KLINICKÁ BIOCHEMIE - praktikárna PRO 1. Bílkoviny krevní plazmy Stanovení celkové bílkoviny v séru biuretovou reakcí Stanovení albuminu v séru Stanovení C-reaktivního proteinu (CRP) Elektroforéza plazmatických bílkovin na agarosovém gelu, hodnocení dysproteinemií 2. Glukóza, lipidy v krvi Stanovení glukózy v séru Stanovení glukózy v kapilární krvi glukometrem Stanovení celkového cholesterolu v séru Stanovení HDL cholesterolu v séru Stanovení triacylglycerolů v séru 3. Nebílkovinné dusíkaté látky, metabolismus žlučových barviv Stanovení močoviny v séru Stanovení kyseliny močové v séru Stanovení přímého a celkového bilirubinu v séru 4. Vyšetření moči I Vznik moči a funkce ledvin Fyzikální vyšetření moči Základní chemické vyšetření moči (glukóza, bílkoviny, ketolátky, krevní barvivo, bilirubin, urobilinogen) 5. Vyšetření moči II Mikroskopické vyšetření močového sedimentu Funkční zkoušky ledvin - stanovení glomerulární filtrace jako clearance kreatininu Aminokyseliny a jejich metabolity v moči (fenylketonurie, cystinurie, tyrosinóza) 6. Ionty v séru, vyšetření mozkomíšního moku Stanovení vápníku v séru fotometricky Stanovení Na + a K + v séru plamenovou fotometrií Vyšetření mozkomíšního moku (glukóza, proteiny, laktát)
Transcript
KLINICKÁ BIOCHEMIE - praktikárna PRO
1. Bílkoviny krevní plazmy
Stanovení celkové bílkoviny v séru biuretovou reakcí
Stanovení albuminu v séru
Stanovení C-reaktivního proteinu (CRP)
Elektroforéza plazmatických bílkovin na agarosovém gelu, hodnocení dysproteinemií
Stanovení celkové bílkoviny v séru biuretovou reakcí
Princip:
Peptidy (nejmén� t�í�lenné) poskytují podobn� jako biuret a karbamylderiváty s ionty Cu2+ v alkalickém prost�edí modrý komplex vhodný k fotometrickému stanovení.
Provedení:
P�ipravte si t�i zkumavky a ozna�te je vz, st a pv. Do zkumavek odpipetujte podle tabulky sérum, standard, fyziologický roztok a biuretové �inidlo.
Nechte stát 30 minut p�i laboratorní teplot�. Zm��te absorbanci vzorku a standardu proti porovnávacímu roztoku p�i vlnové délce 546 nm. Vypo�ítejte koncentraci vzorku podle následujícího vztahu:
Koncentrace celkové bílkoviny c vzorku (g/l) = ��������
���� �� �x c standardu (70 g/l)
Výsledek porovnejte s normální hodnotou celkové bílkoviny v séru.
Použité roztoky a �inidla: 1. biuretové reagens: 1,5 g CuSO4 . H2O a 6 g vinanu sodnodraselného se smísí s 500 ml destilované vody, 300 ml 2,5 M NaOH a za stálého t�epání se ve sm�si rozpustí 1 g KI, doplní se vodou na 1 l, pH má být 11,4 2. Fyziologický roztok (0,9 g NaCl/100 ml) 3. Standardní sérum se známým obsahem bílkovin (nap�. Versatol)
Stanovení albuminu v séru (set Lachema Alb-BCP 30)
Princip:
Bromkrezolový purpur (5,5´- dibrom-o- kresolsulfonftalein) tvo�í s albuminem ve slab� kyselém prost�edí za p�ítomnosti povrchov� aktivních látek zelenomodrý komplex vhodný k fotometrickému stanovení.
Provedení:
P�ipravte si t�i zkumavky a ozna�te je vz, st a pv. Do zkumavek odpipetujte podle tabulky sérum, standard, destilovanou vodu a �inidlo.
Roztoky zamíchejte a nechte stát 10 minut p�i laboratorní teplot�. Zm��te absorbanci vzorku a standardu proti porovnávacímu roztoku p�i vlnové délce 600 nm. Vypo�ítejte koncentraci vzorku podle vztahu:
Koncentrace albuminu c vzorku (g/l) = ��������
���� �� �x c standardu (40 g/l)
Výsledek porovnejte s normální hodnotou albuminu v séru. Vypo�ítejte albumino-globulinový koeficient.
A/G = ������
���������������� (orienta�ní rozmezí je 1,3 – 2,0)
Elektroforetické d�lení plasmatických bílkovin na agarosovém gelu
Bílkoviny jsou biopolymery vzniklé polykondenzací asi dvaceti základních aminokyselin. Funk�ní skupiny n�kterých aminokyselin (Asp, Glu, Lys, Arg, His) nacházející se v postranním �et�zci proteinu mohou p�i vhodném pH disociovat a bílkovina tím získá ur�itý iontový náboj. Za fyziologických podmínek p�i pH krve 7,40 je v plasm� 15 až 17 mmol/l záporných proteinátových náboj�.
Plasmatické bílkoviny tvo�í podstatnou a zcela specifickou sou�ást krve. Normální hladina je 62 až 82 g/l. Mají d�ležitou roli transportní (nap�. bilirubinu, lipid�, n�kterých hormon� aj.), podílejí se na udržování osmotických pom�r�, na iontové i acidobazické rovnováze, na imunitních d�jích a v krizových stavech mohou mít i význam nutri�ní. Jejich spektrum je širší než po�et jejich elektroforetických frakcí, nebo� nelze mezi sebou rozlišit látky se stejnou elektroforetickou pohyblivostí.
P�i d�lení v alkalickém prost�edí (pH = 8,6) lze získat tyto elektroforetické frakce: (+)
Hodnotí se rovn�ž pom�r albuminové a globulinové frakce (tzv. albumino-globulinový koeficient A/G, normální hodnota - vyšší než 1,2).
Vyhodnocení se provádí na densitometrech, které zaznamenají rozložení frakcí, ode�tou na elektroforeogramu jejich plochu a vyjád�í ji ve vzájemném pom�ru. P�i r�zných závažných patologických stavech (akutní a chronické zán�ty, onemocn�ní ledvin a jater, imunitní problémy, poruchy v oblasti lipoprotein�, nádorová onemocn�ní aj.) je provedení elektroforetického d�lení nezbytnou sou�ástí posouzení stavu vyšet�ované osoby.
Provedení:
• Sklen�nou desku s agarosovým gelem osušte filtra�ním papírem.
• Na spodní t�etinu gelu (asi 2 cm od okraje) p�iložte nanášecí šablonu. Otvory šablony napl�te vzorkem séra z�ed�ného pufrem v pom�ru 1 : 3 a nechte 5 minut vsakovat. Pak odsajte p�ebytek séra proužkem filtra�ního papíru a sejm�te šablonu.
• Desku vložte do p�ipravené elektroforetické komory napln�né pufrem agarosovou vrstvou dol� na m�stky ze složeného chromatického papíru a lehce p�itiskn�te.
• Laborantka p�ikryje komoru víkem a p�ipojí zdroj nap�tí.
• D�lení nechte probíhat 30 minut p�i nap�tí 100 V.
• Poté laborantka odpojí zdroj nap�tí, sejme víko a vyjme gel.
• Následuje fixace a barvení:
• 5 minut fixace v kyselém alkoholu • 10 minut barvení v barvicí lázni amido�ern�
• Dalším krokem je odbarvení: • 15 minut v 5% kyselin� octové
• Gel p�eneste ze skla na filtra�ní papír, zvolna usušte a p�iložte k protokolu.
Použité roztoky a �inidla 1. Pufr: 2,76 g kyseliny diethylbarbiturové a 15,40 g diethylbarbiturátu sodného rozpustit na 1500 ml roztoku 2. Agarosový gel: 1,0 g agarosy a 0,6 g arabské gumy rozva�it ve 100 ml pufru (roztok 1) na vodní lázni 3. Fixa�ní roztok: 600 ml ethanolu a 100 ml konc. kyseliny octové doplnit vodou na objem 1000 ml
4. Barvící roztok: 1,0 g amido�ern�, 30 ml konc. kyseliny octové a 6,8 g octanu sodného doplnit vodou na objem 1000 ml
6. Krevní sérum 7. Sklen�né desky s agarosovým gelem
Mezi dv� sklen�né desky (10 x10 cm) se vloží gumový ráme�ek, skla se stisknou svorkami a mezi n� se pipetou pomalu nalije asi 8 ml horké agarosy (roztok 2) tak, aby byl prostor mezi skly zcela vypln�n. Nesmí vzniknout vzduchové bubliny. Nechá se p�i laboratorní teplot� ztuhnout (asi 30 minut), pak se uvolní svorky a opatrn� se stáhne horní sklo. Deska se vloží do vlhké kom�rky a uloží do chladni�ky. Takto se m�že uchovávat 5 dn�.
Stanovení glukózy v séru enzymaticky
Princip:
Glukóza se oxiduje vzdušným kyslíkem za katalýzy glukózaoxidázou na glukonolakton a
peroxid vodíku, který se stanoví oxidační kopulací se substituovaným fenolem a 4-aminofe-
nazolem. Tato druhá reakce je katalyzovaná peroxidázou.
Roztoky: standard glukózy (c=10 mmol/l)
činidlo (enzymová směs + roztok obsahující chromogen a fosfátový pufr)
Provedení:
1. Do tenkostěnných zkumavek napipetujte:
vzorek standard porovnávací roztok
sérum (ml) 0,02 - -
standardní roztok (ml) - 0,02 -
destilovaná voda (ml) - - 0,02
činidlo (ml) 2,0 2,0 2,0
2. Inkubujte 15 minut při 37°C. Změřte absorbanci vzorku a standardu proti
Stanovení glomerulární filtrace jako clearance endogenního kreatininu
1) Do �isté nádobky (najdete na tácu u dve�í do praktikárny) odeberte vlastní mo�.
2) Vzorek mo�i 100x z�edíme.
Do odm�rné ba�ky (o objemu 100 ml) napipetujte sklen�nou pipetou 1 ml mo�i. Destilovanou vodou dopl�te odm�rnou ba�ku po rysku (tj. na objem 100 ml). Odm�rnou ba�ku uzav�ete zátkou a obsah d�kladn� promíchejte.
Pro� mo� �edíme?
Látky, které se v glomerulu voln� filtrují a následn� nepodléhají ani tubulární resorpci ani tubulární sekreci (o kreatininu p�edpokládáme, že se práv� tak chová), mají v definitivní mo�i zhruba 100x v�tší koncentraci než v glomerulárním filtrátu (koncentrace v glomerulárním filtrátu je blízká koncentraci v krevní plazm�).
P�i fotometrickém stanovení, kdy paraleln� zpracováváme vzorek a standard, je nutné, aby koncentrace vzorku nebyla p�íliš vzdálená od koncentrace standardu. V praxi se postupuje tak, že se používá standard o koncentraci srovnatelné s o�ekávanou koncentrací vzorku. Další možností je �ed�ní vzorku tak, abychom se dostali po na�ed�ní �ádov� ke koncentraci standardu. Ze zm��ené koncentrace na�ed�ného vzorku a známého �ed�ní m�žeme snadno spo�ítat koncentraci p�vodního (ne�ed�ného) vzorku, která nás zajímá.
V našem p�ípad� jako standard použijeme krevní sérum o známé koncentraci kreatininu (177 µmol/l), pro zjišt�ní clearance kreatininu musíme zm��it jeho koncentraci jednak ve vzorku krevní plazmy (séra) vyšet�ovaného pacienta, jednak v pr�m�rném vzorku po dobu 24 hodin sbírané mo�i. O�ekávaná koncentrace kreatininu v séru je �ádov�srovnatelná s koncentrací standardu, ale pro mo� tohle neplatí, o�ekávaná koncentrace v mo�i je �ádov� 100x vyšší, proto musíme p�ed m��ením vzorek mo�i �edit.
3) Podle následujícího schématu napipetujte:
• vzorek séra a standardu do centrifuga�ních zkumavek• vzorek mo�i a slepý vzorek (porovnávací roztok) do tenkost�nných zkumavek
Krevní sérum a mo� jsou úpln� jiné biologické matrice, zkumavky 1 (sérum) a 2 (standard) budou zpracovávány odlišným zp�sobem – je nutné odstranit proteiny, které by rušily stanovení, precipitací kyselinou trichloroctovou.
Lihovým fixem zkumavky o�íslujte a centrifuga�ní zkumavky ozna�te tak, abyste si je poznali.
4) Obsah zkumavek promíchejte a nechte 5 minut stát.
5) Centrifuga�ní zkumavky (1 a 2) odevzdejte laborantce k provedení centrifugace (10 min, 3000 ot/min). Tenkost�nné zkumavky (3 a 4) ponechte stát ve stojánku na stole, už jsou p�ipravené pro krok 7 návodu, se kterým ale za�nete až po prob�hnutí centrifugace a odb�ru supernatantu.
�ekání m�žete využít k prohlížení preparát� mo�ového sedimentu, p�ípadn� si vyzkoušet webové kalkulátory GF.
6) Po dokon�ení centrifugace p�eneste opatrn� do paralelních tenkost�nných zkumavek (1 a 2) po 1,00 ml supernatantu.
7) V tomto kroku máte p�ipravené 4 zkumavky, každá obsahuje 1 ml roztoku (zkumavka 1 a 2 supernatant odebraný po centrigugaci, zkumavky 3 a 4 máte už p�ipravené z kroku 3 návodu.
Vlastní stanovení kreatininu (Jaffého reakce)
Ke stanovení kreatininu se používá reakce s kyselinou pikrovou v alkalickém prost�edí. Reakce není specifická, podobn� reaguje �ada dalších látek (tzv. Jaffé-pozitivní chromogeny).
Do všech zkumavek napipetujte roztok kyseliny pikrové a NaOH (viz tabulka):
10) Prove�te výpo�et koncentrace kreatininu v séru (Skr):
st
sérum
stkrA
AcS ×=
pozn. Referen�ní rozmezí fyziologických hodnot je závislé na v�ku a pohlaví, zhruba 50 -120 µmol/l.
11) Prove�te výpo�et koncentrace kreatininu ve z�ed�né mo�i (Uz�. mo�):
st
mo�z�
stmo�z�A
AcU
.
. ×=
12) Prove�te výpo�et koncentrace kreatininu v p�vodní ne�ed�né mo�i (Ukr):
mo�z�kr UU .50 ×=
pozn. Mo� jste p�ed stanovením kreatininu �edili 100x, ale zkumavky 1 a 2 (kde je bylo matricí sérum), byly zpracovávány odlišným zp�sobem.než zkumavka se z�ed�nou mo�í, po centrifugaci byla dále zpracovávána jen polovina výchozího množství...).
13) Prove�te výpo�et odhadu glomerulární filtrace jako clearance kreatininu:
VS
UCGF
kr
kr
kr ×=≈
kde V je diuréza/24 hodin, po�ítejte s údajem V = 1,78 l/den
pozn. Referen�ní rozmezí fyziologických hodnot je závislé na v�ku a pohlaví, zhruba platí: Ckreat = 1,3 – 3,3 ml/s
Provedení v praktických cvi�eních neodpovídá vyšet�ení jednoho daného pacienta, i když pracujete s vlastní mo�í, spo�ítaná glomerulární filtrace nic ne�íká o funkci vašich ledvin !!!
Zamyslete se, jak jste postupovali:
Ukr vlastní mo� – jednorázový odb�r Skr fetální bovinní sérum V 24-hodinový sb�r mo�e nebyl provád�n, diuréza/24 hodin je už pro výpo�et dop�edu udána
Pro zajímavost, jak se vyšet�ení skute�n� provádí:
Pokyny k provedení vyšet�ení (citováno dle: Ústav klinické biochemie a hematologie FN Plze�)
Clearance endogenního kreatininu (Ckr)
3 dny p�ed a b�hem testu vynechat maso, výrobky z masa, léky – pokud je to z klinického hlediska možné. Vyhnout se fyzické námaze. V den testu p�ijímat pr�m�rné množství tekutin; pacient nesmí pít p�íliš, ale též nesmí žíznit. Nepodávat látky s mo�opudným ú�inkem (diuretika, káva, �aj). Dodržovat t�lesný klid; vyšet�ovaný leží nebo mírn� p�echází. Provádíme 24-hodinový sb�r mo�e. Mo� není t�eba konzervovat, p�ípadná konzervace nevadí. Do laborato�e zaslat 5 ml pr�m�rného vzorku mo�e na stanovení hladiny kreatininu (Ukr). Na žádance vyzna�it diurézu/24 h s p�esností na 10 ml. Sou�asn� ráno nala�no, sta�í na konci sb�rného období, odebrat srážlivou krev na stanovení hladiny sérového kreatininu (Skr). Výpo�et se vztahuje na ideální t�lesný povrch 1,73 m2; k výpo�tu skute�ného t�lesného povrchu je t�eba udat hmotnost a výšku pacienta.
STANOVENÍ AMINOKYSELIN A JEJICH METABOLIT� V MO�I
A�koliv jsou aminokyseliny z primární mo�i v tubulech aktivn� resorbovány, v malém množství (do 14 mmol/ 24h) jsou vylu�ovány mo�í. Jejich zvýšená koncentrace je obvykle patologická, hovo�íme o aminoacidurii.
Podle p�í�iny m�žeme rozd�lit aminoacidurie na tzv. renální, kdy zvýšené vylu�ování aminokyselin p�i jejich normální hladin� v krvi je d�sledkem postižení tubul� nebo tzv. overflow aminoacidurii, kde produkce jedné nebo více aminokyselin p�evyšuje resorp�ní kapacitu ledvinných tubul�.
Velmi �asto je aminoacidurie d�sledkem d�di�ného defektu, tzv. d�di�né metabolické
poruchy, která m�že být lokalizována ve specifickém reabsorp�ním systému nebo v metabolické dráze aminokyseliny. D�di�né metabolické poruchy jsou obecn� zp�sobeny mutací v jednom genu, což má za následek tvorbu nefunk�ního produktu, nej�ast�ji enzymu. D�sledkem takovéto enzymové poruchy je hromad�ní substrát� p�íslušné metabolické dráhy a sou�asný nedostatek jejích produkt�. Hromadící se substrát bývá �asto p�em��ován alternativní cestou za vzniku abnormálních, �asto toxických vedlejších produkt�. Výsledkem jsou r�zn� závažné klinické projevy.
Diagnózu d�di�né choroby lze provést na t�ech úrovních:
1. Detekce mutace v DNA
2. Detekce defektního proteinu
3. Detekce zvýšené hladiny substrátu / nedostatku produktu / alternativního produktu
Nejjednodušší a nejdéle užívané jsou detekce zvýšené hladiny aminokyselin nebo jejich metabolit� v mo�i pomocí jednoduchých test�.
Pro stanovení aminokyselin v mo�i použijte modelový vzorek mo�i. Obsahuje danou
aminokyselinu, proto bude výsledek pozitivní. Jako negativní kontrolu použijte vlastní mo�.
1. Stanovení cystinu
Na filtra�ní papír dejte malé množství práškového �inidla (nitroprusid sodný + (NH4)2SO4+Na2CO3+NaCN) a zvlh�ete kapkou mo�i. V pozitivním p�ípad� vznikne ihned �ervenofialové zabarvení. (Na rozdíl od acetonu, kdy se zabarvení vyvíjí pomalu a je trvalejší.)
2. Pr�kaz fenylpyruvátu
K n�kolika ml mo�i ve zkumavce p�idejte 2 kapky 10% HCl a 3 kapky FeCl3. V pozitivním p�ípad� vznikne tmavozelené zabarvení.
3. Pr�kaz tyrosinu
Ve zkumavce smíchejte stejný díl mo�i (max. 0,5 ml) a Millonova �inidla (Hg + HNO3). V pozitivním p�ípad� se do 10 minut vyvine �ervené zbarvení.
