Molekularni a Bunecna Biologie

DISTANČNÍ OPORY PRO KOMBINOVANÉ STUDIUM BIOLOGIE

MOLEKULÁRNÍ A BUN ĚČNÁ BIOLOGIE

Jan Malý

UNIVERZITA JANA EVANGELISTY PURKYN Ě

PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA katedra biologie

Ústí nad Labem 2006

Anotace opory

Molekulární biologie je povinným kurzem studijního oboru učitelství pro střední školy a nově připraveného distančního bakalářského studia jednooborové biologie na katedře biologie přírodovědecké fakulty UJEP. Cílem tohoto kurzu je především poskytnout základní, ucelené informace o principech života na molekulární úrovni. Smyslem této dvoudílné opory bylo především ujednotit a vymezit základní obsah kurzu, tj. vyčlenit nejdůležitější pojmy a stručně je charakterizovat. V tomto pojetí tedy nelze text chápat jako skripta, či učebnici do podrobností objasňující všechny detaily. Text je spíše určitým vodítkem k dalšímu samostudiu z doporučené odborné literatury a popř. vlastních přednášek. Jako doplněk textu jsou uvedeny číslované odkazy na obrázky, které každý student obdrží na samostatném CD disku. Tyto obrázky slouží k snažšímu pochopení složitých molekulárně-biologických dějů a efektivnímu samostudiu.

OBSAH

1. STRUKTURA A FUNKCE PROTEIN Ů …. 3 1.1. Obecné vlastnosti aminokyselin 1.2. Peptidická vazba 1.3. Klasifikace a charakteristika vlastností aminokyselin 1.4. Nestandardní aminokyseliny 1.5. Specializované funkce aminokyselin 1.6. Sekundární struktura proteinů 1.7. Fibrilární proteiny 1.8. Globulární proteiny 1.9. Stabilita proteinů 1.10. Denaturace proteinů 1.11. Kvarterní struktura proteinů

2. STRUKTURA A FUNKCE NUKLEOVÝCH KYSELIN …. 15 2.1. Vlastnosti nukleotidů 2.2. Struktura DNA s nadšroubovicovým vinutím 2.3. Denaturace a renaturace nukleových kyselin

3. REPLIKACE DNA …. 22 3.1. Obecný princip replikace 3.2. Replikační enzymy 3.3. Replikace prokaryot a bakteriofágů 3.4. Replikace eukaryotního chromozómu

4. REPARACE DNA …. 35 4.1. Přímá oprava poškození nukleotidů 4.2. Excisní reparace 4.3. Mismatch reparace 4.4. SOS odpověď 4.5. Reparace dvojřetězcových zlomů 4.6. Identifikace karcinogenních látek

5. TRANSKRIPCE …. 40 5.1. Role RNA v syntéze proteinů 5.2. RNA polymeráza 5.3. Vazba templátu 5.4. Iniciace transkripce 5.5. Elongace 5.6. Terminace transkripce 5.7. Eukaryotní RNA polymerázy 5.8. Struktura promotorových sekvencí eukaryot

6. REGULACE EXPRESE GENŮ NA ÚROVNI TRANSKRIPCE U PROKARYOT …. 50 6.1 Regulace transkripčními faktory 6.2 Regulace katabolickou represí 6.3 Regulace sekvenčně specifickými protein-DNA interakcemi 6.4 Regulace araBAD operonu 6.5 Regulace tryptofanového (trp) operonu atenuací 6.6 Regulace syntézy rRNA za přísných podmínek (stringent response)

7. POSTRANSKRIPČNÍ ÚPRAVY PRIMÁRNÍHO TRANSKRIPTU …. 57 7.1 Úpravy mRNA čepičkou a polyA koncem 7.2 Molekulární sestřih mRNA (splicing)

Studijní opory biologie Malý J.:Molekulární biologie

Strana 4

1. STRUKTURA A FUNKCE PROTEINŮ

1.1. Obecné vlastnosti aminokyselin

Aminokyseliny (amino acids, aa) jsou základními stavebními kameny proteinů. Analýzou

obrovského množství proteinů bylo prokázáno, že jsou vždy tvořeny 20 základními

aminokyselinami (Obr 1 a 2). Tyto molekuly jsou označovány jako tzv. α-aminokyseliny, tzn.

jsou tvořeny primární aminoskupinou a karboxyskupinou navázanou na stejném, centrálním

atomu uhlíku (s vyjímkou prolinu) (Obr.3). Jelikož hodnoty pK α-aminoskupiny a α-

karboxyskupiny aminokyselin leží v rozsahu pH 8,0-9,4 respektive pH 2,2 – 3,5; při

fyziologickém pH jsou obě skupiny kompletně ionizovány (Obr.4). Z tohoto důvodu jsou

aminokyseliny amfolyty, tj. chovají se současně jako báze i kyselina. Aminokyseliny jsou

rovněž zwitteriony, tj. jsou současnými nositely kladného a záporného náboje. Tato vlastnost

výrazně zvyšuje teplotu tání (300°C) a způsobuje velmi dobrou rozpustnost v polárních

rozpouštědlech (voda). Aminokyseliny jsou většinou nerozpustné v nepolárních

rozpouštědlech.

1.2. Peptidická vazba

α-aminokyseliny mohou polymerizovat kovaletní vazbou mezi amino a karboxy skupinou za

vzniku tzv. peptidické vazby CO-NH a uvolnění molekuly vody (1902 Emil Fisher a Franz

Hofmeister) (Obr.5). Dle počtu zpolymerovaných jednotek aminokyselin rozeznáváme

dipeptidy (2 aa), tripeptidy (3 aa), oligopeptidy (do 10 aa) a polypeptidy. Proteiny jsou

molekuly, které se skládají z jednoho či více polypeptidů. Tzv. primární struktura proteinu je

determinována pořadím aminokyselin v řetězci. Typický protein se skládá z polypeptidu o

40-33,000 aminokyselin, tj. jejich molekulová váha se pohybuje v rozpětí 4-3600 kD.

Polypeptidy jsou lineární polymery. Tento fakt je důležitým faktorem který umožňuje přenos

strukturální informace z pořadí lineárně uspořádaných nukleotidů v DNA do jednoznačného

pořadí aminokyselin v řetězci polypeptidu. Toto pořadí určuje výsledné vlastnosti proteinů.

Vzhledem k obrovskému množství kombinací, které je z 20 aminokyselin možné při typické

velikosti proteinů vytvořit (pro protein o pouhých 100 jednotkách je to 20×10100, tj.

1.27×10130 kombinací), je zřejmé, že existují téměř nevyčerpatelné možnosti generování

výsledných vlastností. Především z tohoto důvodu se při evolučním vývoji proteiny uplatnily

jako základní stavební a funkční jednotky garantující základní životní funkce organismů.


Strana 5

1.2. Klasifikace a charakteristika vlastností aminokyselin

Klasifikace aminokyselin je zpravidla založená na polaritě jejich postraních řetězců (-R). Ta

do značné míry rozhoduje o celkových vlastnostech, tj. prostorové konfiguraci vznikajícího

peptidického řetězce. Obecně je tedy možné vyčlenit s určitým zjednodušením aminokyseliny

s (i) nepolárními postranními řetězci (ii) nenabitými postranními řetězci a (iii) polárními

postranními řetězci. Mezi aminokyseliny s nepolárními postranními řetězci patří alanin, valin,

glycin, leucin, isoleucin, methionin, prolin, phenylalanin, tryptofan. Postranní řetězec

jev tomto případě tvořen alifatickými uhlovodíkovými řetězci, thiolovým éterem, phenylovou

a indolovou aromatickou strukturou (Obr.1). Aminokyseliny s nenabitými postranními

skupinami obsahují hydroxylovou, amidovou či thiolovou skupinu v –R řetězci (serin,

threonin, asparagin, glutamin, tyrosin, cystein) (Obr.1). Aminokyselina cystein je

charakteristická tvorbou dimerů, svázaných skrze disulfidický můstek (S-S), převládající

v oxidačních podmínkách prostředí (Obr.6) Tato vazba je důležitým předpokladem ustavení

správné prostorové konformace řady proteinů a její rozštěpení zpravidla vede k jejich

denaturaci. Ve starší literatuře se někdy tento dimer označuje pojmem cystin. Aminokyseliny

s nabitými –R řetězci mohou nést kladný či záporný náboj. Za běžných fyziologických

podmínek jsou –R řetězce lysinu a argininu protonovány a jsou tedy nositely bazických

vlastností. Histidin jako jedinná aminokyselina je při pH ≈ 6 neutrální. Z tohoto důvodu je

histidin často přítomen v aktivních místech enzymů, kde se podílí na přenosu náboje.

Negativně nabité jsou –R zbytky kyseliny asparagové (aspartátu) a glutamové (aspartátu).

Asparagin a glutamin jsou amidy těchto dvou kyselin.

Titrační křivky aminokyselin jsou obecně komplikované, v důsledku existence dvou a

více nabitých funkčních skupin (Obr.7). Aminokyseliny jsou ve vodném prostředí vždy

nositely náboje. pH, při kterém je výsledný náboj aminokyseliny nulový (součet všech

nábojů) se označuje jako izoelektrický bod (pI). Z Handerson-Hasselbalch vztahu plyne, že:

pI = 0.5(pKi + pKj)

kde Ki a Kj značí disociační konstanty nabitých párů, které se účastní vzájemné eliminace

náboje v izoelektrickém bodě. Výsledná hodnota pI je výrazně ovlivněná nabitými skupinami

v postranních řetězcích, obsahem solí v roztoku atp. Proteiny vykazují velmi komplexní

titrační křivky. Jejich výsledný tvar je dán součtem křivek jednotlivých aminokyselin

zapojených v řetězci a je výrazně ovlivněn prostorovou konfigurací proteinu.

Aminokyseliny vyjma glycinu jsou opticky aktivní, tj. stáčí rovinu polarizovaného

světla. Tato vlastnost je způsobena existencí chirálního atomu uhlíku (α-uhlík), tj. uhlíku se

čtyřmi odlišnými substituenty. Obecnou vlastností těchto typů molekul je existence dvou


Strana 6

zrcadlově symetrických, prostorových konfigurací – enantiomerů (stereoizomerů). Tyto dvě

formy jsou zpravidla chemicky či fyzikálně neodlišitelné. Liší se pouze směrem stáčení

roviny polarizovaného světla – stáčí buď ve směru hodinových ručiček (pravotočivost,

znaménko +) či proti směru hodinových ručiček (levotočivost, znaménko -) z pohledu

pozorovatele (Obr.8). Všechny α-aminokyseliny, které se vyskytují v proteinech, jsou L

formy enantiomerů, tj. L-α-aminokyseliny (dle Fischerovy konvence, forma shodná

s uspořádáním L-glyceradehydu) (Obr.9). Některé aminokyseliny (threonin a isoleucin) mají

dva chirální uhlíky, tj. celkem 4 možné stereoizomery. Přirozeně se opět vyskytují L-formy

(zrcadlem je D-forma), zbývající dvě formy se nazývají diastereomery (L-allo a D-allo

formy). Tyto dvě formy jsou odlišné jak po stránce fyzikální, tak po stránce chemické od L a

D-formy. Běžná chemická syntéza aminokyselin vede ke vzniku tzv. racemické směsi, která

je složena ze směsi stereoizomerů. Jedinečnost života spočívá v syntéze pouze jedné L-formy,

D-forma není běžnou součástí proteinů. Důvod a příčiny, proč se evoluce života vydala tímto

směrem a ne opačným (D-formou) není dosud uspokojivě objasněna.

1.3. Nestandardní aminokyseliny

V biologických systémech se přirozeně nevyskytuje pouze výše zmíněných 20 základních

aminokyselin, ale i řada aminokyselin tzv. „nestandardních“ (Obr.10). Řada z nich není

součástí proteinů, přesto však často hrají velmi důležitou roli v metabolismu. Ve všech

případech (až na jednu vyjímku) se jedná o modifikované aminokyseliny, přičemž jejich

vznik není kódován genetickým kódem. Tyto aminokyseliny často vznikají dodatečnou

enzymaticky katalizovanou modifikací –R zbytků polypeptidů. Např. 4-hydroxyprolin a 5-

hydroxylysin jsou důležitými konstituenty fibrilárního proteinu kolagenu. Velmi často jsou

modifikovány proteiny, které jsou součástí komplexů s nukleovými kyselinami, jako např.

histony (metylace, acetylace, fosforylace aminokyselin). N-formylmethionin je typickou

aminokyselinou, která se vyskytuje vždy při zahájení translace u prokaryotních organismů na

N-konci vznikajícího polypeptidového řetězce. D-aminokyseliny jsou součástí některých

krátkých polypeptidů, které se vyskytují zejména u bakterií. Tyto polypeptidy jsou však

syntetizovány enzymatickou cestou a nejsou kódovány v DNA. Jsou součástí buněčných stěn

bakterií a zvyšují jejich odolnost vůči přirozeně se vyskytujícím proteázám (součást

obranných mechanismů hostitele), které mají schopnost štěpit přednostně L-formu

aminokyselin. D-aminokyseliny jsou součástí peptidických antibiotik jako je valinomycin,

gramicidin A a aktinomycin D, produkovaných opět bakteriemi.


Strana 7

1.4. Specializované funkce aminokyselin

Role aminokyselin v organismu není jen role konstituční, tj. výstavba proteinů.

Aminokyseliny často zastupují i jiné, biologicky významné funkce (Obr.11). Například γ-

aminomáselná kyselina (GABA) a dopamin jsou důležité neurotransmitery, histamin je

významným lokálním zprostředkovatelem alergických reakcí, thyroxin je živočišný hormon.

Některé z aminokyselin jsou významné intermediáty v metabolických procesech, např.

citrulin a ornitin (biosyntéza močoviny), homocystein (syntéza aminokyselin) a S-

adenosylmethionin (metylace molekul). Celkový počet dosud zdokumentovaných

aminokyselin nalezených ve všech organismech se blíží číslu 700.

1.5. Sekundární struktura proteinů

Vlastnosti proteinů jsou dány jejich třídimenzionální prostorovou strukturou v nativním (tj.

fyziologicky relevantním) stavu. Unikátní prostorová struktura jednotlivých typů proteinů je

přitom založena na jejich primární struktuře, tj. na pořadí aminokyselin v polypeptidickém

řetězci. Sekundární struktura proteinů je definována jako lokální prostorové uspořádání

polypeptidického řetězce. Tyto sekundární struktury jsou determinovány geometrickými

vlastnostmi peptidické skupiny v řetězci. Studiem konformace peptidické vazby se zabýval

ve 40 letech minulého století fyzik Linus Pauling a Robert Corey. Rentgenovou analýzou

aminokyselin a krátkých peptidů odvodili, že peptidická skupina je rigidní, planární struktury

(Obr.12). V naprosté většině případů jsu peptidické skupiny uspořádány v trans konformaci,

tzn. 2 Cα uhlíky navázané na peptidickou skupinu jsou orientovány planárně na obrácené

straně peptidických vazeb, které je spojují (Obr.13). Tato konformace je stabilnější oproti cis

konformaci především ze sterických důvodů, tj. objemnosti –R řetězců, které by v této (cis)

konformaci musely být přiloženy k sobě (Obr.14). Tento fakt vysvětluje, proč je polypeptid

tvořen pospojovanými sekvencemi planárních peptidických skupin, které mohou nabývat

různých konformací v důsledku vzájemného natočení, tj. tzv. torzních úhlů (tyto úhly se značí

jako φ pro případ vazby Cα-N a ψ pro vazbu Cα-C) (Obr.15). Např. pokud oba úhly jsou

rovné 180°C, pak kostra polypeptidu je tvořena peptidickými vazbami orientované v jedné

rovině. Tyto úhly (natočení) však nemohou být libovolné, ale mohou nabývat vždy pouze

určitých hodnot, které jsou energeticky přípustné. Studiem možných konformací (natočení

vazeb) v polypeptidech se zabýval G.N.Ramachandran. Vyjádřil informaci o možných

kombinaci obou uhlů do konformační mapy, tzv. Ramachandranova diagramu (Obr.16).

V tomoto diagramu jsou zobrazeny pouze ty kombinace úhlů, které jsou uskutečnitelné, tj.

vzdálenost libovolných vzájemně kovalentně nevázaných atomů nepřekračuje tzv. van der


Strana 8

Waalsovu vzdálenost. Z tohoto diagramu vyplývá, že pouze tři oblasti kombinací jsou

z hlediska reálných konformací pravděpodobné a skutečně byly potvrzeny rentgenovou

analýzou některých proteinů (Obr.17). Určitou vyjímkou je nejjednoduší aminokyselina

glycin, u která je volnost natočení vazeb vysoká. Z tohoto důvodu se glycin často vyskytuje

v oblastech, kde dochází k ostrému zatočení polypeptidického řetězce.

Helikální sekundární struktura je jednou z nejběžnějších sekundárních struktur

proteinů. Helix vzniká tehdy, když řetězec je na Cα vždy natočen o stejný úhel. Namísto ψ a φ

úhlů se v tomto případě vyjadřuje míra natočení indexem n, který značí, kolik aminokyselin

v řetězci se nachází na jednu celou otočku helixu a indexem p – prostorovou vzdáleností mezi

aminokyselinami, které odděluje jedna celá otočka (Obr.18). Helix může být v principu

pravotočivý či levotočivý. Pouze jedna z možných konformací (kombinací n a p) je umožňuje

vznik helixu a jeho stabilizaci pomocí vodíkových můstků – tzv. α-helix. Objev této struktury

L. Paulingem v roce 1951 se pokládá za jeden z mezníků dalšího výzkumu v oblasti

strukturální biochemie. α-helix je pravotočivá šroubovice s n=3.6 (3.6 aminokyseliny na 1

otáčku) a d = 5.4Å (Obr.19). Postranní –R zbytky aminokyselin jsou lokalizovány vně helixu

a nejsou ted překážkou ke stabilizaci polymeru. α-helix je běžnou sekundární strukturou u

fibrilárních a globulárních proteinů, s průměrnou délkou helixu 18Å (12 aminokyselin, tj. cca

3 otáčky). Zřídka jsou pozorovány u nativních i umělých polypeptidů další možné varianty

helixů, které jsou stabilizované vodíkovými můstky, ale které se liší hodnotou indexů n a p.

Mezi tyto helixy patří např. tzv. 310 helix, π helix a polyproline II helix (Obr.20).

Ve stejném roce jako byl navržena struktura α-helixu, navrhli Pauling a Corey další

možnou sekundární strukturu – tzv. strukturu skládaného listu (β-sheet). I zde vycházeli

z konformace s opakujícími se úhly ψ a φ, které spadají do povolených oblastí

Ramanchandranova diagramu. Zásadní rozdíl mezi α-helixem a strukturu skládaného listu je

v tom, že skládaný list je tvořen mezi dvěma navzájem sousedícími polypeptidovými řetězci.

Ty mohou být uspořádány paralelně a antiparalelně (dle směru od N k C konci polypeptidu)

(Obr.21). β-listy jsou obvyklým stukturálním motivem v řadě proteinů. U globulárních

proteinů je typicky tvořen z 2-15 řetězců, s průměrnou šířkou plochy cca 25Å a délkou okolo

21Å (15 aminokyselin) (Obr.22). Často dochází k vzájemné kombinaci paralelních a

antiparalelních β-listů. β-listy jsou také ve většině případů mírně pravotočivě zakřivené, což

je jednou z důležitých vlastností zaručující specifické funkce zejména v aktivních centrech

některých enzymů (Obr.23). Topologie (konektivita) β-listů je poměrně komplexní s řadou

možností. Zpravidla jsou spojky mezi jednotlivými β-listy tvořeny helixy, popř. tzv.


Strana 9

vlásenkami (uplatňují se zejména u antiparalelních β-listů), které mohou mít povahu

pravotočivého či levotočivého helixu (Obr.24).

Sekundární stuktury ve formě α-helixu a β-listu zpravidla tvoří až 50%

polypeptidického řetězce globulárních proteinů. Ostatní část existuje ve formě tzv. smyček -

úseků s nepravidelně uspořádánými úhly φ a ψ, které neposkytují definovanou strukturu.

Nejedná se však v žádném případě o náhodnou a neuspořádanou sturukturu, jakou je možné

popsat např. u denaturovaných proteinů. Jedná se pouze o těžko popsatelnou nerepetetivní

strukturu, která však zásadním způsobem ovlivňuje konečnou třidimenzionální strukturu

proteinu. Tzv. obrácené smyčky např. propojují jednotlivé úseky polypeptidu, které vytvářejí

β-listy – tyto úseky se téměř vždy nalézají na povrchu proteinu a ovlivňují tak jeho vlastnosti.

Řada větších globulárních proteinů obsahuje zvláštní struktury, tzv. Ω-smyčky (Obr.25), které

se vyskytují výhradně na povrchu proteinu a hrají důležitou roli při biologických rekogničních

procesech.

1.6. Fibrilární proteiny

Fibrilární proteiny jsou dlouhé polypeptidy, jejichž sekundární struktura se vymyká běžným

strukturálním motivům a je pro ně typická. Řada fibrilárních proteinů se nachází v tkáních

s mechanickou či pohybovou funkcí (kůže, svaly, kosti atd.). Jelikož fibrilární proteiny je

velmi obtížné připravit ve formě krystalů, nelze v protikladu s globulárními proteiny provádět

rentgenovou strukturní analýzu. Z tohoto důvodu je struktura fibrilárních proteinů dosud málo

prozkoumána.

Keratin je mechanicky odolný a chemicky nereaktivní protein, který se nachází u

všech vyšších obratlovců. Je součástí zrohovatělé pokožky (epidermis), nehtů, vlasů, chlupů a

peří přičemž tvoří až 85% buněčných proteinů. Keratiny jsou dále členěny na tzv. α-keratiny,

které se vyskytují u savců a β-keratiny, které se vyskytují u plazů a ptáků. Keratiny, které

vytváří lidský vlas, jsou hiearchicky uspořádány. Vlas je tvořen z mrtvých buněk

s makrofibrilami, které se skládají z tzv. mikrofibril, obsahující α-keratin a amorfní

proteinovou matrix s vysokým obsahem síry (Obr.26). Molekuly α-keratinu jsou tvořeny

dimery dvou polypeptidů, které se navzájem obtáčí a vytváří strukturu podobnou α-helixu.

Tato struktura je tvořena jedním vláknem tzv. typu I (kyselé vlastnosti) a typu II (zásadité

vlastnosti). Výsledný dimer je združen do vláken tzv. protofilament, která se sdružují do tzv.

protofibril a ty tvoří vlastní mikrofibrily (Obr.27). Díky vysokému obsahu cysteinu a tím i

disulfidových můstků ve vláknech je α-keratin odolný proti tahu. Redukční činidla, jako jsou


Strana 10

merkaptany mohou redukovat disulfidické vazby a tím i zvláčnit vlas. Oxidační činidla

naopak vlas ztuží vznikem disulfidických můstků. Defekty ve struktuře keratinu mohou

způsobit závažná onemocnění, např. ztrátu integrity kůže.

Kolagen je přítomen u všech živočichů a je jeden z nejvíce rozšířených proteinů mezi

obratlovci. Jedná se o extracelulární protein existující ve formě nerozpustných vláken

s vysokou odolností v tahu. Je součástí pojivových tkání, jako je kost, zub, chrupavka,

ligamenty atd. U savců je známo až 20 odlišných forem kolagenů přítomných v rámci

různých tkání u jednoho jedince (Obr.28). Kolagen má velmi specifické složení aminokyselin

– více jak z 30% je tvořen glycinem a dalších 15-30% je tvořeno prolinem a 4-

hydroxyprolylem (Hyp) (Obr.29). Nejznámější struktura kolagenu je struktura popsaná pro

bovinní kolagen α1(I), který se skládá z opakujících se sekvencí Gly-Pro-Hyp. Prostorovou

strukturu kolagenu navrhl již v roce 1955 F. Crick a A. Rich. Jedná se o paralelní

trojřetězcovou strukturu navzájem se pravotočivě ovíjejících vláken kolagenu (Obr.30).

Struktura je jako celek stabilizována vodíkovými můstky. Toto uspořádání vláken je

zodpovědné za charakteristickou odolnost vlákna v tahu. Podélné napětí v tahu je přenášeno

do kompresního působení jednotlivých řetězců kolmo na osu vlákna. Vlákna kolagenu jsou

uspořádána do tzv. fibril, které jsou v mikroskopickém pohledu příčně pruhované (Obr.30).

Tyto fibrily se skládají ze symetricky uspořádaných šestic kolagenních vláken, odhalujících

každých 400Å tmavší strukturu tvořenou v místě „děr“, tj. vzájemného přiložení vláken

v řadě. Kolagenní vlákna jsou jak intramolekulárně, tak intermolekulárně zesítěná kovalentní

vazbou mezi aminokyselinami Lys a His činností enzymu lysyl oxidázy (Obr.31). Defekty ve

struktuře kolagenu jsou příčinou řady lidských onemocnění.

1.7. Globulární proteiny

Globulární proteiny tvoří velmi různorodou skupinu proteinů, pro které je typická jejich

existence v kompaktním sférickém nativním tvaru. Většina globulárních proteinů vytváří

enzymy, transportní a receptorové proteiny. Naprostá většina poznatků o tercierní struktuře

proteinů byla získána jejich studiem využitím rengenové strukturní analýzy a nukleární

magnetické resonance (NMR).

Rentgenová strukturní analýza je metodikou, která podává informace o struktuře

molekul na atomární úrovni. Rengenové záření je podmínkou k získání této informace

vzhledem k velmi malé vlnové délce (λ ≈ 1.5Å), která se blíží vzdálenosti kovalentní vazby

v molekulách. Vzorek ve formě krystalu je osvícen zářením z zdroje rengenového záření

(např. synchrotron) a vzniklý difrakční obrazec zviditelněn na fotografické desce. Ten je


Strana 11

podkladem k matematické rekonstrukci třídimenzionální struktury molekul (Obr.32).

Difrakční obrazec je ve své podstatě obraz prostorově rozložené elektronové hustoty molekul.

V dnešní době lze snadno vytvářet pomocí počítačové rekonstrukce 3D obrazy elektronových

hustot proteinů (Obr.33). Krystaly proteinů jsou zpravidla méně uspořádané a rigidní

struktury než krystaly anorganických látek. Zejména v důsledku vysoké míry hydratace

polypeptidických řetězců, která je nutná pro udržení správné prostorové konformace. Z tohoto

důvodu není prakticky možné získat rozlišení jejich struktury pod 1.5Å, jako je tomu u

běžných krystalů. Získání dostatečně čistého a uspořádaného krystalu proteinů je v řadě

případů hlavní překážkou ke strukturální analýze s vysokým rozlišením (Obr.34). Přesnější

představu o architektuře proteinu je zpravidla možné získat pouze kombinací znalostí

primární struktury polypeptidu a výsledku strukturní analýzy. Struktura proteinů získaná

analýzou krystalů je zpravidla vždy stejná, jako je jejich nativní struktura. Tento fakt je

podpořen řadou argumentů, např. některé enzymy přetrvávají v aktivním stavu i ve formě

krystalu, tj. jejich aktivní místa nejsou uspořádáním v mřížce krystalu nijak ovlivněna.

Třídimenzionální strukturu proteinů v nativním stavu ve vodném roztoku je možné

získat metodou dvourozměrné (2D) a nověji i 3 a 4D NMR spektroskopie. Tato metodika

dovoluje stanovit meziatomovou vzdálenost díky přítomnosti specifických protonů, které jsou

u známých polypeptidových sekvencí vzdálené méně jak 5Å. Tyto určené vzdálenosti jsou

využity k výpočtům 3D struktury proteinů kombinací znalostí o chiralitě, van der Waalsově

vzdálenosti, skupinové planaritě atd. Tato metodika nedovoluje určit jednoznačnou strukturu

proteinu, spíše poskytuje určité množství možných řešení, která jsou si vzájemně velmi blízká

(Obr.35). Výhodou NMR oproti rengenové strukturní analýze je možnost stanovit strukturu

bez nutnosti získání krystalu proteinu, což je v některých případech velmi obtížné. Navíc, tato

metodika je využívána ke studiu sbalování proteinů (protein folding) a jejich dynamiky,

neboť NMR analýzu je možné provádět v širokém časovém rozmezí.

V důsledku velmi komplikovaných struktur je prakticky nemožné zobrazit protein se

všemi atomy, které se účastní jeho stavby. Z tohoto důvodu se zpravidla využívá zobrazení

pouze polypeptidické uhlíkové kostry, přičemž se zobrazují pouze některé hlavní řetězce

(Obr.36). Jiná zobrazení využívají vyobrazení typických sekundárních struktur, především α-

helixů, β-listů a smyček (Obr.37). V současné době existuje řada počítačových programů,

které poskytují informace v zjednodušených, ale i komplikovaných 3D projekcích.

Terciární struktura proteinů značí skutečné prostorové uspořádání sekundárních

struktur polypeptidického řetězce. Pvním globulárním proteinem, u kterého byla zjištěna 3D

struktura rengenovou krystalografií, byl myoglobin (Obr.38). Do dnešní doby je známa 3D


Strana 12

struktura přibližně 18.000 proteinů. Ačkoliv jsou tyto dosud charakterizované struktury

unikátní, jsou nositely některých společných znaků a vlastností. V řadě globulárních proteinů

jsou přítomny jak α-helixy tak β-listy (v průměru 31% a 28%). Globulární struktury velmi

zřídka obsahují periodické motivy v primární struktuře, jako je tomu u fibrilárních proteinů.

Nepolární rezidua aminokyselin, jako jsou Val, Leu, Ile, Met a Phe, jsou velmi často

lokalizovány dovnitř proteinu, mimo kontakt s vodným prostředím obklopující protein. Nabité

polární skupiny aminokyselin jako je Arg, His, Lys, Asp a Glu jsou lokalizovány především

na povrchu proteinů, tj. obrácené do vodného prostředí. Tyto skupiny velmi často váží

enzymové kofaktory a učastní se katalytické funkce enzymu. Nepolární skupiny aminokyselin

jako je Ser, Thr, Asn, Gln, Tyr a Trp jsou běžně orientovány na povrchu i ve vnitřku proteinů,

téměř vždy jsou svázány vodíkovými můstky s jinými fukčními skupinami. Typickým

příkladem je struktura cytochromu c (Obr.39). Vnitřek proteinů, tvořený těsně nahloučenými

nepolárními skupinami je téměř bezvodý a připomíná tak uspořádání podobné molekulárnímu

krystalu. Proteiny, které jsou delší jak ≈ 200 aminokyselin zpravidla vytváří dva nebo více

vzájemně propojených globulárních shluků, tzv. domén. Domény jsou strukturálně nezávislé

jednotky, které mají každá o sobě charakter malého globulárního proteinů. Pro ilustraci lze

uvést např. složení enzymu glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenázy (Obr.40). Polypeptidické

spojky mezi doménami jsou často místem, kde dochází k enzymatické proteolýze proteinu. Ta

však nutně nemusí ovlivnit konformaci a funkci propojených domén. Každá doména se skládá

vždy z několika vrstev sekundárních struktur a má specifickou funkci. Příkladem je NAD+

vazebná doména glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenázy. V řadě i strukturálně nepříbuzných

proteinů se vyskytují tzv. proteinové motivy (supersekundární struktury), specifická uskupení

sekundárních stuktur. Nejznámější je tzv. βαβ motiv, β-vlásenkový motiv, αα motiv a motiv

řeckého klíče (Greek key motif) (Obr.41). Skupiny proteinových motivů vytváří strukturu

jednotlivých domén. Doménové struktury jsou zpravidla členěny na tzv. α a β domény a α /β

domény. Reprezentativním příkladem α domény je globinová doména, 4-helixový svazek u

cytochromu b562 a lidský růstový hormon (Obr.42). α domény jsou nedílnou součástí

transmembránových proteinů. β domény se skládají z 4 až 10 převážně antiparalelních β-listů

ve dvou rovinách, tvořících sendvičové uspořádání. Příkladem je doména imunoglobulinů

(Obr.43) a retinol-vázajícího proteinu (Obr.44). α /β domény jsou tvořeny centrálním

paralelním uspořádáním β-listů pospojovaných α-helixy (Obr.45). Tyto struktury jsou často

součástí aktivních center enzymů a jsou evolučně příbuzné i u funkčně vzdálených enzymů.

Je tedy pravděpodobné, že vznikly z jedné původní domény divergenční evolucí. Naproti


Strana 13

tomu, jejich optimální uspořádání v aktivním centru enzymu mohlo vést i ke konvergentní

evoluci z původně nepříbuzných struktur.

Získávání, zpracování a uchování informací o struktuře proteinů je v současné době

neodmyslitelně spjato s rozvojem tzv. strukturální bioinformatiky. Bioinformatika je vědní

obor, který se zabývá využitím moderních výpočetních postupů v analýze sekvencí proteinů a

nukleových kyselin stejně jako způsoby, jakými mohou být zobrazovány a srovnávány

makromolekulární struktury jako jsou proteiny. Znalosti o atomární struktuře proteinů jsou

shromažďovány v tzv. proteinové bance (Protein Data Bank, PDB, http//www.rcsb.org/pdp/).

Do dnešní doby je v této databázi shromážděno až 20 tis. biomolekulárních struktur získaných

NMR a rentgenovou strukturní analýzou. Databáze nukleových kyselin (Nucleic Acid

Database, NDP, http://ndbserver.rutgers.edu/NDB/ndb.thml) poskytuje informace o struktuře

biomolekul obsahující nukleové kyseliny. Existuje řada počítačových programů, které

umožňují třídimenzionální zobrazení prostorových struktur proteinů (např. RasMol, VRML

atd.), popř. programy umožňující provádět klasifikaci či srovnávací analýzy 3D struktur

proteinů (např. kategorizace CATH, CE, SCOP atd.).

1.8. Stabilita proteinů

Z termodynamických měření vyplývá, že nativní proteiny, tj. jejich správná prostorová

konformace je ve fyziologických podmínkách velmi křehká, neboť je garantována pouze

slabými interakcemi. Ze srovnání např. plyne, že typický protein o 100 aminokyselinách je

držen ve správné konformaci energií cca 40 kJ.mol-1. V protikladu k tomu je např. energie

potřebná k rozštěpení vodíkové vazby rovna cca 20 kJ.mol-1. Denaturaci proteinu je tedy

zabráněno pouze velmi citlivě balancovanými vnitřními a vnějšími silami působícími na

protein ve fyziologickém prostředí. Elektrostatické síly, tj. coulombovské interakce, výrazně

přispívají zejména k mezimolekulárním vazbám mezi proteiny, nukleovými kyselinami a

substrátem. Současné počítačové postupy dovolují realizovat např. výpočty prostorového

rozložení povrchového náboje proteinů, které do značné míry ovlivňují mechanismus

enzymové aktivity (Obr.46). Iontové páry (solné můstky) přispívají ke stabilizaci proteinů

pouze malou měrou, zejména díky jejich solvataci. Daleko větší měrou se uplatňují tzv. van

der Waalsovy síly, které mají svůj původ v dipól-dipólových interakcích (ať již

permanentních či dočasných dipólů) (Obr.47). Např. karbonylová a amidová skupina

peptidické vazby mají formu permanentních dipólů. Přestože jejich energie je vzhledem

k iontovým interakcím slabá, v důsledku jejich superpozice a zesílení hrají velmi důležitou

roli při stabilizaci proteinů. Londonovy disperzní síly, které mají svůj původ v elektronových


Strana 14

fluktuacích jinak nepolárních molekul, jsou stabilizační silou zejména v těsně nahloučených

vnitřních prostorách globulárních proteinů. Výrazným způsobem stabilizují protein vodíkové

můstky. Správně zbalené proteiny nabírají takové konformace, ve které dosáhnou maximální

počet intermolekulárních vodíkových můstků. Nezbalené proteiny vytvářejí vodíkové můstky

s molekulami rozpouštědla. Důležitými stabilizačními silami jsou hydrofóbní síly.

Hydrofobní síly jsou síly, které vedou k minimalizaci kontaktu nepolárních molekul s vodou

či amfipatickými molekulami, jejichž výsledkem je např. vznik micelárních struktur. Jelikož

proteiny jsou do určité míry podobné micelárním strukturám (hydrofobní zbytky

aminokyselin lokalizovány do jádra proteinu), je jisté, že podíl těchto sil na stabilizaci

proteinu je významný. Disulfidové můstky vznikající spojením dvou cysteinových zbytků

jsou výrazným stabilizátorem tercierní struktury proteinů. Relativně redoxní povaha

cytoplasmy řady buněk však snižuje stabilitu disulfidických můstků v nativních podmínkách.

Tato vazba je zasílena při exkreci proteinů do extracelulárních prostor, kde převažují oxidační

podmínky.

1.9. Denaturace proteinů

Povaha slabých stabilizačních sil, které zaručují správnou konformaci proteinů je příčinou

snadné denaturace proteinů v podmínkách, kdy tyto vazby jsou narušeny. V případě, že je

protein postupně zahříván, dochází k skokovým změnám jeho vlastností, jako je aktivita a

konformačně závislé charakteristiky, UV absorpce, viskozita atd. Rychlost těchto změn

napovídá, že ztráta konformace probíhá kooperačním způsobem, tj. částečná ztráta struktury

navozuje rychlou destabilizaci proteinu jako celku. Tato změna vyvolá kolaps struktury do

náhodného klubka polypeptidu, tj. denaturovaného proteinu. Tzv. teplota tání proteinu (Tm) je

obdoba veličiny, která charakterizuje tepotu tání pevných látek. U naprosté většiny proteinů je

Tm menší jak 100°C (Obr.48). Mimo teplotní denaturace, proteiny mohou podléhat ztrátě

konformace např. změnou pH; působením detergentů či vysokou koncentrací organických, ve

vodě rozpustných látek (např. alifatických alkoholů). Tzv. chaotropní činidla jsou soli, které

ve zvýšené koncentraci mohou navodit denaturaci proteinů (např. I-, ClO4-, SCN-, Li+).

1.10. Kvarterní struktura proteinů

Díky existenci prostorových povrchových nábojů proteinů je obecnou vlastností jejich vazba

na jakékoliv jiné molekuly. Toto však neplatí o jiných proteinech. Zde je tato vazba pro

funkčnost nežádoucí a proto byla evolucí u funkčně nesourodých proteinů vyloučena.

Vyjímku tvoří polypeptidy, které spoluvytvářejí funkční celek – kvarterní strukturu proteinů.


Strana 15

Jednotlivé polypeptidy, které tuto strukturu vytvářejí se nazvývají proteinové podjednotky.

Naprostá většina funkčních proteinů je složena z několika podjednotek. Existuje několik

důvodů pro tento fakt. U řady strukturně i funkčně složitých proteinů je snažší vytvářet vyšší

celky samovolným skládáním menších podjednotek (self-assembling process), které mohou

být v případě potřeby vyměněny za jiné. Místo vzniku, úprav a konečného složení funčního

celku může být lokalizováno v různých částech buňky. U řady komplikovaných enzymů

vzniká aktivní místo na pomezí jeho podjednotek. Multikomponentní stavba umožňuje snažší

regulaci funkce proteinů atd. Proteiny, které se skládají ze stejných, často mnohokrát

opakovaných podjednotek, se nazývají oligomery. Jednotlivé podjednotky tohoto typu se pak

nazývají protomery. Protomer se pak muže skládat buď z jednoho polypeptidického řetězce

nebo z více, vzájemně odlišných řetězců. V tomto pohledu je např. hemoglobin dimer složený

z protomeru α a β (Obr.49).

V převážné většině oligomerních proteinů jsou protomery symetricky uspořádané, tj.

nachází se v pravidelné geometrické pozici v rámci oligomeru. Z tohoto důvodu vznikají

prostorově ohraničené definované struktury, které jsou charakterizovány tzv. bodovou

symetrií. Tyto struktury jsou dále charakterizovány rotační symetrií, tj. lze nalézt osu rotace,

podle které je tvar proteinu symetrický (Obr.50). Nejjednoduším typem rotační symetrie je

symetrie cyklická (Cn, kde n značí počet protomerů), která je tvořena pouze jednou osou

symetrie. Dihedrální symetrie (Dn) je více komplikovaná symetrie, s dvou- a více-

symetrickými, dvěma navzájem kolmo orientovanými osami. Příkladem je hemoglobin.

Složitější útvary mohou nabývat tetrahedrickou (T), kubickou či oktahedrickou (O) symetrii.

Některé oligomerní proteiny nabývají tzv. helikální symetrie (Obr.51). Příkladem je aktin a

tubulin.


Strana 16

2. STRUKTURA A FUNKCE NUKLEOVÝCH KYSELIN

2.1. Vlastnosti nukleotidů

Nukleotidy a jejich deriváty jsou biologicky nazastupitelné molekuly, které participují takřka

ve všech biochemických procesech. Vyvářejí monomerní jednotky nukleových kyselin a

sehrávají tak centrální roli při uschování a expresi genetické informace. Nukleosid-trifosfáty

(NTP) jsou energeticky bohaté molekuly, které se účastní většiny metabolických pochodů

v buňce jako zásobárna okamžitě využitelné energie. Řada metabolických pochodů je

regulována přítomností/nepřítomností dostatečného množství ATP, některé NTP se účastní

přenosu informací v buňce. Některé nukleotidové deriváty, jako je nikotinamid adenin

dinukleotid (NAD či NADP), flavin adenin dinukleotid (FAD) nebo coenzym A (CoA) jsou

přímími účastníky řady enzymatických reakcí. Některé nukleotidy mají katalytickou aktivitu,

zejména pokud jsou součástí tzv. ribozymů, tj. nukleových kyselin s enzymatickou aktivitou.

Nukleotidy jsou fosfátovými estery pětiuhlíkatých cukrů, ve kterých je dusíková báze

vázána v poloze C1´ na cukerném zbytku (Obr.52). Tzv. ribonukleotidy, které jsou

monomery ribonukleových kyselin (RNA) jsou tvořeny pentózou D-ribózou, kdežto

deoxyribonukleotidy, součást deoxyribonukleových kyselin (DNA), jsou tvořeny 2´-deoxy-D-

ribózou. Fosfátová skupina je navázaná buď na C5úhlík pentózy a vytváří tak 5´-nukleotid,

popř. je vázána na C3úhlík pentózy a vytváří tak 3´-nukleotid. Pokud není fosfát na pentóze

navázán vůbec, molekula se nazývá nukleosid. Je tedy možné 5´-nukleotid označit také za

nukleosid-5´-fosfát. Ve všech známých přirozeně se vyskytujících nukleotidech je dusíkatá

báze vázána na C1úhlíku s kovalentní vazbou (glykosidickou vazbou) orientovanou do stejné

roviny, jako vazba mezi C4á C5úhlíkem pentózy (β-konfigurace). Fosfátový zbytek je za

fyziologických podmínek dvakrát ionizován, tj. má poměrně silné kyselé vlastnosti. Dusíkaté

báze jsou planární, aromatické a heterocyklické molekuly, které jsou v zásadě odvozeny od

struktury purinu a pyrimidinu (Obr.53). Nejdůležitější purinovou bází je adenin a guanin,

v případě pyrimidinových bazí se jedná o cytozin, uracil a thymin (5-methyluracil) (Obr.54).

Purinové báze se váží na pentózu skrze jejich N9 atom, pyrimidinové báze skrze N1 atom.

Nukleové kyseliny jsou lineární polymery nukleotidů, které vznikají spojení skrze

fosfátové skupiny na 3á 5átomu uhlíku po sobě jdoucích pentóz (Obr.55). Fosfátové zbytky

těchto polynukleotidů jsou za fyziologických podmínek kyselé, tzn. že nukleové kyseliny jsou

polyanionty. Nukleové kyseliny jsou směrově orientovatelné, každá má 3´konec (C3átom

není spojen s dalším nukleotidem) a 5´konec (C5átom není spojen s dalším nukleotidem).


Strana 17

DNA má vždy stejný počet adeninu a thyminu (A = T) a guaninu a cytosinu (G =C). Toto tzv.

Chargaffovo pravidlo bylo objeveno ve 40. letech 20. st. díky rozvoji kvantitativních metod

separace a analýzy hydrolyzované DNA. Podstatou tohoto jevu je existence genomové DNA

ve formě dvoušroubovice (dsDNA – double stranded DNA), složené ze dvou, navzájem

komplementárních řetězců nukleových kyselin (ssDNA – single stranded DNA),

stabilizovaných vodíkovými můstky mezi páry A-T a G-C. Obsah GC je velmi proměnlivý

z hlediska organismů (od 25-75%), v rámci příbuzných skupin je však poměrně ustálený

(např. savci mají rozsah GC obsahu v rozpětí 39-46%). RNA se vyskytuje v převážné většině

v jednořetězcové (ssRNA – single stranded RNA) formě. U některých virů, ve kterých je

přítomna dvouřetězcová forma RNA (dsRNA – double stranded RNA) podléhá

Chargaffovým pravidlům, jen místo párování A-T je párování A-U.

Struktura nativní DNA byla stanovena v roce 1953 Watsonem a Crickem. Jejich objev

byl později oceněn Nobelovou cenou. Watson-Crickova struktura DNA patří k základním

pilířům a mezníkům rozvoje molekulární biologie. Jejímu objevu napomohlo několik v té

době známých faktů o povaze a vlastnostech DNA: (i) Chargaffovy pravidla; (ii) znalost

správných tautomerních forem dusíkatých basí potvrzených jejich NMR, spektroskopickou a

rentgenovou strukturální analýzou; (iii) informace o helikální struktuře DNA získaná

rentgenovou difrakcí (R. Franklin) (Obr.56). Na základě těchto faktů navrhl Watson a Crick

strukturu dvouřetězcové šroubovice, která se velmi rychle ujala mezi vědeckou veřejností

zejména díky jednoduchosti a jasné interpretaci z ní vyplývajících biologických principů.

Tzv. B-DNA (Obr.57), popsaná Watsonem a Crickem je považována za nativní

(biologicky aktivní) konformaci DNA. Tato struktura je popsána několika následujícími

charakteristickými znaky. Skládá se ze dvou řetězců polynukleotidů, které se navzájem obtáčí

do pravotočivé dvoušroubovice s průměrem ≈ 20Å. Tyto řetězce jsou navzájem antiparalelní,

přičemž báze jsou směřovány dovnitř šroubovice. Roviny bazí jsou téměř kolmé na osu

šroubovice. Každá z bazí je svázána vodíkovými můstky s protilehlou komplementární bazí

(tzv. párování bazí). Ideální B-DNA je tvořena 10 páry bází (bp – base pair) na 1 otočku

helixu, přičemž délka vlákna na 1 otočku je 34Å. Jednou z důležitých vlastností B-DNA je

vzájemné párování pouze adeninu s thyminem a guaninu s cytosinem, tj. existence tzv.

Watson-Crickových párů bazí (Obr.58). Tyto páry jsou vzájemně zaměnitelné, tj. nezáleží, na

kterém vlákně DNA se daný člen dvojice nachází. Naopak v případě nekomplementárních

bazí (např. párování A-G, A-C atd.) by došlo k párování, které by výrazným způsobem

deformovalo cukerný řetězec polynukleotidu a narušovalo uspořádanost struktury DNA. B-

DNA je tvořena dvěma externími tzv. žlábky - úzkým (minor groove) a širokým žlábkem


Strana 18

(major groove). Skutečná struktura B-DNA se od teoretické v několika aspektech liší. Např.

je známo, že skutečná struktura je sekvenčně závislá, tj. určité kombinace sekvencí (pořadí

nukleotidů v řetězci) vnáší do B-DNA deformace, které zesilují či zeslabují vazbu obou

řetězců. Tyto sekvence jsou důležité např. pro sekvenčně specifické interakce DNA

s proteiny, které zpracovávají genetickou informaci.

Zejména v souvislosti s rozvoje umělých syntéz oligonukleotidů a jejich rentgenovou

difrakční analýzou bylo zjištěno, že B-DNA není jedinou konformací dvouřetězcových

nukleových kyselin. Existuje celá řada konformací, které mohou zaujímat dsDNA, dsRNA či

DNA-RNA hybridní molekuly, v závislosti na přítomnosti iontů kovů či vlhkosti prostředí.

Charakteristiky dvou typických konformací – A-DNA a Z-DNA jsou uvedeny na Obr.59.

V okamžiku, kdy je vlhkost prostředí snížena z 90 na 75%, přechází B-DNA struktura

samovolně na tzv. A-DNA strukturu (Obr.60). Opět se jedná o dvouřetězcovou pravotočivou

šroubovici, avšak podstatně širší, s 11.6 bp na 1 otáčku a délkou 34Å s centrální dutinou.

Rovina bazí je pootočena vzhledem k ose šroubovice asi o cca 20°. Široký žlábek je hluboce

zaříznutý do helixu, úzký žlábek je velmi mělký. V nativních podmínkách byla tato struktura

popsána např. v aktivním vazném místě DNA-polymerázy (≈ 3bp segment) a u bakteriálních

spór, kde jejich existence zaručuje odolnost spór proti UV záření, tj. vzniku kovalentní vazby

mezi dvěma sousedními thyminy (tzv. thyminových dimerů).

20 let po objevu B-DNA byla popsána velmi neobvyklá struktura levotočivého

dvojřetězcového helixu (Wang a Rich) u syntetického oligonukleotidu d(CGCGCG) a

označena jako Z-DNA (Obr.61). Helix je tvořen 12 bp na 1 otáčku s délkou 44Å. Je pro něj

charakteristický velmi hluboký úzký žlábek a zanedbatelný široký žlábek. Studiem

syntetických oligonukleotidů bylo zjištěno, že Z-DNA vzniká především na segmentech

s alternujícími purinovými a pyrimidinovými bázemi v přítomnosti vysokých koncentrací

solí. In vivo existence Z-DNA byla prokázána teprve nedávno, jako tzv. Zα-protein vázající

doména lokalizovaná ve specifických nukleotidových sekvencích na řetězci B-DNA (Obr.62).

Dvouřetězcové dsRNA, které jsou běžné u některých virů, nemohou vytvářet strukturu

obdobnou B-DNA v důsledku sterických zábran 2´-OH skupin. Ve většině případů nabývají

konformace blízké A-DNA, které se označují jako A-RNA či RNA-11. Tato struktura má

11bp na 1 otočku, dlouhou 30.9Å. Hybridní dvouřetězcové komplexy, tj. komplexy DNA-

RNA nabývají opět struktury podobné A-RNA (Obr.63). Tyto struktury jsou in vivo běžné,

neboť jsou principiálně součástí hybridní DNA-RNA vznikající při transkripci a při iniciaci

(primerování) replikace. V tomto případě je tato struktura (RNA) substrátem pro RnasuH,

která specificky hydrolyzuje RNA hybridního helixu.


Strana 19

Dvouřetězcová DNA je ve srovnání s terciérní strukturou proteinů daleko méně

komplexní, tj. existuje pouze limitovaný počet možných konformací, ve kterých je tato

struktura stabilní. Tento fakt je způsoben podstatně menší diverzitou nukleotidů ve srovnání

s aminokyselinami. Stejně jako v případě proteinů, i zde se uplatňují stabilizační síly různé

povahy. Základem stabilizace dvou řetězců nukleové kyseliny je poměrně omezená

konformační volnost cukerné kostry nukleové kyseliny, která může nabývat pouze několik

stabilních prostorových uspořádání a párování Watson-Crickových bazí obou protichůdných

řetězců. Vzhledem k velmi nízké stabilitě se v rámci dsDNA nevyskytují párování bazí

jiného než komplementárního typu. Vodíkové vazby přispívají ke stabilizaci dsDNA pouze

omezeně a to i přes to, že jsou zodpovědné za párování komplementárních bazí. Lze se o tom

přesvědčit např. snadnější denaturací DNA v nevodném rozpouštědle (např. ethanolu), který

zeslabuje vodíkové můstky a snižuje tak teplotu tání (Tm) dsDNA. Po denaturaci jsou báze

stabilizovány vodíkovými můstky s molekulami vody. Z analýzy krystalů DNA je známo, že

důležitou stabilizační silou dsDNA je tzv. base stacking, tj. van der Waalsovy interakce

planárních paralelních molekul purinových a pyrimidinových basí v řetězci nukleové kyseliny

(Obr.64). Tyto interakce jsou ve vodném prostředí nejčastěji způsobeny hydrofobními silami

působícími mezi bázemi nukleotidů. V důsledku polyiontové povahy nukleových kyselin

(negativně nabité fosfáty nukleotidů) se stabilizace účastní rovněž i iontové síly. Přítomnost

kationtů v roztoku (zejména divalentních, např. Mg+2) stabilizuje dsDNA (zvyšuje Tm).

2.2. Struktura DNA s nadšroubovicovým vinutím

Genetické analýzy prokazují, že naprostá většina bakterií a virů obsahuje genomovou DNA

ve formě uzavřených kruhových DNA. Tato skutečnost byla prokázána jak molekulárně-

biologickými přístupy, tak např. elektronovou mikroskopií (Obr.65). Řada těchto kruhových

DNA se nachází ve stočeném stavu, který se nazývá superhelikální, či nadšroubovicové

vinutí. Tato topologická struktura se občas označuje i za tercierní strukturu DNA a má pro

tyto organismy důležitou roli v řadě životních projevů.

Schematický diagram základní struktury cirkulární DNA je znázorněn na Obr.66.

Výsledné geometrické uspořádání této struktury je závislé na počtu otáček, kterými se obě

vlákna DNA vzájemně obtáčí. Změnu v počtu otáček není možné provést jiným způsobem,

než přestřihnutím a provlečením jednoho z vláken okolo vlákna druhého. Matematicky se dá

vyjádřit tento fakt vztahem: L = T + W; kde L značí tzv. spojovací číslo označující počet

otáček jednoho vlákna kolem vlákna druhého; T číslo celkových otáček DNA kolem osy

vlákna v dané konformaci a W je počet otáček duplexu DNA kolem osy dvojšroubovice. W je


Strana 20

měřítkem nadšroubovicového vinutí (superhelicity) DNA. Rozdíl mezi T a W je prezentován

na Obr.67., příklad zavedení nadšroubovicového vinutí do cirkulární DNA na Obr.68.

Superhelikální DNA s negativním W může existovat ve dvou odlišných formách – tzv.

toroidním helixu a v stočeném helixu (Obr.69). V toroidním helixu je osa duplexu omotána ve

formě cylindru, v případě stočeného helixu se duplex stáčí okolo sebe. Superhelikální DNA

může být převedena in vitro do relaxované podoby, tj. cirkulární formy s W=0 pomocí štěpení

jednoho řetězce v duplexu pankreatickou DNasou I (endonukleáza, štěpící v určité sekvenci

pouze 1 vlákno duplexu). Dojde k protočení jednoho vlákna okolo druhého a uvolnění

nahromaděného napětí.

Topologii, tj. prostorové uspořádání cirkulární DNA se superhelicitou lze laboratorně

studovat a měřit. Dosud pozorované nativní formy těchto duplexů byly případem stočeného

helixu. Tento jev byl mnohokrát potvrzen využitím interkalárních molekul, jako je ethidium

bromid (EtBr) (Obr.70). EtBr je planární molekula, která má schopnost se vmezeřit mezi

vlákna duplexu (Obr.71) a přitom mění stupeň pootočení vláken (≈ 26°) a tím i superhelicitu

duplexu. Postupným zvyšováním koncentrace EtBr je možné dosáhnout postupnou změnu

superhelicity od negativní superhelicity (W < 0), přes relaxovanou kruhovou DNA až po

pozitivní superhelicitu (W > 0) (Obr.72). Hodnota superhelicity (W) je pak vyhodnocena

odlišnou sedimentační rychlostí jednotlivých typů duplexů. Jinou metodikou, schopnou odlišit

navzájem odlišné struktury s různou superhelicitou je agarózová elektroforéza (Obr.73). I zde

dochází k separaci, tj. nestejně rychlé migraci, superhelikálních DNA v elektickém poli a

polymerním sítu agarózového gelu.

Správná biologická funkce cirkulrání DNA je zaručena pouze v případě správné

topologie, tj. prostorovém uspořádání helixu. V procesech transkripce a translace vyžadují

enzymy jako je RNA polymeráza či DNA polymeráza lokální rozpletení duplexu DNA a

odhalení sekvence bazí. Negativní superhelicita cirkulární DNA napomáhá odtrhnutí obou

vláken duplexu v určitých sekvencích a sestavení funkčních polymeráz. Pokud je DNA

relaxována, pak výše zmíněné procesy buď probíhají velmi pomalu, či neprobíhají vůbec.

Superhelicita je kontrolována početnou skupinou enzymů, které se nazývají topoisomerázy.

Jejich název je odvozen z faktu, že tyto enzymy pouze mění topologii DNA, avšak nikoliv její

kovalentní strukturu. Topoisomerázy se člení na 2 skupiny, tzv. topoisomerázy typu I se

subtypy IA a IB (na základě jejich primární struktury a reakčního mechanismu) a

topoisomerázy typu II (způsobující dvouřetězcové zlomy DNA).


Strana 21

Typ I topoisomeráz katalyzují úplnou relaxaci superhelikální DNA změnou jejich

počtu otáček (L) v jednootáčkovém krokování. Typ IA se nachází ve všech typech buněk a

provádí relaxaci pouze u negativní superhelikální DNA, typ IB se nachází jak u prokaryot tak

i eukaryot a provádí relaxaci negativní i pozitivní superhelikální DNA. Podstatou funkce typu

IA je rozštěpení jednoho řetězce duplexu DNA, jeho akivní provlečení (spotřeba energie)

okolo druhého řetězce a opětovného spojení (strand passage mechanism) (Obr.74). Příkladem

je činnost topoisomerázy I a III bakterie E.Coli (Obr.75). Tyto enzymy mají schopnost

restrikce v určitých specifických sekvencích duplexu DNA za současného navázání

rozštěpených konců řetězce pomocí tzv. 5´-fosfotyrozinové vazby na aktivní tyrozin enzymu

(Obr.76). Pravděpodobný proces a jeho jednotlivé fáze jsou prezentovány na Obr.77. Typ IB

pracuje na základě kontroly rotace duplexu. Příkladem je lidská topoisomeráza I (topo I)

(Obr.77). I zde dochází k rozštěpení jednoho řetězce duplexu DNA a jeho vazbě na tyrozin,

avšak skrze 3´-fosfotyrozinovou vazbu. Následuje relaxace duplexu, která je však prováděna

odlišným mechanismem od typu IA, tj. kontrolovanou rotací přestřiženého vlákna DNA

kolem zafixovaného komplementárního řetezce. Tento proces nevyžaduje dodání další

energie enzymem, neboť jeho rotace je způsobena uvolněním negativního napětí v duplexu

(Obr.78).

Typ II topoisomeráz prokaryot se označují jako enzym gyráza. Gyráza je A2B2

heterotetramer, který se skládá z podjednotek GyrA a GyrB. Tento enzym katalyzuje krokové

zvyšování negativní superhelicity duplexu DNA za současné hydrolýzy ATP. Gyráza může

rozpojovat a spojovat jeden i oba řetězce duplexu DNA. Ostatní topoisomerázy typu II

prokaryot a eukaryot (vyjma gyrázy) naopak provádí relaxaci DNA, avšak opět za spotřeby

ATP. DNA gyrázy mohou být inhibovány řadou látek, jako je např. novobicin, antibiotika

izolovaného z streptomycet (patří ke kumarinovým typům antibiotik) či ciprofloxacin

(obchodní značka Cipro) pařící k chinolinovým typům antibiotik (Obr.79). Tyto antibiotika

inhibují procesy replikace a transkripce v bakteriích, v důsledku navození relaxace DNA

(nečinnost gyráz). Funkce gyrázy spočívá v přestřižení obou vláken duplexu, protlačení

vlákna duplexu přes dvojřetězcový zlom a jeho opětovné spojení (Obr.80). Dobře

prostudovanou topoisomerázou typu II je enzym izolovaný z kvasinek (Saccharomyces

cerevisiae, topoII) (Obr.81). Tyto enzymy pracují mechanismem obdobným strand passage

mechanismu topoisomeráz IA. Po rozstřižení jednoho řetězce v duplexu je 5´-konec zachycen

kovalentní vazbou na tyrozinu a následně je mezi vzniklým zlomem provlečeno celistvé

vlákno (Obr.82). Na závěr dochází k opětovnému spojení vlákna a uvolnění duplexu DNA. Je

známa řada látek, které inhibují činnost eukaryotních topoisomeráz typu II a jsou hojně


Strana 22

využívána v nádorových chemoterapiích. Příkladem je doxorubicin a etoposid (Obr.83).

V kontrastu s inhibitory gyráz, tyto molekuly zvyšují rychlost štěpení duplexů, nebo inhibují

religační schopnost. Dochází tak k masivnímu nárůstu jedno a dvou-řetězcových zlomů DNA

v buňce a následní zánik především rychle se replikujících, nádorových buněk.

2.3. Denaturace a renaturace nukleových kyselin

Pokud je roztok duplexu DNA zahříván na určitu teplotu, dochází ke kolapsu nativní

dvojřetězcové struktury, oddělení komplementárních řetězců DNA a jejich sbalení do

náhodného uspořádání. Tento proces se nazývá denaturace (Obr.84). Denaturace je

doprovázena změnou fyzikálně-chemických vlastností roztoku DNA, zejména viskozity či

absorpčního spektra (Obr.85). Nejspolehlivější metodou, jako monitorovat denaturaci DNA,

je sledování změn absorpce v UV oblasti, kde jsou lokalizována charakteristická absorpční

maxima. Během procesu denaturace dochází k ≈ 40% nárůstu absorpce v důsledku uvolnění

aromatických bazí, které jsou odpovědné za absorpci v UV oblasti. Tento jev, který se nazývá

hyperchromní efekt, je možné pozorovat např. při konstantní vlnové délce λ = 260nm jako

závislost na teplotě roztoku (Obr.86). Získaná závislost se nazývá křivka tání a její střední

hodnota odpovídá teplotě tání Tm (melting point). Teplota tání duplexu je závislá na celé řadě

faktorů, jako je povaha solventu, concentrace a typ přítomných iontů, pH, popř. obsah GC a

AT párů. Obecně platí pravidlo, že vyšší obsah GC zvyšuje Tm v důsledku existence tří

vodíkových můstků mezi komplementárními bazemi, kdežto vyšší obsah AT naopak snižuje

Tm (2 vodíkové můstky). Stanovení Tm u genomové DNA je jednou z metod, jak se dá

odhadout tzv. sekvenční komplexita genomu (obsah GC).

Pokud je roztok obsahující denaturovanou DNA rychle schlazen pod hodnotu Tm,

výsledná DNA bude pouze částěčně spárovaná (Obr.87), neboť oba řetězce nemají dostatek

času k nalezení komplementárních sekvencí před tím, než je struktura definitivně „zmražena“.

Pokud je však teplota roztoku ponechána po určitou dobu ≈ 25°C pod Tm, terrmální energie je

stále dostatečná k tomu, aby se vlákna DNA navzájem pohybovala a reorganizovala s cílem

nalézt komplementární oblasti. Za těchto podmínek je možné kompletně renaturovat DNA

v původní formě. Obdobně lze například získat i dvouřetězcovou hybridní DNA-RNA

molekulu procesem, který se nazývá hybridizace. Ta je základem moderních metod

v molekulární biologii a genovém inženýrství (např. polymerázová řetězová reakce, PCR).


Strana 23

3. REPLIKACE DNA

3.1. Obecný princip replikace

V roce 1958 nastínil Crick schéma přenosu a realizace genetické informace v organismech,

které se později označilo za tzv. centrální dogma molekulární biologie. DNA řídí vlastní

replikaci (zdvojení obsahu DNA), zatímco její transkripce (tj. přepis) poskytuje RNA, která je

podkladem pro translaci (tj. překlad) genetické informace do pořadí aminokyselin

v proteinech (Obr.88). Replikace přitom zajišťuje kontinuitu existence genové informace

v čase a prostoru, tj. zaručuje její mezigenerační přenos. Transkripce a translace jsou

nástrojem, které realizují genetickou informaci uloženou v DNA v daném konkrétním

organismu. Přestože role a existence replikačního mechanismu byla známa již v koncem

50.let min. stolení, její detailní popis se podařilo uskutečnit až mnohem později, v průběhu

70.let 20.st. Důvodem byl především fakt, že replikace se vždy účastní pouze několik málo

kopií enzymů v jedné buňce, které bylo nutné izolovat a popsat.

DNA je replikována pomocí enzymu, který se nazývá DNA polymeráza (DNAP),

popř. DNA specifická DNAP (označující typ nukleové kyseliny, který replikuje). Tyto

enzymy využívají jednořetezcový templát DNA k syntéze komplementárního vlákna

z příslušných s templátem párujících se nukleotidů (Obr.89). Jednotlivé nukleotidy

komplementárního řetězce jsou přísně kontrolovány tak, aby nedocházelo k vzniku chybného

párování. Vzniká tak dsDNA s typickou helikální strukturou. Téměř všechny známé DNAP

jsou schopny připojit nový nukleotid do vznikajícího řetězce na volnou 3´-OH skupinu

syntetizovaného vlákna. Důsledkem je směrovost syntézy (replikace), která probíhá vždy jen

ve směru 5´-3´vznikajícího vlákna DNA. Dovouřetězcová DNA je kopírována tím způsobem,

že dochází k postupujícímu rozštepění dsDNA vlákna v určitém místě (sekvenci) a odhalení

volných bazí nukleotidů, které slouží jako templát k syntéze komplementárního řetězce kopie

DNA. Vzniká tak tzv. semikonzervativní dceřiná kopie dsDNA (Obr. 90), tj. každé vzniklé

vlákno dsDNA obsahuje jedno vlákno z původní dsDNA a druhé nově nasyntetizované,

komplementární vlákno. Poprvé byl tento proces pozorovnán J. Cairnem jako replikace

cirkulárního chromozómu a vzniklé struktury označeny řeckým písmenem theta (θ) a nazvány

jako tzv. replikační očko (Obr.91). Část replikačního očka, ve kterém je syntetizována dceřiná

dsDNA se nazývá replikační vidlička (Obr.92). Replikační očko může obsahovat jednu či dvě

replikační vidličky, v závislosti na počtu DNAP, které se replikace účastní (jednosměrná či

dvousměrná replikace). Místo, kde na vlákně dsDNA je zahájena replikace, se nazývá


Strana 24

replikační počátek. Prokaryotní a bakteriofágová DNA je charakterizovaná pouze jedním

replikačním počátkem, eukaryotní chromozóm obsahuje zpravidla více replikačních počátků.

Požadavek na rozpletení DNA v místě replikačního počátku přináší poměrně závažný

topologický problém. Například chromozóm bakterie E. Coli je replikován rychlostí ≈ 1000

nukleotidů za 1s, tzv. že rozpletení šroubovice by bylo spojené s jejím točením kolem osy

s rychlostí cca 100 otáček za 1s, popř. akumulaci (tj. hrnutí) otáček ve směru replikace.

Z různých důvodů tento proces není možný a je ošetřen enzymatickou aktivitou např.

topoisomeráz. V přirozené formě je bakteriální chromozóm cirkulární s negativní

superhelicitou, který napomáhá rozvinutí duplexu DNA. U prokaryot je tato topologie

udržována aktivitou topoisomeráz II, které vzniklé napětí v cirkulární DNA uvolňují.

Ze struktury replikační vidličky vyplývá, že DNAP, které je ve vidličce přítomná

popojíždí jedním směrem a syntetizuje semikonzervativní kopie dsDNA. Jelikož však

všechny známé kopie DNAP mohou polymerizovat komplementární vlákno pouze ve směru

5´-3´vznikajícího řetězce, tj. ve směru pohybu DNAP po 3´-5´ templátovém řetězci, vyvstává

otázka, jak je možné tímto způsobem replikovat i druhé templátové vlákno původního řetězce,

které je orientováno opačně, tj. ve směru 5´-3´. Tato problematika byla objasněna v roce 1968

výzkumem R. Okazakiho, který popsal tvorbu krátkých nukleotidových polymerů, dnes

nazývaných jako Okazakiho fragmenty (Obr.93). Tyto fragmenty jsou dlouhé 1-2 tisíce

nukleotidů, jsou komplementární k druhému rodičovskému řetězci DNA, který je orientován

ve směru 5´-3´. Jejich existence umožnila formulovat tzv. semidiskontinuální replikační

model, ve kterém jsou oba mateřské řetězce DNA replikovány odlišným způsobem. Tzv.

vedoucí řetězec (leading strand) je templátový řetězec orientovaný ve směru 3´-5´, tj. syntéza

komplementárního řetězce probíhá v souladu se směrem pohybu DNAP. Naproti tomu tzv.

zpožďující se řetězec (lagging strand) je také syntetizován ve směru 5´-3´ narůstajícího

komplementárního řetězce, ale diskontinuálně, tj. tvorbou Okazakiho fragmentů. Okazakiho

fragmenty jsou pospojovány až následně činností enzymu DNA ligázy. Existence

diskontinuálního procesu syntézy DNA je mimo jiné potvrzena elektronovou mikroskopií

existencí jednořetězcových úseků DNA v replikační vidličce (Obr.94). U replikačních oček se

dvěma replikačními vidličkami jsou navíc Okazakiho fragmenty syntetizovány na

protilehlých řetězcích v jednotlivých vidličkách (tj. mění se poloha lagging a leading řetězce).

Již z faktu, že DNAP je shopná pouze připojit nový nukleotid k 3´-OH skupině

předchozího nukleotidu v řetězci vyplývá, že nutně musí existovat nejaký specifický

mechanismus zahájení replikace. Analýzou Okazakiho fragmentů bylo prokázáno, že jejich

5´-konce jsou tvořeny krátkými úseky RNA, koplementárními k templátové DNA. Tyto úseky


Strana 25

se nazývají RNA primery. Např. v bakterii E. Coli existují dva enzymy, které mají schopnost

syntetizovat RNA primery – tzv. RNA polymeráza (RNAP) a tzv. primáza, která je podstatně

menším enzymem, než RNAP. Primáza není citlivá k inhibitoru RNAP rifampicinu. Fakt, že

rifampicin inhibuje pouze syntézu vedoucího řetězce (a tedy jeho primerování je zaručeno

RNAP) dokazuje, že primáza se účastí zahájení (iniciace) tvorby Okazakiho fragmentů

(Obr.95). Jelikož zralá dsDNA neobsahuje RNA, je pochopitelné, že v určité fázi musí

docházet k odstranění primerů a jejich nahrazení komplementární DNA (o mechanismu viz

dále).

3.2. Replikační enzymy

DNA replikace je složitým procesem zahrnující celou řadu enzymů. V souhrnu lze jmenovat

následující: (i) DNA topoisomerázy; (ii) tzv. helikázy, tj. enzymy, které separují jednotlivé

řetězce dsDNA v replikační vidličce; (iii) proteiny, které zabraňují jejich zpětnému spárování

dle komplementárních bazí; (iv) enzym, které syntetizují RNA primery; (v) DNA polymeráza;

(vi) enzym, který odstraňuje RNA primery; (vii) enzym, který kovalentně spojuje Okazakiho

fragmenty. V následujícím textu jsou podány informace o struktuře a funkci jednotlivých

proteinů.

DNA polymeráza I (DNAP I nebo Pol I) byla objevena v roce 1957 A. Kornbergem

jako enzym, který v buněčném extraktu bakterie E. Coli syntetizoval DNA. Dalším

výzkumem bylo zjištěno, že Pol I spojuje deoxynukleosid trifosfáty nasedlé na DNA templátu

mechanismem nukleofilního ataku 3´-OH skupin narůstajícího řetězce α-fosforylovou

skupinou připojovaného nukleosid trifosfátu. Reakce je doprovázena uvolněním dvou fosfátů

(PPi) a jejich následným rozštěpením pyrofosfatázou. Reakce se velmi podobá aktivitě

RNAP, avšak s tím zásadním rozdílem, že nutně vyžaduje přítomnost správně spárované

komplementární báze s templátovou DNA. DNAP I tak pracuje s velmi vysokou přesností, tj.

do vznikajícího dsDNA je chybně inkorporována pouze 1 nukleotid na každých 10 milionů

zpolymerovaných nukleotidů. Pol I je pracuje tzv, processingem, tj. provádí série

polymerizačních kroků (typicky 20 a více), aniž by opustila templát. Pol I může za určitých

okolností pracovat i obráceným směrem, tj. odštěpovat nukleotidy od narůstajícího řetězce.

Tento proces však není přirozený a nemá závažný fyziologický význam. Požadavek na

polymeraci Watson-Crickovy báze spočívá spíše než v schopnosti rozpoznání příslušné báze

v požadavku na jejím dokonalém zpárování s templátem. Tento fakt byl potrzen např.

inkorporací molekul mimikujících elektronovou strukturu bazí, ale neposkytujících

vodíkovou vazbu (např. 2,4.difluorotoulen) (Obr.96). Mimo schopnosti polymerizace, Pol I


Strana 26

má schopnost odštěpovat nukleotidy z řetězce, tj. vlastní 3´-5á 5´-3´ exonukleázovou

aktivitu. 3´-5éxonukleázová aktivita se projeví v okamžiku, kdy se do řetězce vznikající

DNA začlení špatná (nespárovaná) báze. V tomto případě převládne exonukleázová aktivita a

špatně spárovaná báze je zpět odštěpena a její místo může obsadit báze komplementární. Tato

aktivita Pol I se nazývá proofreading nebo také tzv. editační aktivita. Tato aktivita umožňuje

efektivně eliminovat chyby při čtení a replikaci templátu. Cena za tuto aktivitu je určitá ztráta

energie, neboť takto je vytřiženo cca 3% všech inkorporovaných nukleotidů. Pol I 5´-3´

exonukleázová aktivita se projevuje především v jednořetězcovém zlomu DNA, kde Pol I

odštepuje jednu či několik málo bazí od 5´konce nezávisle na typu přítomné báze. Pol I je

tvořena tzv. Klenowovým fragmentem, tj. strukturální částí, která je zodpovědná za 3´-

5éxonukleázovou aktivitu a polymerázovou aktivitu a zbylou částí, zodpovědnou za 5´-

3éxonukleázovou aktivitu (Obr.97). Podrobně prostudovanou DNAP I je polymeráza

izolovaná z termofilní bakterie Thermus aquaticus (Taq), označovaná jako Klentaq1. Tento

enzym byl krystalizován a jeho struktura společně s krátkými oligonukleotidovými řetězci

duplexu B-DNA charakterizována rentgenovou krystalografickou analýzou (Obr.98). Klentaq

1 je funkčně i strukturálně podobný Klenowovu fragmentu Pol I bakterie E. Coli. Aktivní

místo této polymerázy naznačuje, že správný nukleotid je rozpoznán ne základě sekvenčně

nezávislé interakce s přiházejícím dNTP, přičemž aktivní místo mimikuje komplementární

tvar správné báze. Nukleotidylový transfer (spojení nukleotidů) je umožněn přítomností dvou

iontů kovů, zpravidla Mg2+ , které jsou přítomné v aktivním místu (Obr.99). Pol I se výraznou

měrou podílí na reparačních procesech poškozené DNA (např. chemickými mutageny). Pokud

se vyskytne poškozená DNA (např. modifikovaná báze), pak je řetězec v tomto místě

rozštěpen endonukleázou a stává se přístupným k 5´-3éxonukleázové aktivitě Pol I. Ta

v tomto místě nejen odstraní několik nukleotidů, ale zárověn syntetizuje vlákno nové a tím

opravuje poškozenou dsDNA. Praktické využití této aktivity Pol I je např. při syntéze

radioaktivně značených dsDNA, kdy 5´-úsek vlákna v uměle navozeném jednořetězcovém

zlomu je v přítomnosti Pol I a radioaktivně značených nukleotidů odstraněn (tzv. nick

translation) a nahrazen značenými nukleotidy (Obr.100). 5´-3éxonukleázová aktivita Pol I

se uplatňuje in vivo také v případě odstranění RNA primerů na 5´-konci nově

syntetizovaného vlákna ds DNA, přičemž polymerázová aktivita vyplňuje vznikající mezery.

Mimo DNAP I byly objeveny další typy polymeráz, které se z hlediska morfologie a

struktury liší od DNAP I. Jsou jimi především DNA polymeráza II (DNAP II, popř. Pol II) a

DNA polymeráza III (DNAP III, resp. Pol III). Srovnání vlastností jednotlivých polymeráz je

provedeno na Obr.101. Aktivita těchto polymeráz je ve srovnání s Pol I nízká (cca 5%


Strana 27

v normální buňce). DNAP II se uplatňuje především při reparačních procesech ds DNA skrze

tzv. SOS odezvu. Podobnou funkci mají i nedávno objevené DNAP IV (Pol IV) a DNAP V

(Pol V). Pol III je DNA replikáza v bakterii E. Coli. Skládá se z tzv. Pol II jádra (Obr.102),

které je funčně velmi podobné Pol I (s vyjímkou např. nick translace) a které je v nativní

podobě součástí komplikované struktury Pol III holoenzymu, skládajícího se nejméně z 10

podjednotek (Obr.103). Nejvýznamější součástí je tzv. β a λ podjednotka s vysoce

organizovaným procesem sestavení na primerovaném templátu DNA (viz dále). β odjednotka

vytváří prstenec, kterým prochází vlákno DNA - struktura známá jako pohyblivá β-svorka

(Obr.104), která je schopna „popojíždět“ po templátovém vlákně DNA. Význam této funkce

bude objasněn v dalším textu.

Pol III holoenzym bakterie E. coli nemá schopnost rozvinout dsDNA, jako např. Pol I.

Tuto roli přebírají u této bakterie tři speciální proteiny - DnaB protein ( produkt dnaB genu),

Rep helikáza a tzv. SSB protein (single-strand binding protein), které společnou činností za

spotřeby energie ve formě hydrolýzy ATP rozplétají dsDNA v replikační vidličce a připravují

ji tak na replikaci. Charakteristické vlastnosti těchto proteinů jsou popsány na Obr.105.

Enzymy, které poskytují přístup dsDNA k procesům replikace, transkripce atd. rozvolněním

jejich struktury na dva ssDNA řetězce se obecně nazývají helikázy. Helikázy jsou velmi

širokou a početnou skupinou enzymů, např. v E. Coli je známo celkem 12 různých helikáz.

Helikázy pracují většinou tak, že postupují navázané na jednom vlákně DNA a před sebou

rozplétají dsDNA za spotřeby NTP. Helikázy se zpravidla člení na několik typů např. podle

morfologie (hexamer, dimer) či směru rozplétání (ve směru 3´-5´ či 5´-3´vázaného vlákna).

DnaB protein E. coli patří mezi hexamerní helikázy, pohybující se po zpožďujícím se řetězci

ve směru 5´-3´ za současné hydrolýzy ATP (Obr.106). Jiným příkladem je helikáza-primáza

bakteriofága T7 (produkt genu 4) napadající E. coli (Obr.107 a 108), popř. Rep helikáza nebo

PriA protein jiných bakteriofágů napadajících rovněž E.coli (Obr.109). Pokud by rozvinuté

ssDNA vlákna v replikační vidličce byla ponechána bez další ochrany, došlo by k jejich

zpětnému a rychlému spojení do dsDNA. Tomuto procesu zabraňují SSB proteiny. Rovněž

zabraňují tvorbě nejrůznějších náhodných intramolekulárních sekundárních struktur ssDNA a

chrání ji proti nukleázám. Jednotlivé SSB proteiny jsou na vlákně ssDNA nahloučeny jako

korálky. Před replikací Pol III holoenzymem však musí být rychle odstraněny. Struktura SSB

homotetrameru z E. coli je známa a je zobrazena na Obr.110.

Jak již bylo popsáno, Pol I odstraňuje primery Okazakiho fragmentů a syntetizuje

komplementární DNA procesem tzv. nick translace. Vznikají tak jednořetězcové niky


Strana 28

(nespojitosti) mezi Okazakiho fragmenty, stejně jako nick na vedoucím řetězci po ukončení

replikace cirkulární DNA, které jsou pospojovány tzv. DNA ligázou za využití energie ve

formě ATP a NAD+ (Obr.111). DNA ligáza spojuje sousední nukleotidy vytvořením

fosfodiesterové vazby mezi jejich 3´-OH a 5´-P volnými skupinami a za současného uvolnění

AMP.

Primázy bakterií a některých bakteriofágů sledují pohyb replikační vidličky v asociaci

s některými proteiny DNA helikázy. Např. bakterie E.coli disponuje tzv. DnaG primázou

(produkt genu dna G), která je v nativním stavu asociována s helikázou DnaB. Jelikož tato

helikáza se pohybuje po zpožďujícím řetězci ve směru 5´-3´, musí se tato primáza pohybovat

dočasně opačným směrem, aby byla schopná syntetizovat RNA primer pro Okazakiho

fragment ve směru 5´-3´vznikajícího RNA primeru. Ačkoliv in vitro je DnaG primáza

schopna syntetizovat primery až ze 60 nukleotidů, v in vivo procesu se jedná pouze o 11

nukleotidů, kdy vzhledem k rychlosti replikace dochází k syntéze cca 1 primeru za 1s.

Struktura DnaG primázy byla získána teprve nedávno (Obr.112).

3.3. Replikace prokaryot a bakteriofágů

Bakteriofágy jsou jedny z nejjednodušších nebuněčných organismů a způsob (tj. relativní

jednoduchost) jejich replikace tento fakt do značné míry odráží. Řada poznatků o principech

replikace byla získána studiem bakteriofágů. Nejběžněji studovanými fágy jsou kolifág M13 a

φX174 (bakteriofág napadající bakterii E.coli). Nejvíce prostudovaným zástupcem replikace

prokaryot je pak samotná bakterie E. coli.

Bakteriofág M13 je tvořen 6408-bp cirkulární virovou (+) ssDNA (zanaménko plus

značí, že DNA je zároveň templátem pro transkripci). Jakmile dojde k infekci E. coli, dojde

k sysntéze komplementárního (-) vlákna DNA a vytváří se cirkulární duplex, tzv. replikativní

forma (RF), která může být jak přerušena nickem (relaxována) (RF II) či se nachází

v nadšroubovicové formě (RF I). Jakmile M13 (+) ssDNA pronikne do bakterie, je

stabilizována pomocí SSB proteinů vyjma krátké sekvence 57 nukleotidů, které vytváří

vlásenku na základě intermolekulární komplementarity, tj. palindromatických sekvencí

(Obr.113). RNA primáza syntetizuje RNA primer 6 nukleotidů před počátkem vlásenky a

vzniká DNA-RNA heterodimer procházející dalších 20 až 30 nukleotidů do samotné

vlásenky. Pol III holoenzym pak syntetizuje (-) DNA. Primer je odstraněn činností Pol I, tj.

nick translací. Vzniká RF II, která je transformována do RF I činností gyrázy a DNA ligázy.

Bakteriofág φX174 je tvořen obdobně jako M13 jednořetězcovou cirkulární DNA. In

vivo konverze tohoto bakteriofága je však daleko komplikovanější než v případě M13,


Strana 29

především účastí proteinu tzv. primosomu (Obr.114). Syntéza komplementárního (-) řetězce

probíhá celkem v 6 fázích a je modelem pro objasnění syntézy zpožďujícího se řetězce

(lagging strand) (Obr.115). (1) Reakce začíná obdobně jako u M13, tj. (+) ssDNA vlákno je

po infekci obaleno SSB proteiny, mimo 44 bp vlásenku. Sekvence vlásenky je známa jako

tzv. místo pas (primosome assembly site), které je rozpoznáno podjednotkami primosomu

PriA, PriB a PriC. (2) Na sestavené proteiny v míst pas se váží proteiny DnaB a DnaC

s pomocí proteinu DnaT přičemž po spotřebě ATP a uvolnění DnaC vzniká tzv. preprimosom.

Ten váže primázu a vzniká vlastní primosom. (3) Primosom se pohybuje ve směru 5´-3´ (+)

řetězce a vytěsňuje SSB proteiny za spotřeby ATP (obrácený směr pohybu než směr čtení

templátu). (4) V náhodných místech dojde k zpětnému pohybu primosomu po (+) vlákně,

přičemž primáza syntetizuje RNA primer. (5) Pol III holoenzym prodlužuje primery do formy

Okazakiho fragmentů. (6) Pol I vyštěpí primery a nahradí je DNA. Fragmenty jsou

pospojovány pomocí DNA ligázy a činností DNA gyrázy je na něj zavedená superhelicita.

Primosom nadále zůstává spojen s dsDNA a podílý se na syntéze nových (+) ssDNA

(replikaci viru). Syntéza (+) ssDNA vlákna slouží jako model pro replikaci vedoucího řetězce

(leading strand). Jedno vlákno cirkulární dsDNA může být kopírováno systémem tzv. valivé

kružnice (nebo tzv. σ-replikace, v důsledku podobnosti replikační struktury řeckému písmenu

sigma) (Obr.116). Pozitivní (+) ssDNA bakteriofága φX174 je kopírováno modifikací tohoto

mechanismu, tzv. loop mechanismem (loop mód valivé kružnice) z RF I templátu (Obr.117).

Celý proces se dá popsat 4 kroky. (1) (+) dsDNA vlákno s navázaným primosomem je

svázáno s proteinem genu A, který specificky rozštěpí (+) vlákno a kovalentně se naváže na

5´-P skupinu DNA řetězce. (2) Rep helikáza se přiloží k (-) řetězci v místě navázaného

proteinu genu A s pomocí stále navázaného primosomu rozplétá dsDNA od 5´-konce (+)

řetězce. Vytěsněný (+) řetězec je dále obalen SSB proteiny a stabilizován. Pol III holoenzym

syntetizuje (+) řetězec dle (-) templátu. (3) V průběhu syntézy narůstá (+) řetězec loop

(smyčka) procesem, přičemž druhý konec je neustále spojen s proteinem genu A. (4) Po

ukončení jednoho cyklu je (+) řetězec uvolněn a celý cyklus se může opakovat. Tento proces

se vyskytuje v pozdních stádiích infekce, kde vznikající (+) vlákna jsou zabalena do fágových

hlav.

Bakterie E. coli replikuje svůj chromozóm pomocí dvousměrného theta θ

intermediátu, který vzniká v jednom místě na chromozómu, tzv. replikačním počátku. Většina

modelů popisujících replikaci této bakterie byla vytvořena na základě jednodušších modelů,

jako jsou kolifágy M13 a φX174. Schéma replikace je na Obr.118. DnaB helikáza rozplétá


Strana 30

dsDNA, přčemž vznikající ssDNA řetězce jsou ihned obaleny SSB proteiny. Syntéza

vedoucího řetězce je zajištěna Pol III holoenzymem, přičemž primer je syntetizován primázou

primosomu. Stejná primáza syntetizuje i RNA primery Okazakiho fragmentů. Syntéza

vedoucího i váznoucího řetězce je zajištena tzv. replisomem, tj. složitým komplexem

skládajícím se z podjednotek – dvou jader Pol III (podjednotky αεθ), které jsou spojené skrze

podjednotky τ. Zpožďující řetězec tedy vytváří smyčku. Jakmile je dokončena syntéza

jednoho Okazakiho fragmentu, holoenzym Pol III zpožďujícího se řetězce se přesouvá do

místa v replikační vidličce, kde vznikl nový primer pro následující Okazakiho fragment.

Primery Okazakiho fragmentů jsou nahrazeny DNA pomocí Pol I katalyzované nick translace

a následně jsou jednotlivé fragmenty spojeny DNA ligázou.

Replikační počátek chromozómu E.coli tvoří unikátní 245-bp segment, známý jako

tzv. oriC místo (lokus). Tato sekvence je velmi konzervativní mezi gram-negativními

bakteriemi. Proces iniciace je zahájen vazbou DnaA proteinů, které rozpoznají specifické

sekvence na oriC, tzv. DnaA boxy (obsahují vysoce konservovanou sekvenci 5´-

TTATCCACA-3´) přičemž jejich vazbou vzniká negativní závit na oriC a stočení dsDNA

kolem přítomných pěti DnaA proteinů (Obr.119). Tento ohyb dsDNA je zesílen vazbou DNA

vázajících proteinů – tzv. HU proteinu a IHF (integration host factor). Tento ohyb způsobí

rozštěpení dsDNA v místě specifické 13-bp sekvence oriC, která je bohatá na AT. Vazbou

DnaB proteinů na odhalené ssDNA vzniká tzv. preprimerový komplex. V přítomnosti SSB

proteinů, DNA gyrázy a DnaB helikázy dochází k dalšímu rozšiřování preprimerového

komplexu tak, že se umožní vznik replikačních vidliček se sestavenou primázou a RNA

polymerázou.

Replikace chromozómu E. coli se vyskytuje vždy jen jednou na jedno dělení buňky,

tzn. že tento proces musí být striktně kontrolován. Doba zdvojení E. coli je v závislosti na

vnějších podmínkách od 20 min do 10 hodin (37°C, dostatek substrátu). Porovnání rychlosti

replikace (1000 n/s) a velikosti genomu bakterie (4.6 × 106 bp) poskytuje replikační čas (tj.

doba zdvojení chromozómu) ≈ 40 min. Z porovnání doby zdvojení a replikačního času plyne

logický závěr, že buňka musí zahájit replikaci jěště před ukončením předchozího cyklu dělení.

Výsledkem je chromozóm s více replikačními vidličkami, které zaručují vznik nové kopie

chromozómu vždy těsně před následujícím buněčným dělením (Obr.120). Ačkoliv každý

chromozóm tak obsahuje více oriC počátků, přesto v rámci jedné generace buňky dochází

k zahájení vždy jen jedné replikace. Chromozomy jsou separovány do dceřinných buněk

vazbou na membránu bakterie. Přednostně se na membránu vážou tzv. hemimethylované


Strana 31

oriC. OriC přitom obsahuje methylační sekvence GATC přístupné pro tzv. Dam

methyltransferázu, která methyluje A v této sekvenci. U čerstvě zreplikovaných dsDNA je

jeden A v sekvenci GATC v oriC nemetylován, tj. vlákno je tzv. hemimethylované. Právě

vazba těchto hemimethylovaných oriC na membránu zabraňuje iniciaci další replikace a

zároveň garantuje rozchod čerstvě zreplikovaných chromozómů do dceřinných bakterií.

Vazba chromozómu na membránu je zprotředkována proteinem SeqA, produktem tzv. seqA

genu.

Replikace je ukončena v místě, které se označuje jako tzv. terminus. Jedná se o

nepalindromické 23-bp sekvence, které se označují jako TerE, TerD a TerA na jedné straně a

TerG, TerF, Ter B a TerC (Obr.121). Replikační vidlička směřující proti směru hodinových

ručiček a vznikající v oriC na opačném pólu chromozómu se zastavuje přednostně na TerA,

popř. na TerD a TerE (nejspíše zálohují TerA). Druhá replikační vidlička se naopak zastavuje

na TerC, popř. na TerB. Tento systém zaručuje setkání obou replikačních vidliček v jednom

místě na chromozómu. Zastavení vidličky v místě terminus je umožněné díky speciálnímu

proteinu Tus (produkt genu tus), který zabraňuje DnaB helikáze rozplétat vlákno dsDNA.

3.4. Replikace eukaryotního chromozómu

Replikace eukaryotního chromozómu je v řadě aspektů velmi podobná relikaci prokaryot.

Přesto existují zásadní rozdíly, které jsou podmíněny zejména vysokou komplexitou eukaryot

v porovnání s prokaryoty. Například eukaryotní chromozóm je složitý organizovaný komplex

dsDNA a proteinů, a replikační mechanismy musí tedy být s těmito komplexy

synchronizovány. Buněčný cyklus eukaryotní buňky je členěn na čtyři odlišné fáze (Obr.122).

(1) mitóza a dělení buňky se objevují v relativně krátké M fázi. (2) G1 fáze (gap phase) patří

mezi nejdelší fáze buněčného cyklu. Jedná se o hlavní období buněčného růstu. (3) S fáze

(synthesis) je jedinnou fází, kde dochází k syntéze (replikaci) DNA. (4) G2 fáze, která je

poměrně krátká a charakterizuje přípravu buňky k mitóze. Buněčný cyklus buněk v in vitro

kulturách se pohybuje okolo 24 h na 1 dělení, v nativních podmínkách v rozsahu cca 8h až

více jak 100 dní. Některé buňky (např. neurony) se nedělí vůbec a zůstavají tak v tzv G0 fázi.

Rozhodnutí buňky k dělení je učiněno v G1 fázi v důsledku řady faktorů, včetně patogenních

(karcinogenní látky či nádorové viry navozující nekontrolovatelné dělení, ravinové bujení).

Ve zdravé buňce je přechod buňky mezi jednotlivými fázemi je regulován proteiny, tzv.

cykliny a cyklin-dependentními protein kinázami (Cdks). Cykliny jsou vždy tvořeny

v průběhu jedné fáze buněčného cyklu ale kompletně degradovány v následující fázi. Cykliny

aktivují příslušné Cdks (vážou se na ně), které aktivují cílové proteiny jejich fosforylací. Tyto


Strana 32

proteiny zaručují nezbytné funkce buňky v daném fázi buněčného cyklu. Aby bylo možné

přejít z jedné fáze do druhé, musí buňka splnit určité kontrolní body (např. vznik mitotického

vřeténka musí předcházet mitóze atd.). Pokud tyto body nejsou splněny, buňka setrvává

v jedné fázi, nebo se přechod do další fáze výrazně zpožďuje.

Naprostá většina poznatků o eukaryontní DNA replikaci byla získána studiem

kvasinek (Saccharomyces cerevisiae), viru SV40 a metazoí jako je Drosophila a Xenopus

laevis. Eukaryotní buňky obsahují celou řadu DNA polymeráz, které mohou být rozděleny do

6 rodin na základě jejich fylogenetické příbuznosti: rodina A (příbuzná Pol I), rodina B

(příbuzná Pol II), rodina C (příbuzná Pol III) a rodiny D,X, a Y. Buňky živočichů obsahují 4

DNAP, které se účastí replikace. Jedná se o polymerázy označené jako (Pol) α, γ, δ a ε popř.

jako POL A, POL G, POL D1, POL E (Obr.122). Pol α se nachází v jádře buňky a podílí se

na replikaci chromozomální DNA. Lze ji specificky inhibovat aphidicolinem (Obr.123).

Obdobně jako jiné DNAP i tato syntetizuje nové vlákno DNA dle ssDNA templátu ve směru

5´-3´ templátu. Nemá exonukleázovu aktivitu, avšak je velmi těsně asociován s primázou a

vytváří tak protein, nazvaný pol α/primáza. Struktura tohoto typu DNAP byla získána studiem

DNAP bakteriofága RB69 (Obr.124). Pol δ je opět jaderná DNAP, která však nemá

primázovou aktivitu a projevuje korekturní 3´-5´ exonukleázovou aktivitu. Tato DNAP je

schopná replikovat templát jakékoliv délky, pokud je v komplexu s proteinem, který se

nazývá proliferační buněčný nukleární antigen (PCNA). Ten funguje pravděpodobně stejně

jako tzv. β-svorka u DNAP E. coli (Obr.125). Pol ε je velmi podobná Pol δ, avšak je

charakterizována velkou procesivitou i bez navázaného proteinu PCNA. Pol γ se nachází

výhradně v mitochodriích a replikuje tedy mitochondriální DNA. Obdobná DNAP je

přítomná i v chloroplastech. Mimo tyto základní typy DNAP existují další, které se však

účastní spíše reparačních mechanismů (POL B, POL H, POL I atd.).

Eukaryotní a prokaryotní DNA replikační systémy se liší především ve faktu, že

eukaryotní chromozóm obsahuje celou řadu replikačních počátků, na rozdíl od bakteriálního

chromozómu, který obsahuje pouze jeden (Obr.126). Replikace eukarytního chromozómu je

také daleko pomalejší, tj. okolo 50 nukleotidů za 1s (oproto 1000 nukleotidů u bakterií).

Pokud by tedy byl přítomen pouze 1 replikační počátek, replikace chromozómu by trvala řadu

týdnů. Proto se tyto počátky vyskytují hojně na přibližně každých 300 kb úseku dsDNA.

Replikace se tak zkrátí na potřebnou hodnotu do několika málo hodin. Úsek DNA, která se

replikuje z jednoho počátku, se nazývá replikon. Zpravidla dochází k aktivaci a současné


Strana 33

syntéze klastrů až 80 replikonů v S fázi. Nově nasyntetizovaná DNA je buňkou rozpoznána a

není tedy možné provést v jednom buněčném cyklu více replikací stejného replikonu.

Sestavení replikačního komplexu na replikačním počátku chromozómu eukaryot se

odehrává ve dvou fázích. V první fázi dochází k sestavení tzv. pre-replikativního komplexu

(pre-RC) v každém replikačním počátku v průběhu G1 fáze. Jedná se o tzv. licenční proces,

neboť pouze v této fázi cyklu může pre-RC komplex vzniknout. Vznik pre-RC komplexu je

nutnou podmínkou k replikaci replikonu, avšak nikoliv podmínkou postačující. K tomu aby

došlo k replikaci, musí být tento komplex aktivován v S fázi buněčného cyklu. Tímto

způsobem je vyloučena další iniciace replikace na nově vzniklém dsDNA vlákně v S-fázi a

tím i jedna kopie každého replikonu v jednom buněčném cyklu. Výzkum licenčního procesu

je teprve v počátcích. Sestavení pre-RC komplexu je zahájeno v pozdní M či na počátku G1

fáze cyklu vazbou tzv. komplexu rozpoznávající replikační počátek (ORC, origin recognition

complex) (Obr.127), hexameru který se skládá z podjednotek Orc1-Orc6 do počátku

replikace. ORC je funkční analog DnaA proteinu E.coli a ve spolupráci s dalšími proteiny

(Cdc6-18) umožňuje vazbu tzv. MCM komplexu, který zakončuje vznik licencovaného pre-

RC komplexu. MCM komplex je ATP helikázou obdobnou DnaB helikáze E. coli. V S-fázi

dochází ke konverzi pre-RC licencovaného komplexu na iniciační replikační komplex vazbou

pol α/primázy, pol ε, replikačního proteinu A (obdoba SSB proteinů E. coli) a několika

dalších proteinových podjednotek. Po zahájení replikace dochází k syntéze nových dsDNA

v replikačních vidličkách (dvě na jedno replikační očko) dokud se replikační vidličky

sousedních replikonů na chromozómu nesetkají. Eukaryota neobsahují terminační místa

replikace jako bakteriální chromozóm. Dalším ze způsobů, kterým se zabraňuje dvojí

replikaci téhož replikonu v jednom buněčném cyklu je aktivita cyklin dependentních kináz

(Cdks), princip této regulace však ještě není dostatečně znám. Buňky, které se nedělí, tj.

setrvávají v tzv. Go fázi cyklu nemají aktivní Cdk a neobsahují MCM komplex. Z tohoto

důvodu nejsou schopny sestavit pre-RC komplex. Nádorové buňky, které jsou

charakterizované rychlým a nekotrolovatelným dělením buněk obsahují velké množství MCM

komplexu. Z toho důvodu je tedy MCM komplex důležitým potenciálním diagnostickým

markerem nádorového onemocnění. RNA primery eukaryotních Okazakiho fragmentů jsou

odstraněny enzymem RNázou H1, která ponechává pouze 5´ribonukleotid – ten je následně

odstraněn tzv. flap endonukleázou-1 (FEN1).

Mitochondriální DNA je replikována pomocí tzv. D-loop mechanismu (D-loop

displacement mechanism) (Obr.128). Vedoucí řetězec vytěsňuje v průběhu syntézy váznoucí

řetězec formou tzv. D-smyčky. D-smyčka je přechodná trojřetězcová struktura DNA, která se


Strana 34

v mitochondriálním cirkulárním chromozómu vyskytuje jako nestálý, 500-600 nukleotidů

dlouhý úsek. V průběhu replikace se tato smyčka prodlužuje. Jakmile dosáhne přibližně dvou

třetin délky obvodu kruhu chromozómu, odhalí se replikační počátek pro váznoucí řetězec a

je započatá syntéza jeho komplementárního vlákna, avšak v obráceném směru. Váznoucí

řetězec je tedy nasyntetizován pouze z jedné třetiny, v okamžiku, kdy syntéza vedoucího

řetězce je ukončena.

Retroviry, které patří mezi RNA eukaryotní viry a jsou často odpovědné za virově

aktivované nádorové změny buněk či za onemocnění, jakým je syndrom získaného selhání

imunity (onemocnění AIDS, původce HIV, human immunodeficiency virus) obsahují

speciální DNAP, tzv. RNA dependentní DNA polymerázu (nebo také reverzní transkriptázu,

RT). Tento enzym byl objeven v roce 1970 H.Teminem a D. Baltimorem a popsán jako

enzym, který syntetizuje DNA ve směru 5´-3´ primerovaného templátu. Templátem ale není

DNA, nýbrž RNA. Reverzní transkriptáza přepisuje RNA genom retroviru do dsDNA

v několika fázích (Obr.129). (1) Retrovirová RNA slouží jako templát pro syntézu

komplementárního vlákna DNA (pomocí RT) za vzniku RNA-DNA hybridního helixu. DNA

syntéze je primerována tRNA hostující buňky, resp. jejím částečně rozpleteným 3´-koncem.

(2) RNA vlákno hybridu RNA-DNA je odstraněno pomocí aktivity enzymu RNázy H. (3)

vzniklé ssDNA vlákno je templátem pro syntézu komplementárního vlákna DNA a vzniku

dsDNA. Následně je dsDNA integrována do hostujícího genomu. RT je využívána v genovém

inženýrství, neboť je schopná transkribovat mRNA izolované z organismu do

komplementární DNA (tzv. copy DNA, tj. cDNA). Vzniklou genomovou knihovnu (soubor

cDNA) je možné využít např. k identifikaci genu zodpovědného za kódování příslušné

mRNA, popř. k sekvencování jejich struktury. Struktura modelové RT, reprezentované HIV-

1 reverzní transkriptázou byla stanovena teprve nedávno (Obr.130). Jedná se o dimerní

protein skládající se z podjednotek p66 a p51 (dle velikosti v kD). Na základě znalosti

prostorového uspořádání těchto podjednotek byly připraveny inhibitory HIV-1 RT, které jsou

využity k léčbě AIDS (Obr.131).

Problémem, který se vyskytuje u lineárních řetězců dsDNA a tedy i u chromozómů

eukaryot je především nebezpečí zkracování konců jako důsledek replikace. Tento problém je

způsoben faktem, že RNA primer na 5´-konci templátové DNA váznoucího řetězce nemůže

být nahrazen DNA (primer na dosyntetizování tohoto konce by se neměl na čem uchytit).

Z tohoto důvodu existuje speciální mechanismus, který mi jsou konce lineárních chromozómů

eukaryot, tj. telomery replikovány. Telomery DNA mají neobvyklé sekvence. Ta se skládá

z mnohatisíců tandemových opakování jednoduché, na G bohaté a druhově odlišné sekvence


Strana 35

nukleotidů (obratlovci TTAGGG), ukončující každý 3´-konec chromozómu. Telomery jsou

syntetizovány jiným mechanismem, než zbylá dsDNA. Za syntézu jsou odpovědné speciální

enzymy, tzv. telomerázy, která nezávisle na povaze templátu neustále přidávají tandemové

sekvence na 3´-konec telomerního oligonukleotidu. Tato syntéza je umožněna faktem, že

telomerázy jsou ribonukleoproteiny, které obsahují ve své RNA složce komponenty

s komplementárními úseky k opakující se telomerické sekvenci. Tato sekvence tedy působí

jako templát pro syntézu telomér principem reverzní transkripce, tj. dosyntetizováním telomér

ve formě ssDNA (Obr.132). Bez existence telomeráz by docházelo ke zkrácení 3´-konců

chromozómu o 50-100 bazí na jeden replikační cyklus. Navíc, volné 3´-konce ve formě

ssDNA by mohly být přístupné k exonukleázám a mohly by být jednoduše degradovány. Aby

ted tento mechanismus splňoval svou funkci, musí být telomery chráněny před jejich aktivitou

pomocí tzv. čepičky (Obr.133). Čepička je tvořena telomerní DNA ve vazbě na speciální

proteiny. Telomerázy mohou vytvářet cyklický tetramer, tzv. G-kvartet. Na tuto strukturu se

váží proteiny, které vytváří čepičku, jako je např. TRF1 a TRF2 savců (telomere repeat

binding factor). Ze studií telomér savců byla potvrzena existence tzv. T-smyček (T-loops) –

dimerních forem telomér s navázaným proteinem TRF2 (Obr.134). V případě neexistence

čepičky, popř. ztrátě funkce telomerázy dochází po několika generacích dělení buněk k jejich

smrti v důsledku postupné eliminace telomeráz. Telomerázy se tedy podílí na procesech

stárnutí buňky a mnohobuněčných organismů. Např. somatické buňky izolované

z mnohobuněčných organismů zpravidla neobsahují aktivní telomerázu a v in vitro kulturách

přežívají pouze 20-60 dělení. Vztah mezi délkou telomér a počtem dělení buněk v těchto

kulturách byl jednoznačně potvrzen. Jedním z důvodů stárnutí buněk (zkracovní telomér)

může být ochrana organismu před nádorovným bujením. Rakovinové buňky jsou

charakteristické nekontrolovatelným dělením a ve své podstatě neomezeným počtem

buněčných generací. Smrtelnost běžných buněk je způsobena neaktivní telomerázou. Pokud

by telomeráza zůstávala aktivní i u somatických buněk, výrazně se zvyšuje riziko jejich

maligní transformace, tj. ztráty kontroly nad činností telomerázy a tím i zajištění podmínky

nekontrolovaného dělení. Z tohoto důvodu se jako potenciální protinádorové léky mohou

uplatnit inhibitory telomeráz.


Strana 36

4. REPARACE DNA

DNA v organismu není neměná, rigidní struktura. V prostředí buňky musí čelit řadě

negativních vlivů (chemické látky, záření, působení enzymů), které mohou vést k jejímu

poškození jako je např. chemická modifikace bazí či cukerné kostry, pořípadě přerušení

řetězce (např. v lidské buňce dojde denně k ≈ 10 tis. přerušení glykosidických vazeb v DNA)

Tyto poškození musí být opraveny (reparovány), tak aby genetická informace zanesená

v genomu nebyla poškozena a byla tak zajištena její neměnnost (integrita). Tato oprava je

možná z toho důvodu, že informace o pořadí nukleotidů je kódována dvěma rětězci dsDNA,

tj. pokud dojde k porušení jednoho z řetězců, může být informace obnovena na základě

řetězce komplementárního. Důležitost reparace DNA je potvrzena existencí více jako 300

genů, kódující v lidském genomu proteiny účatnící se reparačních pochodů. Podstata těctho

podchodů je přitom velmi podobná s pochody, které jsou zdokumentovány pro bakterii E.coli.

4.1. Přímá oprava poškození nukleotidů

UV záření o vlnové délce v rozsahu 200-300 nm způsobuje kovalentní vazbu mezi dvěma

v řetězci sousedícími thyminy, tj. vznik tzv. thyminových dimerů (Obr.135). Obdobně mohou

vznikat i vazby mezi thyminem-cytosinem popř. mezi dvěma cytosiny. Tyto pyrimidinové

dimery způsobují lokální deformaci dsDNA, která zabraňuje replikaci a transkripci řetězce

DNA. Reparace pyrimidinových dimerů je umožněna existencí enzymů, tzv.

fotoreaktivačních enzymů, jako je DNA fotolyáza (přítomná jak v prokaryotech tak i

eukarytech). Tento enzym se váže ve tmě ve formě dimeru (55 a 65 kD) na pyrimidinový

dimer. Chromofore, nejčastěji tzv. MTHF nebo 5-deazaflavin (Obr.136) absorbuje v oblasti

300-500 nm a přenáší excitační energii na FADH-, který redukuje thyminový dimer a způsobí

jeho reparaci na dva nesvázané thyminy (Obr.137).

Chemické látky, tzv. alkylační činidla (např. tzv. NMNG – viz Obr.138) mají

schopnost alkylovat (přenášet alkylovou skupinu) dusíkaté báze (např. guanin za vzniku O6-

alkylguaninu). Tyto chemické změny jsou velmi mutagenní, neboť vnášejí při replikaci do

vznikajícího řetězce špatné báze v důsledku nesprávného párování (např. thymin místo

cytozinu). Příkladem enzymu, který umí odstranit tyto alkylované báze je vzniku O6-

alkylguanin-DNA-alkyltransferáza, která je však po této reakci sama zničena a není tedy

klasickým enzymem. Tento protein se v případě bakterie E.Coli nazývá Ada protein.

Struktura Ada proteinu byla analyzována s atomárním rozlišením (Obr.139).


Strana 37

4.2. Excisní reparace

Existují dva typy této reparace: (1) tzv. nukleotidová excizní reparace (NER), která reparuje

poměrně větší poškození DNA a (2) tzv. excisní reparace bazí (BER), reparující malá

poškození včetně jednoduchých bazí.

NER je typ reparace, který se nachází u všech organismů, které eliminují poškození

dsDNA vystřižením celých poškozených úseků (oligonukleotidů) a následným nahrazením

novou DNA. Tento systém je zpravidla aktivován v místě, kdy dochází k porušení struktury

helixu v důsledku přítomnosti nesprávných či modifikovaných nukleotidů (bazí) (Obr.140). U

člověka je tento způsob reparace hlavním mechanismem, jak dochází k boji proti

karcinogenům, nadměrnému UV ozáření a toxickému působení cigaretového kouře. NER

systémy prokaryot a eukaryot si jsou velmi podobné (až na počet podjednotek enzymu tj. 3 u

prokaryot a 6 u eukaryot), avšak pravděpodobně vznikly konvergentní evolucí. U E.coli se

jedná o ATP dependentní proces, na němž se podílí podjednotky UvrA, UvrB a UvrC. Celý

tento systém se nazývá UvrABC endonukleáza. Ta štěpí 4. a 7. fosfodiesterovou vazbu na 5á

3´konci od místa poškození DNA. Do vzniklé ssDNA je navázána UvrD známá také jako tzv

helikáza II a komplementární vlákno je nasyntetizováno činností enzymu Pol I a spojeno

DNA ligázou. Geneticky kódovaná porucha obdobného reparačního systému u člověka

způsobuje velmi závažné onemocnění, nazývané xeroderma pigmentosum, charakterizovaná

extrémní citlivostí na světelné záření a brzkým vývoje rozsáhlé rakoviny pokožky. Obdobné

onemocnění, které však nezpůsobuje rakovinové bujení je tzv. Cockayneův syndrom (CS).

Báze nukleových kyselin jsou často modifikovány reakcemi, které probíhají za

normálních fyziologických podmínek, ale i skrze nejrůznější toxické působení polutantů.

Vznikají tak modifikované báze jako je např. 7-methylguanin, 3-methyladenin atd. Ionizující

záření může způsobit otevření heterocyklů bazí. Tyto změny mohou způsobit změnu párování

bazí. BER mechanismus napomáhá tyto pozměněné báze odstranit. Buňky obsahují řadu tzv.

DNA glykosiláz, které mají schopnost rozpoznat specificky modifikovanou bázi a rozštěpit

glykosidickou vazbu bezi bazí a cukrem a ponechat tak pouze cukernou část nukleotidu

v řetězci DNA (Obr.141). V následném kroku je tzv. bezbázové místo (apurinic nebo

apyrimidinic site, AP-site) odstraněno naštěpením AP endonukleázou a nahrazeno pomocí

DNAP a DNA ligázy správným nukleotidem.

I přes znalost faktu, že uracil zastupuje v RNA thymin, nebyl tento fakt dlouhou dobu

uspokojivě objasněn. Teprve s výzkumem reparací bylo zjištěno, že tento fakt je esenciální

pro správné uchování genetické informace. V normálních fyziologických podmínkách může


Strana 38

totiž docházet k deaminačnímu procesu, kdy báze cytosin je konvertována na uracil. Pokud by

uracil byl normální součástí DNA, nebylo by možné rozhodnout, zda daný uracil je správný,

či vznikl z cytozinu touto reakcí. Nutně by to znamenalo postupnou ztrátu informace uložené

v DNA. Pokud se tedy U vyskytne v DNA, pak nutně vznikl deaminací cytosinu a musí být

odstraněn. Tuto funkci zastávají enzymy, které se nazývají uracil-DNA glykosylázy (UDG).

Tyto enzymy pracují mechanismem BER, tedy obdobně, jako bylo zmíněno výše.

4.3. Mismatch reparace

Jakákoliv chyba párování, která není opravena v průběhu replikace (tj. editační aktivitou

DNAP) může být opravena pomocí mechaismu tzv. mismatch reparace (MMR – mismatch

repair). Např. chyba replikace Pol I a Pol III u E. coli se pohybuje v rozsahu 10-7 do 10-6 na

jednu bázi. Navíc, MMR systém umí opravit úseky, které mohou vznikat tzv. sklouznutím

DNAP (slippage mechanismus), tj. nespárované úseky až 4 nukleotidů. Důležitost tohoto

reparačního mechanismu vyplývá i z faktu, že defekt v lidském MMR systému způsobuje

vyskou incidenci rakovin, především tzv. dědičné nonpolypózní kolorektální rakoviny

(HNPCC). Aby MMR systém mohl rozlišit, které z vláken dsDNA je správné, musí existovat

systém, který určí správné, tedy templátové vlákno. Např. u E.coli je tento systém tvořen tzv.

DAM methylázou, která methyluje sekvenci GATC u nově vzniklých vláken avšak s určitou

časovou prodlevou. Vlákno, které je dceřiné zůstává tedy po určitou dobu nemethylováno.

Tato doba je dostatečná k tomu, aby byly odhaleny nespárované úseky a opraveny MMR

systémem. MMR systém byl nejlépe prostudován opět na bakterii E.coli (Obr.142). Protein

MutS se váže ve formě homodimeru na nespárovanou bázi. MutS-DNA komplex váže

homodimer MutL. MutS-MutL komplex vytváří na dsDNA smyčku za spotřeby ATP. Za

pomocí MutH je rozpoznáno nemethylované vlákno DNA a rozstřiženo endonukleázou na 5´-

konci nemetylované sekvence GATC. Tato sekvence může být až 1000 bazí vzdálená od

místa nespárovaných bazí. Po vzniku nicku (nastřižení) odstraní exonukleáza ve spojení

s proteinem UvrD (helikáza) nastřižené vlákno až po 3´-konec nespárovné sekvence.

Odstraněné vlákno je znovu syntetizováno dle templátové methylované DNA Pol III a

spojeno pomocí DNA ligázy. MMR systém eukaryot je mnohem komplikovanější než

popsaný systém, především z ohledu na počet zůčastněných proteinů.

4.4. SOS odpověď

Fyzikálně-chemické vlivy (alkylační činidla, UV záření, zesíťovací činidla atd), které

v buňkách vyvolávají modifikace DNA, způsobují v buňkách bakterie E.coli řadu procesů,


Strana 39

které jsou známy jako tzv. SOS odpověď. V tomto stavu se bakterie přestane dělit a spustí se

řada reparačních mechanismů.

Podstatou této reakce buněk je dána funkcí tzv. proteinu RecA, který se za

normálních podmínkách podílí na procesech rekombinace DNA. V případě zvýšené dávky

výše zmíněných stresorů, které modifikují či poškozují DNA, způsobuje tento protein

rozštěpení specifické sekvence proteinu LexA. Tento krok je zahájen vazbou RecA na

ssDNA, která se v případě poškození DNA může v buňce objevit. LexA je represorem 43

genů, které kódují proteiny důležité pro reparační mechanismy DNA a kontrolují dělení

buňky. Všechty tyto geny obsahují tzv. SOS box, 20 nukleotidovou sekvenci bazí, která

funguje jako operátor (tj. váže represor a blokuje/zahajuje transkripci) (Obr.143). LexA tedy

za normálních okolností inhibuje expresi SOS genů vazbou na SOS box a inhibicí činnosti

RNAP. Jakmile se však v buňce objeví ssDNA zlomy, dojde k vyvázání a aktivaci proteinu

RecA, který aktivuje rozštěpení a tím i deaktivaci proteinu LexA. Dodjde tak k uvolnění

operátorů a zahájení transkripce SOS genů. Po reparaci poškozené DNA činností SOS

proteinů RecA přestane navozovat lýzy LexA, ten nasedne a blokuje SOS box a celý proces

se může opakovat.

4.5. Reparace dvojřetězcových zlomů (double strand breaks repair, DSB repair)

Dvojřetezcové zlomy DNA (DSB) vznikají expozicí DNA ionizujícímu záření a volnými

radikály, které vznikají jako vedlejší produkt metabolismu buňky. Navíc, DSB jsou

normálními intermediáty DNA v přirozených procesech, jako je meióza a tzv. V(D)J

rekombinace v lymfatických buňkách, která napomáhá vytvářet rozsáhlou diverzitu antigen-

vázajících míst protilátek a receptorů T-buněk. Neopravené DSB mohou být pro buňku

letální, či mohou způsobovat vznik rakoviny. Z tohoto důvodu jsou opravné mechanismy

DSB esenciální pro život buňky. Buňky mají ve své podstatě dvě odlišné

strategie/mechanismy reparace DSB. Tzv. rekombinační reparace a tzv. non-homologní

rekombinace konců (NHEJ – nonhomologous end-joining repair). Homologní rekombinace je

diskutována v samostatné kapitole. V případě NHEJ mechanismu se jedná o způsob ligace

DSB, ve kterém musí být nejdříve konce přerušené DNA nalezeny, jejich konce nastaveny do

správné, tj. komplementární polohy, či zanořeny do sebe tak, aby byly nalezeny

komplementární sekvence a následně musí dojít k ligaci (Obr.144). U eukaryot je celý proces

zahájen pomocí proteinu Ku, který se nachází v buňce v hojném množství a má schopnost

vazby do místa DSB na poškozené DNA (Obr.155). Komplex Ku-DNA má schopnost


Strana 40

dimerizace, tj. spojení obou konců DSB. Toto spojení poskytuje možnost opětovného spojení

řetězců díky činnosti DNA ligázy IV a proteinu Xrcc4.

4.6. Identifikace karcinogenních látek

Řada forem rakoviny je způsobena expozicí organismů skupině látek, která je známa pod

názvem karcinogeny. Odhaduje se, že přibližně 80% forem lidské rakoviny je způsobeno

právě těmito látkami. Existuje řada důkazů, že primárním účinkem těchto látek je poškození

DNA. U bakterií tyto látky velmi často způsobují navození SOS reakce a vznik mutací.

Existuje velmi úzká souvislost mezi mutagenezí a karcinogenezí. V současnosti je známo

více jak 60 tisíc chemických látek, které se využívají v průmyslu. Jelikož není technicky

možné toto množství látek prozkoumat na mutagenní a karcinogenní účinky standardními

metodikami, jako je např. testování na zvířatech, využívají se často testy na mutagenní účinky

pomocí jednodušších organismů, jako je bakterie Salmonella typhimurium. Z míry

mutagenních účinků je pak odhadnuta i míra potenciálních karcinogenních účinků, které se u

dané látky mohou objevit. Nejběžnejší je tzv. Amesův test, kdy tato bakterie, která je tzv. his-,

tj. nemá schopnost syntézy histidinu a nemůže tedy růst na médiu bez přítomnosti histidinu, je

kultivována v přítomnosti potenciálního mutagenu. Pokud daná látka projevuje mutagenní

účinky, dochází k změně bakterií z his- na his+ a tím i schopnosti těchto buněk růst na médiu

bez dodaného histidinu. Množství revertantů, tj. množství narostlých kolonií na petriho misce

v porovnání s množstvím spontánních revertantů poskytuje informaci o míře mutagenicity

stanovené látky (Obr.155). Řada látek, u kterých byla pomocí Amesova testu identifikována

vysoká mutageneze, byla později ověřena i pro vysoké karcinogenní účinky na testech se

zvířaty. Patří sem nejen látky, které jsou synteticky připravené, ale i řada velmi nebezpečných

přírodních látek, jako je např. aflatoxin a celá řada dalších mykotoxinů (Obr.166).


Strana 41

5. TRANSKRIPCE

Exsitují tři druhy RNA, které se účastní translace. Ribozomální RNA (rRNA), transferová

RNA (tRNA) a mediátorová RNA (mRNA). Všechny tyto RNA jsou syntetizovány na

základě DNA templátu procesem transkripce (přepisu). Centrální role RNA ve spojení

s nukleo-proteinovými komplexy - ribozómy při překladu informace v proteosyntéze byla

navržena již ve 30.letech 20.st. J. Brachetem. Tato hypotéza byla stvrzena formulací tzv.

centrálního dogmatu molekulární biologie F. Crickem v roce 1958.

5.1. Role RNA v syntéze proteinů

Role mRNA v proteosyntéze byla navržena na základě studia indukce exprese proteinů u

jednoduchých organismů – bakterií. V následujícím textu jsou shrnuty některé klasické

experimenty, které vedly k objevu mRNA. Na těchto pokusech bylo ukázáno, že indukce

tvorby proteinů je důsledkem regulace syntézy mRNA pomocí proteinů, která se specificky

váží na templátovou DNA, ve které je mRNA kódována.

Bakterie E.coli je schopná syntetizovat okolo 4300 různých polypeptidů v obrovském

počtu kopií (např. ribozomální proteiny i v 10tis. kopiích v 1 buňce), popř. i ve velmi malém

počtu kopií (regulační proteiny, i méně jak 10 kopií na 1 buňku). Tzv. konstitutivní proteiny

jsou syntetizovány neustále ve stejném množství, neboť zajišťují základní životní funkce

buňky, tj. patří mezi skupinu tzv. „housekeeping genes“. Naproti tomu enzymy, které jsou

syntetizovány v proměnlivém množství, se nazávají inducibilní, či adaptabilní enzymy. Ty

jsou syntetizovány pouze za určitých okolností, tj. dle aktuální potřeby buňky.

Bakterie jako E. coli syntetizují enzym pro příjem substrátů pouze tehdy, pokuď tento

substrát je přítomen v médiu. Např. enzym β-galaktozidáza je syntetizován pouze v případě,

že v kultivačním médiu se nachází substrát tohoto enzymu, disacharid (např. laktóza). Pokud

se tak stane, enzym rozštěpí tento disacharid na dva monosacharidy, galaktózu a glukózu

(Obr.177). Jiné proteiny, tzv. galaktosid permeáza (nebo také laktóza premeáza) transportuje

laktózu do buňky. E. coli, která roste bez laktózy v médiu, obsahuje pouze minimální (< 5)

těchto přenašečů v membráně. Jakmile však je do média laktóza přidána, během několika

málo minut dojde k obrovskému nárůstu syntézy těchto proteinů (až 1000krát) a udržuje tento

stav dokud není laktóza z média vyčerpána. Následuje návrat hodnot počtu a aktivit těchto


Strana 42

enzymů na tzv. bazální hladinu (úroveň) (Obr.178). Tato obecná vlastnost bakterií –

schopnost syntetizovat enzymy a proteiny ke zpracování substrátu jen v jeho přítomnosti –

jsou důležitou adaptací bakterií na velmi proměnlivé podmínky jejich životního prostředí.

Umožňuje jim provádět syntézu jen skutečně potřebných enzymů a proteinů v daném místě a

čase. Laktóza tedy musí nějakým mechanismem indukovat syntézu příslušných enzymů.

Tento typ molekul se také nazývá induktor. Přirozený induktor laktózového systému je

laktózový izomer, 1,6-allolaktóza, která se vždy vyskytuje v roztoku laktózy v určitém, avšak

minimálním množství. V umělých podmínkách se jako induktor využívá především

syntetický analog laktózy, tzv. isopropylthiogalaktosid (IPTG), který není metabolizován β-

galaktozidázou. Geny zodpovědné za kódování a regulaci produkce β-galaktozidázy,

galaktóza permeázy a thiogalaktosid transacetylázy (další protein, jehož funkce však není

známa) se označují jako Z+, Y+ a A+. Tyto geny, společně s kontrolními elementy P a O

vytváří genetickou jednotku, označovanou jako operon, konkrétně lac operon (Obr.179).

Důležitými experimenty, které vedly k objasnění struktury a funkce lac operonu E.

coli byly provedeny tzv. konstitutivní mutací. Tato mutace způsobuje nadměrnou syntézu lac

proteinů bez přítomnosti induktoru. Tato mutace mutace je provedena v úseku I, která je

lokalizovaná blízko lac enzymových kódujícícho oblastí na DNA. Povaha tohoto úseku byla

objasněna tzv. PaJaMo experimentem (Obr.180), který provedl A. Pardee, F. Jacob a J.

Monod v roce 1959 a který využil jevu tzv. bakteriální konjugace (vysvětlení pojmu viz Maly

J.: Opory studia mikrobiologie) (Obr.181). V tomto experimentu byly Hfr bakterie

s genotypem I+Z+ skříženy s F- kmenem s genotypem I-Z- v nepřítomnosti induktoru pro β-

galaktozidázu. Do 1 hodiny po zkřížení bakterií bylo možné v F- kmenu zaznamenat vysoké

množství aktivní β-galaktozidázy, přestože nebyl přítomen induktor. Tento jev lze vysvětlit

tak, že Z+ gen, který se dostane do I- buňky, začne ihned syntetizovat β-galaktozidázu

v konstitutivním množství. Teprve po určité době, kdy I+ pocházející z F+ buňky měl dostatek

času pro svou expresi, došlo k inhibici tvorby β-galaktozidázy v F- buňkách. Závěr z tohoto

experimentu byl takový, že I+ je zodpovědný za syntézu difuzibilního produktu, který funguje

jako tzv. lac represor (v tomto případě se jedná o protein), tj. inhibuje tvorbu β-galaktozidázy

(a tedy transkripci lac operonu). Induktory jako je IPTG dočasně inaktivují lac represor. I-

buňky využité v experimentu produkovaly konstitutivně β-galaktozidázu, neboť neobsahovaly

represor. Obdobně jako byl objeven lac represor, byl objeven i tzv. O gen, který má schopnost

kontrolovat expresi Z genu na jenom chromozómu.


Strana 43

Popsané experimenty vedly k vytvoření hypotézy, že strukturální geny DNA jsou

transkribovány do komplementárních řetězců mRNA. Ta je pak v součinnosti s ribosomy

odpovědná za syntézu polypeptidických řetězců. Tyto hypotézy vysvětlovaly působení

induktoru a represoru lac systému. Koordinovaná (simultánní) syntéza všech lac enzymů

spočívá ve faktu, že jsou kontrolovány jedním operátorem, tj. vzniká tzv. polycistronická

mRNA, která obsahuje všechny transribované lac geny (cistron je zastaralé označení genu).

Kontrolní sekvence, jako je např. O gen, mohou kontrolovat pouze geny na téže DNA, na

které se nachází. Tento typ sekvencí se nazývá cis-působící elementy. Geny jako gen I, které

produkují difusibilní regulační produkty a které mohu ovlivňovat i různé vlákna DNA, se

nazávají trans-působící faktory.

5.2. RNA polymeráza

RNA polymeráza (RNAP) je enzym zodpovědný za DNA-dependentní syntézu RNA (tj.

templátem je DNA), který byl nezávisle objeven v roce 1960 S. Weissem aj. Hurwitzem.

Enzym navzájem spojuje ribonukleosid trifosfáty ATP, CTP, GTP a UTP na podkladě DNA

templátu v reakci, která je poháněna energií uvolněnou při hydrolýze PPi. Všechny buňky

obsahují RNAP. V bakterií jeden typ RNAP syntetizuje všechny RNA (vyjma RNA primerů

pro replikaci DNA). Mnoho bakteriofágů kóduje specifické RNA polymerázy, které jsou

fágově specifické. Eukarytní buňky obsahují 4-5 RNAP, které syntetizují rozdílné skupiny

RNA. RNAP bakterie E.coli je tvořena tzv. holoenzymem, skládajícím se z podjednotek

α2ββ´ωσ (Obr.182). Jakmile dojde k iniciaci transkripce, sigma (σ) podjednotka, která se také

označuje jako tzv. sigma (σ) faktor oddisociuje od jádra enzymu, kterým je α2ββ´ω a které je

zodpovědné za samotnou polymeraci. Holoenzym se na DNA váže v několika fázích, které

zahrnují vazbu templátu; iniciaci transkripce; elongaci a terminaci.

5.3. Vazba templátu

Syntéza RNA je zahájena vždy jen na specifickém místě DNA, zvané promotor. Ten je

rozpoznán specifickým sigma faktorem. Existence promotorů byla objevena studiem sekvencí

v okolí některých genů (např. pro lac enzymy), přičemž mutace v těchto sekvencích

ovlivňuje úroveň transkripce enzymů. Genetické mapování těchto sekvencí ukazuje, že se

jedná o přibližně 40-bp úseky lokalizované na 5´- konci od startu transkripce (konvencí bylo

dohodnuto, že nukleotid, od kterého začíná transkripce se označuje indexem +1, přičemž

znaménko plus označuje směr transkripce, tedy pohybu RNAP. Promotor se nachází nalevo

od +1 sekvence a je značen indexem se záporným znaménkem, např. -35). Holoenzym vytváří


Strana 44

velmi pevné komplexy s promotory (disociační konstanta K ≈ 10-14 M) přibližně v oblasti od

-20 do +20, kde jej brání působení DNázy I. Sekvenací promotorů v těchto oblastech byly

získány tzv. konsensus sekvence E.coli (Obr.183). Nejvíce konzervované (tj. opakující se u

různých promotorů) sekvence se nachází v oblasti -10 nukleotidu ve formě hexameru, tzv.

Pribnowův box (D. Pribnow 1975). Jedná se o sekvenci TATAAT. Další oblast

s konservovanými sekvencemi je tzv. -35 oblast, která je charakterizovaná sekvencí

TTGACA. Sekvence mezi -10 a -35 není důležitá z hlediska sklatby, ale kritická je její délka

(16-19 bp). V určitých případech je iniciační nukleotid v +1 místě tvořen A nebo G. U

některých promotorů je navíc přítomný tzv. upstream promotorový element (UP) v oblasti -40

až -60, který váže C-terminální doménu α-podjednotky RNAP. Tento element se nachází

nejčastěji v blízkosti genů pro ribozomální RNA. Míra (rychlost) s jakou je transripce

prováděna je závislá na stabilitě komplexu RNAP holoenzymu a promotoru. Mutace, které

způsobí změny v síle této vazby se nazývají jako „up“ a „down“ mutace. Vazbou holoenzymu

na promotor a alkylací nevázané DNA (metoda DMS footprinting) bylo možné odhalit

sekvence promotoru, které RNAP překrývá. Ve většině případů se jedná o -10 a -35 sekvenci

na stejné straně B-DNA, tzn. že holoenzym váže DNA z jedné strany. Dále bylo prokázáno,

že činností holoenzymu dochází k rozštěpení dsDNA vlákna v 14 bp sekvenci se symetrií

kolem -10 sekvence, tj. s přesahem do transkribované oblasti. Jádro RNAP váže nespecificky

velmi silně dsDNA nezávisle na sekvenci (K = 5 × 10-7 M). Teprve navázání příslušného

sigma-faktoru (tj. sestavení holoenzymu) způsobí snížení této nespecifické vazby (K ≈ 10-7

M) a zvýšení specifické vazby k promotoru. Sigma faktor tak napomáhá RNAP nalézt

správný promotor popojížděním holoenzymu po dsDNA a jeho zastavením na správném

místě. Jakmile je sigma faktor po zahájení transkripce uvolněn, jádro nabude opět silné

nespecifické vazby na dsDNA a tím dojde ke stabilizaci RNAP na transkribované DNA.

5.4. Iniciace transkripce

5´-konec prokaryotní RNA je téměř vždy tvořen purinem, přičemž nejčastěji jde o A

(následuje v četnosti G). Iniciace transkripce je vpodstatě založena na spojení dvou nukleosid

trifosfátů fosfodiesterovou vazbou. Na rozdíl od DNA replikace tedy iniciace nevyžaduje

přítomnost primeru. Bakteriální RNA tedy obsahují na 5´- konci trifosfátovou skupinu.

Obtížnost s rozštěpením dsDNA vlákna holoenzymem povrzuje fakt, že velmi často se po 2-

12 nasyntetizovaných nukleotidech jejich další syntéza přeruší a z enzymu odchází krátké

oligonukleotidy. Holoenzym se však neodpoutá od komplexu s promotorem a znovu se


Strana 45

pokouší o iniciaci. Tento jev se nazývá abortivní transkripce. Pokud se rozštěpení dsDNA

podaří, je zahájena kontinuální (procesivní) transkripce, která vede k prodlužování vlákna

RNA. V tomto okamžiku oddisocijuje σ faktor z holoenzymu a může vytvořit nový iniciační

komplex s dalším jádrem RNAP.

RNAP je velmi komplexní struktury. U E.coli dosud nebyla definitivně určena.

Krystalografické studie však byly provedeny v jiném případě – na holoenzymu a jádře RNAP

Thermus aquaticus (Taq) (Obr.184). Rentgenová krystalografie komplexu DNA-RNAP

ukazují složitý mechanismus vazby nukleové kyseliny, které se účastní několik podjednotek

holoenzymu za aktivní účasti iontů Mg2+ a Zn2+ (Obr.185 a 186). Antibiotikum rifamycin B

produkovaný Streptomyces mediterranei a syntetický derivát rifampicin specificky inhibují

prokaryotní RNAP (ale nikoliv eukaryotní RNAP). Tato antibiotika jsou velmi účinná a

využívají se k léčbě infekcí gram-pozitivními bakteriemi a tuberkulózy. Rifamycin se váže do

podjednotky β, příčemž brání přechodu RNAP z fáze iniciace do elongace. Navázaná RNAP

na promotoru brání ostatním RNAP zahájení transkripce a tím dochází k poškození funkce

buňky. Mechnismus inhibice je znám. Antibiotikum navázané do podjednotky β ze sterických

důvodů zabraňuje elongaci – prodlužování syntetizované RNA. Místo jeho účinku je

sekvenčně odlišné od stejných podjednotek na RNAP eukaryot, což vysvětluje specifitu

inhibice.

5.5. Elongace

Studie s přídavky radioaktivně značených nukleotidů a sledování jejich fixace v narůstajících

řetězcích RNA potvrdila, že směr syntézy RNA je orientován ve směru 5´-3´ vznikajícího

řetězce, tj. obdobně, jako v případě replikace DNA. Toto zjištění bylo dále potvrzeno faktem,

že antibiotikum cordycepin, analog adenosinu postrádající 3´-OH skupinu inhibuje RNA

syntézu. Pokud je tato molekula začleněna do řetězce (v případě syntézy ve směru 5´-3´) je

zamezena další elongace RNA v důsledku nemožnosti napojení dalšího nukleotidu.

Elongace RNA vyžaduje, aby dsDNA řetězec byl rozevřen z důvodu odhalení bazí

templátové DNA pro syntézu komplementární RNA. V průběhu elongace je tak tvořen na

přechodnou dobu heteroduplex RNA-DNA v tzv. transkripční bublině. Tato struktura, která

vzniká v průběhu iniciace v holoenzymu RNAP, je posouvána ve směru pohybu současně

s RNAP (Obr.187). Teoreticky se toto může uskutečnit dvěma možnými způsoby. V prvním

případě dochází k pohybu RNAP po vlákně dsDNA tak, že RNAP se obtáčí souhlasně

s templátovým vláknem, tj. shodně s orientací helixu. Vzniklá RNA se obtáčí kolem dsDNA a


Strana 46

na templátové DNA nedochází k vzniku superhelicity. Tento model je nepravděpodobný,

neboť vzniklá RNA by se nemohla od dsDNA samovolně oddělit. Druhá možnost spočívá

v principu, kdy RNAP se neotáčí kolem dsDNA, ale naopak, RNAP svým dopředným

pohybem před sebou hrne otáčky DNA, která rotuje. Rotaci se podařilo experimentálně

povrdit v umělých podmínkách. Je pochopitelné, že namísto skutečné rotace v in vivo je

navozená superhelicita relaxována pomocí topoisomeráz a gyráz. RNA je v tomto případě

elongována volně do prostoru a není navinuta na dsDNA. V případě selhání funkce těchto

enzymů dochází k zastavení transkripce nahromaděním otáček dsDNA, které vytváří přílišné

negativní napětí na vlákně DNA zamezující postupu transkripční bubliny a zastavení

transkripce.

Rychlost transkripce in vivo je přibližně 20 až 50 nukleotidů za sekundu při 37°C u

bakteri E.coli. Jakmile je zahájena elongace transkripce a promotor je tedy uvolněn, dojde

inhed k sestavení nové RNAP a proces iniciace a elongace se může opakovat. V případě

RNA, které je třeba syntetizovat ve velkém množství, jako např. rRNA, dochází k opakované

iniciaci přibližně jedenkrát za sekundu (Obr.188). RNAP na rozdíl od DNAP nemá korekturní

aktivitu, tj. nemá schopnost štěpit nasyntetizované vlákno RNA v případě vazby nesprávného

nukleotidu do řetězce exonukleázovou aktivitou. Tento fakt je příčinou daleko vyššího počtu

chyb vnášených do RNA – přibližně 1 špatně vložená báze na ≈ 104 transkribovaných bazí.

Zvýšení chyb se z hlediska funkce buňky zpravidla vůbec neprojeví v důsledku několika faktů

– každý gen je opakovaně transkribován; genetický kód obsahuje řadu synonymních kodonů

(kodony kódující stejnou aminokyselinu); záměna jedné aminokyseliny se na funkci proteinu

většinou neprojeví; velká část eukaryotních RNA je po transkripci vystřižena (úprava

primárního traskriptu, tzv. splicing).

5.6. Terminace transkripce

DNA obsahuje specifická místa, kde je transkripce terminována. Transkripční terminační

sekvence genů E. coli jsou typické mnoha společnými rysy. Obsahují 4-10 sekvencí AT na

templátovém řetězci. RNA je terminována na této sekvenci nebo těsně za ní. Za AT sekvencí

proti směru transkripce se nachází palindromická (dvoustranně souměrná) GC sekvence.

Transkribovaná RNA tak může na svém konci vytvořit vlásenkovitou strukturu zakončenou

krátkou sekvencí několika U (Obr.189). Stabilita této vlásenky na syntetizované RNA a velmi

slabá vazba sekvence uracilů k templátové AT sekvenci je pravděpodobně velmi důležitým

faktorem, který způsobuje ukončení (terminaci) transkripce. Vytvoření vlásenky na RNA

způsobí krátké zastavení (několik sekund) RNAP na terminačním místě. Tento okamžik


Strana 47

zřejmně napomůže vytlačení RNA vázané oligo(U) koncem na templátové DNA pomocí

komplementární DNA v transkripční bublině a tím terminaci. Tuto hypotézu potvrzují

výsledky studia bodových mutací v sekvencích vlásenky, či krátkého oligo(U) řetězce, které

téměř vždy vedou k neschopnosti ukončit trankripci na terminační sekvenci templátové DNA.

Jiný model předpokládá, že terminace je umožněna především povahou interakce RNA-

RNAP. RNA je pravděpodobně svázána s RNAP ve dvou místech a právě vytvoření

terminační vlásenky jednu z těchto vazeb porušuje, což v důsledku znamená odpojení RNA

od templátové DNA a terminaci.

Výše zmíněné způsoby terminace jsou spontánní a závislé na existenci terminačních

sekvencí. Ve skutečnosti pouze přibližně polovina terminačních mít kóduje vlásenku a oligo

(U) řetězce. V těchto případech je k terminaci vyžadována aktivita tzv. proteinu Rho (Rho

faktor). Rho faktor, hexamerní protein se známou strukturou (Obr.190), zvyšuje efektivitu

spontánní terminace a zároveň je zodpovědný za terminaci transkriptů bez terminační

vlásenky. Rho protein je ve své podstatě helikáza, schopná oddělovat helixy RNA-DNA a

RNA-RNA za spotřeby ATP. Genetické studie ukázaly nutnost existence speciálních

rozpoznávacích sekvencí (80-100 nukleotidů, vysoký obsah C, nízký G) na RNA před

terminačním místem, které jsou nutné k Rho dependetní terminaci. Rho faktor se tedy

pravděpodobně váže na nascentní (právě vznikající) RNA v místě rozpoznávací sekvence,

migruje po RNA ve směru 5´-3´, tj. směrem k RNAP, dokud RNAP nedostihne v okamžiku,

kdy transkripční komplex je zastaven na terminačním místě. Rho protein následně rozvine

RNA-DNA duplex v transkripční bublině RNAP a uvolní RNA transkript. Trankripce je tedy

ukončena.

5.7. Eukaryotní RNA polymerázy

Jádro eukaryotní buňky obsahuje tři různé typy RNA polymeráz, které se liší způsobem,

jakým syntetizují RNA. RNA polymeráza I (RNAP I, RNAP A) se nachází v jadérku (hustá

struktura v buněčném jádře, která obsahuje ribozomální geny) a syntetizuje většinu

prekurzorů ribozomálních RNA (rRNA). RNA polymeráza II (RNAP II, RNAP B) se nachází

v nukleoplazmě a syntetizuje mRNA. RNA polymeráza III (RNAP III, RNAP C) se rovněž

nachází v nukleoplazmě a syntetizuje prekurzory 5S ribozomální RNA, tRNA, řadu malých

jaderných RNA (snRNA) a cytozolických RNA. Mimo klasické jaderné RNAP se v eukarytní

buňce nachází RNAP i v mitochodriích a chloroplastech (u rostlinných buněk). Tyto RNAP

jsou velmi jednoduché a podobají se RNAP některých bakteriofágů. Eukaryotní RNAP jsou

daleko komplexnější než polymerázy prokaryot, o čemž svědčí i vysoká variabilita a počet


Strana 48

funkčních pojednotek (Obr.191). Některé z těchto podjednotek jsou homologické

k podjednotkám α,β, a ω prokaryotní RNAP, avšak k nim se přidávají další, u prokaryot

chybějící proteiny. Z celkem 12 podjednotek RNAP II je 10 sekvenčně velmi podobných

podjednotkám RNAP I a III a navíc, sekvence těchto 10 podjednotek je vysoce kozervována

od kvasinek až po člověka (Obr.192). Aktivaci RNAP II (tj. přechodu z iniciace do elongace)

předchází fosforylace C-terminální domény podjednotky β´ (tzv. CTD doména). CTD může

být reverzibilně fosforylována/defosforylována pomocí CTD kináz/fosfatáz. Na rozdíl od

RNAP holoenzymů prokaryot, RNAP eukaryot nejsou samy o sobě vázány těsně na dsDNA.

Tato vazba je jim propůjčena až po utvoření mediátorového komplexu s transkripčními

faktory, které řídí sestavení RNAP na promotoru transkribovaného genu.

Krystalografická studie eukaryotní RNAP izolované z kvasinek a provedená R.

Kornbergem potvrdila vysokou míru podobnosti s již zmíněnou Taq RNAP. RNAP II je o

trochu větší komplex z více podjednotek, který váže dva Mg2+ ionty v aktivním místě, které

jsou pravděpodobně zodpovědné za katalýzu elongace RNA vlákna, obdobně jako u DNAP.

Povrch RNAP II je negativně nabit, vyjma pozitivně nabitého žlábku, do kterého se váže

DNA. Mechanismus translokace RNA-DNA duplexu v průběhu elongace je zobrazen na

Obr.193 a 194. dsDNA je vnořena do RNAP tunelem mezi tzv. „můstkem“ a „svorkou“ a

unvitř se stáčí v 90° úhlu, a vychází místem „exit“. V místě stočení dochází ke vzniku RNA-

DNA duplexu a syntéze RNA řetězce v aktivním místě s Mg2+. Translokace (posun řetězce

dsDNA o 1 nukleotid k umožnění čtení následujícího nukleotidu) je pravděpodobně

způsobena pravidelnými konformačními změnami helixu podjednotky Rpb1, která vytváří

„můstek“ nespecificky interagující s templátovou DNA. Známým inhibitorem transkripce, tj

RNAP III a RNAP III je skupina toxinů, které se nazývají amatoxiny (na ostatní RNAP

nepůsobí). Tyto toxiny jsou přítomné v jedovaté houbě Amanita phalloides (5-6 mg amanitinu

je letální dávka pro člověka). Nejběžnější z nich, tzv α-amanitin má schopnost mnohotisíckrát

zpomalovat transkripci vazbou a inhibicí RNAP (transkripce pouze jednotky nukleotidů za

minutu). Krystalografickou analýzou bylo identifikováno místo vazby α-amanitinu v tzv.

„trychtýři“, tj. části RNAP, kudy se do aktivního místa dostávají NTP k syntéze RNA.

Inhibiční účinek však pravděpodobně spočívá v inhibici konformačních změn „můstku“, tj.

zpomalení nebo zastavení translokace a nikoliv ve snížení průchodnosti či změnou afinity pro

NTP.

5.8. Struktura promotorových sekvencí eukaryot


Strana 49

Jelikož valná většina sekvencí rRNA v eukaryotním chromozómu si je velmi podobná, RNAP

I rozpoznává pouze jeden promotor, tj. tento enzym rozpoznává pouze tento jeden specifický

promotor a z tohoto důvodu není RNAP I schopná provádět transkripci jiných něž rRNA.

Mutační studie (studium vlivu mutací v promotoru) ukázaly, že pro vazbu RNAP I do

promotorů genu pr rRNA je nezbytně nutná existence tzv. jaderného promotorového

elementu, který se nachází mezi -31 až +6 nukleotidem. Navíc, k zvýšení úrovně transkripce

je vyžadována sekvence (horní kontrolní sekvence) bohatá na G a C lokalizována daleko před

vlastním promotorem (-187 až -107) (upstream promotor element). Tyto sekvence jsou

místem vazby traksripčních faktorů, který dirigují sestavení funkční RNAP I na promotoru.

Promotory RNAP II jsou mnohem delší a více diverzifikované, než v případě

prokaryot. Navíc, jejich struktura ještě nebyla detailně popsána. Strukturální geny, které

kódují tzv. housekeeping genes, tj. geny, které jsou exprimovány ve všech typech buněk

v organismu a které jsou zodpovědné za udržení základních životních funkcí buňky, mají

vždy jednu nebo více kopií GGGCGG sekvence (GC box), lokalizované před +1 nukleotidem.

Mutační analýzou bylo zjištěno, že tyto GC boxy fungují obdobně jako prokaryotní

promotory. Naproti tomu strukturální geny, které jsou syntetizovány pouze za určitých

okolností (pouze u určitých typů buněk) obsahují spíše AT bohaté sekvence lokalizované 25

až 30 bp před +1 nukleotidem. Tento tzv. TATA box je velmi podobný -10 sekvenci

prokaryot (TATAAT). Role TATA boxu však na rozdíl od prokaryot není naprosto esenciální

pro zahájení transkripce, jeho delece vede k zpomalení, nikoliv k úplnému zastavení

transkripce genu (Obr. 193). Mimo TATA box se na těchto typech promotorů vyskytují i

další regulační sekvence, tentokráte v oblasti -50 až -110. Například globinové geny obsahují

konsensus sekvenci, tzv. CCAAT box, v oblasti vymezené -70 a -90 nukleotidem a dále další

horní kontrolní sekvenci – CACCC box lokalizovanou ještě před ní. Je evidentní, že tyto

sekvence se výraznou měrou podílejí na sestavení funkční RNAP II.

Jedním ze zajímavých a dosud neobjasněných faktů je existence kontrolních

elementů, které nemají fixovanou pozici vzhledem k počátku transkripce a vyskytují se na

řetězci poměrně v náhodné poloze, často velmi vzdálené od +1 (i několik tisíc bp). Tyto

elementy nejsou nezbytné pro vlastní transkripci – jejich delece sice ovlivní míru činnosti

RNAP, ale nezastaví ji úplně. Z tohoto důvodu se tyto genové elementy nazávají enhancery

(zesilovače). Tyto zesilovače jsou nezbytné pro zajištění maximální aktivity příslušných

promotorů. Je prokázáno, že tyto genetické elementy jsou rozpoznávány řadou transkripčních

faktorů, jejichž vazba stimuluje sestavení funkční RNAP II na příslušném promotoru. Tato

funkce je zajištěna vytvářením smyček dsDNA mezi promotorem a enhancerem, přičemž


Strana 50

jejich vazba a fixace se vznikající RNAP II je zprostředkována pomocí transkripčních faktorů.

Enhancery tedy do značné míry ovlivňují selektivní expresi genů v eukaryotních

organismech.


Strana 51

6. REGULACE EXPRESE GENŮ NA ÚROVNI TRANSKRIPCE U PROKARYOT

Prokaryta musí být schopny rychle reagovat na skokové změny vnějšího prostředí, jako je

například tok živin, rychlou syntézou příslušných přenašečových proteinů a enzymů. Tento

proces přitom trvá pouze několik málo minut, neboť proces transkripce a translace je velmi

těsně spjat (Obr.194). Ribozómy začíjí translatovat vznikající mRNA od 5´-konce

v okamžiku, jakmile je tento konec vlákna uvolněn z RNAP. Navíc, většina mRNA prokaryt

je velmi rychle (do 1-3 min. po syntéze) degradována nukleázami, aby nedocházelo k tvorbě

nepotřebných proteinů a zbytečné spotřebě energie. 5´-konec mRNA je tak často degradován

dříve, než dojde k dosyntetizování 3´-konce řetězce. V kontrastu s prokaryoty, eukaryotní

buňky syntetizují nové proteiny velmi pomalu (hodiny až dny), zejména v důsledku

odděleného místa transkripce (jádro) a translace (cytoplasma), kdy vznikající mRNA musí být

dopravena skrze jaderné póry do místa translace. Navíc, eukaryotní buňky většiny

mnohobuněčných organismů jsou obklopeny stabilním prostředím a nejbouřlivější transkripce

probíhá v průběhu dělení buňky či její diferenciace. Regulace genové exprese se může

odehrávat na několika úrovních, z nichž regulace na úrovni transkripce je nejefektivnější.

Jelikož je tato regulace u eukaryot velmi složitá, v následujícím textu je věnována pozornost

pouze prokarytní regulaci. Regulace exprese u eukaryot bude součástí samostatné kapitoly.

6.1. Regulace transkripčními faktory

V přítomnosti vysoké koncentrace induktoru, dochází k rychlé transkripci lac operonu (viz

předchozí kap.). Lac represor, produkc lac I genu E.coli, je v konstrastu syntetizován ve velmi

malém množství, nepřevyšující 10 jednotek na 1 buňku. Příčinou tohoto stavu je velmi málo

efektivní (slabý) promotor genu lac I. Naproti tomu geny, které jsou transkribovány ve

velkém množství (intezitě) mají silný promotor a obsahují konsensus sekvence.

Regulace exprese u prokaryot je dobře prostudována v differenčních pochodech.

V průběhu differeciace buňky dochází k řízené změně exprese genů, která je kontrolována

pomocí speciálních proteinů, tzv. sigma faktorů (součást RNAP holoenzymu). Jedním

z modelových systémů je model bakteriofág-bakterie. Fág obsahuje soubor genů, které se

mohou dělit na tzv. ranné, střední a pozdní geny. Tzv. ranné geny se dostanou do bakterií

inhed na počátku infekce. Ty navodí v buňce řadu změn, které dále podpoří expresi středních

genů fága. V nich jsou kódovány proteiny, které umožňují expresi pozdních genů. Sekvenční

exprese těchto genů je umožněna pomocí syntézy tzv. kaskády sigma faktorů. Např. po


Strana 52

infekce bakterie Bacillus subtilis bakteriofágem SP01 dojde nejdříve k transkripci ranných

genů bakteriofága pomocí RNAP holoenzymu bakterie. Mezi proteiny těchto ranný genů je i

gen 28, která dává vznik sigma faktoru, označeného jako σgp28. Ten nahradí σ faktor bakterie,

který je přítomný v RNAP holoenzymu a zvyšuje tak afinitu RNAP k promotoru středních

genů bakteriofága. Obdobně, genový produkt středních genů, sigma faktor 33/34 (σgp33/34)

způsobuje po vazbě na RNAP transkripci pozdních genů bakteriofága. Bakterie B. subtilis

obsahuje mimo obvyklý sigma faktor σ70 i jiné sigma faktory, které jsou zodpovědné za

proces sporulace. V případě navození sporulace tak dochází v důsledku sekvenčních změn

v expresi navozených působením kaskádou příslušných sigma faktorů k přestavbě

metabolismu bakterie a vzniku spóry. Ta se jak morfologicky, tak z hlediska metabolismu liší

od normální vegetativní buňky.

Lac represor je tetramerní protein s vysokou afinitiou k IPTG (K = 10-6M).

V nepřítomnosti induktoru projevuje nejen nespecifickou afinitu k dsDNA, ale především

mnohem silnější specificku vazbu k lac operátoru. Je velmi pravděpodobné, že represor hledá

operátor popojížděním po dsDNA, na kterou se nespecificky váže. V případě, že narazí na

operátor, dojde k jeho zastavení a blokaci promotoru. Lac operátor je tvořen palidnromatickou

sekvencí 26 nukleotidů, který je společným znakem pro vazebné interakce řady proteinů

s dsDNA (Obr.195). Operátor se nachází mezi -7 a +28 sekvencí lac operonu. Jelikož RNAP

iniciační komplex je pevně vázán mezi -20 až +20 sekvencí, dochází k překryvu vazebného

místa s represorem. Navázaný represor způsobuje zvýšení kinetické bariéry pro přechod

RNAP z abortivní transkripce do procesivní transkripce (elongace).

6.2. Regulace katabolickou represí

Glukóza je jedním z nejdůležitějších substrátů bakterie E.coli. Její dostatek v médiu zamezuje

(inhibuje) expresi více jak 100 genů, které jsou zodpovědné za fermentaci mnoha látek, jako

je laktóza, arabinóza, galaktóza atd. Tento jev, kdy přítomnost jednoho substrátu navozuje

inhibici příjmu jiného substrátu se nazývá katabolická represe. Princip tohoto jevu byl

studován na souvislosti mezi hladinou cAMP v buňce E.coli a přídavky glukózy do média

(Obr.196). Zvýšení koncentrace glukózy má za následek pokles vnitrobuněčné koncentrace

cAMP, který je znám jako tzv. druhý posel v přenosu informace v živočišných buňkách. U

mutatntních buněk, postrádajících tento typ odezvy na přídavek glukózy, není přítomen tzv.

genový aktivační protein (CAP), který má schopnost vazby an cAMP za vzniku komplexu

CAP-cAMP. Jak bylo později prokázáno, komplex CAP-cAMP se váže na lac operon a


Strana 53

stimuluje transkripci v nepřítomnosti lac represoru. CAP je tedy příkladem pozitivní regulace

laktózového operonu, v protikladu k negativní regulaci navozenou lac represorem. Struktura a

funkce vazby CAP-cAMP na operon byla objasněna na molekulární úrovni (Obr.197). CAP

interaguje přímo s RNAP skrze C-koncovou sekvenci tzv. α-CTD podjednotky. Tato vazba

stimuluje zahájení iniciace RNAP na nejbližším promotoru. Navíc, α-CTD podjednotka se

nespecificky váže na dsDNA, zejména v oblastech se zvýšenou přítomností AT sekvencí.

Promotory, vážící CAP-cAMP komplex mohou být děleny do tří skupin. Třída I promotorů,

jakým ja např. lac operon, které vyžadují pouze vazbu CAP-cAMP k aktivaci transkripce.

Třída II promotorů, které rovněž vyžadují pouze přítomnost CAP-cAMP. Na rozdíl od

předchozí třídy však je jednoznačně definována poloha vazby CAP, tj. v oblasti -35

promotoru, tj. překryvem s vazbým místem pro RNAP (u přechozí třídy je místo vazby

různé). Třída III promotorů vyžaduje spolupůsobení více aktivátorů současně k maximální

stimulaci transkripce.

6.3. Regulace sekvenčně specifickými protein-DNA interakcemi

Jelikož genová exprese je regulována proteiny jako je CAP nebo lac represor, je velká

pozornost věnována otázce, jak tyto proteiny rozpoznávají jejich cílovou sekvenci na DNA.

Jelikož tyto proteiny zpravidla nemají schopnost rozštěpit dsDNA, jejich rozpoznávací

schopnost musí být determinována pouze těmi funkčními skupinami bazí, které přečnívají do

úzkého či širokého žlábku helixu dsDNA. Ze sterických důvodů se však uplatňuje především

široký žlábek, neboť úzký žlábek je těžko přístupný pro sekundární strukturu proteinů.

CAP dimer je tvořen dvěma symetricky uspořádánými helixy, které vycházejí

z proteinu a jsou vsazeny do dsDNA v místě širokého žlábku. Tyto dva helixy CAP proteinu

vytváří tzv. helix-turn-helix motiv (HTH motiv), který je konformačně blízký jiným HTH

motivům přítomným v bakteriálních represorů, jako je lac represor, trp represor, cI represor a

Cro proteiny bakteriofága λ. Všechny tyto typy HTH motivů jsou evolučně spjaté a váží

dsDNA podobným způsobem. Jedná se o cca 20 aminokyselinový polypeptid ve formě dvou

α-helixů, které jsou zkřížené ve 120° úhlu. Interakce mezi HTH a dsDNA je zprostředkována

pomocí postraních helixů vycházejících z druhého helixu HTH motivu, který se nazývá

rozpoznávací helix. Vazba HTH motivu na dsDNA a způsob rozeznání sekvence je velmi

komplexního charakteru, při které se uplatňuje řada strukturálních interakcí různé povahy,

především pak vodíkové můstky, solné můstky a van der Waalsovy interakce (Obr.198, 199).

Neexistují jednotná pravidla, která by ovlivňovala způsob interakce jednotlivých


Strana 54

aminokyselinových zbytků a bazí. Rekognice sekvence DNA je tedy dána souhrnem faktorů a

interakcí, které se podílí na vzájemné vysoké vazebné afinitě HTH motivu a DNA. Jiným

příkladem protein-DNA interakce je tzv. met represor (MetJ), který po vytvoření komplexu

s S-adenosylmethioninem (SAM) reprimuje tvorbu sebe sama a genů, zodpovědných za

syntézu methioninu a SAM. Krystalizací komplexu MetJ-SAM s dsDNA bylo zjištěno, že

tento represor se váže na palindromatickou sekvenci DNA pomocí symetricky uspořádaných

dvouřetězcových antiparalelních β-listů, které jsou vloženy do širokých žlábků rozpoznávané

dsDNA. Velká většina prokaryotních transkripčních regulátorů obsahuje stuktury obdobné

HTH motivu či podobné β-listu MetJ represoru. Naproti tomu eukaryotní stukturální motivy

jsou daleko více variabilní a řada z nich neobsahuje prvky symetrie, jako prokaryotních

motivů. Tyto motivy budou diskutovány v kapitole věnující se regulaci transkripce u

eukaryot.

6.4. Regulace araBAD operonu

Bakterie E. coli má schopnost metabolizovat pentózový cukr L-arabinózu. Tři z pěti enzymů,

které jsou využitelné k jejímu metabolickému zpracování jsou produkty operonu araBAD,

který podléhá katabolické represi. Tento operon obsahuje v horních sekvencích od +1

nukleotidu kontrolní místa, tzv. araI, araO1 a araO2 (Obr.200). AraI (místo pro vazbu

induktoru) se skládá ze dvou 17 bp míst, araI1 a araI2, které jsou lokalizovány v blízkosti -35

regulační sekvence promotoru. Obdobně i araO1 je složeno ze dvou sekvecí L a R. AraO2 je

lokalizována v nekódující oblasti -270, v blízkosti tzv. araC genu. Transkripce araBAD

operonu je regulována jak systémem CAP-cAMP, tak i tzv. proteinem vázajícím arabinózu,

AraC. Regulace araBAD operonu probíhá v několika stupních (Obr.201). V nepřítomnosti

AraC, RNAP provádí transkripci genu araC, zatímco araBAD operon je transkribován pouze

na bazální (konstitutivní) úrovni. Jakmile je přítomný AraC (ale zároveň je nepřítomná

arabinóza a CAP-cAMP), dojde k vazbě proteinu AraC na sekvenci araO2 a araI1 a zamezení

transkripce araBAD operonu (negativní kontrola). Vzdálenost obou regulačních sekvencí

napovídá, že dsDNA mezi nimi je vazbou proteinu AraC ohnutá do smyčky, což je

pravděpodobně příčinou zamezení transkripce. V případě přítomnosti arabinózy v médiu,

dojde k eliminaci vazby AraC na araI1 za současného zachování vazby na araO2. Tento fakt

dovolí rozvolnit smyčku a je zahájena transkripce araBAD operonu (pozitivní kontrola).

V případě nízkého obsahu glukózy v substrátu (velké množsví CAP-cAMP), dojde k k vazbě

CAP-cAMP na sekvenci mezi araO2 a araI1 a tím i snadnějšímu rozpletení smyčky. Zvyšuje

se tak afinita AraC k místu araI2. Vazba AraC-arabinóza komplexu do místa araO1


Strana 55

v nadbytku arabinózy blokuje přístup RNAP do do promotoru araC, tj. dochází k represi

tvorby AraC.

6.5. Regulace tryptofanového (trp) operonu atenuací

Atenuace je způsob regulace exprese na úrovni transkripce, který využívají některé bakterie

k regulaci operonů, zúčastňujících se biosyntézy aminokyselin. Tento způsob byl popsán na

příkladu tryptofanového operonu bakterie E. coli. Trp operon kóduje pět polypeptidů, které se

účastní syntézy tryptofanu. Tyto geny jsou kontrolovány trp represorem, dimerickým

proteinem genového produktu trpR (Obr.202). Trp represor váže L-tryptofan, přičemž vzniká

komplex, který se specificky váže na trp operátor (trpO) a snižuje tak míru transkripce až o

70 krát. Tryptofan tedy funguje jako tzv. korepresor, tj. jeho nadbytek jako koněčný produkt

biosyntézy negativně reguluje jeho vlastní syntézu. Trp represor navíc reguluje další dva

operony, trpR operon a aroH operon.

Působení trp represoru není jediným regulačním mechanismem transkripce

tryptofanového operonu. Ze sekvenčních analýz vyplývá, že trpE, prvnímu z genů v operonu,

předchází 162 nukleotidová sekvence, tzv. vedoucí sekvence (leader), označovaná jako trpL.

V případě, že množství tryptofanu je v buňce malé, dochází k syntéze polycistronické mRNA

včetně trypL sekvence. S nárůstem koncentrace tryptofanu je transkripce trp operonu

postupně inhibiována pomocí trp represoru-korepresoru. Přesto ale dochází k neustálé

produkci sekvence obsahující trpL. Nedochází tedy k naprostému zamezení transkripce, ale

k vytváření a terminaci nehotových transkriptů, které neobsahují geny pro translaci enzymů.

Tomuto způsobu kontroly transkripce se říká atenuace a kontrolnímu elementu, který ji

způsobuje atenuátor. Transkript atenuátoru obsahuje čtyři komplemenární segmenty, které

mohou vytvářet dva typy odlišných vlásenek (Obr.203). Tzv. segmenty 3 a 4 vytváří společně

normální, rho-nezávislý (viz rho závislá terminace terminace transkripce) transkripční

terminátor. Transkripce pokračuje velmi zřídka i za tuto terminační vlásenku. Přesto je část

segmentu 1 translatována za vzniku krátkého, z 14 aminokyselin tvořeného polypeptidu, který

obsahuje dva za sebou jdoucí tryptofany. Pozice těchto dvou aminokyselin ve vzniklém

řetězci je důležitým faktorem v mechanismu atenuace (Obr.204). Ten je započat RNAP, která

syntetizuje trpL mRNA. Jakmile dojde k syntéze tohoto krátkého řetězce mRNA, ihned

dochází k sestaven ribozomu na jejím 5´-konci a zahájení translace. V případě, že v buňce je

dostatek tryptofanu, je i dostatek tryptofanyl-tRNATrp (transferová RNA pro tryptofan

s navázaným Trp reziduem) a ribosom pokračuje v syntéze na segmentu 2, tj. blízko RNAP

přičemž blokuje vznik 2-3 antiterminační vlásenky a způsobuje vznik 3-4 terminační


Strana 56

vlásenky, která ukončí transkripci. Jakmile však není v buňce dostatek tryptofanu a tedy ani

tryptofanyl-tRNATrp, ribozom se zastaví na kodonu UGG pro tryptofan a umožní vznik

antiterminační vlásenky 2-3. RNAP tak není zastavena a pokračuje dále v transkripci trp

operonu, tedy všech genů nutných pro syntézu tryptofanu. Mimo tryptofanu se podobným

způsobem reguluje i syntéza histidinu, v tzv. his operonu a syntéza isoleucinu, leucinu a

valinu pomocí tzv. ilv operonu v bakterii E. coli. Oba tyto případy obsahují sekvence bohaté

na regulované aminokyseliny, které jsou kódovány v leaderových sekvencích peptidu.

Mechanismus atenuace je tedy velmi podobný (Obr.205).

6.6. Regulace syntézy rRNA za přísných podmínek (stringent response)

Buňky bakterie E.coli se za optimálních podmínek dělí každých 20min, což mimo jiné

znamená, že musí být schopna nasyntetizovat až 35 000 ribozomů na jeden buněčný cyklus.

RNAP je schopná zahájit transkripci ribozomální rRNA nejrychleji jednou za 1 s. Pokud by

tak buňky obsahovala pouze jednu kopii genu pro každou s ribozomálních RNA, nebyla by

schopna nasyntetizovat více jak 1200 kopíí jednoho typu. Z tohoto důvodu obsahuje genom

batekterie sedm samostatně lokalizovaných operonů pro rRNA, přičemž každý obsahuje po

jedné kopii všech rRNA. Navíc, rychle se dělící bakterie obsahují více částečných kopií

chromozómu, takže ve výsledku jsou schopny dosáhnout požadované rychlosti syntézy

ribozomů a potažmo i proteinů důležitých pro buněčné dělení.

Buňky mají schopnost koordinovat míru translace potřebný proteinů s počtem

ribozómů. Zamezuje se tak nadbytečné a neefektivní syntéze, která by buňkám odebírala

zbytečnou energii. Míra syntézy rRNA je tak srovnatelná s mírou translace, tj. syntézy

proteinů. Jedním ze způsobů, jak se tato kontrola realizuje je tzv. regulace za přísných

podmínek (stringent response). Nedostatek některé z aminokyselin, který se může objevit za

nedostatečné míry její syntézy, se projeví vznikem tzv. „nenabité“ příslušné tRNA pro tuto

aminokyselinu. Následuje odpověď buňky, kdy dochází k potlačení celé řady syntetických

pochodů na úkor zvýšení syntézy enzymů, zodpovědných za tvorbu aminokyselin. Buňka se

tak připravuje na hladovění za nedostatku živin. Mechanismus této regulace spočívá

v akumulaci neobvyklých nukleotidů, jako je ppGpp a pppGpp (dohromady pojmenované

jako (p)ppGpp (guanosin pentafosfát) a jejich rychlé degradaci v okamžiku dostatku všech

aminokyselin. Tyto nukleotidy mají schopnost měnit afinitu RNAP k promotorům a snižují

rychlost elongace transkripce určitých genů. Syntéza pppGpp spočívá v enzymaticky řízené

rekaci ATP a GTP za vzniku nukleosid pentafosfátu a AMP, katalyzované enzymem ReIA

(stringent factor). (p)ppGpp vzniká v okamžiku, kdy se v ribozómu na patřičném kodonu pro


Strana 57

chybějící aminokyselinu vyskytne neobsazené místo (v důsledku absence příslušné tRNA).

Tím je odhalen nedostatek aminokyseliny v buňce a vznikající (p)ppGpp působí jako

difuzibilní efektor, navozující následné změny ve transkripci příslušných genů regulací

pomocí stringent mechanismu. Opětovná degradace (p)ppGpp je navozena genovým

produktem spoT.


Strana 58

7. POSTRANSKRIPČNÍ ÚPRAVY PRIMÁRNÍHO TRANSKRIPTU

Ribonukleová kyselina, která vzniká ihned po syntéze RNAP, tzv. primární transkript,

memusí být nutně konečnou funkční RNA. S cílem nabýt konečné, biologicky aktivní

konformace musí řada těchto primárních transkriptů projít následnými, tzv. postranskripčními

úpravami, jakou je např. exonukleázové či endonukleázové odštěpení polynukleotidových

segmentů; připojení specifických nukleotidových sekvencí na 3á 5´konec RNA a modifikace

specifických nukleosidů. Těmto úpravám podléhají zejména mRNA, rRNA a tRNA.

7.1. Úpravy mRNA čepičkou a polyA koncem

V prokaryotních buňkách je většina syntetizované mRNA translatována bez jakýchkoliv

úprav, zejména z důvodu potřeby jejich rychlé translace ribozómy. U eukaryt je ale RNA

syntetizována v jádře a translatována v cytozolu. Eukarytní mRNA tedy provází řada

postranskripčních úprav a to ještě před opuštěním samotného jádra buňky.

Eukaryotní mRNA je opatřena enzymaticky syntetizovanou tzv. čepičkou, která je

tvořena 7-methylguanosinem navázaným na původní 5ńukleosid 5´-5´ trifosfátovým

můstkem (Obr.206). Čepička je navázána na nascentní mRNA, jakmile je odhaleno prvních

30 nukleotidů a definuje startovní místo eukaryotní translace. Mimo základní úpravu

koncového nukleotidu mohou být provedeny i úpravy další, např. O2´-methylace prvního

nukleosidu, který vede k tzv. cap-1 čepičce (typická pro mnohobuněčné organismy). Dle

může být tento typ methylace proveden i na druhém (cap-2) popř. ani na jednom (cap-0) z

nukleosidů. Pokudje prvním nukleosidem adenosin, je metylován v poloze N6. Vytvoření

čepičky je provedeno několika postupnými kroky s účastí několika enzymů: (1) odstranění 5´-

terminální trifosfátové skupiny RNA trifosfatázou; (2) guanylace mRNA čepičku tvořícím

enzymem za vzniku 5´-5´ trifosfátového můstku; (3) metylace guaninu guanin-7-

metyltransferázou (metyl dodává S-adenosylmethionin, SAM); (4) O2´metylace prvního popř.

durhého nukleosidu 2´-O-metyltransferázou.

Eukaryotní mRNA v konstrastu s prokaryotní mRNA jsou téměř vždy

monocistronické. Z tohoto důvodu nebyly u těchto organismů identifikovány terminační

sekvence. Výsledkem tohoto faktu je heterogenita 3´-konců primárních transkriptů eukaryot.

Naproti tomu, zralé mRNA, vzniklé úpravou těchto primárních traskriptů mají vždy velmi

dobře definované 3´-konce. Tyto konce jsou např. u savců vždy tvořeny 3´-polyA koncem o

délce až 250 nukleotidů. PolyA konce jsou enzymaticky připojeny k primárnímu transkriptu


Strana 59

ve dvoustupňové reakci katalyzované komplexem z přibližně 6 proteinů. V prvním kroku

dochází k odštěpení 3´-konce primárního transkriptu ve specifické sekvenci zhruba 20

nukleotidů vzdálené od sekvence AAUAAA, která je vysoce konzervovaná u všech eukaryot

(vyjma kvasinek). Na štěpení RNA se podílí tzv. restrikční faktor I a II (CFI a CFII). Problém

heterogenních konců primárních transkriptů je tak vyřešen. V druhém kroku je syntetizován

polyA konec z ATP činností enzymu poly(A) polymerázy (PAP). Ten s pomocí dalšího

faktoru (tzv. CPSF faktor) rozpoznává sekvenci AAUAAA a na jejím podkladě zahajuje

syntézu polyA konce. Délka polyA konce je rozpoznávána a regulována prostřednictvím

vazby proteinu poly(A) – vázajícího proteinu (PAB II) na vznikající polyA konec. Jeho

přítomnost na polA reguluje činost PAP. PAP je RNAP, kteráje nezávislá na existenci

templátu a prodlužuje mRNA primer od 3´-OH konce. Její struktura byla popsána

rentgenovou analýzou (Obr.207). PolyA konec nemá kostitutivní funkci, tj. není translatován.

Jeho funkce spočívá v protekci 3´-konce mRNA před působením exonukleáz, přítomných

v cytoplazmě. Tento fakt je potvrzen dlouhou dobou existence polyA modifikovaných mRNA

v cytoplasmě (hodiny) oproti mRNA bez polyA konce (např. RNA pro histony, 30 minut) a

postupnému zkracování 3´-konců mRNA s polyA koncem v průběhu jejich přítomnosti

v cytoplasmě. PolyA konec je v nativních podmínkách v cytoplazmě kompletován s tzv.

poly(A) vazebným proteinem (PABP), který se výraznou měrou podílý na prodloužení doby

života mRNA.

7.2. Molekulární sestřih mRNA (splicing)

Jedním z největších rozdílů mezi strukturálními geny prokaryot a eukaryot je že, v druhém

jmenovaném případě je gen tvořen kodujícími sekvencemi, které jsou přerušeny sekvencemi,

které nic nekódují. Objev tohoto typu kódování souvisel s faktem, že původně indentifikovaná

RNA v jádře, tzv. heterogenní nukleární RNA (hnRNA) byla jen na výjímky jejích 5´- a 3´-

konců pozorována v cytozolu, kde dochází k translaci. Vysvětlení tohoto jevu přinesly

výzkumy P.Sharpa a R. Robertse, kteří dokázali, že hnRNA podléhá ještě v jádře výrazným

změnám, které vedou k vystřižení dlouhých úseků a spojení zbylých úseků. hnRNA je tedy

složena z úseků, tzv. intronů, které jsou z hlediska délky velmi variabilní a které nic nekódují

(jsou vystřiženy) a kódujících úseků, nazývaných exony (Obr.208). Průměrný počet intronů

na jeden gen je ≈ 8, přičemž charakteristická délka je ≈ 3500 nukleotidů. Jejich sekvence je

v každém intronu téměř unikátní a nahodilá. Exony jsou zpravidla podstatně kratší

s průměrnou délkou nepřesahující 300 nukleotidů. Na počátku je vždy syntetizována mRNA

jako ucelená kopie jaderného genu, včetně intronů. Po nasyntetizování čepičky jsou introny


Strana 60

vyštěpeny a exony po stranách vystřiženého intronu navzájem spojeny (Obr.209). Tento

proces se nazývá molekulární sestřih, nebo také splicing (genový splicing), který se často

provádí kotranslačně, tj. ještě na nehotové, avšak čepičkou opatřené mRNA v jádře. Tento

proces je charakteristický vysokou přesností. Každý špatný sestřih, byť by znamenal jen

posunutí jednoho nukleotidu, by poskytl zcela jiný protein po translaci. Nedochází ani ke

změně pořadí exonů – ve zralé mRNA zcela kopírují jejich polohu na templátové DNA.

Srovnávací studie sekvencí v oblasti uzlu mezi exony a introny ukazují, že tyto spoje

projevují vysokou míru homologie. Na 5´ konci intronu se vždy nachází invariantní sekvence

GU a na 3´konci itronu sekvence AG. Tato struktura začátku a konce intronu je

nepostradatelná pro vytvoření struktury, která je nepostradatelná pro proces splicingu

(Obr.210). Studie provedené A.Efstradiadisem a T. Maniatisem objasnily mechanismus

ekcise (vystřižení) intronu, který probíhá pomocí transesterifikačních reakcí a je obecné

povahy u organismů (Obr.211). Excise je započatá vytvořením 2´,5´-fosfodiesterové vazby

mezi adenosinem intronu a jeho 5´-koncové fosfátové skupiny (intronu) za současného

uvolnění 3´-OH skupiny exonu. Intron tak utvoří novou lasovitou strukturu. Adenosinový

zbytek intronu se nachází přibližně 50 bází od 3´-konce štěpeného intronu a často je obklopen

konzervovanou sekvencí UACUAAC. V následujícím kroku vytváří volná 3-OH skupina

uvolněného exonu fosfodiesterovou vazbu s 5´-terminální fosfátem následujícího exonu,

prozatím vázaného s intronem s lasovitou strukturou. Vzniká tak spojení dvou exonů, přičemž

vystřižený intron linearizuje a je rychle degradován. Celý proces splicingu nevyžaduje dodání

volné energie, neboť se jedná o transesterifikaci, tzn. jedna vazba zaniká ale místo ní vzniká

vazba nová.

Introny jsou rozděleny dle stuktury a mechanismu do osmi rozdílných skupin, z nichž

sedm se vyskytuje u eukaryot (Obr.212). Skupina I intronů se vyskytuje v jádře, michondriích

a chloroplastech široké skupiny eukaryot, vyjma obratlovců. Studium těchto typů intronů na

prvoku Tetrahymena thermophila vedla T. Cecha k velmi důležitému objevu tzv. self-

splicingu (samosestřih) (Obr.213). U izolovaného primárního transkriptu rRNA, který byl

inkubován s guanosinem nebo s GMP, GDP popř. GTP došlo v nepřítomnosti proteinů

k samovolnému vystřižení intronu a s spojení příslušných exonů do jednoho řetězce. Tento

objev potvrdil, že za určitých okolností se RNA může chovat jako enzym a katalyzovat

nejrůznější reakce. Tento proces probíhá ve třech krocích (Obr.214). 3´-OH skupina volného

guanosinu vytváří fosfodiesterovou vazbu s 5´-koncem intronu a uvolňuje levý (tj. na 5´konci

situovaný) exon. 3´-OH skupina uvolněného levého exonu vytváří fosfodiesterovou vazbu

s 5´-terminálním fosfátem pravého (ted na 3´ konci RNA orientovaného) exonu. Dochází tak


Strana 61

ke spojení levého a pravého exonu do jednoho vlákna RNA a uvolnění intronu. 3´-OH

skupina intronu vytváří fosfodiesterovou vazbu s fosfátem nukleotidu na 15 pozici intronu od

jeho 5´-konce. Dojde tak k vyštěpení krátkého lineárního vlákna a cyklizaci velké části

intronu. Tento self-splicing je opět tvořen sledem transesterifikačních reakcí a nevyžaduje

dodání volné energie. Další studium vlastností intronu potvrdilo jeho katalytické schopnosti.

Ty byly demonstrovány na jeho schopnosti štěpit in vitro poly(C) s urychlením jeho

hydrolýzy na C s faktorem 1010. Navíc, kinetika této katalyzované reakce podléhala

závislostem Michaelise-Mentenové. Podobné RNA enzymy se dnes označují jako ribozymy.

Skupina II intronů se nachází zejména v mitochondriích hub a rostlin a zahrnuje

většinu intronů v chloroplastech. I tento typ intronů projevuje self-splicing. Na rozdíl od

předchozí skupiny však splicing probíhá přes lasovitou strukturu (viz výše) a nevyžaduje

dodání externího nukleotidu. Tyto introny tak procházejí splicingem, který je velmi podobný

sestřihu jaderné mRNA. V případě mRNA v jádře je však k sestřihu využit tzv. spliceosom,

který je ribonukleotidovou částicí, katalyzující sestřih. Podobnost mechanismu sestřihu

se skupinou II intronů vede k teorii, že spliceosom není nic jiného, než původní self-splicing

RNA doplněná o proteiny, které její funkci a strukturu upevňují. Podobné úvahy platí i o

struktuře a funkci ribozómu. Všechny tyto poznatky vedou k hypotéze, že původním

biologicky aktivním katalyzátorem na počátku evoluce života, tj. ještě v před vznikem buňky,

nebyly proteiny, ale molekuly RNA. Proteiny byly jako stavební kameny a katalyzátory

organismů uplatněny až v pozdějších fázích evoluce makromolekul a života jako takového.

Ribozymů bylo do dnešní doby nalezeno a po strukturní stránce charakterizováno

několik typů. Příkladem je již výše zmíněný ribozymu ve formě intronu skupiny I (Obr.215).

Tento ribozym se skládá z devíti dvojřetězcových segmentů, přičemž aktivní místo vzniká

protkáním několika řetězců v centrální oblasti. Jinými typy ribozymů, které jsou dobře

popsány jsou ribozymy s kladivovou strukturou (hammerhead ribozymes), vyskytující se u

některých rostlinných virů. Název spočívá v charakteristickém uspořádání trojrozměrné

struktury, připomínající kladivo. Tyto ribozymy katalyzují transesterifikační reakci, při které

je rozštěpena 3´,5´-fosfodiesterová vazba mezi nukleotidy C a A, za vzniku cyklické

intramolekulární 2´,3´-fosfodisterové vazby (Obr.216).

Jádro eukaryotních buněk obsahuje řadu kopií několika vysoce konzervovaných 60-

300 nukleotidových RNA, které se nazývají malé jaderné RNA (snRNA, small nuclear RNA).

Tyto RNA tvoří komplexy s proteiny, které se nazývají malé jaderné ribonukleoproteiny

(snRNP, small nuclear ribonucleoproteins). 5´-konec jedné z těchto RNA, tzv. U1-snRNA

(patří do skupiny snRNA s vysokým obsahem U) je částečně komplementární ke konsensus


Strana 62

sekvenci mezi intronem a exonem na 5´-konci vlákna mRNA. Obdobné vlastnosti projevují i

U2-snRNP, U4-U6-snRNP (U4 a U6-snRNA jsou spárovány komlementárními bázemi) a U5-

snRNP. Všechny tyto ribonukleoproteiny se tedy účastní samotného splicingu mRNA v jádře

eukaryot a jsou součástí tzv. spliceosomu, tedy struktury, jejíž činností ke splicingu dochází.

Spliceosom je ≈ 45 S velká částice, která se skládá z primárního mRNA transkriptu, čtyřech

snRNP a nedefinovaného počtu mRNA-vázajících proteinů (dohromady cca 65 proteinů

(Obr.217). Funkce spliceosomu je poměrně komplikovaná (Obr.218). Spliceosom se

pravděpodobně sestavuje již jako funkční molekula ještě než nasedne na mRNA. Její štěpení

je doprovázeno spotřebou ATP. Vznik lasovité struktury transesterifikací v prvním stupni

reakce je doprovázen změnou prostorové struktury spliceosomu, která probíhá v šesti

stupních. K obdobně rozsáhlým strukturálním změnám spliceosomu dochází i při druhé

transesterifikaci a regeneraci spliceosomu. Existuje řada proteinů, které nejsou přímou

součástí spliceosomu, avšak na procesu splicingu se nepřímo podílí. Mezi tyto tzv. splicing

faktory patří např. splicing faktor 1 (SF1, nebo také BBP) nebo tzv. U2-snRNP přídavný

faktor (U2AF). Oba tyto proteiny napomáhají nalézt hranici intronu.

Analýzou genomu řady organismů bylo zdokumentováno, že introny se takřka

nevyskytují u prokaryotní DNA, jsou přítomné pouze v nevýrazném množství u taxonomicky

nižších eukaryot avšak velmi hojné u vyšších eukaryot (vyjímkou jsou geny pro histony a

interferony u obratlovců). Z tohoto důvodu je až 80% typického genu obratlovců tvořeno

oblastmi, které se neexprimují, tj. obsahují nekódující oblasti ve formě intronů. Jedna z teorií,

která se k existenci intronů váže, říká, že intron je ve své podstatě „molekulárním parazitem“

(tzv. junk DNA, junk = odpad). Tato teorie se však zdá být nepravděpodobná, neboť bylo

prokázáno, že molekulární sestřih RNA přináší buňce některé podstatné výhody. Splicing je

například významným mechanismem pro rychlou evoluci proteinů (viz dále). Druhou

výhodou je tzv. alternativní splicing, který umožňuje kódování funkčně i morfologicky zcela

odlišných proteinů jedním genem. Tyto mechanismy jsou diskutovány v následujících

odstavcích.

Mnoho eukaryotních proteinů se skládá z modulů, které se nachází i v jiných

proteinech. Příkladem může být tzv. LDL receptor v plazmatické membráně, který váže

lipoproteiny s nízkou hustotou (LDL, low-density lipoprotein) a umožňuje jejich transport do

buňky endocytózou. Gen pro tento receptor se skládá z 18 exonů, které kódují specifické

funkční domény proteinu. 13 těchto exonů je navíc podobných polypeptidickým segmentům

jiných proteinů. Např. 5 z těchto exonů kódují sekvenci, která se vyskytuje i u tzv.

komplementu C9 (protein, který je součástí imunosystému). Tři exony jsou podobné exonům


Strana 63

v genu pro epidermální růstový faktor (EGF) atd. Je tedy evidentní, že LDL receptor se skládá

modulárně uspořádaných exonů, které se vyskytují i v jiných typech proteinů. Podobné

uspořádání je typické pro celou řadu dalších eukaryotních proteinů. Je tedy pravděpodobné,

že geny, které kódují tyto modulární proteiny, byly vytvořeny postupnou kombinací z různých

exonů rekombinací mezi jejich sousedními introny. Tento způsob vytváření nových proteinů

přináší velkou výhodu v kombinaci evolučně osvědčených modulů. Evoluce nových proteinů

tak nutně nemusí začínat „de novo“, tj. optimalizací jejich primární struktury, ale skládáním

funkčních částí v nový celek.

Exprese řady buněčných genů je modulována selekcí alternativních míst či způsobů

splicingu. Určitý typ exonu v jedné diferencované buňce tak může být součástí intronu

v buňce jiné. Klasickým příkladem je krysí gen pro svalový protein α-tropomyosin, který

poskytuje 7 rozdílných tkáňově-specifických variant skrze alternativní splicing pre-mRNA

(Obr.219). Obdobný mechanismus alternativního splicingu je typický pro všechny

mnohobuněčné organismy, obzvláště pro obratlovce. Např. původní odhady počtu

strukturálních genů pro člověka (50-140 tis. genů) se ukázaly být nepravdivé, neboť

sekvenací bylo zjištěno „pouze“ 30 tis. těchto genů. Rozdíl je dán mechanismem

alternativního splicingu, který je prováděn odhadem až v 60% všech lidských strukturálních

genů. Mechanismus alternativního splicingu je velmi rozmanitý. Může se jednat o vložení či

naopak vystřižení celých funkčních domén, jednotlivých aminokyselin, nebo např. vložení

stop kodonu a předčasnou terminaci translace. Výsledkem těchto rozmanitých změn splicingu

může být ovlivnění takových vlastností proteinu, jako je jeho rozpustnost v cytoplazmě či

naopak vazba v membráně, zda bude podléhat fosforylaci specifickou kinázou či nikoliv, do

jakého místa v buňce bude protein lokalizován, zda bude vázat určitý typ alosterického

faktoru, jaká bude afinita receptoru ke specifickému ligandu atd. Jelikož je typ splicingu

tkáňově či orgánově specifický, musí existovat dokonalá regulace. Častá geneticky kódovaná

onemocnění člověka (≈ 15%) jsou způsobena změnou splicingu pre-mRNA v dané tkáni.

Pokud dojde např. ke změně místa splicingu bodovou mutací, odhalí se jiné místo splicingu,

které poskytne funkčně a morfologicky odlišný protein. Dobře zdokumentované změny

splicingu jsou i v případě růstu rakovinového nádoru.

Mechanismus alternativního splicingu je dobře popsán pro případ proteinů

ovlivňujících pohlaví mušky octomilky (Drosophila) (Obr.220). Jedná se o dva samostatné

mechanismy. V prvním případě obsahuje primární transkript proteinu tra (transformer) dvě

alternativní místa splicingu na 3´-konci exonu 2. V případě využití tzv. proximálního místa

splicingu, který je blíže 5´-konci exonu 1 dojde ke determinaci samčího pohlaví, v případě


Strana 64

využití druhého místa splicingu, které je blíže k 3-konci exonu 2 je determinováno samičí

pohlaví octomilky. Princip odlišného štěpení spočívá v existenci stop kodonu UAG mezi

těmito dvěma místy splicingu. V případě samečka dojde k vazbě splicingového faktoru U2AF

a odhalení stop kodonu, přičemž dojde k předčasné terminaci nefunkčního proteinu. Protein

tra tak nevzniká. V případě samiček je však první místo splicingu blokováno vazbou tzv. SXL

proteinu (produkt tzv. sex-lethal genu sxl, který je funkční jen u samiček), který blokuje

vazbu U2AF. Ten se váže do druhého místa splicingu a zamezuje tak čtení výše zmíněného

stop kodonu. Vzniká tak funkční protein tra. V druhém případě se jedná o regulaci splicingu

tzv. doublesex (dsx) pre-mRNA. První tři exony jsou vždy konstitutivně tvořeny nezávisle na

pohlaví. U samečků však dochází k vystřižení exonu 4 a vzniká tak tzv. DSX-M protein (male

specific DSX protein). U samiček však dochází v přítomnosti funkčního proteinu tra (viz

předchozí regulační mechanismus) k jeho vazbě do specifických míst v exonu 4, který

zaručuje aktivaci alternativního místa splicingu a ponechání tohoto exonu v translatovaném

řetezci mRNA. Vzniká tak DSX-F protein (female specific DSX protein). Ten funguje jako

represor specifických samčích genů. Obdobné mechanismy alternativního splicingu byly

popsány i v případě obratlovců.

Dosud popsané mechanismy splicingu se týkaly úprav jednoho vlákna pre-mRNA, tj.

jednalo se o tzv. cis-splicing. Naproti tomu existuje způsob splicingu, který probíhá mezi

odlišnými vlákny pre-mRNA za účasti spliceosomu tzv. trans-splicingem. Tento způsob je

doložen u trypanozóm (zástupce protozoí, způsobují spavou nemoc) (Obr.221). Všechny

mRNA tohoto organismu obsahují tzv. leaderovou sekvenci (SL)RNA, která však v genech

pro tyto mRNA chybí. (SL)RNA je kódována v samostatném genu a k mRNA každého genu

připojena mechanismem trans-splicingu. Tento mechanismus je velmi podobný cis-splicingu,

neboť samotná (SL)RNA obsahuje na 5á 3´-konci konsensus sekvence obdobné těm, které se

nachází na koncích intronu a jsou nezbytné pro vazbu spliceosomu. Ten tato místa rozpozná a

váže tak vlákno (SL)RNA na pre-mRNA příslušného genu. Obdobný mechanismus se

pravděpodobně vyskytuje u nematod a některých zástupců vyšších eukaryot, vč. obratlovců.

Dalšími možnými úpravami, který mi může RNA procházet, je záměna nebo

vymazání některých bazí v řetězci. Tento proces, který se nazývá editování RNA (RNA

editing), zahrnuje např. výměnu jednoho typu báze za jiný typ (např. C za U, U za C), deleci

báze (např. U) a inzerci opakujících se G a C zbytků. Příkladem je lidský protein

apolipoprotein B (apoB):apoB-48 a apoB-100. Oba proteiny jsou kódovány stejným genem,

avšak jejich funkce (transport lipidů a lipoproteinů) a místo tvorby je však zcela jiné.

Důvodem je odlišnost jednotlivých mRNA v záměně C za U a vznik nového stop kodonou


Strana 65

UAA na apoB-100 mRNA a tím odlišného produktu. Editační aktivita je zaručena specifickou

aktivitou enzymu citidin deaminázy, transformující C na U deaminací. Tento způsob editace

se nazývá substituční. Obdobný mechanismus je zdokumentován např. pro glutamátový

receptor v nervové tkáni (záměna A na I deaminací , I je modifikovaná báze inosin, viz. další

kap., která je překládána jako G). Enzymy, které provádějí tuto substituci se nazývají ADAR1

a 2 (adenosine deaminases acting on RNA). Tyto enzymy se váží pouze do specifických míst,

které jsou tvořeny dsRNA vznikající mezi komplementárními sekvencemi exonu a intronu

(Obr.222). Tento způsob editace výrazně zvyšuje variabilitu proteinů a napomáhá existenci

řady izoforem stejného proteinu.

Date post:	27-Nov-2014
Category:	Documents
Upload:	hana-simkova
View:	2,812 times
Download:	0 times

Molekularni a Bunecna Biologie

Documents