteriální buňky • jakýkoliv zásah do proteosyntézy vede k zborcení celé řady klíčových dějů a okamžitě

k smrti buňky nebo minimálně k zastavení růstu

Přesnost p řekladu

• průměrná přesnost překladu nemůže být nikdy vyšší než přesnost amino-acylace tRNA na amino-acyl tRNA syntetázách

• průměrná přesnost překladu je cca 5 x 10-4 • průměrné polypeptidy v buňce, ať už bakteriální nebo eukaryotní, mohou být jenom tak

velké, aby se v nich nehromadily chyby • nesprávný triplet s 2 stejnými bázemi je rozeznáván pouze 10-1 až 10-2 méně účinně než

správný ⇒ nutný vliv i jiných mechanismů než jen párování kodón – antikodón • vliv ribozomu, ribozomálních proteinů (S12 x streptomycin, S4, S5), rRNA (hypometylace,

mutace – např. 5S rRNA u kvasinek), translačních faktorů (EF-Tu ...), změny konformace a mutace v aminoacyl-tRNA, primární a sekundární struktura mRNA na přesnost překladu

• “proofreading” – degradace nesprávného polypeptidu (např. “nonsence mediated decay”) • dosahovaná přesnost překladu je kompromisem mezi rychlostí, přesností a energetickou

náročností • hledal se gen (příčina) rezistence na streptomycin a ukázalo se, že za to je

zodpovědná bílkovina malé ribozomální podjednotky S12 (předpona S značí malou ribozomální podjednotku, L značí velkou ribozomální podjednotku)

• čím více se získávaly kmeny, které byly rezistentní vůči vyšším dávkám streptomycinu, tím víc mutací se hromadilo v genu kódující bílkovinu S12

166

• nejzajímavější bylo, že když se získaly kmeny, které byly rezistentní na opravdu vysoké dávky streptomycinu a daly se na agarovou půdu bez streptomycinu, tak naprostá většina těchto kmenů nerostla

• zjistilo se, že streptomycin zvyšuje chybovost syntézy, zvyšuje chybovost translace • mutace v bílkovině, která je v cílovém místě pro streptomycin a mutace v bílkovině S12

naopak zvyšuje preciznost ribozomu, ale zároveň snižuje rychlost ribozomu → takovéto kmeny, které byly schopny normálně růst při vysokých dávkách streptomycinu, byly přeneseny na normální médium, tak měly tak přesné ribozomy, ale zároveň v uvozovkách tak pomalé ribozomy, že skoro nesyntetizovaly proteiny a nebylo to slučitelné s životem buňky → tak jak dnes vypadají translační aparáty, tak dosahovaná přesnost překladů je kompromisem mezi přesností a rychlostí

• když se snižovaly dávky streptomycinu, tak se začaly hromadit mutace v dalších ribozomálních proteinech, konkrétně mutace v proteinech S4 a S5, které jakoby naopak snižují přesnost translace a zvyšují rychlost ribozomu

Degradace vadné mRNA a jejího produktu

Prokaryota

• např. při výskytu vyskytne nečekaně končící mRNA (nekončí stop kodónem) • využívá se tzv. transferová messenger RNA (tmRNA)

• speciální RNA, která je aktivovaná aminokyselinovým zbytkem alaninu,je to alanyl tRNA

• je přenesena do A místa a umožní přenos peptidylu na tmRNA • tmRNA zároveň uvnitř kóduje kratičký polypeptid, který je normálně přeložen a kóduje i

konec tohoto polypeptidu, to znamená dojde k normálnímu rozpadu komplexu a dojde k degradaci špatné, chybné původní mRNA • dojde k označení toho nedokončeného, špatného polypeptidu značkou, která je

značkou pro proteolytickou inaktivaci vzniklého nového polypeptidu a vede k jeho degradaci

Eukaryota

• komplikovanější, každá část syntézy mRNA i jejího využití je pod dohledem • nonsense-mediated decay znamená, že se někdy vyskytne nonsense nebo stop kodón a

vyskytne se někde, kde neměl původně být • exon junction komplex (EJC) je část proteinu, která zůstane po sestřihu mRNA

• kousek od 5´ exon-intronového spojení zůstává jakýsi proteinový komplex, který označuje, kde došlo ke spojení exonů a intronů

• buňka tím pádem na mRNA, která je exportována ven z jádra, pozná, kde došlo ke spojení jednotlivých exonů, (má tato jednotlivá místa tímto označená)

• EJC je odstraněn v průběhu translace, v průběhu syntézy ribozomem • EJC není odstraněn z celé mRNA v případě, že se náhle objeví stop kodón a je

předčasně ukončena syntéza polypeptidu • mRNA, která na sobě dlouho nechává tyto EJC komplexy je rozpoznána dalšími

faktory, které umožní říct: „tady na této RNA je zřejmě něco špatného, nepřekládá se celá, půjde do degradace“

• v případě, že mRNA nemá stop kodón (nonstop decay), musí nastat její degradace • ribozom dojede na konec, zastaví se, nemůže dojít k uvolnění tohoto komplexu RNA,

transferyl peptidyl tRNA a ribozomů

167

• takovýto zastavený ribozom je rozpoznán skupinou faktorů, které umožní uvolnění těchto komplexů a degradaci této špatné RNA

Kotransla ční a posttransla ční úpravy

Vytvořené nebo někdy ještě se tvořící polypeptidy jsou různým způsobem modifikovány a upravovány.

• deformylace N-koncového methioninu specifickou deformylasou (prokaryota) • odštěpení N-koncového methioninu aminopeptidasou • chemická modifikace konců i různých AMK zbytků uvnitř řetězce (acylace, metylace,

hydroxylace, glykosylace, myristilace, prenylace, ADP-ribosylace, fosforylace...) • štěpení peptidu (např. prepropeptidu při sekreci) • vytváření sekundární, terciární a kvarterní struktury, vazba prostetických skupin, interakce

s dalšími biopolymery a tvorba supramolekulárních celků atd.)

Posttransla ční lokalizace protein ů

V buňce jsou proteiny po anebo již během translace směrovány do míst jejich pozdější funkce nebo míst, kde jsou dále modifikovány. Složitá situace je zvláště v eukaryotické buňce vzhledem k její kompartmentaci.

• Proteiny lze hrubě rozdělit na cytosolické a membránově vázané. Místo určení syntetizovaných proteinů je determinováno specifickou sekvencí AMK – lokalizačním signálem (např. N-koncový pro mitochondrie, chloroplasty, ER, sekreci ven z buňky; C-koncový pro peroxisomy; interní pro jádro atd.).

• Cytosolické a organelové proteiny jsou syntetizovány na “volných” cytoplasmatických ribozomech. Proteiny směrované do membrán organel – posttranslační translokace.

• Proteiny cytoplasmatické membrány (CM), ER, Golgi ... a sekretované proteiny jsou syntetizovány na drsném ER – kotranslační translokace.

Skládání protein ů do terciární struktury (“folding”)

Některé proteiny samy zaujmou funkční finální konformaci – samoorganizace, některé vyžadují pomocné proteiny:

a) chaperony

• hlavní chaperony patří do rodin “heat shock proteinů” Hsp70, Hsp60, Hsp90 • Hsp70 – na počátku vzniku proteinu (E. coli DnaK, eukaryota BiP)

• vyskytují se u všech organismů (u kvasinek je jich asi 14) a všude – jsou v mitochondriích, v chloroplastech, cytosolu, jsou v ER

• BIP v lumen ER se postupná váže na nově vznikající polypeptid a jednak vede (tj. pomáhá skládání polypeptidu) a jednak převádí rovnováhu směrem k translokaci, to znamená směrem k syntéze peptidu dovnitř

• Hsp60 – později; velký komplex ve tvaru oboustranně otevřeného barelu (E. coli GroEL), funkční spolu s Hsp10 (E. coli GroES)

168

• chaperony ovlivňují nejen skládání do terciární struktury, ale i oligomerizaci b) proteindisulfidizomeráza (PDI) – vliv na vytváření S-S můstků v endoplazmatickém

retikulu c) peptidylprolylizomeráza (PPI) – vliv na konverzi cis konformace prolinu na trans

Prolin vnáší ohyby do polypeptidového řetězce, protože atom dusíku je držen v kruhové struktuře. Existence (a vzájemná konverze) dvou stereochemických tvarů peptidyl-prolinové vazby je důležitým prvkem bílkovinné struktury

Posttransla ční translokace – eukaryota

• V organelách syntetizováno relativně málo proteinů: mitochondrie cca 10, chloroplasty cca 50

• základní dráha importu proteinů do mitochondrií: translace → “folding” → translokace přes vnější i vnitřní membránu do matrix (receptor, kanál, Hsp70...) → “folding” popř. i oligomerizace (Hsp60...) → případný přenos zpět do vnitřní membrány nebo lumen

• Díky různému prostředí může být struktura proteinu v cytosolu a v mitochondrii různá

Kotransla ční translokace – eukaryota

169

• kotranslační translokace, protože pro translokaci bílkoviny skrze membránu ER je využívána částečně energie translace a dochází k tomu přenosu ve stejné chvíli, kdy je příslušná bílkovina překládána

• N-terminální signální sekvence 15 až 30 AMK (hydrofóbní jádro) • základní dráha importu proteinů do ER:

1) start translace

2) po syntéze cca 70 AMK (signální sekvence ven z ribozomu + cca 40 AMK uvnitř) dochází k vazbě SRP na signální sekvenci a dochází k zastavení nebo k zpomalení syntézy polypeptidu na ribozomu (SRP = “signal recognition particle”, 5-6 x 23-24 nm, 11S, 6 proteinů + 7S RNA [305 b])

3) vazba SRP na receptor (SRα + SRβ)

4) přenos ribozomu na Sec61, resp. Sec61/TRAM komplex

• u bakterií jsou Sec proteiny součástí cytoplasmatické membrány • u eukaryot se Sec-systém najde jak u translokónů pro posttranslační translokaci

bílkovin na ER, ale najde se třeba i v chloroplastech 5) translokace přes membránu

6) štěpení signální peptidasou

7) “folding”, glykosylace a další modifikace

170

Prokaryota využívají kotransla ční i posttransla ční translokaci

• Na nascentní protein se váže chaperon SecB → vazba na membránový protein SecA a transmembránový SecY → translokace a odštěpení signálního peptidu

• většina bílkovin u bakterií je translokována posttranslačně, nicméně v menší míře mají bakterie i kotranslační systém a dokonce lze u nich najít i ribonukleproteinové partikule, které také obsahují RNA a vážou se na ribozom

• analog SRP = ribonukleové partikule s 4,5S RNA, nezastavují proteosyntézu • energie pro translokaci bílkovin je využívána štěpením ATP ATPázou

Degradace protein ů

• lysosomy, vakuoly, proteasom • místa masivní degradace bílkovin musí být odlišena od zbytku buňky, aby nedocházelo

k poškozování funkčních bílkovin, které jsou uvnitř buňky • jednou z hlavních značek, která určuje, které bílkoviny budou degradovány je navázání

malého všudypřítomného polypeptidu ubiquitinu, který se váže na tu danou bílkovinu • proteasom = supramolekulární komplex ≈ 700 kD, degraduje proteiny s navázaným

polyubiquitinem na jejich ε-Lys (ubiquitin pospojován přes C-terminal Gly a Lys46) • umožňuje rozštěpení bílkovin a recyklaci jednotlivých aminokyselin

• po degradaci proteinu je ubiquitin recyklován

Regulace genové exprese

Genové inženýrství