Obecná
ZoologiePro kombinované
i denní
studium
biologie
Doplněk skript Opora OZ, kap. 8
Zařízení
a metody pro studium buněk a tkání
Pouze pro osobní
potřebu účastníka konzultaceŠíření
v rozporu se zákonem o autorských právech
Mareš
V., KBI, PřF
UJEP Ústí
n.L. Aktualizováno 14.2.2010
Pokud není
uveden jiný zdroj materiál je z archivu autora
Metody a zařízení
pro studium buněk a tkání
Mikroskopy– Světelné
-
Transmisní
klasickéfázový a DIF kontrast
Inverzní
pro buněčné
kulturyfázový a DIF kontrast
Fluorescenční: klasické
i inverzníkonfokálníluminiscentní
-Elektronové
-
TransmisníSkanovací
-
Atomové
(AMF)
Doplňková
zařízení
viz další
snímek
Obr označené
* jsou z této publikace.Autoři jednotlivých kapitol jsou uvedeny u příslušných snímků
Doplňková
zařízení
ke SM a EM:
1. Kreslící
zařízení
pro SM (Abbeho
zrcátko, ramenový tubus, grafické tablety aj. )
2. Fotografická
zařízení
pro SM a EM ( fotografické
aparáty a digitalizační kamery)
3. Počítačová
analýza
mikroskopických obrazů4. X-ray
mikrodensitometrie
pro stanovení
chemických prvků
Další
speciální
zařízení
1. Průtokové
(flow-) cytofluorometry2. „Třídiče“
buněk (Cell sorters)
3. Separační
centrifugy (pro isolaci buněk )4. Robotická
zařízení
pro tzv. microarrays
(„mikrořady“)
5. Atomové
mikroskopy (Atom Force
Microscopy, AMS)
Opora OZ kap.9
*
RS objektivu
(RS) = Nejmenší vzdálenost mezi 2 body kdy ještě
„nesplývají
v jeden“RS = 0. 61 x λ/n.sin alfa
n= refrakterní
index skla, montovacího a imersního media
sin alpha
= ½
sinus vstupního úhlu světla = numerická
apertura ! (NA)
λ=vlnová
délka světla 0.61= konstanta pro tzv. inkoherentní
světlo.Cave: modré
světlo 400-
470 nm;
zelené: 565 nm; červené
: >600nm;Max. RS oka: 500-1000 um , SV: 0.2 um (200nm) ,
*
*
*
Typy světelných mikroskopůKlasické
transmisní
pro denní
světlo
Inverzní
pro práci s buněčnými kulturamiFluorescenčníPolarizační
Pomocná
zařízeníFázový kontrastFotodokumentace a analýza obrazu
Rozlišovací
schopnost objektivu
(RS) = Nejmenší
vzdálenost mezi 2 body kdy ještě
„nesplývají
v jeden“RS = 0. 61 x λ/n.sin alfa
n= refrakterní
index skla, montovacího a imersního mediasin alfa = ½
sinus vstupního úhlu světla = numerická
apertura ! (NA)
λ=vlnová
délka světla 0.61= konstanta pro tzv. inkoherentní
světlo
1. 3 Typy
a vlastnosti
objektivů
pro SM:1. Suché
2. Imersní: (olejové, nebo
vodní)
Vady
objektivů
a jejich
korekce
(kombinací
vícero
typů čoček
z různých
druhů
skla-
flintové, korundové,křemičité
):
1. Vada
chromatická: Části
spektra
s odlišnou
λ
mají
různý
fokus→ neostrý
obraz.
Objektivy
s korekcí
pro 2 barvy: achromáty; pro 3
barvy:
apochromáty
2. Vada
sférická: Střed
čočky
láme
světlo
více
než
okraje
→ neostrý obraz
3. Nerovnoměrné
zakřivení
zorného
pole. Objektivy
s korekcí: planapochromáty
(dokonale
ploché
pole)
Nervová
tkáň
v trasnsmisním
světelném mikroskopuParafin, H&E, 400x
a mozečku v trasnsmisním
světelném mikroskopuafin, H&E, 200x
Kůra mozečku v trasnsmisním
světelném mikroskopuParafin, Luxol stain, 600x
Buňky ve fázovém kontrastu v kultuře(jádra a cytoplazma s organelami vč. cytoskeletu)
* text z Jaečková
a ost
Inverzní
světelnýmikroskop
*
*
* text z Jaečková
a ost
*
Mikrofilamenta
zobrazena protilátkou proti aktinu
fluorescenční
technikou
mouse
mab
anti-actin, anti
mouse
IgG-FITC
9.1 4. Konfokální
mikroskop
pracuje
s
laserovým
(i) paprskem(y), kterými
excituje
fluorochrom
navázaný
na molekuly
buňky. Mikroskop
provádí
automaticky
skanování
objektu
v různých
hloubkách. Získané obrazy
automaticky
zaznamenává
a umožňuje
tak
prostorové
(„3D“)
zobrazení
molekul
a organel
v
buňce.
*
*Pala a Krist 2008
*
*
*
*
Výroba monoklonálních
protilátek
Ferenčík
RS EM = 0. 61 x λ/n.sin alfa
= 0.0002 um (0.2 nm, 2A ) RS(λ
elektronů
0.005 nm
(50 000 V
na katodě)
9. 2 Elektronovýmikroskop
1. Trasmisní
(TEM)2. Skanovací
(SEM)
*
*
EM gliových
buněk v kultuře
Gliové
buňky v kultuře extra situm(Skenovací
elektronový mikroskop zobrazující
povrch buněk)
Optimální
růstové
podmínky Změny po chemicky vyvolanéinhibici růstu
9.5 Příprava
mikroskopických
preparátů
a jejich
barvení
9. 5. 1 Typy
mikroskopických
preparátů: a. Nátěry
b. Otisky
c. Roztlače d. řezy9. 5. 2. Fixace
biologického
materiálu: Denaturace
a inaktivace
bílkovin,
především
enzymů. Tím
se zabrání
samovolnému
rozkladu
tkáně
lyszomálními enzymy
(konservace
tkáne). Denaturace
bílkovin
vyvolá
změny
prostorové
konfigurace
bílkovin
a tím
často
zlepší
dostupnost
(„obnaží“) reaktivní
funkční skupiny
molekul
buňky. Chemická
fixativa
(viz
níže) mohou
některé
molekuly
z
buňky
vyluhovat.
Typy fixace:Fyzikální
(zmražení, mrazové
vysoušení, krátkodobé
zvýšení
teploty,
mikrovlné
záření) Chemická
(formaldehyd, ethanol, methanol, aceton, kyselina
octová,
pikrová, osmičelá
a j.)
Nejčastěji
použivané
fixační
směsi:
Carnoyova
tekutina
(ethanol + octová
kys.+ ev. chloroform, 6:3:1, Bakerova
tekutina: 10% formol-chlorid
vápenatý, Buinova
tekutina: formalin 37% 25 ml, pikrová
kyselina
nasycená
75ml, octová
kyselina ledová
5 ml).
9. 5. 3 Zalévání
vzorku
do zpevňujících
mediíProsycení
biologického
vzorku
pevnou
látkou
(viz
níže) umožní
krájení
tenkých
řezů. Předchází
„vyprání“
fixativa, dehydratace
tkáně
a její
prosycení
rozpustidlem
zalévací
hmoty.
Nejčastější
zalévací
hmoty: Celoidin
(nitrocelulóza
v ethanolu), parafin, Paraplast-Plus (+ DMSO), sacharóza, polymerizující
pryskřice
pro EM.
9. 5. 4 KrájeníPro studium
tkání
pod mikroskopem
je nezybtné, aby
tloušťka
prohlíženého
objektu
nebyla
větší
než
průměrná
velikost
buněk
(7-20 um). V opačném případě
se totiž
obrazy
buněk překrývají.
Řezy
tkání
se pro SM připravují
na
speciálních
zařízeních, tzv. mikrotomech, s kovovým
nožem. Dle
konstrukce
se mikrotomy
dělí
na
sáňkové
(objekt
je pevně
zachycen
a pohybuje
se nůž) a rotační
(nůž je pevně
uchycen
a objekt
se pobybuje). Krájení
zmražených
tkání
se provádí
na
tzv. zmrazovacím
mikrotomu
nebo
kryostatu, pracujícím
při
minus 20- 30oC.
Mikrotomy
pro EM používá
velmi
tvrdý
a ostrý
skleněný
nůž, který
umožní krájet
trvzenou
pryskyřici
o tlouštce
řezu
ve
zlomích
mikrometru.
9. 6 BarveníCílem
barvení
je zobrazit
bunňky
pro pozorování
ve
SM nebo
EM. Před
vlastním
barvením
je nutno
ze
vzorku
odstranit
zalévací
medium (např. parafin xylenem
, pryskyřice
methanolem
a peroxidem
vodíku. Preparáty
pro EM se
„barví“
ionty
těžkých
kovù
(Os, U aj.) ještě
před
zalitím
do pryskyřice. Barvení
orthochromatické: barva
buněk
a barviva
je stejná.
Barvení
metachromatické: Barvivo
barví
některou
komponentu
biologického vzorku
odlišně.
9.6.1 Přehledné
(nespecifické) barvící
metody:Barvení
diachromy
(chromogeny): Pigmenty pohlcující
viditelnou část
spektra. Vytvoření
kovalentní
vazby
mezi
ionizovanými
skupinami organických
molekul
buněk a iontem
barviva
(=reaktivní
látky
s
aromatickým
řetězcem
a vysoce
pohyblivými
elektrony).
Kationická
(basická) barviva
(pararosanilin, basický
fuchsin, kresylvioleť, toluidinová
modř, hematoxylin) obsahují
volné
kationtové
skupiny
a váží
se proto na
aniontové
skupiny
organických
molekul
buněk
(karboxylové, hydroxylové, fosfátové, sulfátové
a další). Barví
proto hlavně
nukleové
kyseliny
a tzv. ”kyselé”
proteiny, obsahující
četnější
dikarboxylové aminokyseliny.
Anionická
(kyselá) barviva
(žlutá
kyselina
pikrová, červený
eosin a j.) obsahují
volné
aniontové
skupiny
se váží
na
kationtové
skupiny
organických
molekul
buněk
(aminoskupiny, iminoskupiny
sulfhydrylové, β-indolylové
a imidazolylové, aj.). Barví
např. “basické”
tj. diamino
aminokyseliny
obsahující
proteiny
(histony).
9. 6 Speciální
histochemické
a cytochemické
metody
-74)
9. 6.1 Přímé
barvení
organických molekul
(např. DNA Feulgenovou
reakcí, polysacharidů
alciánovou
modří, RNA galocyanimem
apod.)
9.6.2
Katalytická
histochemie enzymů
(příloha str. 74)Enzym + jeho substrát---> štěp substrátu, který se převede na barevný produkt. Barevný produkt vzniká:(i) Srážením produktu enzymatické
reakce s kationty
těžkých kovù
(Gomoriho
reakce: kationtem
těžkého kovu se sráží
štěpný produkt, vzniklý činností
enzymu. Průkaz fosfatáz, cholinesterázy, sulfatázy, glukuronidázy).
Příklad: glycerofosforečnan
sodný jako substrát fosfatáz
+ enzym + Ca++ ----> fosforečnan vápenatý. Přidání
AgNO3 ---> fosforečnan stříbrný, který se redukuje na stříbro
(ii) tzv. azokopulací.
Bezbarvá
diazoniová
sùl
je zbytkem syntetického štěpného substrátu přemění
na azobarvivo. Vhodné
pro fosfatázy, esterázy karboxylových kyselin, aminopetidázy
aj.Příklad: fosforečný fosfát alfa naftolu + fosfatáza
--> štěpný produkt na který se váže bezbarvá
diazoniová
sůl (Fast
Blue
B, Fast
Red
TR Salt a j.), která
se přemění
na barevný pigment(iii) Tzv. Indigogenní
reakcí: Indoxyl, uvolněný enzymem z indoxyl-substrátu se oxiduje kyslíkem na indigo. Vhodné
pro nespecifické
esterázy, glukozidázy, galaktosidázy, fosfatázy.
(iv) Tzv.tetrazoliovou
reakcí: Tetrazoliová
sůl je redukovaná
vodíkem, který se uvolňuje ze syntetických substrátů
flavinovými
enzymy (jejichž
přítomnost chceme prokázat), a která
se mění
na barevný a nerozpustný formazan. Vhodné
pro dehydrogenázy, monoaminoxidázy, disacharidázy
9. 6. 4 Imunocytochemie
(obr. 66 a příloha str. 71)Proti studované
molekule se na zvířecím modelu nebo pomocí
tzv.
hybridomu
v buněčné
kultuře (viz níže) nejprve vyrobí
(dnes již
skoro vždy koupí) specifická
protilátka, se kterou se buňky inkubují.
Protilátka se tak specificky naváže na molekuly, které
chceme studovat. Tato tzv. primární
protilátka je bezbarvá
a proto se musí
vizualizovat
přímým, nebo nepřímým navázáním-konjugací (“vmezeřením”
tzv. sekundární
protilátky při tzv.nepřímé
metodě
barvení) vhodného fluorochromu
(nejčastěji tzv. FITC, TRITC, Texas Red-Cy3, Cy5 a další
s emisními spektry různé
vlnové
délky, barva
zelená, modrá
červena aj.).
Příklad:
Průkaz vimentinu, bílkoviny středních filamet
cytoskeletu. Buňky se inkubují
s primární
protilátkou proti vimentinu, isolovanou ze séra např. králíka imunizovaného vimentinem. Následuje inkubace s protilátkou proti králičímu imunoglobulinu
(vyrobenou např. na praseti nebo ovci a pod.), konjugovanou s některým fluorochromem
(viz shora). Struktury obsahující
vimentin
zeleně
fluoreskují
po excitaci svìtlem
specifické
vlnové
délky). Viz praktikum
Atom Force
Microscopy
(AFM)
Poznámka: (a) Protilátky izolované
z krve imunizovaného zvířete obsahují imunoglobuliny
proti mnoha epitopům
(= usekům
polypeptidického
rětězce) dané
látky-antigenu, např. vimentinu, který byl použit k imunizaci zvířete. Proto protilátky polyklonální,
neboť
jsou tvořeny vícero klony lymfocytů.
Protilátky monoklonální
se připravují
v prvním kroku imunizací
myši. Z imunizované
myši se isolují
lymfocyty, které
se jednotlivě
“spojí”
(hybridizují) s
nádorovými buňkami myší
sleziny (myelomové
buňky). Vznikají
tzv. hybridomy, z
nichž
každý tvoří
protilátky proti pouze jednomu epitopu
(= úseku polypeptidického
řetězce) daného antigenu (např. vimentinu).
(b) Sekundární
protilátka může být též
konjugovaná
s enzymem, např. křenovou peroxidázou
(KPx),alkalickou fosfatázou
a pod. Komplex je pak vizualizován
inkubací
se substrátem specifickým pro konjugovaný enzym, který je enzymem štěpen a který oxiduje další
bezbarvou látku, která
se mění
na barevný produkt
(např. KP rozkládá
H2O2, který oxiduje bezbarvý diaminobenzidin
na hnědý pigment).
Průtoková
(flow-) cytofotometrieTřídiče buněk (cell sorters)
BlottingPodobně
lze imunochemicky
specifikovat bílkoviny isolované
elektroforézou.
Z elektroforetogramu
se bílkoviny přenesou tzv. blottovaním
(blott
angl. sací papír) nebo elektrickým nábojem na speciální
membránu, která
se inkubuje
s příslušnými protilátkami a dalšími reagenciemi.
Metoda se označuje mezinárodně
jako Western blotting
v případě, že jsou takto studovány bílkoviny. Northern
nebo Southern
blotting
se používá
pro
detekci sekvencí
nukleových kyselin. V posledních 2 aplikacích se místo imunochemického
postupu může použít i postup autoradiografický
po
předchozím označení
tzv. nukletidové
sondy radioizopem.
Poznámka k terminologii. Blottovací
metoda byla poprvé
navržena E. Southernem
pro izotopové
studium DNA. Názvy modifikací
podle
světových stran jsou slovní
hříčky.
S (DNA-radio-
DNA, tzv. DNA sonda)
N (DNA-radio
RNA, tzv.RNA sonda)
W (Protein-protilátka)EGlycan-lectin
E. Southern
Macromolecule
blotting
and
probingThe
terms
northern, western
and
eastern
blotting
are derived
from
what
initially
was
a molecular
biology joke
that
played on the
term Southern
blotting, after
the
technique
described
by Edwin
Southern
for
the
hybridisation
of
blotted
DNA. Patricia Thomas, developer
of
the
RNA blot
which
then
became
known
as the
northern
blot
actually
didn't use the term[2]. Further
combinations
of
these techniques
produced
such terms
as southwesterns
(protein-DNA hybridizations), northwesterns
(to detect
protein-RNA interactions) and
farwesterns
(protein-protein interactions), all
of
which
are presently
found
in the
literature. Wikipedie…….
Western (protein-protein)
Southern
(DNA-DNA)
Northern
(DNA-RNA)
Eastern
(glycan-lectin)
E. Southern
9. 10 Hybridizace
nukleových
kyselinDvouvláknová
DNA (double stranded
DNA, dsDNA) se denaturací
teplem
rozvlákní
a na každé
vlákno (single stranded
DNA, ssDNA) se naváže komplementárním párováním předem připravená
jednovláknová
molekula RNA,
nebo fragment DNA (tzv. DNA sonda), které
jsou „označena“
isotopem nebo fluorochromem. Tento proces spojení
nukleových kyselin se označuje jako
hybridizace. Komplex se zviditelní
autoradiograficky
nebo ve fluorescenčně. V případě, že objektem stdua
jsou celé
buňky, lze takto lokalizovat např. geny v
jádře i na jednotlivých chromozomech, studovat jejich expresi, vyhledávat mutované
geny atp. Jde o tzv. hybridizaci in situ. Zkratka často používané
FISH
metody pak znamená
„Fluorescence In Situ
Hybridization“.
DNA microarrays
(arrays= řady, šiky, nepřekládá
se do češtiny) jsou založeny rovněž
na principu hybridizace nukleových kyselin. Na malou pevnou podložku
(cca 2x2 cm) se roboticky
nanese formou mikroteček několik set i více známých nukleotidových
sond do
„řádků“-
arrays
(průměr tečky cca 100 um, 100-1000 a
více. Na takovýto „čip“
se pak nanese nukleová
kyselina jednoho nebo vícero studovaných vzorků( mRNA
po předchozím přepisu do DNA). Molekuly z obou
vyšetřovaných vzorků
jsou označeny 2 odlišnými fluorochromy
(např. zeleně-FITC nebo červeně-TRITC). V místě
komplementární
vazby nukleotidových
sekvencí
sond a vyšetřovaného vzorku (hybridizace) vznikne pevná
vazba a objeví
se odpovídající
fluorescence. V
případě
vazby molekul 2 vzorků
na týž
gen vzniká
sumaci obou fluorochromů
barva žlutá
až
bílá. Vazba se vyhodnocuje se roboticky
Protein microarays. Pracují
na podobném principu. Reagovat se však nechává protein s protilátkou. Podrobněji v molekulární
biologii
Poznámka.
Elektroforéza je způsob separace látek v
elektrickém poli, ve kterém se látky pohybují
ve směru opačného náboje. Klasickým nosičem je agarózový
nebo polyakrylamidový
gel, který funguje rovněž
jako síto přes které
se molekuly pohybují
rychlostí
nepřímo úměrnou jejich molekulové
hmotnosti. Metoda má
mnoho variant. Provádí
se pomocí
řady komerčních zařízení. V
předkládaných skriptech je zmíněna ELFO separace bílkovin např. pro Western blotty, nukleových kyselin pro DNA finger
printing, hybridizaci nukleových kyselin (Southern
a Northern
blotty, viz shora). Více v
Základech chemie a fyziky a Molekulové
biologii.
Microarrays
Na destičku (chip) zhruba 2x2 cm je nanesen velký ppikomolárních
množství
tzv. DNA prób,charakteristic
pro různé
geny. Po inkubaci ve směsi fluorescenčněoznačených molekul i mRNA
zkoumaných buněk, doj
navázání
partnerských molekul principem párovánínukleotidových
bazí
(hybridizace). mRNA
jedné
sku
je označena červeně, druhá
skupina zeleně. Geny exv obou skupinách buněk svítí
žlutě
až
bíle. Nanášení
i odečítání
je robotické. Slouží
k mapovaní
genomu
ajeho exprese. http://en.wikipedia.org/wiki/DNA_micro
Microarrays
Hybridization
of
the
target
to the
probehttp://en.wikipedia.org/wiki/DNA_microarray
http://en.wikipedia.org/wiki/File:Microarray-schema.jpg
9.6.3 Izotopové
„značení“
molekul, organel a buněk-
autoradiografie
Radioaktivně
značená
prekurzorová
molekula se po podání
zvířeti nebo buňkám v kultuře inkorporuje do molekuly, organely a buňky, které
chceme studovat. Místo
inkorporace se zobrazí
fotografickým principem pomocí
speciální
fotoemulse, která se navrství
na histologický řez nebo jiný preparát buněk (autoradiografie). Studovat
lze takto i rozložení
např. iontů
a anorganických molekul.Příklad:
3H-thymidin
se podá
zvířeti nebo živým buňkám v tkáňové
kultuře. Inkorporuje se do DNA buněk v S-fázi buněčného cyklu. Nad buňkami se objeví
mikroskopická
černá
zrníčka stříbra (viz preparáty na praktiku).Podobně
je možno zobrazit radioaktivně
značené
fragmenty nukleových kyselin
nebo bílkoviny rozdělené
elektroforézou. Využití
autoradiografie
pro tento účel (tzv. Southern
blott, viz též
9.6.4 ) je dnes nejčastější. Neposkytuje však informaci
o lokalizaci inkorporovaného izotopu v
buňce.
Příklad. Místo 3H-thymidinu
se podá
zvířeti nebo živým buňkám v tkáňové
kultuře atypický nukleotid (nejčastěji bromdeoxyuridin), který buňka nerozpozná
jako pozměněný a inkorporuje jej do DNA místo thymidinu. Způsob detekce pomocí
protilátky proti bromodeoxyuridinu
je uveden v
následující
kapitoly.
Izotopové
i imunocytochemické
značení
jaderné
DNA se využívá
k
nepřímému studiu buněčného cyklu. Podíl „značených“
buněk v
celkové
populaci určuje relativní
délku S-fáze.
V případě, že buňky již
později nedělí
(např. neurony), inkorporovaná
„značka“
ukazuje kde a kdy buňka procházela časnou proliferační
fází
(tzv. tracing
buněk). Tato místa jsou v některých orgánech značně
vzdálená
místům konečné
lokalizace diferencovaných buněk. Příklady na praktiku.
Isolace chromozomů
hypotonickým šokem
