Pátráme po mikrobechDíl IX.

Průkaz nukleové kyseliny

Ondřej ZahradníčekK praktickému cvičení pro VLLM0421c

zahradnicek@fnusa.cz

Obsah této prezentace

Metody detekce nukleové kyseliny

Princip PCR

PCR prakticky

Kontrolní otázky

Úvod – pohádka

Pohádka• Když Lipold, syn rolníka z Křídlovic,

zemřel léta Páně 1184, jeho smrt provázela spousta dohadů. Byly to opravdu souchotiny, na co umřel? Mezi lidem se říkalo, že jeho bratr Děpold mu záviděl, že jeho díl pole je lepší a má lepší přístup ke slunci.

• Teprve za více než osm století se ukáže pravda: Lipoldovou smrtí opravdu nebyl vinen Děpold, ale Mycobacterium tuberculosis

Poučení z naší pohádky• Průkaz nukleové kyseliny je velmi

citlivá a přesná metoda – někdy tak citlivá, že se její citlivost musí uměle omezit, aby nebyly zachyceny náhodné komponenty

• Zajímavostí je, že mikrobiální DNA lze zachytit i v kosterních pozůstatcích stovky let starých

• Tyto metody používáme zejména tam, kde jiné přímé metody jsou obtížně proveditelné či málo spolehlivé

Metody detekce nukleové kyseliny

Použití metod průkazu DNA (RNA) v klinické mikrobiologii

• Tyto metody používáme zpravidla tam, kde mikroskopický a kultivační průkaz je obtížný nebo není vůbec možný

• Typickým příkladem je M. tuberculosis• Nehodí se příliš pro běžné patogeny

přítomné ubikvitárně. Pro svou velkou citlivost by ruče vyčenichaly kdejakou molekulu přilétlou z vnějšího prostředí

• Metody nejsou ani neužitečné, jak si někdo myslí, ani samospasitelné, jak si myslí pro změnu jiní

Důležité upozornění• Nehodláme studenty učit

principiální otázky týkající se molekulárních metod. K tomu jsou určeny jiné předměty

• Naším cílem je seznámit studenty s přehledem využitelnosti těchto metod v lékařské mikrobiologii.

• Jedince s hlubším zájmem o tuto problematiku ve 3.–5. ročníku rád přivítá as. Filip Růžička ve volitelném předmětu VSMB081

Průkaz nukleové kyseliny• Metody bez amplifikace (genetické

sondy). Jsou méně citlivé, to je někdy i výhoda

• Polymerázová řetězová reakce (PCR) velmi citlivá, stačí i jedna molekula DNA. Lze ovšem uměle citlivost snížit. Za PCR vděčíme Dr. K. Mullisovi, který obdržel v roce 1993 Nobelovu cenu za objev PCR.

• Ligázová řetězová reakce (LCR) je velmi podobná (ale zavedla ji jiná firma)

• Průkaz virové RNA je možný pomocí upravené PCR

Další členění PCR ve smyslu různých cílových molekul amplifikace

• specifické PCR (specifický gen pro enzym, faktor patogenity apod.)

• „multiplex PCR“ (několik specifických cílových míst v jedné reakci)

• univerzální (cílové místo = gen, který mají všechny bakterie – např. 16S rRNA)

DNA mikroarray ("mikročip")• DNA čip (DNA microarray) je kolekce spotů ("skvrnek")

mikroskopických vláken DNA na destičce (skleněné, silikonové).

• DNA čipy se používají ve výzkumu k měření úrovně exprese u velkého počtu genů (104, i 106) simultánně nebo ke genotypové analýze více oblastí genomu

• Každý spot obsahuje několik molekul jednoho konkrétního DNA oligonukleotidu (próby, reportery). Vzorek se přivede do kontaktu se spotem.

• Nyní molekuly vzorku (nazývané cílové) hybridizují s komplementárními molekulami přichycenými na destičce.

• Produkty hybridizace jsou detekovány pomocí cílů označených fluoroforem (či jinak).

• Výsledky bývají zpracovány bioinformatickými postupy.• Obdobou DNA čipů jsou RNA čipy a proteinové čipy.

DNA microarray

http://dnaandgenome.blogspot.com/2010/09/dna-microarray.html

Real-time PCR• Též nazývána kvantitativní polymerázová

řetězová reakce (Q-PCR/qRT-PCR)• Kvantita může být vyjádřena jako absolutní

množství kopií či jako relativní počet• Je založena na principu klasické PCR, avšak

amplifikovaná DNA je detekována tak, jak reakce pokračuje ve skutečném čase.

• Dvě nejčastější metody, používané k detekci produktu při RT-PCR:– nespecifická fluorescenční barviva, která se

vážou na jakoukoli dvouvláknovou DNA– DNA sondy sekvenčně specifické

(oligonukleotidy označené fluorescenčním reporterem, který umožňuje detekci pouze v případě hybridizace sondy s komplementárním cílem DNA)

Detekce fluorescence u RT-PCRhttp://www.lfhk.cuni.cz/farmakol/interakce/micuda/real-PCR.htm

LCR rusky

molbiol.edu.ru/review

Princip PCR

Základní schéma reakce PCR

• V první fázi je nutno získat izolovanou DNA. Proces je poměrně složitý.

• V druhé fázi probíhá vlastní amplifikace (pokud vzorek obsahuje úsek DNA odpovídající příslušnému primeru

• Ve třetí fázi probíhá detekce produktu amplifikace– Gelovou elektroforézou nebo– Metodou ELISA (≠ serologická ELISA

k průkazu mikrobiálních antigenů nebo protilátek!!!)

– Použitím fluorescenční sondy– Jinak

Izolace DNA• Izolace DNA je proces, který musí

předcházet vlastní PCR. Zahrnuje rozbití buněk a odstranění nadbytečných součástí přítomných ve vzorku.

Amplifikace specifických úseků DNA metodou PCR

• Je to jádro vlastní reakce PCR. Využívá se Taq polymerázy.

Postup izolace DNA pro PCR

PC

R a

tep

lota

Vývoj PCR byl umožněn výzkumem vedoucím k objevení Taq polymerázy z termofilní bakterie Thermus aquaticus, která umí přežít vysoké teploty.

PCR proces

www.pcrstation.com/images

toxics.usgs.gov

Termocyklery

kinich.cifn.unam.mx

http:///images/110.jpg

PCR prakticky

Proč je důležitá interní kontrola

• Velmi běžným jevem je, že dochází k.tzv. inhibici reakce. Inhibice reakce je dána přítomností různých interferujících látek (např. talek z rukavic)

• Proto by měla být pro detekci vždy použita směs, obsahující kromě vzorku a jemu příslušných primerů ještě kontrolní DNA + primery. Pozitivita IC je dokladem, že nedošlo k inhibici reakce

• Ovšem pozor: IC může být negativní u vysoce pozitivních vzorků (prohraje v.kompletici o nukleotidy). To ale nevadí, je-li viditelný pozitivní výsledek reakce, nemůže jít o inhibici

Možné výsledky PCRNásledující možnosti platí bez ohledu na

způsob detekce (gelovou elektroforézou nebo ELISou)

• Pozitivní výsledek vzorku svědčí o pozitivitě vzorku. Přitom výsledek IC je zpravidla také pozitivní, ale u silně pozitivních případů nemusí být.

• Negativní výsledek vzorku při pozitivním výsledku IC = negativní výsledek reakce

• Vzorek i IC negativní = inhibice reakce

Přehled interpretaceVlastní reakce

Interní kontrola

Interpretace

negativní pozitivní negativní

negativní negativní inhibice reakce

pozitivní pozitivní pozitivní

pozitivní negativní (vysoce) pozitivní

Detekce výsledků PCR pomocí gelové elektroforézy• Gelová elektroforéza je jednou

z.možností detekce produktu PCR• Produkty putují gelem od katody

směrem k anodě a jsou zviditelněny pomocí UV-transluminátoru

• Každý vzorek obsahuje také interní kontrolu (IC)

• Kromě vzorků je použit také žebříček (ladder) jako měřítko

Příklad gelu (www.medmicro.info)

Pacienti 1 a 4 – pozitivní, pacient 2 – negativní, pacient 3 – inhibice reakce. 5 – pozitivní kontrola, 6 – negativní kontrola, 7 – ladder

Vlastní reakce

IC

Průkaz produktu PCR metodou ELISA

• V praktiku J08 se probírá využití metody ELISA k průkazu antigenů a protilátek

• Přístup, používající ELISA k detekci produktu PCR, je však jiný. Nejde tu o sérologické použití této reakce, ale o ELISA-detekci produktu PCR. Proto i zde máme vedle důlku vzorku také důlek patřící IC.

RT-PCR• Používá se jiná (fluorescenční) metoda detekce

produktu• Průběh reakce je zaznamenáván v reálném

čase• Nicméně i zde máme tři typy výsledku reakce:

pozitivní/negativní/inhibice

Linie vlastní reakce

Linie interní kontroly

Pozitivní

Negativní

Inhibice

Porovnání výsledků dvou reakcí: průkaz protilátek a PCR

• V řadě případů nelze spoléhat jen na výsledek jediné reakce. Pro interpretaci potřebujeme kombinaci výsledků různých reakcí.

• V daném případě máme k dispozici výsledek PCR a výsledek reakce ELISA

• Musíme mít na paměti, že PCR je přímý průkaz, ELISA k průkazu protilátek je průkaz nepřímý se vším všudy

Konecwww.roche.com/pages/facets/1/chlamyde.htm.

Mycobacterium tuberculosis

• Je to původce všech forem tuberkulózy• Zajímavé na tomto mikrobovi je, že žije uvnitř

buněk. Jedním z důsledků je i to, že imunita je převážně buněčná a protilátková odpověď je slabá a nejistá. Proto se nepřímá diagnostika v praxi nepoužívá.

• Mikroskopie je možná, ale vyžaduje speciální barvicí metodu zahrnující zahřívání (Ziehl-Neelsen, viz praktikum P08)

• Kultivace je také možná, ale vyžaduje speciální média a trvá několik týdnů

• Proto je PCR dobrým řešením pro diagnostiku.

http://www.genomeindia.org

Kontrolní otázky

• 1. Které mikroorganismy je výhodné detekovat pomocí PCR?

• 2. Jak zabránit kontaminacím PCR?• 3. Jako lékaři dostanete zprávu z laboratoře: „Výsledek

PCR vyšetření na lymeskou borreliózu u pacienta XY: inhibice reakce“. Jak budete takovou zprávu interpretovat?

• 4. Petr má čerstvou infekci Lymeskou borreliózou s neurologickými příznaky (trvá asi týden). Jaké budou asi jeho výsledky PCR, ELISA IgM a ELISA IgG?

• 5. Jaký je hlavní rozdíl mezi genetickou sondou a PCR?• 6. Jak se nazývá test, který se používá pro paralelní

testování exprese většího množství genů?• 7. Co znamená zkratka RT-PCR• 8. Jaký je základní rozdíl mezi klasickou PCR a RT-PCR?• 9. Které metody lze použít k detekci produktu PCR v

lékařské mikrobiologii?

Formulace nemusí přesně odpovídat formulaci otázek v IS MU!