1 POLYMERNÍ FILMY V MEDICÍNĚ A ELEKTRONICE VÁCLAV ŠVORČÍK Ústav inženýrství pevných látek, Vysoká škola chemicko-technologická, Technická 5, 166 28 Praha, e-mail: [email protected]V této práci jsou shrnuty některé poznatky o využití polymerních filmů v medicíně a v elektronice. Pozornost byla věnována zejména oblastem, kterými se zabývá naše skupina na VŠCHT. V oblasti polymerů v medicíně je to studium modifikovaných polymerů jako nosičů pro pěstování kožních buněk při léčbě poškození kůže (popáleniny, bércové vředy, …) nebo interakce těchto filmů s buňkami hladkého svalstva pro cévní protézy. V oblasti využití polymerů v elektronice se zabýváme studiem dotace filmů diplóly pro konstrukci čidel (např. teplotních). Jsou studovány struktury kov-polymer-kov, které jsou základem tzv. tunelovacích diod a příprava metalizovaných polymerů, které lze využít při balení a ohřevu potravin. POLYMERY V MEDICÍNĚ Při řízené interakci buněk se substrátem jsou aplikovány dvě základní strategie. První se snaží o vytvoření dokonale inertních materiálů, jež by nedovolovaly adhezi ani růst buněk na jejich povrchu. Tento typ materiálů je žádoucí např. při konstrukci kontaktních čoček nebo některých zařízení, která jsou v kontaktu s krví 1 . Druhým přístupem je tvorba substrátů, jež by naopak podporovaly adhezi (uchycení), proliferaci (růst) a diferenciaci (vyzrávání) buněk. Pouze diferenciované buňky jsou schopny správně plnit všechny své životní funkce. V transplantační medicíně je nutné správné fungování transplantátu a jeho integrace s okolními tkáněmi (v případě kostí, parenchymatických orgánů a obvykle také cév) 2 . Tento typ umělých transplantátů může být před samotnou transplantací kolonizován pacientovými buňkami (in vitro) a tím může být sníženo riziko odmítavé reakce imunitního systému. Dále jsou diskutovány dva příklady využití polymerních substrátů v medicíně (cévní náhrady, nosiče pro kultivaci kožního krytu). Bylo prokázáno, že snížení trombogenicity a podpoření správného fungování cévních náhrad může být dosaženo pokrytím povrchu umělé cévy vrstvou autologních buněk před implantací do organismu 3 . Tato metoda odpovídá základní myšlence tkáňového inženýrství vytvářet funkční náhrady tkání kombinováním biologicky aktivních buněk a vhodných materiálů. Jedná se o poměrně mladou techniku, první pokusy byly zahájeny v 80. letech a první klinická data byla publikována v roce 1992.
Transcript
1
POLYMERNÍ FILMY V MEDICÍNĚ A ELEKTRONICE
VÁCLAV ŠVORČÍK
Ústav inženýrství pevných látek, Vysoká škola chemicko-technologická, Technická 5,
26. Efimenko K., Rybka V., Švorčík V., Hnatowicz V.: Appl.Phys A 67, 503 (1998).
27. Švorčík V., Efimenko K., Rybka V., Hnatowicz V.: Appl.Phys. A 68, 357 (1999).
8
Geneticky modifikované organismy M. Ondřej Ústav molekulární biologie rostlin AVČR* 1. Vymezení pojmů
Pro začátek bude užitečné uvést několik definic, aby se vytříbily základní pojmy, které se v dalším textu budou používat. Termíny jsou obecně známé, ale různí autoři je používají v různém smyslu. Zde uvedené definice si nedělají nárok na univerzální platnost. Genetika je věda o dědičnosti a její proměnlivosti. Molekulární genetika je ta část genetiky která studuje dědičnost na molekulární úrovni, konkrétně na úrovni nukleových kyselin a proteinů. Genové inženýrství nebo genové manipulace jsou tou částí molekulární genetiky, která využívá specifických enzymů, jež umožňují provádět přesné, reprodukovatelné zásahy do DNA. Je to především rekonstrukce poměrně krátkých úseků DNA a analýza jejích primárních sekvencí (sledů) bází. Pro DNA, jež byla sestavena metodami genového inženýrství z různých úseků, pocházejících z odlišných organismů, se vžil termín rekombinovaná DNA (rDNA). Šlechtění je technologie, která využívá genetiky a dalších vědních oborů ke tvorbě nových odrůd a jejich udržování. Biotechnologie představují aplikaci metod genového inženýrství a dalších moderních laboratorních metod (tkáňové a buněčné kultury) v biologické produkci. Bioetika pojednává o uplatnění etických principů v biologii a jejím praktickém využití. Těsně s ní souvisí otázky zákonných norem, legislativy biotechnologií a geneticky modifikovaných organismů. Tyto obory se překrývají v ne příliš velkém, ale velmi důležitém prostoru, který bude předmětem této přednášky. Přednáška bude pojednávat nejvíce o rostlinách, protože geneticky modifikované odrůdy rostlin jsou často ne zcela informovaně diskutovány. V prvé řadě je nutno si ujasnit, co jsou a co nejsou tak zvané genové manipulace, zda a v čem se liší od předchozích přístupů, jež našly praktickou aplikaci ve šlechtění. 2. Souběžný vývoj genetiky a šlechtitelských metod 2.1. Období klasické genetiky
Hlavním praktickým výsledkem, kterým genové inženýrství přispělo ke šlechtění, je přenášení genů nezávisle na taxonomické vzdálenosti a tvorba geneticky modifikovaných organismů, které obsahují jeden nebo několik genů, vnesených do genomu metodami genového inženýrství a biotechnologií. Chceme-li se dovědět, co je na nich nového a co je pokračujícím uplatněním rozšiřujících se genetických metod, je třeba si uvědomit paralelní vztah vývoje genetiky a vývoje šlechtění. Ještě jsme neslavili sté výročí vzniku genetiky. Mendel své objevy o štěpení znaků v potomstvu hybridů sice publikoval již v r. 1864, ale upadly v zapomenutí a teprve na počátku tohoto století byly znovuobjeveny. Termín genetika vznikl v r. 1906 na schůzi Královské zahradnické společnosti v Londýně, kdy prof. William Bateson navrhl, aby se takto nazývala nově vznikající věda o dědičnosti. Celé 20. století je dobou intenzivního rozvoje genetiky a šlechtění. Již pravěký člověk sil obilí a k setí uchovával zrno nejlepších rostlin. Tento princip umělého výběru se uchoval jako jediná metoda šlechtění prakticky až do 19. století. Teprve v průběhu 17.-18 století bylo definitivně prokázáno, že pyl rostlin působí jako samčí princip a to vedlo k postupnému zavádění záměrného křížení do šlechtění rostlin. První semenářské a šlechtitelské podniky vznikaly až na přelomu 19. a 20. století a teprve uplynulé století je stoletím rozvoje šlechtění. Hlavní přínosy genetiky pro šlechtění se projevily v těchto nových přístupech:
2. Indukce polyploidie - znásobení počtu chromosomů (od r. 1930). 3. Vzdálená hybridizace, tedy hybridizace mezi různými biologickými druhy nebo dokonce
rody. Vzdálenější hybridizace se klasickými metodami nepodařila (asi od r. 1930). 4. Indukce mutací ionizujícím zářením a chemickými mutageny (přibližně od roku1930). 5. Genetické uplatnění tkáňových kultur (přibližně od roku 1960). 6. Nové možnosti dané genovým inženýrstvím (přibližně od roku 1970). Ad 1) Hybridologická analýza: S možností výpočtu předpokládaných frekvencí určitých kombinací genů v potomstvu hybridů bylo možno plánovat potřebný rozsah šlechtitelského materiálu a tím zefektivnit proces šlechtění. Ad 2) Zdvojování počtu chromosomů (vznik polyploidních buněk a jedinců). Základem je blokáda tvorby vřeténka v anafázi buněčného dělení prostřednictvím některých látek, z nichž nejvýznamnější je kolchicin. Důsledkem je vznik buněk a z nich celých rostlin s dvojnásobným počtem chromosomů. To má své důsledky pro možnosti vzdálené hybridizace. Ad 3) Vzdálené - mezidruhové křížení: Zde se perspektivy průběžně rozšiřují po dalších asi 40 let. Vzdálená hybridizace je hybridizace mezi různými rostlinnými druhy, případně rody. Druhy se v zásadě v přírodě nekříží. Může to být ale dáno jen geografickou izolací nebo různou dobou kvetení. V některých případech jsou blokády oplození po sprášení, v jiných blokády vzniku hybridních semen, jindy hybridní semena vznikají, ale jsou neklíčivá. V řadě případů je nekřižitelnost důsledkem odlišného počtu chromosomů.Přitom ke křížení někdy dochází, ale hybridi nejsou plodní. V meiozi totiž nedochází k normálnímu párování a normálnímu rozdělení chromosomů. Takovýmto situacím může odpomoci právě zdvojení počtu chromosomů hybridů (tzv. amfidiplodizace, tedy zdvojení chromosomových sádek obou rodičů), které vede k obnově jejich homologie při meiosi a ke vzniku hybridů. Tak vznikaly i nové kulturní rostliny, jako rod Triticale - kříženec pšenice a žita, která se dnes pěstuje na velkých plochách i v ČR, rod Tritordeum, - kříženec pšenice a ječmene, josta - amfidiploidní kříženec rybízu a angreštu. Mezidruhové křížení se využívá i u dalších kulturních plodin, které nejsou deklarovány jako mezidruhoví hybridi. Například odolnost k houbovým a bakteriálním chorobám je možno dodávat odrůdám bramboru křížením s příbuznými planými druhy (Solanum andigena, S. phureja, S. demisum a d.) a pak se provádí několikanásobné zpětné křížení s bramborem a ve všech generacích se sleduje na znak odolnosti k chorobám. Ad 4) Indukce mutací: Mutace jako přirozené změny dědičné hmoty vznikají spontánně s nízkou frekvencí. I když většina z nich je vývojově nepříznivých, malá část vývojově příznivých mutací je hybnou silou vývoje. Protože však spontánní vznik je velmi vzácný, v klasických dobách šlechtění se mutace jen zřídka stávaly základem pro vznik nových odrůd. V r. 1927 však byla objevena možnost indukce mutací ionizujícím zářením a v roce 1942 ještě účinnějšími chemickými mutageny. Posledních 50 let se indukované mutace využívají ve šlechtění rostlin. Jedná se buď o tzv. bodové mutace, které mění jediný, gen, nebo o chromosomové aberace, přeskupení úseků chromosomů za vzniku často mikroskopicky pozorovatelné změny struktury chromosomů (například translokace). Typické naše odrůdy, které vznikly mutačním šlechtěním, je odrůda ječmene Diamant a z něho odvozené odrůdy tzv. diamantové řady. Je třeba konstatovat, že změny, k nimž dochází mutacemi, nejsou vždy zcela přesně definované. Kromě mutace, která byla detekována a je využívána mutace pravděpodobně způsobil i řadu dalších změn DNA, které nejsou zřejmé.
Ve šlechtění se často kombinují metody vzdálené hybridizace a indukce chromosomových přestaveb, zvláště translokací. Mnoho současných vysoce výkonných odrůd pšenice tak obsahuje ve svém dědičném základu úseky chromosomů žita, které jim dodávají odolnost k některým chorobám.
10
Ad 5) Využití tkáňových kultur ve šlechtění. Na tkáňových kulturách rostlin se začalo intenzivně pracovat asi před třiceti lety a od té doby se staly jedním ze základních nástrojů šlechtění.Části rostlin i celé rostliny lze pěstovat sterilně na agarových kulturách. Části rostlin mohou také růst jako nediferencovaná pletiva, tzv, kalusy nebo jako buněčné populace v tekutých mediích, v suspenzních buněčných kulturách. Z tkáňových kultur lze zpětně získat celé rostliny, přesadit je do půdy a dále množit. Tkáňové kultury rostlin lze využít k celé řadě různých genetických zásahů. Lze jimi také navozovat mutace a tento způsob indukce mutací se využívá dokonce častěji, než působení záření a chemických mutagenů. Pomocí prašníkových kultur je možno takto získávat rostliny se základním gametickým počtem chromosomů 1n. Působením kolchicinu je možno takovéto rostliny diploidizovat (přesněji dihaploidizovat) a získávat tak zcela čisté linie. Pro šlechtitele je to zvláště výhodné v prvé generaci hybridů, protože tímto způsobem lze "obejít" štěpící generace a urychlit tak proces šlechtění nových odrůd až o několik let. Značně velké možnosti poskytuje využití rostlinných protoplastů, tedy buněk, zbavených buněčné stěny, se kterými je rovněž pracovat metodami tkáňových kultur. Důležitou metodou je somatická hybridizace rostlinných protoplastů různých druhů nebo i vzdálenějších taxonomických jednotek. V dalších fázích je možno dosáhnout regenerace buněčných stěn, dělení buněk a konečně vznik celých somaticky hybridních rostlin. Ty jsou geneticky odlišné od klasických hybridů (pokud je vůbec generativní hybridizací lze získat) především v tom, že počet chromosomů je součtem počtu chromosomů obou rodičů (což odpovídá amfidiploidii). Navíc, zatímco při generativní hybridizaci genetická výbava chloroplastů a mitochondrií při běžné generativní hybridizaci je shodná s genetickou výbavou mateřského jedince, při somatické hybridizaci může chloroplastová genetická výbava pocházet z jednoho či druhého druhu a mitochondriální může být navíc rekombinovaná. Klasickým příkladem hybrida, vzniklým somatickou hybridizací, je hybrid mezi bramborem a rajčetem. Praktického uplatnění však nedoznal, protože celá rostlina je jedovatá, vytváří jen malé plody a nevytváří hlízy.
Vše o čem se psalo v této kapitole, jsou genetické změny, které nejsou genetickými modifikacemi. Termín genetické modifikace je populárním tisku zavedený, ne však nejlepší termín pro vnášení klonovaných genů do genomu. Tyto geny nemusejí nutně pocházet z nepříbuzných organismů. Zatímco přístupy klasické genetiky ve šlechtění umožňují využívat uvedených neusměrněných změn, jejichž podstatu známe jen obecně, genové inženýrství umožňuje vnášet jediný gen nebo malou skupinu genů, které známe zcela přesně (na úroveň primární sekvence basí v DNA). 2. Období genového inženýrství Poslední příklad současně ukazuje omezení významu hybridizačních metod a metod somatické hybridizace pro šlechtění rostlin. To současně zvýrazňuje význam transgenose - vnesení jednoho, přesně definovaného genu (nebo malé skupiny přesně definovaných genů) do dědičného základu - genomu metodami genového inženýrství. Tyto zásahy se často nazývají také genetické modifikace. Obdobná je i situace ve šlechtění hospodářských zvířat i v biochemickém využití mikroorganismů. Na genetických modifikacích je nové to, že přidáváme jediný gen nebo malou skupinu přesně (až na úroveň sekvence basí DNA) známých. Jsou tedy přímějšími a lépe definovanými změnami, než hybridizace nebo mutace, kdy povahu změn v potomstvu zcela přesně neznáme. Současně jsou jen dalším rozšířením spektra genetických metod používaných ve šlechtění rostlin. Přenášení genů, klonovaných metodami genového inženýrství je logickým pokračováním dosavadního vývoje uplatňování nových přístupů genetiky ve šlechtění rostlin. Je třeba si uvědomit, že metody klasické genetiky, aplikované na šlechtění, všeobecně indukují neusměrněné změny, ze kterých šlechtitelé vybírají změny, které směřují k cíli šlechtění. Mohou být založeny na výběru vhodných jedinců v potomstvu hybridů. Rostlinný
11
genom má zhruba 25 000 genů (modelová rostlina huseníček, jejíž genom již byl sekvencován) až přes 100 000 genů (u pšenice se předpokládá asi 80 000 genů). Při křížení se smísí genomy obou rodičů a výsledné genomy ve štěpících generacích představují náhodný výběr z nesmírného množství všech existujících genových kombinací. Při mutačních zásazích dochází k náhodným změnám genů podobně, jako při využívání tkáňových kultur rostlin. Již mnoho desítek let neplatí, že by odrůdy kulturních rostliny byly přírodní a přirozené. Jsou produktem uvedených genetických metod, využívaných ve šlechtění rostlin. Právě tyto metody se zasloužily o jejich vysokou kvalitu a výnos. Přirozeným pokračováním vývoje jsou metody genových manipulací, které jsou založeny na principech, jež se rozvíjejí posledních 30 let. Jsou to metody, jejichž základem je využití specifických enzymů, které přesně definovaným způsobem upravují DNA. Hlavní z nich jsou restrikční endonukleasy - enzymy, které působí zlomy v přesně definovaných krátkých úsecích dvojvláknové DNA, často o délce 6 párů bází. To je spojeno s dalšími enzymy, které umožňují spojovat úseky DNA a které mají ještě mnoho jiných specifických funkcí. Geny jsou obvykle vřazován do bakteriálních plasmidů. Plasmid je kružnicová bakteriální DNA, která existuje a množí se nezávisle na chromosomální DNA, je mnohem menší a nese některé geny, které pro bakterii nejsou zcela nepostradatelné. Plasmidy, používané v genovém inženýrství byly upraveny tak, aby dobře sloužily jako nosiče pro množení a úpravy jakéhokoli klonovaného genu - vyjmutého z genomu a namnoženého v plasmidu v bakteriálních buňkách. Základní úpravy genu se dělají na plasmidech v bakteriích Escherichia coli a upravené plasmidy se pak přenášejí do bakterií A. tumefaciens, odkud jsou na nich obsažené geny vnášeny do rostlinných buněk.
Enzymatické metody ve spojení s fyzikálními metodami (bakteriální transformace, sekvenování, konstrukce genomových knihoven, umělá syntéza polynukleootidů a jiné) umožňují širokou škálu nových přístupů. Jednou z nejdůležitějších je právě transgenose. Geny, které jsou transgenosí vnášeny, mohou pocházet z organismů zcela nepříbuzných (bakteriálních, virových, živočišných, rostlinných). Často to bývají chimérické geny (které jsou složeny z úseků, pocházejících z různých genomů) a mohou to být i syntetické geny, syntetizované na základě odpovídajících genů z přírody. Vnášení genů do rostlinného genomu je možné od r. 1978, kdy bylo prokázáno, že půdní bakterie Agrobacterium tumefaciens je schopna vnášet malou část své DNA do rostlinného genomu. Tohoto přirozeného přírodního principu bylo využito ke vnášení předem plánovaných a upravených genů do rostlinného genomu. Později byly vyvinuty i metody tak zvané přímé transformace, při nichž použití bakterií A. tumefaciens není třeba. Do rostlin byly v posledních pětadvaceti letech takto vneseny tisíce genů, většinou za účelem využití ve vědeckém výzkumu, někdy u s cílem praktického využití v nových odrůdách. V populárním tisku se nepoužívá pojem transgenní organismy, ale geneticky modifikované organismy (GMO). Při využití bakterií A. tumefaciens je třeba, aby geny, které chceme přenést do rostlin, byly nejprve metodami genového inženýrství a s využitím bakterií E. coli integrovány do vhodného vektorového plasmidu a v něm vneseny (transformací nebo bakteriální konjugací) do upraveného kmene bakterií Agrobacterium tumefaciens. Bakterií se pak inokulují rostliny. Je třeba, aby rostliny byly prosté jiných mikroorganismů, tedy aby byly kultivovány sterilně ve tkáňových kulturách. Při inokulaci bakteriemi A. tumefaciens přejde přesně vymezená část plasmidu, označovaná jako T-DNA (transferred DNA) z bakterií do některých rostlinných buněk a vestaví se do některého rostlinného chromosomu. K tomu dojde jen v malé frakci buněk. Je proto třeba vyselektovat ty rostlinné buňky, u kterých k vestavění došlo a proto DNA, vnášená do rostlin, musí obsahovat 2 typy genů: 1. Selektovatelné geny. Na základě jejich projevu je možno selektovat na vhodném
výživném mediu ty rostlinné buňky, u kterých došlo k vestavění cizorodé DNA (transgenosi).
2. Vlastní funkční geny, které chceme do rostlin vnést a v rostlinách studovat a využívat.
12
Selektovatelné geny jsou často geny pro odolnost k některému antibiotiku (kanamycin, hygromycin). Mohou to být i geny pro toleranci k herbicidům (glyfosát) nebo jiné geny. Jestliže jsou rostlinná pletiva, na která bylo působeno bakteriemi A. tumefaciens kultivována na agarovém mediu s přidáním selekční látky, potom jsou schopné růst a dělit se jen ty buňky, které jsou transgenní. Ty pak dají vznik celým transgenním rostlinám, jež je možno přenést do půdy. V agarovém mediu musí být současně i další antibiotikum, vhodné pro eliminaci bakterií A. tumefaciens. Při přímé transformaci, bez využití bakterií A. tumefaciens, je postup velmi podobný. Transformace se nejčastěji provádí tak zvanou mikrobalistickou metodou pomocí mikroprojektilů. To znamená, že mikroskopické zlaté nebo wolframové kuličky o průměru 0.002 mm, které nesou na svém povrchu plasmidovou DNA s transgenem, se pomocí speciálního zařízení vstřelují do rostlinných buněk. Některé z nich proniknou do buněčných jader a tam se plasmidová DNA uvolní a pravděpodobně se zabuduje do některého chromosomu. I ty kuličky, které proniknou pouze do cytoplasmy, uvolní svou DNA a ta má určitou, i když malou pravděpodobnost dostat se do buněčného jádra. Je třeba uvést, že většina zasažených buněk je průnikem kuličky natolik poškozena, že není schopna dalšího dělení. Účinnost metody je tedy poměrně malá. Další často používané metody přímé transformace jsou mikroinjekce přímo do buněčných jader (velmi účinné) nebo jen do pletiv (málo účinné), případně působení roztokem DNA na rostlinné protoplasty, při němž je stimulován průnik cizorodé DNA do cytoplasmy a z ní do buněčných jader. Speciálními metodickými postupy je možno u některých rostlinných druhů selektovat buňky, u nichž došlo k začlenění transgenu při přímé transgenosi do chloroplastové DNA. Výhodou je intenzivnější projev transgenu a to, že není přenášen pylem. 3. Genetické modifikace kulturních rostlin V současné době byly již metody transgenose vypracovány pro většinu kulturních rostlin. Množství typů transgenních rostlin, které jsou již využívány jako odrůdy, je přesto zatím velmi omezené. Tržně jsou uvolněny odrůdy těchto kulturních rostlin (seřazeno přibližně podle velikosti využívané zemědělské plochy): kukuřice, soja, řepka, bavlník, brambor, cukrovka, rajče, tabák, tykev, papaja, čekanka, karafiát. Celková plocha transgenních rostlin ve světě v r. 2000 byla přes 400 000 km2. Počet malých pokusných políček, na kterých byly prováděny pokusy před tržním uvolněním odrůd, jde do sta tisíc. 3.1. Tolerance k herbicidům Jedná se o toleranci k poměrně novým typům herbicidů, jež jsou nejedovaté pro živočichy a člověka, po aplikaci mají krátkou životnost a v půdě jsou poměrně rychle biodegradovatelné prostřednictvím půdních mikroorganismů. Příčinou toxicity herbicidů pro rostliny obvykle je, že herbicid inokuluje některý konkrétní enzym, který je pro rostlinu nepostradatelný. Jedná se současně o enzym, který je specifický pro rostliny (a bakterie) a který se u živočichů nevyskytuje, nebo má jinou formu a funkci. Transgenní odrůdy tolerantní k herbicidům obsahují ve svém dědičném základu zpravidla transgeny pro toleranci k některému z těchto dvou hlavních typů herbicidů: Glyfosát: vyrábí firma Monsanto pod obchodním názvem Roundup. Tento herbicid blokuje v chloroplastech enzym, který se podílí na biosyntetické dráze aromatických aminokyselin. Porušení této biosyntézy u všech netransgenních rostlin vede již po několika dnech k úhynu rostlin. Enzym, který je kódován transgenem, je odolný k působení glyfosátu a liší se jen nepatrně od enzymu kódovaného rostlinným genem (v jedné variantě transgenní kukuřice se enzym kódovaný transgenem liší od odpovídajícího rostlinného jen dvěma aminokyselinami). Fosfinothricin (gluphosinate ammonium): vyrábí firma Aventis pod obchodním názvem Liberty. Přípravek blokuje rostlinný enzym pro přeměnu amoniaku na aminokyselinu glutamin. Hromadění amoniaku v netransgenní rostlině po působení fosfinothricinu je
13
příčinou rychlého uhynutí po aplikaci fosfinothricinu, ale rostliny s odpovídajícím transgenem přežívají.. 3. 2. Odolnost k hmyzím škůdcům Jsou druhou nejvíce využívanou skupinou genetických modifikací v transgenních odrůdách. Obsahují gen pro bílkovinu δ-endotoxin (enterotoxin) bakterie Bacillus thuringiensis. Tato bílkovina v bakteriích vzniká pouze při jejich sporulaci. Je známo téněř 200 kmenů této bakterie, které mají geny pro různé odlišné formy enterotoxinu. Tato bílkovina je jedovatá pro určité řády hmyzu dokonce preferenčně pro určité druhy. Spektrum hmyzu zahrnuje motýly, brouky a dvojkřídlý hmyz a liší se podle výchozího bakteriálního kmene. Toxin, produkovaný určitým bakteriálním kmenem je jedovatý jen pro jednu z těchto skupin hmyzu a zcela nejedovatý pro ostatní živočichy. Transgenní rostliny (kukuřice, bavlník, brambory) pak jsou odolné ke svým hlavním hmyzím škůdcům. Tím se ušetří mnoho insekticidů, které by se jinak musely aplikovat na pole s netransgenními odrůdami. Odpůrci transgenních rostlin namítají, že enterotoxin se kořenovou soustavou transgenních rostlin dostává i do půdy. Většina je ho sice brzy rozložena, ale část se adsorbuje na jílovitých částečkách půd a v této formě je poměrně stabilní. Bylo však prokázáno, že na půdní mikrofaunu to nemá vliv. Jiná námitka se týká toho, že se u hmyzích škůdců geneticky vyvíjí odolnost k δ-endotoxinu. Vzniká tím, že se v populacích hmyzu selektují spontánní mutace hmyzu se zvýšenou odolností k δ-endotoxinu. Je pravda, že v tomto ohledu se transgenní rostliny s transgenem pro δ-endotoxin v zásadě neliší od chemických pesticidů, na které rovněž u hmyzu vzniká odolnost. Genetici však vyvinuli opatření, jejichž cílem je rozvoj populací hmyzu, odolných k transgenním rostlinám s genem pro δ-endotoxin, maximálně oddálit s tím, že se předpokládá, že do té doby budou nové transgenní odrůdy, jejichž resistence k hmyzu je založena na jiných principech.. 3.3. Další typy geneticky modifikovaných odrůd rostlin
Existují (ale není jich mnoho) transgenní odrůdy, odolné k určitým rostlinným virům. Takováto transgenní rostlina ve svém dědičném základu obsahuje transgen pro obalový protein viru. Projev tohoto genu, který nemá nic společného se symptomy virového onemocnění, chrání rostlinu před napadením obdobným typem viru. Existuje i velké množství dalších typů transgenů, rostlinných i živočišných. Některé jsou schopné dodávat rostlinám obecnou odolnost k virům, ale v transgenních rostlinách se nepoužívají.
Jiné odrůdy geneticky modifikovaných rostlin mají ve svém dědičném základu vnesený gen pro pylovou sterilitu a gen pro obnovu fertility pylu. Tato dvojice, zpravidla v kombinaci s tolerancí k herbicidům, umožňují snadno získávat hybridní (F1) odrůdy.
Prostřednictvím transgenose je možno také zablokovat aktivitu určitého genu nebo skupiny podobných genů. Jestliže se gen zabuduje obráceně do úseku, který obsahuje k němu příslušející regulační úseky , potom jeho přepisem vzniká RNA v obráceném smyslu, tedy protismyslová (angl. antisense) RNA. Ta tvoří se správnou mRNA genu dvojvláknovou RNA, která nemůže být překládána do struktury bílkovin. Toho bylo využito již u prvé geneticky modifikované odrůdy, rajčete FlavrSavr, které bylo tržně uvolněno již v r. 1994. Toto rajče má blokován gen pro galakturonidasu - enzym, který narušuje pektin v buněčných stěnách. Rajče zraje pomaleji, je méně napadáno skládkovými chorobami a ke spotřebiteli se dostane v dobrém, nepoškozeném stavu. Na podobném principu - blokádě syntézy ethylenu prostřednictvím antisense RNA, která blokuje syntézu jednoho enzymu, potřebného ke tvorbě tohoto rostlinného plynného hormonu, byly vyvinuty transgenní odrůdy karafiátu, jejichž květy vydrží delší dobu čerstvé ve váze. Existují dále transgenní odrůdy řepky, které mají odlišné složení olejů semen a jsou vhodné pro speciální použití, například v kosmetickém průmyslu, nebo k výrobě mazadel ve strojírenství.
14
3.4. Transgenní rostliny pro budoucnost Velké množství dalších typů transgenních rostlin je připraveno k uznání jako odrůdy. Jsou to především typy luskovin a obilovin s vhodnějším obsahem aminokysein v zásobních bílkovinách semen. Bílkoviny semen totiž mají nedostatek některých aminokyselin. Z tohoto důvodu nemohou rostlinné bílkoviny být plnohodnotnou náhražkou masa jako zdroje bílkovin v lidské výživě. Některé typy transgenních rostlin však mají poměr aminokyselin daleko příznivější a takové by mohly výrazně přispět ke zlepšení lidské výživy, zvláště v zemích třetího světa. Ještě důležitější jsou transgenní rostliny, které mají zvláštní hodnotu jako léčiva. Existují již typy transgenních rostlin, které syntetizují antigen, například úsek bílkoviny nějakého pathogena (např. viru hepatitidy typu C) a jsou schopny imunizovat člověka proti nákaze tímto virem. Dále jsou typy geneticky modifikovaných rostlin, které jsou schopny syntetizovat protilátky. Může jít o protilátky proti rostlinným patogenům a rostliny pak nejsou napadány, nebo o protilátky vhodné k využití v medicině, které ze z rostlin účinně izolovat. Konečně existují v této skupině další geneticky modifikované rostliny, které produkují vzácné bílkoviny, využitelné v medicině. Jednou z takovýchto bílkovin je například. hirudin - protein pijavky koňské, který zabraňuje srážení krve. Má významné použití při operacích, zabraňuje emboliím. Je možné ho produkovat v semenech transgenní řepky. Široké použití má tzv. zlatá rýže. Ta v obilkách produkuje β-karoten, provitamin vitaminu A. Jeho nedostatek je častou příčinou vývojových, zvláštně očních poruch u dětí třetího světa. Zlatá rýže má také zvýšený obsah železa. Byla vyvinuta teprve zcela nedávno a zatím není k dispozici jako tržní odrůda. Vědci, kteří tuto transgenní rýži vyvinuli, však ji dali bezplatně k využití pro vývoj odrůd v zemích třetího světa.
Bylo by možno uvést celou řadu příkladů nových typů geneticky modifikovaných rostlin, které mají nová průmyslová využití: transgenní rostliny, které produkují nové typy dřeva, jiné, které produkují biodergradovatelné polymery, vhodné pro využití v obalové technice místo umělých hmot a další. 3.5. Transgenní rostliny ve vědě
Jestliže počet transgenů, které se uplatnily v nových odrůdách, můžeme počítat na desítky a těch, které jsou perspektivní pro šlechtění na stovky, počet transgenů v různých typech transgenních rostlin pro vědecký výzkum jde dnes již do tisíců. Transgenní rostliny se využívají především pro studium genové regulace a pro funkční genomiku - přisuzování funkcí jednotlivým známým genům. 4. Předpokládaná rizika geneticky modifikovaných rostlin Transgenním rostlinám se přisuzují mnohé potenciální negativní vlastnosti. Předpokládají se negativní vlivy na přírodní prostředí, přírodní společenstva a zdraví člověka i zvířat. I když žádné bezprostřední negativní vlivy nebyly prokázány, antibiotechnologčtí aktivisté varují před dlouhodobými vlivy, které se mohou podle jejich názoru projevit až po desítkách let. Jsou to názory těžko vyvrátitelné bez vědeckých argumenů, protože těm zpravidla nechtějí naslouchat.
Teoretická možnost nepříznivých účinků transgenních rostlin musí zajímat vědce dříve, než rostliny uvedou do prostředí. Rozhodujícím je tedy okamžik kdy se přechází z uzavřeného způsobu kultivace transgenních rostlin z laboratoře, kultivační místnosti nebo uzavřeného skleníku do volné přírody - nejprve na pokusný záhon nebo políčko. Toto stadium se nazývá uvolnění do prostředí a představuje také legislativní krok. Vždy je třeba požádat o povolení oprávněný státní orgán, pověřený realizací zákona o GMO. Ten si vyžádá tzv hodnocení rizika, t.,j. přehled možných nepříznivých vlivů a dosavadních zkušeností, podložených vědeckými výsledky. Uvolňování GMO do prostředí se děje případ od případu a krok za krokem.
15
Závažnou námitkou je možnost vzniku toxických nebo alergenních produktů v důsledku transgenoze. Transgeny jsou vždy sekvenovány. Je známo nejen pořadí basí DNA, ale i odpovídající pořadí aminokyselin v bílkovině, z toho je možno modelovat strukturu bílkoviny a je známa i její funkce. Na základě analogie se strukturou genů a odpovídajících bílkovin v molekulárně genetických Internetových databasích je možno předpovídat další vlastnosti a experimentáleně je ověřovat. Samozřejmě, pokud se transgenní rostlina má stát odrůdou, musí být zcela vyloučeny možnosti toxických produktů genu. Co se týče alergenity, malá frakce bílkovin má alergenní vlastnosti. Pro transgenosi platí základní pravidlo: výchozí organismus, z něhož je transgen isolován, nesmí mít alergenní vlastnosti. Pokud by je měl, je třeba provést důkazy, že je nemá bílkovina, kódovaná přeneseným genem. Transgenní rostliny, které mají být využity jako odrůdy, musí být testovány z tohoto hlediska. V souvislosti s transgenními odrůdami tolerantními k herbicidům se někdy hovoří o nebezpečí, že transgen se přenese pylem do dědičného základu nepříbuzných planých druhů, ty se stanou k herbicidu odolné a budou se množit jako obtížný plevel. Toto nebezpečí není nijak velké. Z transgenních rostlin, které přicházejí v úvahu ve střední Evropě, se uvažuje o této potenciální možnosti hlavně u řepky. Ani tam však oplození příbuzných planých rostlin a další rozšíření transgenu není příliš pravděpodobné. Mezidruhoví hybridi zde vznikají vzácně a jsou částečně nebo úplně neplodní. Pokud by takovéto plané rostliny vznikly a rozšířily se, byly by nebezpečím především pro firmu, která transgenní rostliny a k nim odpovídající herbicid produkuje - herbicid by se stal k ošetřování transgenních rostlin daného druhu nepoužitelný. Přesto se možnost přenosu transgenu pro toleranci k hmyzu do planých druhů, tak do kulturních netransgenních rostlin téhož druhu pečlivě sleduje v četných výzkumných projektech. Někdy se hovoří o tzv. horizontálním přenosu genů. To znamená, že se předpokládá, že geny se mohou přenášet v přírodě mezi nepříbuznými druhy podobně, jako při pokusu s transgenosí. Nebylo to experimentálně potvrzeno, s výjimkou přenosu plasmidů a jimi nesených genů mezi různými druhy bakterií. Všechna z toho vyplývající údajná nebezpečí (přenosu selektovatelného genu pro odolnost k antibiotiku z transgenní rostliny do bakterie, přenosu genů z transgenní, ale ne netransgenní rostliny do trávicího traktu člověka) jsou vykonstruovaná a nikdy nebyla prokázána. 5. Geneticky modifikované mikroorganismy Základním krokem genových manipulací je namnožení klonované sekvence DNA, jež je součástí bakteriální mimochromosomální DNA - plasmidu, který se množí v bakteriích Escherichia coli. V dalších krocích se může opět štěpit restrikčními endonukleasami, upravovat, sekvencovat nebo přenášet do dalších prokaryontních či eukaryoontních hostitelů. Genetické modifikace rostlin a živočichů tak nutně zahrnují i genetické modifikace bakterií. Konstrukce plasmidu však může být i taková, že umožňuje projev vloženého genu přímo v bakteriální buňce E. coli. Jinou bakterií, která je využívána již i pro biotechnologickou produkci proteinů na základě rDNA, je Bacillus subtilis. Při produkci bílkovin, které jsou eukaryotního původu, v bakteriálních buňkách však bílkovinám často chybí nezbytné posttranslační modifikace (acetylace, glykosylace). Proto se k produkci proteinů často využívá kvasinek Saccharomyces cerevisiae nebo jiných eukaryontních buněk, které lze pěstovat ve fermentorech. Řadu dalších bílkovin je však nutno získávat z rostlinných nebo živočišných buněk právě proto, aby měly příslušné modifikace. První úkoly, které stály před biotechnology a byly řešeny již před cca 20 lety, byla produkce vzácných bílkovin, potřebných v medicině. V „klasickém“ období rozvoje mikrobiálních biotechnologií se pozornost soustředila na tři okruhy genetických modifikací: 1. Produkce lidského růstového hormonu. Tento hormon u člověka napravuje některé specifické dědičné vývojové defekty. Před érou biotechnologií byl velmi omezeně dostupný, bylo možno jej získávat pouze z mrtvých lidí. Biotechnologicky, pomocí geneticky
16
modifikovaných mikroorganismů, je možné tuto bílkovinu produkovat v dostatečně velkém množství. 2. Produkce insulinu. Pro nemocné cukrovkou se insulin klasickým způsobem získávají z živočišných zdrojů. U některých nemocných však časem k tomuto insulinu vzniká alergie. Pro takové osoby je nyní dostupný lidský insulin, produkovaný biotechnologicky pomocí mikroorganismů. 3. Produkce interferonu. To je protivirový protein, vyráběný buňkami savců. Jeho terapeutické účinky nebyly bez biotechnologické produkce přesně známy, protože ho nebylo možno získat větší množství. Působí i proti některým nádorovým chorobám, základní obrat v medicině však nepředstavuje.
V současné době se spektrum vzácných proteinů, které lze produkovat pomocí mikroorganismů s rDNA, stále zvětšuje. V mnoha případech jsou alternativní možnosti produkce pomocí mikroorganismů, rostlin nebo živočichů a je třeba zvažovat, který způsob je u daného proteinu nejvýhodnější. 6. Geneticky modifikovaní živočichové
Možnost vnášet jednotlivé geny do živočišných buněk se stala reálnou přibližně ve stejné době, jako u rostlin,m tedy asi před třiceti lety. Je možno získávat geneticky modifikovaný hmyz, ryby, obojživelníky, ptáky a savce. Často se využívá mikroinjekcí do jader vajíček, případně mikroprojektilů. Kromě sekvencí DNA na plasmidů se používají také speciálně upravené virové vektory. Základním typem virů pro ně jsou retroviry. To jsou živočišné a lidské viry, které mají schopnost se zabudovávat do chromosomů a reprodukují se prostřednictvím transkripce, vzniká tedy RNA. Ta je pak převáděna do formy DNA v buňkách zvláštním enzymem reversní transkriptasou, která je kódována přímo virovým genomem. U savců existuje tradiční modelový objekt transgenose - myš. Provádí se ale také u ovcí, koz, a prasat, skotu a podařila se i u primátů. Hlavní praktické cíle transgenose jsou: intenzita růstu, odolnost proti chorobám, změny kvality živočišných produktů, produkce transgenních zvířat pro xenotransplantace a produkce léčiv pro medicinu. Co se týče zvýšení intenzity růstu, mnoho pokus bylo provedeno s genem pro růstový hormon z různých zdrojů.Myši skutečně rostly daleko rychleji, ale u hospodářských zvířat se k intenzivnímu růstu připojily různé nepříznivé vedlejší vlivy jako poruchy kloubů a defekty končetin. Rybí varianta genu silně zvyšuje růst u lososovitých ryb. Transgenní lososi s tímto genem mají až 43x větší váhový přírůstek. Takovéto ryby by mohly mít selekční výhodu proti původním typům a postupně je vytěsnit. To by však mohlo vést k rozsáhlejšímu porušení přirozené biologické rovnováhy ve vodních ekosystémech. Proto se zatím pěstují jen jejich triploidní (s počtem chromosomů 3n) sterilní varianty, které nejsou schopné rozmnožování, a to jen v uzavřených nádržích. Do genomu živočichů bylo experimentálně vneseno několik genů, které zvyšují odolnost vůči chorobám. Je to například gen pro plášťový protein viru ptačí ptačí leukosy vyvolává odolnost vůči tomuto ptačímu viru. Je možno provádět imunizaci živočichů přímo vnesením genů pro lehký a těžký řetězec imunoglobulinů monoklonálních protiiátek. Byl přenesen myší gen Mx, který navozuje odolnost proti chřipkovým virům. Rovněž gen pro protimrznoucí protein (antifreeze protein) z dědičného základu některých arktických ryb byl vpraven do genomu lososa. Blokuje růst krystalů ledu v krvi a tím zvyšuje odolnost ryb vůči mrazu.
Co se týče změn kvality živočišných produktů prostřednictvím transgenose, jsou zatím obecně v experimentálním stadiu. Celá řada směrů výzkumu se týká úpravy kravského mléka. Mnoho lidí nemůže pít mléko, protože nemohou štěpit cukr laktosu - chybí jim k tomu příslušný enzym. Existuje několik způsobů, jak genetickými modifikacemi obsah laktosy v mléce snížit, i když ho nelze zcela odstranit. Jsou rovněž snahy odstranit z mléka složku, která u některých lidí způsobuje alergii. Další výzkumný směr se týká humanizace mléka - snahy
17
získávat kravské mléko s bílkovinami mateřského mléka, vhodnými pro výživu kojenců. Jiné směry výzkumu, u dalších hospodářských zvířat, usilují o zvýšení kvality masa, kvality vlny a dalších parametrů.
Směr využití transgenose živočichů, který se opouští, je produkce transgenních zvířat pro xenotransplantace. Možnost transplantace živočišných (prasečích) orgánů by mohla zachránit život mnoha lidem. Při transplantaci živočišné tkáně ale dochází k velmi rychlému odvržení transplantátu - jeho nekrose. Tomu lze předejít vnesením některých lidských genů do zvířecího genomu. Existují však nebezpečné prasečí viry, přenosné na člověka a proto byl tento směr výzkumu pozastaven.
Poslední směr se týká produkce léčiv pro medicinu prostřednictvím transgenních živočichů. Léčivem pro hemofiliky může být např. lidská bílkovina - faktor srážlivosti krve IX, který lze produkovat v mléce transgenních zvířat. Stádo několika desítek krav by bylo schopno pokrýt celosvětovou potřebu této bílkoviny. 7. Genetické modifikace tělních buněk člověka
V některých případech dědičných onemocnění (cystická fibrosa) a některých nádorových onemocnění (zvláště krvetvorných buněk) existují různé, zatím individuálně a experimentálně využívané možnosti, jak vnesením transgenu napravit dědičný defekt nebo pomoci zastavit nádorový růst. Jako nádorová onemocnění mají mnoho typů, tak je i mnoho možností léčení některých typů zhoubného bujení transgenosí. Již je na světě více než stovka lidí, kterým transgenose zachránila život.
Existují dva způsoby vnášení cizorodé DNA: - In vivo. DNA se vnáší přímo do těla. Může to být DNA adenovirů s určitým vřazeným
genem. Adenoviry v buňkách projevují svou dědičnou informaci, ale nezabudovávají se do chromosomů. Postupně množství adenovirů klesá. Pak klesá i projev s nimi vneseného genu a proceduru je třeba opakovat. Upravené retroviry naopak svou genetickou informaci do malé části tělních buněk zabudovávají a projevuje se trvale.
- In vitro. Při tomto způsobu jsou tělní buňky (obvykle krvetvorné buňky) z těla vyjmuty, kultivovány in vitro na umělém mediu a je do nich zabudován malý úsek další genetické informace. Buňky s touto změnou jsou pak ve tkáňové kultuře vyselektovány a namnoženy a pak jsou vpraveny znovu do těla. Transgenoze zárodečné linie člověka se neprovádí. Nebyla by etická, i po biologické
stránce by byla pochybná. 8. Postoj veřejnosti
Genetické modifikace a jejich praktické využité představují široké spektrum otázek mikrobiologických biotechnologií, nových směrů ve šlechtění rostlin, nových směrů plemenářství i nových směrů mediciny. Poslední dvě odvětví jsou v experimentálním stadiu. Geneticky modifikované mikroorganismy se využívají v průmyslových biotechnologiích bez velké pozornosti veřejnosti.
Značná pozornost veřejnosti v negativním smyslu je věnována transgenním rostlinám. Poloviny americké produkce kukuřice i podstatná část soji představuje plodiny transgenní. Absenci jakýchkoli negativních vlivů prokázala nejen věda a výzkum, ale i praxe, to, že se již po více než 5 let ve velkém konzumují a potraviny z nich připravené běžně jedí miliardy lidí bez jakýchkoli nepříznivých následků.. Přesto veřejnost požaduje značení transgenních potravin. V současné době se provádí všude dokonce značení transgenních rostlinných produktů od pěstování na poli až ke spotřebiteli. Legislativa v Evropě, která upravuje pěstování a využívání transgenních plodin, je určována spíše snahou politiků naklonit si voliče, tedy politickými, méně však biologickými aspekty. Lze očekávat, že jde o přechodný stav a opatření registrace a kontroly transgenních plodin a z nich vyrobených potravin se bude časem zmirňovat. Svou negativní úlohu v něm sehrály tzv. ekologické organizace typu
18
Greenpeace, které mají v programu bojovat proti transgenním odrůdám rostlin. Jejich boj je obdobou boje proti parním strojům, železnici a automobilismu v minulosti. 9. Legislativa týkající se geneticky modifikovaných organismů
Již v průběhu prvých pokusů na genovém inženýrství mikroorganismů si biologové uvědomili potenciání nebezpečí, které genové inženýrství může obsahovat a v roce 1974 uveřejnili v odborných časopisech Nature a Science výzvu k dočasnému zastavení pokusů s rekombinovanou DNA do doby svolání konference, na které se vědečtí pracovníci dohodnou, zda v pokusech dále pokračovat a za jakých podmínek. Tato konference se sešla v r. 1975 v americkém městě Asilomaru. Bylo dohodnuto pokračování s tím, že bakterie Escherichia coli, v nichž se rekombinovaná DNA převážně pěstuje, budou upraveny tak, aby nemohly přežít mimo specifické laboratorní podmínky. Rovněž laboratoře s rekombinovanou DNA od této konference mají svou ochranu danou vybavením, která je odstupňována do čtyř stupňů podle potenciální nebezpečnosti rekombinované DNA. První regulace GMO tedy zavedli biologové. 9.1. Legislativa USA, Kanady a Evropského společenství
Zásadní rozdíl v přístupu ke GMO je mezi legislativou v USA a Kanady na jedné straně a mezi evropskými zeměmi na straně druhé. V USA a Kanadě se za potenciální zdroj rizika nepovažuje metoda, jakou bylo určitého typu organismu dosaženo, ale jeho vlastnosti. Neexistuje tedy speciální zákonná úprava pro práci s GMO, ale například transgenní odrůdy rostlin, resistentní k herbicidům, nebo škůdcům, musí vyhovovat některým předpisům o pesticidech. GMO se posuzují pode běžně platných zákonů, například Federálního zákona o insekticidech, fungicidech a rhodenticidech, zákona o rostlinných škůdcích a dalších.
V Evropském společenství se GMO posuzují zcela odděleně. Principem posuzování je již to, že obsahují rekombinovanou DNA. Před deseti lety byly vydány dvě směrnice 90/219/EEC (která se vztahuje pouze na geneticky modifikované mikroorganismy) a 90/220/EEC, která reguluje uvádění geneticky modifikovaných organismů do prostředí a na trh. Tyto směrnice, které byly novelizovány, v zásadě ukládají členským státům přijmout odpovídající opatření k ochraně lidského zdraví a prostředí před možnými nežádoucími účinky GMO a ustanovit příslušný orgán státní správy, který bude zajišťovat registraci práce s GMO a dozor nad ní. Každý stát evropského společenství má vlastní legislativu, týkající se GMO, která musí ovšem být v souladu s touto základní směrnicí. 9.2. Legislativa v České republice U nás existuje od 1.1.2001 Zákon č. 153/2000 o nakládání s geneticky modifikovanými organismy a produkty a o změně některých dalších zákonů. V zásadě implementuje uvedené dvě evropské směrnice a předvídá další vývoj legislativy v ES. Garantem zákona je Ministerstvo životního prostředí, ve spolupráci s Ministerstvem zemědělství a Ministerstvem zdravotnictví. Podle tohoto zákona každá právnická osoba, která hodlá nakládat s GMO, musí podat žádost o zapsání do seznamu uživatelů. Současně geneticky modifikovaný organismus, se kterým bude nakládat, musí být zařazen do seznamu geneticky modifikovaných organismů. Existují tři typy nakládání s GMO: - Uzavřené nakládání (v laboratoři, kultivační místnosti, fermentoru, uzavřeném skleníku nebo zvěřinci) - Uvádění do prostředí (např. pokusné pěstování transgenních rostlin v přírodě), kdy již není možno zcela zabránit nekontrolovanému šíření, ale jeho objem je omezen. - Uvádění do oběhu, kdy transgenní organismus je volně dostupný (je v prodeji) a jeho další šíření není legislativně omezeno. Jednotlivé fáze musí následovat za sebou v tomto pořadí, žádnou nelze přeskočit. Pokud však transgenní rostlina byla vyvinuta v zahraničí a tam provedena prvá nebo prvé dvě fáze, po nichž následovalo hodnocení, mohou výsledky tohoto hodnocení být u nás akceptovány a již
19
proběhlé fáze se nemusí opakovat. V každém případě, i po uvolnění do oběhu, je nutno provádět monitoring geneticky modifikovaného organismu. Existují také čtyři kategorie rizika nakládání s GMO. Podle zákona: . První kategorie rizika představuje činnost bez rizika nebo s minimálním rizikem škodlivého působení na zdraví člověka a zvířat, životní prostředí nebo biologickou rozmanitost. - Druhá kategorie rizika představuje činnost s rizikem takového škodlivého působení na zdraví člověka a zvířat, životní prostředí nebo biologickou rozmanitost, které může být snadno odstraněno obecně známými opatřeními. - Třetí kategorie představuje činnost s rizikem takového škodlivého působení na zdraví člověka a zvířat, životní prostředí nebo biologickou rozmanitost, které může být odstraněno jen zvláště náročnými zásahy. - Čtvrtá kategorie představuje činnost s rizikem takového škodlivého působení na zdra¨ví člověka a zvířat, životní prostředí nebo biologickou rozmanitost, které zanechává trvalé následky a nemůže být zcela odstraněno ani zvláště náročnými zásahy. V praxi se setkáváme především s první a druhou kategorií rizika nakládání s GMO.
Žádosti o zapsání do seznamu uživatelů a geneticky modifikovaných organismů podle zákona posuzuje Česká komise pro nakládání s geneticky modifikovanými organismy. Skládá se z odborníků v molekulární genetice a genovém inženýrství, odborníků na mikroorganismy, šlechtitelů rostlin i odborníků na živočišnou genetiku, hygieniků, právníků, a odborníků na otázky životního prostředí i zástupců občanských sdružení. Posuzuje žádosti o zapsání o seznamu uživatelů a geneticky modifikovaných organismů a doporučuje Ministerstvu životního prostředí jejich povolení, případně doporučuje změny, které je třeba v žádostech udělat. Současně provádí kontrolu pracovišť, kde se pracuje s GMO a dostává od nich pravidelná hlášení o postupu práce. Sleduje vědecký a legislativní pokrok v otázkách GMO ve světě a uvádí ho do souladu s odbornou a legislativní úrovní v ČR. Komise má tedy dobře zmapovánu situaci práce s GMO v ČR. 9.3. Budoucnost nakládání s geneticky modifikovanými organismy
Parlament a Rada EU připravují nové nařízení o geneticky modifikovaných organismech a potravinách nebo krmivech nich vyrobených. Značení se bude týkat sledovanosti a značení geneticky modifikovaných organismů a potravinářských výrobků, vyrobených z GMO nebo příměsí výrobků, obsahujících GMO. Předpokládá, že Komise EU zavede systém jednoduchého numerického kódu pro GMO. Tento kód bude doprovázet organismus od jeho produkce až ke spotřebiteli, nebo ke zpracování, které z něj učiní neživý produkt. Ten bude opatřen již jen nápisem „Vyrobeno z GMO“. Nařízení se týká i výrobků z GMO, které neobsahují zjistitelné stopy nukleových kyselin a bílkovin (např. olejů). Není vyžadováno u produktů, vyrobených s pomocí GMO, např. u živočišných produktů zvířat, krmených geneticky modifikovanými rostlinami.
Podle Zákona č. 306/2000 Sb. o potravinách a tabákových výrobcích u nás od příštího roku bude nutno značit potraviny, které obsahují příměs GMO. Existuje několik laboratoří, které provádějí detekci příměsi GMO v surovinách a potravinách. Metoda je založena na analýze přítomnosti specifických sekvencí DNA (tzv. metoda PCR). Aby měla smysl, musí být schopna zachytit úsek části genu, tedy úsek, který tvoří méně než 1/100 000 obsahu DNA v jádře. Tento úsek musí umět zachytit v množství příměsi menším než 1%, čímž se požadavek na citlivost metody opět o dva řády zvyšuje. Cena analýzy representativního vzorku potravin nebo surovin se pohybuje v rozmezí tisíců až desítek tisíců korun. Podle zákona č. 153/2000 Sb. však pokuty za neoprávněné nakládání s GMO dosahují výše statisíců až milionů korun.
Tato opatření jsou vynucena veřejností, silně negativně ovlivněnou antibiotechnologickými organizacemi. Dočasně je ve světě sice možná koexistence maximálního využívání předností GMO v USA a Kanadě a obav a vyhýbání se jim v Evropě, není to ale trvalý stav.
20
Závěry:
U většiny kulturních plodin neexistují „přirozené“ odrůdy, získané výběrem. Všechny současné odrůdy kulturních plodin byly získány kombinací různých přístupů moderní genetiky. Genetické modifikace - včleňování jednotlivých genů nebo malých skupin genů do dědičného základu, jsou nejnovějším členem řady těchto přístupů. Zavádění geneticky modifikovaných rostlin do přírodního prostředí se provádí v postupných krocích, které se vyhodnocují. Využívají se také geneticky modifikované kultury mikroorganismů a spíše v experimentálním stadiu, než ve stadiu běžného využití, jsou geneticky modifikovaní živočichové. V ČR se geneticky modifikované odrůdy tržně nepěstují, ale pěstují se na malých plochách postupně. Podle zákona č. 153/2000 veškeré kultivace geneticky modifikovaných organismů povoluje, registruje a sleduje Ministerstvo životního prostředí spolu s Českou komisí pro nakládání s geneticky modifikovanými organismy, Ministerstvem zemědělství a Ministerstvem zdravotnictví. Žádné nepříznivé vlivy geneticky modifikovaných rostlin zatím u nás ani kdekoli jinde nebyly zjištěny. Geneticky modifikované odrůdy rostlin se tržně pěstují od r. 1994 a v roce 2000 se pěstovaly na celkové ploše přes 400 000 km2. Potraviny a produkty z nich vyrobené se v USA a Kanadě používají bez omezení a žádné zdravotní ani jiné problémy nevznikly. Přesto v EU jsou a v ČR od příštího roku budou výrobky, obsahující geneticky modifikované organismy, při prodeji značeny. Literatura Římanová, D., Doubková, Z.: Zákon o nakládání s geneticky modifikovanými organismy a produkty a o změně některých dalších zákonů včetně prováděcích předpisů s komentářem. Nakl. Polygon, 2001. Šifner, F. a kol.: Vybrané kapitoly z biotechnologií pro studující učitelství biologie a ekologické výchovy. (Skriptum). Karolinum, Praha 1998. *Adresa autora: Doc. RNDr. Miloš Ondřej, DrSc. Ústav molekulární biologie rostlin AVČR České Budějovice Branišovská 31 370 05 [email protected] tel. 038/7775508 fax 038/7775537
21
MODERNÍ METODY MĚŘENÍ VYBRANÝCH FYZIKÁLNÍCH VELIČIN
Ing. Pavel Svoboda, CSc.
Fyzikální ústav Akademie věd ČR, Praha
Obsah :
1. Úvod : Měření a soustava jednotek SI
2. Kvantové jevy v metrologii 2.1. Josephsonův jev a etalon elektrického napětí 2.2. Kvantový Hallův jev a etalon odporu 2.3. Místo kvantových etalonů napětí a odporu v soustavě SI 2.4. Tunelování jednotlivých elektronů a etalony proudu a kapacity 2.5. Metrologický trojúhelník
3. Moderní metody realizace kilogramu 3.1. Avogadrovo číslo a křemíkové koule 3.2. Kilogram a kvantové etalony elektrických veličin
4. Závěrem : Jak jsme na tom v ČR ? 1. Úvod : Měření a soustava jednotek SI
Měřením v nejširším slova smyslu nazýváme soubor operací, jejichž cílem je přiřadit určité veličině číselnou hodnotu. Tato činnost je náplní vědního oboru, který se nazývá metrologie. Úkoly metrologie je možno shrnout do následujících bodů :
• stanovit vhodné jednotky měření, jejichž násobkem je příslušná číselná hodnota dané veličiny; • vyvinout metody, jakými lze tyto jednotky v praxi realizovat s nejvyšší dostupnou přesností. Výsledkem této činnosti jsou tzv. etalony měření. • sledovat rozvoj vědních disciplín vztahujících se k metodice měření a využívat nových objevů, které mohou přispět k zvýšení přesnosti měření a k realizaci přesnějších či snadněji aplikovatelných etalonů měření. • vypracovat a udržovat systém navazování mezinárodních etalonů na národní etalony jednotlivých států tak,aby byla zajištěna jednotnost měření v různých zemích.
Toto je ovšem současné vymezení úkolů metrologie, k němuž vedla dlouhá cesta. Ta začala s rozvojem obchodu u jednotek, z dnešního hlediska často dosti bizarních, které byly odvozeny např. z rozměrů předmětů považovaných tehdy za všeobecně známé či dokonce z tělesných rozměrů panovníků. Tyto jednotky měly zřejmě pouze lokální význam. Již ve středověku se však projevovaly snahy definovat jednotky běžných veličin poněkud obecněji a s využitím elementárních statistických postupů. Definice jednotek měření se mnohokráte měnila s tím, jak se rozšiřoval okruh jejich uživatelů. Vznikala potřeba univerzálních, všeobecně platných a uznávaných jednotek a současně se rozšiřoval okruh veličin, které bylo potřeba měřit. Bylo zřejmé, že jednotky měření není možno volit libovolně, nýbrž že musí tvořit ucelený systém. Tento proces vyvrcholil v roce 1875, kdy byl vytvořen Mezinárodní systém jednotek, tzv. soustava SI, která je používána dodnes. Původní dohodu přijalo 17 států, které založily Mezinárodní konferenci měr a vah (CPGM). Počet členských států se postupně zvýšil na dnešních 47; jedním z nich je také Česká republika.
22
Soustava SI je tvořena 7 základními jednotkami (metr, kilogram, sekunda, ampér, kelvin, mol a kandela), 2 doplňkovými (radián a steradián) a množstvím jednotek odvozených, které jsou vytvářeny ze základních, případně doplňkových, jednotek pomocí definičních vztahů. Vidíme, že z elektrických jednotek měření, které jsou hlavním předmětem této přednášky, se mezi těmi základními vyskytuje pouze jedna jediná, a tou je jednotka elektrického proudu ampér. Všechny ostatní elektrické jednotky soustavy SI jsou jednotkami odvozenými a závisejí také na jednotkách mechanických , jmenovitě na metru, kilogramu a sekundě.
Jak jsme již zmínili, soustava SI platí beze změn již 126 let. To ovšem neznamená, že se nemění způsoby, jakým lze její jednotky, základní i odvozené, prakticky realizovat. Tady metrologie těžila a stále těží z nových objevů přírodních věd, především fyziky, a způsob realizace většiny jednotek se za tu dobu podstatně změnil. Vždy však byla dodržována zásada, že nově definovaný etalon pouze zpřesňoval svého předchůdce v tom smyslu, že jeho hodnota ležela uvnitř intervalu neurčitosti ( „ přesnosti “ ) staršího etalonu dané veličiny a jeho vlastní neurčitost byla menší. Zvláště v posledních desetiletích byla hlavním motivem těchto změn snaha přejít u tzv. primárních etalonů veličin od výtvorů lidských rukou (např. mezinárodních prototypů jednotek) k jevům, navázaným na základní přírodní konstanty, nezávislé na člověku. Dnes už, pokud jde o základní jednotky SI, odolává těmto snahám jediná z nich, totiž kilogram, který je stále reprezentován oním platino-iridiovým artefaktem, přechovávaným v Paříži, v klimatizované sklepní místnosti Mezinárodního úřadu měr a vah (BIPM). V této přednášce se chci mj. pokusit ukázat , že i jeho dny se krátí. Hlavním předmětem této přednášky jsou však jednotky elektrické, při jejichž realizaci se uplatnily velké objevy fyziky pevných látek posledních několika desetiletí.
Jediná základní elektrická jednotka soustavy SI - ampér - je definována prostřednictvím silových účinků dvou paralelních vodičů protékaných proudem a její realizace tedy zahrnuje vážení. Dosahovaná přesnost činí dnes řádově 10-7. Jednotka elektrického napětí volt je určována pomocí tzv. napěťových vážek, kde se srovnává elektrostatická síla Fe působící mezi elektrodami válcového kondenzátoru dané kapacity C s gravitační silou Fm působící na závaží hmotnosti m. Zařízení tohoto typu postavené v roce 1991 v německém Spolkovém fyzikálně technickém ústavu (PTB) pracuje se standardní relativní chybou 3.10-7. Pokud jde o jednotku elektrického odporu ohm, zde se využívá speciálně konstruovaného kondenzátoru s vypočitatelnou kapacitou a kombinace měření kapacit a impedancí umožňuje kromě ohmu stanovit i jednotku kapacity farad. U ohmu bylo na špičkové aparatuře vybudované v r. 1989 v USA dosaženo relativní neurčitosti 2,2.10-8.
Naznačené postupy poskytují tzv. primární etalony hlavních elektrických veličin. Ty se pro svoji složitost ovšem nepoužívají k přímému cejchování praktických měřících přístrojů. K tomuto účelu slouží tzv. sekundární etalony měření, které jsou uchovávány v národních metrologických laboratořích a jejichž vztah k příslušným primárním etalonům je znám a průběžně kontrolován. V případě napětí jsou těmito sekundárními etalony buď klasické Westonovy články o napětí 1,018 V anebo komerčně vyráběné referenční standardy v hodnotách 1 V a 10 V, v nichž je napětí stabilizováno pomocí Zenerovy diody. Sekundárními etalony odporu jsou drátové nebo fóliové odpory, zpravidla v dekadických hodnotách, z nichž nejběžnějšími jsou 1 Ω , 100 Ω a 10 k Ω . Konstrukce těchto odporů a výběr použitých materiálů je podřízen snaze co nejvíce potlačit vliv vnějších podmínek měření, především teploty, ale také atmosférického tlaku či vlhkosti prostředí, na jejich hodnotu. I tak však je pro jejich provoz nezbytně nutné zajistit vysokou stabilitu podmínek měření ve specializovaných laboratořích. Navíc je třeba stále sledovat změny jejich hodnoty v čase, k nimž nevyhnutelně dochází.
Možnost realizovat etalony odporu a napětí, jejichž hodnoty by se prakticky vůbec neměnily v čase a navíc by byly i podstatně méně citlivé vůči změnám vnějších podmínek měření, poskytla metrologii moderní fyzika pevných látek. Dva zásadní objevy posledních let, jejichž autoři byli v obou případech poctěni Nobelovou cenou za fyziku, zásadním způsobem
23
změnily metrologii elektrických veličin. V posledním desetiletí se navíc natolik zdokonalily technologie přípravy miniaturních součástek z kovů a polovodičů, že je možno uvažovat i o kvantovém etalonu elektrického proudu. To by vedlo k tomu, že všechny hlavní elektrické veličiny by byly vztaženy přímo k základním přírodním konstantám, jmenovitě k náboji elektronu e a Planckově konstantě h . Stručný popis podstaty těchto objevů a způsobu jejich praktického využití je náplní následujících odstavců.
2. Kvantové jevy v metrologii Elektrické jevy v pevných látkách jsou podmíněny rozložením a pohybem nositelů
elektrického náboje, elektronů. Striktně řečeno, veškeré chování elektronů se řídí zákony kvantové fyziky a adjektivum "kvantové" tedy lze použít pro všechny pozorované jevy. V řadě případů však vystačíme s popisem, v němž se elektrony chovají jako klasické částice. Čistě kvantové chování se ovšem projevuje na úrovni atomů a molekul a takovéto kvantové jevy využívá metrologie již dlouhou dobu. Například jednotka času, sekunda, mimochodem vůbec nejpřesněji definovaná jednotka SI s relativní neurčitostí nižší než 10-14, je již od roku 1967 definována pomocí přechodu mezi energetickými hladinami základního stavu atomu 133Cs. Zde však hovoříme o jevech pozorovaných ve vzorcích makroskopických rozměrů, v nichž jsou příslušné měřitelné veličiny - napětí, odpor nebo elektrický proud - kvantovány, tzn. nabývají pouze určitých hodnot, které lze vyjádřit jako celočíselný násobek nějaké přesně definované "jednotky", a k jejichž vysvětlení nevystačíme s klasickým popisem.
2.1. Josephsonův jev a etalon elektrického napětí Historicky prvním makroskopickým kvantovým jevem, o němž se zde zmíníme, je
supravodivost, které je letos již 90 let. V supravodiči je pohyb elektronů korelován na dlouhou vzdálenost a elektrony tvoří svázané dvojice, tzv. Cooperovy páry. V roce 1962 předpověděl Brian Josephson existenci jevů, které se uplatňují při průchodu Cooperových párů tenkou nesupravodivou barierou oddělující dva supravodiče. Jeho předpověď, která byla již v následujícím roce experimentálně potvrzena, je východiskem disciplíny zvané slabá supravodivost, která zásadním způsobem ovlivnila vývoj měřící techniky i metrologie. Brian Josephson obdržel Nobelovu cenu za fyziku v r. 1973.
Pro systém, tvořený dvěma supravodiči oddělenými dostatečně tenkou vrstvou izolátoru nebo normálního, nesupravodivého kovu - tzv. slabý spoj - předpověděl Josephson existenci dvou různých jevů :
• Stejnosměrný proud o hustotě J < Jc může procházet izolační vrstvou, aniž by na ní vznikalo jakékoliv napětí (stejnosměrný Josephsonův jev). Kritický proud Jc je dán parametry použitého slabého spoje.
• Je-li slabý spoj ozářen elektromagnetickým zářením o frekvenci f , vytváří se na izolační bariéře konstantní napětí U, jehož velikost je úměrná f (střídavý Josephsonův jev).
Stejnosměrný Josephsonův jev se záhy uplatnil v měřící technice při konstrukci tzv. skvidů - extrémně citlivých detektorů magnetického toku. Kvantový etalon elektrického napětí vychází ze střídavého Josephsonova jevu. Je-li slabý spoj, kterým prochází stejnosměrný proud, ozářen mikrovlnným zářením o frekvenci f, objeví se v jeho volt-ampérové charakteristice (tj. v závislosti měřeného stejnosměrného napětí U na procházejícím proudu J) stupňovitá struktura, tzv. Shapirovy schody. Jednotlivým stupňům, jejichž šířka závisí na amplitudě mikrovlnného záření a parametrech slabého spoje, odpovídá konstantní napětí U , jehož velikost je dána vztahem
U U n he
fn= =2
, (1)
24
kde n je celé číslo. Nastavením režimu slabého spoje na určitý schod dostaneme zdroj napětí, které prakticky nezávisí na typu použitého slabého spoje, je v dosti širokých mezích necitlivé k fluktuacím napájecího proudu a je určeno pouze hodnotou základní fyzikální konstanty h/2e. Měření napětí se tak prakticky převádí na měření frekvence, což je nejpřesněji měřitelná fyzikální veličina s relativní neurčitostí řádu 10-14. Prakticky používané frekvence leží v oboru mikrovln; budící frekvence 70 GHz poskytuje na jednom slabém spoji napětí 145 µV.
Základním problémem realizace etalonu napětí, založeného na střídavém Josephsonově jevu, je především výroba součástky s jedním nebo více slabými spoji. Postupně bylo zkoumáno několik typů slabých spojů, dnes se uplatňuje pouze tzv. tunelový spoj, schématicky nakreslený na obr. 1. Jde o dvě supravodivé destičky (v praxi spíše tenké vrstvy) supravodiče oddělené izolační vrstvou, jejíž tloušťka je srovnatelná s koherenční délkou ξ0 . Tato veličina patří mezi základní charakteristiky daného supravodiče a její velikost se pohybuje od několika nanometrů u vysokoteplotních supravodičů, jako je YBa2Cu3O7-δ , až do 1500 nm u hliníku. Tunelové spoje mají nenulovou kapacitu C , u spojů využívaných v kvantových etalonech napětí dokonce poměrně velkou, a jejich volt-ampérové charakteristiky v režimu stejnosměrného Josephsonova jevu vykazují výraznou hysterezi. Ozáříme-li tunelový spoj mikrovlnným zářením, dostaneme soustavu Shapirových schodů konstantního napětí, které se však vzájemně značně překrývají a kde dokonce můžeme nastavit nenulové napětí i při nulovém napájecím proudu. Jak uvidíme dále, právě tato vlastnost je klíčová pro budování kvantového etalonu napětí.
První Josephsonovy etalony napětí byly sestrojeny již v roce 1968. Obsahovaly pouze jediný slabý spoj a byly schopny produkovat napětí do 5 mV. Aby je bylo možno použít k sledování časových změn klasických Westonových článků s napětím 1,018 V, bylo třeba je doplnit napěťovými děliči, které značně zvyšovaly chybu měření a bylo velmi složité je vyrobit i ocejchovat. Bylo zřejmé, že řešením tohoto problému jsou tzv. Josephsonova pole slabých spojů, ve kterých je množství pokud možno stejných slabých spojů spojeno do série.
Jak jsme se již zmínili, u vysoce hysterézního tunelového spoje ozářeného mikrovlnným zářením může dojít k spontánnímu vzniku kvantovaných napětí i při nulovém napájecím proudu. Návrh Josephsonova pole takových spojů se objevil v roce 1977 a na začátku roku 1981 bylo realizováno pole o 100 spojích, produkující napětí do 27 mV při frekvenci mikrovln f = 20 GHz . Vývoj pak rychle pokračoval a jeho nositelem byly především Fyzikálně-technický spolkový ústav (PTB) v Německu a Národní institut pro standardy a technologie (NIST) v USA. Již v roce 1984 demonstrovaly týmy pracovníků těchto institucí společně vytvořené pole 1474 spojů, které bylo schopno poskytovat kvantované napětí do 1,2 V. Konečně v r. 1985 obě zmíněné instituce vyrobily prakticky použitelné Josephsonovy etalony napětí pracující na úrovni 1 V, které tak umožnily přímé porovnání s Westonovými
25
články a Zenerovými etalony 1 V bez jakýchkoliv napěťových děličů. Dalším krokem byla Josephsonova pole, obsahující i přes 20 000 propojených slabých spojů, které umožňovaly nastavit prakticky jakékoliv napětí v rozmezí od −10 V do +10 V. Pro ilustraci uveďme, že již v roce 1989 byl v PTB vyroben čip 10V, kde je umístěno 20160 tunelových spojů a veškeré mikrovlnné obvody, to vše na ploše 10×27 mm2. Dnes jsou komerčně dostupné čipy, umožňující (doladěním frekvence f budících mikrovln a volbou napájecího proudu J ) nastavit prakticky jakékoliv napětí v rozmezí od −15 V do +15 V. Při kalibraci nějakého sekundárního zdroje napětí se tedy vždy jedná o srovnávání napětí v poměru 1 : 1, což značně zjednodušuje měřící obvod.
Josephsonovo pole ovšem není tvořeno jenom soustavou sériově propojených slabých spojů. Jeho nedílnou součástí jsou i mikrovlnné obvody, které musí být navrženy tak, aby bylo zajištěno homogenní ozáření všech spojů. Ze vzorce (1) sice plyne, že pro dosažení co nejvyšších Shapirových schodů je třeba užít co nejvyšší frekvence f , z hlediska dosažitelných parametrů vlnovodů a dostupných zdrojů mikrovln je budící frekvence omezena pod 100 GHz a dnes nejběžnější pracovní frekvence mikrovln je 70 GHz. Byly vyrobeny součástky pracující i při frekvencích nižších, což se projeví v nižších nákladech na mikrovlnnou techniku, současně to však vede k užším Shapirovým stupňům a potřebě větších amplitud budících mikrovln, nemá-li příliš vzrůst plocha jednotlivých spojů .
Máme-li čip s Josephsonovým polem slabých spojů a systémem vlnovodů umožňujících jejich ozáření mikrovlnami z nějakého vhodného zdroje, je potřeba jej především ochladit na pracovní teplotu, a to zpravidla přímým ponořením do lázně kapalného 4He v transportní héliové nádobě. Čip je propojen s vnějšími elektrickými a mikrovlnnými obvody, které pracují na pokojové teplotě. Měřící obvody používané v existujících kvantových etalonech napětí se příliš neliší od napěťových komparátorů používaných pro vzájemné porovnání dvou klasických sekundárních etalonů. Je třeba pouze na nejvyšší možnou míru potlačit zdroje šumu v těch částech obvodu, který pracují na pokojové teplotě, aby bylo možno využít vysokou přesnost Josephsonova pole. Aparatury tohoto typu jsou dnes komerčně dostupné a v PTB byl dokonce vyvinut celý přenosný Josephsonův etalon napětí, který je možno provozovat v každé laboratoři zařízené na práci s kapalným héliem.
V posledních letech představili výrobci nové generace čipů, v nichž jsou dosud používané Josephsonovy spoje typu SIS (supravodič-izolátor-supravodič) nahrazeny tzv. bezhysterézními či odporově tlumenými spoji typu SNS nebo SINIS, kde N symbolizuje vrstvu normálního kovu. V nich je spoj přemostěn poměrně malým odporem R a voltampérová charakteristika ozářeného spoje sestává ze stupňů, kde je napětí kvantováno stejně jako o SIS spojů, které se však na rozdíl od nich nepřekrývají. Dané hodnotě budícího proudu J je tak jednoznačně přiřazena kvantovaná hodnota napětí. Tím je jednak odstraněna největší slabina polí SIS spojů, jejich časová nestabilita spojená s nekontrolovatelnými přeskoky mezi několika napětími odpovídajícími témuž budícímu proudu, jednak to otvírá cestu k programovatelným zdrojům přesného napětí.
Podmínkou použití polí bezhysterézních Josephsonových spojů je ovšem dokonalé zvládnutí technologie jejich přípravy tak, aby se V-I charakteristiky jednotlivých spojů v podstatě překrývaly. V NIST bylo vyrobeno Josephsonovo pole, tvořené 32 768 SNS spoji (Nb/AuPd/Nb) uspořádanými do 13 nezávisle napájených segmentů. Čip s tímto Josephsonovým polem je možno použít jako plně programovatelný, dokonale stabilní zdroj napětí, které je možno prakticky spojitě měnit v rozmezí od -1,1V do +1,1V.
Programovatelné Josephsonovy napěťové zdroje by mohly zcela změnit jedno odvětví metrologie, totiž etalonáž střídavých elektrických napětí a proudů. Ty jsou dnes odvozovány od příslušných stejnosměrných veličin pomocí tzv. termálních AC-DC konvertorů, v nichž jsou porovnávány tepelné účinky obou signálů. V nejjednodušším provedení je to odporový drát, umístěný ve vakuu ; změna jeho teploty, vyvolaná průchodem střídavého proudu, se
26
měří připojeným termočlánkem a srovnává se se změnou působenou průchodem stejnosměrného proudu známé velikosti. Jako alternativa se nabízí přímá syntéza střídavého signálu libovolného časového průběhu z pulsů stejnosměrného napětí známé výšky. V NIST se např. pracuje na vývoji přesného zdroje střídavého sinusového napětí milivoltových amplitud a frekvencí až do 1 MHz, které vzniká syntézou kvantovaných pulsů pole bezhysterézních Josephsonových spojů.
2.2 Kvantový Hallův jev a etalon odporu Kvantový Hallův jev (KHJ) objevil Klaus von Klitzing při zkoumání elektronových
transportních vlastností křemíkových, polem řízených tranzistorů Si-MOSFET za velmi nízkých teplot (T < 0,1 K) a v silných magnetických polích (B = 18 T). Při průchodu proudu I takovouto strukturou byly na křivce příčného (Hallova) napětí UH v závislosti na velikosti napětí na hradle pozorovány charakteristické prodlevy, na nichž bylo toto napětí s vysokou přesností konstantní a jeho hodnota odpovídala výrazu
U i hie
IH ( ) = 2 , (2)
kde i je přirozené číslo. Je pozoruhodné, že hodnota Hallova odporu RH (i)= UH (i)/ I na těchto prodlevách byla s vysokou přesností (zcela nesrovnatelnou s tou, s kterou se běžně elektronové transportní vlastnosti v pevných látkách měří) stejná pro různé vzorky a neměnila se ani při poměrně výrazných fluktuacích magnetického pole a změnách teploty měření. Nezbytnou podmínkou existence KHJ je přítomnost tzv. dvourozměrného elektronového plynu, (2DEG), kde je elektronům umožněno pohybovat se pouze v rovině vrstvy, a jeho umístění do silného (tzv. kvantujícího ) magnetického pole orientovaného kolmo k vrstvě 2DEG. Dvourozměrná elektronová vrstva se vytváří v několika typech vrstevnatých struktur, z nichž se pro účely metrologie prosadil hlavně heteropřechod GaAs / AlGaAs s 2DEG na rozhraní dvou polovodičů téměř shodné krystalové struktury, ale s rozdílnou šířkou zakázaného pásu.. Na rozdíl od Si-MOSFETů je zde koncentrace elektronů ve vrstvě fixována technologií přípravy heterostruktury a při experimentu se měří závislost napětí na vzorku na velikosti vnějšího magnetického pole B. Pro metrologické použití heterostruktur GaAs / AlGaAs pak stačí zařízení, umožňující vytvářet pole B ≤ 12 T při teplotě vzorku T < 2 K, což jsou podmínky realizovatelné mnohem snadněji než u vzorků křemíkových.
Charakteristický průběh závislosti odporu heteropřechodu v režimu KHJ na magnetickém poli je uveden na obr.2.. V závislosti Hallova odporu RH se objeví charakteristické prodlevy, v nichž je odpor s vysokou přesností roven kvantovaným hodnotám RH(i) = UH(i) / I. Na křivce podélného odporu Rxx je existence prodlev vždy doprovázena minimem; u prodlev využívaných v metrologii musí být hodnota odporu Rxx v minimu blízká nule, což v praxi bývá nejlépe splněno pro i = 2 a i = 4 . Objasnění původu tohoto chování je mimo rámec této přednášky, existence prodlev v Hallově odporu RH je však nesporným experimentálním faktem a je rovněž prokázáno, že hodnota RH (i) ,která odpovídá prodlevě se stejným pořadovým číslem i, je s přesností nejméně 10-9 stejná, ať už je získána měřením na strukturách Si-MOSFET nebo na heterostrukturách typu GaAs / AlGaAs.
27
Obr. 2 : Charakteristický průběh podélného odporu ρxx(B) a Hallova odporu RH(B) u heterostruktury GaAs / AlGaAs v režimu celočíselného KHJ
K realizaci kvantového etalonu odporu je třeba mít k dispozici nejen vhodnou polovodičovou strukturu a kryogenní zařízení, dovolující nastavit ji do příslušného pracovního bodu ( zpravidla T ≤ 1,5 K a B v rozmezí od 5 T do 12 T), nýbrž také měřící zařízení, které umožňuje s nejvyšší dosažitelnou přesností srovnat známou hodnotu RH(i) s odporem sekundárního odporového etalonu Rs, který chceme cejchovat a který je na pokojové teplotě.
Je třeba si uvědomit, že z hlediska uživatele jsou mezi Josephsonovým etalonem napětí a kvantovým etalonem odporu dva zásadní rozdíly. Zatímco napětí Josephsonova etalonu je možno přizpůsobit cejchovanému napětí, je hodnota RH(i) odporu kvantového etalonu dána a uživatel ji nemůže nijak ovlivnit. Navíc, hodnota odporu metrologicky využitelných prodlev KHJ není právě nejvhodnější ; jak vidíme z hodnoty von Klitzingovy konstanty RK-90 a ze vzorce (2), je RH(2)=12906,4 Ω a RH(4)=6453,2 Ω . Drátové či fóliové odporové etalony se tradičně vyrábějí a používají v dekadických řadách, takže nejbližší srovnatelný sekundární etalon je Rs=10 k Ω . Zdálo by se, že i zde lze přímo použít měřící obvody používané pro srovnání dvou odporů za pokojové teploty, pouze doplněné vhodným odporovým děličem. Bohužel tomu tak není. Klasické odporové můstky dosahují v optimálním případě (cejchování typu 1 : 1) relativní přesnosti 10-7 či jen o něco málo lepší (což je stále o 1 až 2 řády horší, než je reprodukovatelnost hodnoty RH(i)), podmínkou je však poměrně velký proud I ≥ 1 mA, který je třeba pouštět do vzorku pro zvýšení poměru signálu k šumu. Maximální proud, který je možno pustit do heterostruktury GaAs / AlGaAs, je zhruba 100 µA, a u struktur Si-MOSFET je to dokonce nejvýše I ≈ 10 µA. V praxi to znamená, že vývoj kvantového etalonu odporu zahrnuje rovněž konstrukci speciálního vysoce přesného měřícího obvodu.
Existuje několik typů měřících obvodů, s kterými je možno dosáhnout požadované přesnosti měření řádu 10-9. Historicky prvním z nich byl tzv. napěťový komparátor; odpory RH(i) a Rs jsou zapojeny do série, prochází jimi týž proud z jednoho zdroje a porovnává se napětí, které na nich vzniká. V původní verzi bylo možno porovnávat pouze dva stejné
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 110
200
400
600
800
1000
1200
1400
ρ xx [Ω
]
B [T]
0
2
4
6
8
10
12
14
RH(i) = h / i.e2 = RK-90/ iRK-90 = 25 812,807 Ω
i = 4
i = 3
i = 2
Idc = 45 µAT = 0,5 K
RH [kΩ
]
28
odpory, v pozdějších modifikacích se mohly i mírně lišit. Tento typ se dosud občas používá, zvláště v moderní verzi, kde je zdrojem referenčního napětí Josephsonovo pole slabých spojů. Jeho zásadní nevýhodou je, že k dosažení vysoké přesnosti potřebuje velmi dlouhou dobu měření.
Dnes je však téměř ve všech národních metrologických laboratořích dávána přednost tzv. kryogennímu proudovému komparátoru (CCC). CCC odstraňuje podmínku shodnosti odporů RH(i) a Rs a umožňuje přímé srovnání odporů i značně odlišných. Jeho složitost tkví především v tom, že součástí systému je i další kryogenní zařízení - skvid - ve funkci vysoce citlivého detektoru magnetického toku. Odpory RH(i) a Rs jsou zde zapojeny v různých proudových obvodech napájených různými proudovými zdroji. Vlastní proudový komparátor sestává z několika různých těsně na sebe navinutých vinutí o vhodně voleném počtu závitů Nk. Jedno z nich, primární s N1 závitů, je spojeno v sérii s odporem RH(i), zatímco druhé s N2 závity je v proudovém obvodu odporu Rs. Zapojení je takové, že primárním a sekundárním vinutím protéká proud opačným směrem . Protékající proud indukuje magnetický tok daný pro každé vinutí směrem a velikostí proudu a počtem závitů. Pokud se magnetické toky z primárního a sekundárního vinutí přesně kompenzují (skvid nedetekuje žádný celkový magnetický tok), je poměr velikosti proudů v primárním a sekundárním obvodu přesně roven poměru počtu závitů. Pokud navíc nulový detektor indikuje, že i napětí produkovaná těmito proudy na odporech RH(i) a Rs jsou si rovna, odpovídá poměr RH(i) / Rs poměru N1 / N2. Složitost tohoto zařízení spočívá především v nutnosti dokonalého odstínění vinutí proudového komparátoru a skvidu od vnějších vlivů, například i od fluktuací magnetického pole Země. To si vynucuje použití několikavrstvového supravodivého stínění a umístění celého komparátoru i se skvidem do kapalného hélia, a to zpravidla nejen do jiného kryostatu než ve kterém je magnet s odporem RH(i), ale i do jiné místnosti. S jeho použitím však lze dosáhnout relativní přesnosti řádu 10-9 již po několika minutách měření, a to i při přímém navazování odporu RH(2) například na sekundární etalon Rs=100 Ω .
2.3. Místo kvantových etalonů napětí a odporu v soustavě SI. Již několik let po objevu Josephsonových jevů a kvantového Hallova jevu bylo
experimentálně prokázáno, že kvantované hodnoty napětí resp. odporu je možno reprodukovat s přesností nejméně o 2 řády převyšující dosažitelnou přesnost realizace příslušných jednotek soustavy SI. To vyvolalo mezi metrology intenzivní diskusi, zda nenastal čas změnit základní jednotky soustavy SI, což by především postihlo jednotku hmotnosti a všechny jednotky z ní odvozené. Existovalo veliké pokušení využít k tomu právě kvantových jevů v pevných látkách. Nakonec však bylo zvoleno a všemi členy Mezinárodní konference měr a vah (CPGM) přijato jiné řešení : neměnit soustavu SI, ale doporučit všem členským zemím přesně definované dohodnuté hodnoty základních konstant, které vystupují v rovnicích pro Josephsonovo napětí (1) a kvantovaný Hallův odpor (2). Při stanovení těchto konstant se vzaly v úvahu hodnoty naměřené v deseti předních světových metrologických laboratořích a výsledkem je, že s účinností od 1.1.1990 je pro mezinárodně jednotné uchovávání voltu nahrazena veličina 2e /h ve vztahu (1) tzv. Josephsonovou konstantou KJ-90, zatímco pro ohm je ve výrazu (2) třeba nahradit veličinu h / e2 tzv. von Klitzingovou konstantou RK-90. Doporučené hodnoty těchto konstant dnes činí
KJ-90 = 483 597,9 GHz / V ;
RK-90 = 25 812,807 Ω .
29
Tím bylo dosaženo toho, že jednotky elektrických veličin, získané měřením kvantových etalonů, souhlasí v mezích jejich přesnosti s jednotkami SI, jsou reprodukovatelné s vysokou přesností ( chyba ≤ 10-9 ), nepodléhají žádnému měřitelnému časovému posuvu a vedou ke stejným numerickým hodnotám při cejchování v různých institucích ve světě.
Soustava SI tedy zatím odolala. Jak však uvidíme dále, tlak na změnu základních jednotek SI stále trvá, především v souvislosti se snahou nahradit mezinárodní prototyp kilogramu časově nezávislou jednotkou.
2.4. Tunelování jednotlivých elektronů a etalony proudu a kapacity Říkali jsme, že objev supravodivosti slaví letos 90. narozeniny. Stejně starý je i slavný
Milikanův pokus, který demonstroval, že elektrický náboj je kvantován, to znamená že je vždy roven celistvému násobku náboje elektronu e . Elementární náboj e je ovšem velmi malý a teprve v posledních letech umožnil rozvoj mikroelektroniky, zvláště pak tzv. nanolitografie, praktickou realizaci součástek, v nichž je možno detekovat procesy vyvolané přemístěním jednoho jediného elektronu. Přenos jednotlivých elementárních nábojů vyžaduje totiž existenci struktur tak malých, aby přítomnost či absence jediného elektronu vedla k významné změně energie systému. Tato změna musí být velká ve srovnání s jinými relevantními energiemi, především s tepelnou energií kB T .
Tunelováním jednotlivých elektronů (JET) rozumíme řízený proces, při němž známý počet elektronů prochází za jednotku času součástkou, obsahující tzv. tunelové spoje, to jest tenké izolační bariéry oddělující od sebe dvě vodivé oblasti. Elektrický proud tekoucí součástkou pak bude vyjádřen vztahem
I = e f , (3)
kde f udává četnost průchodu elektronů součástkou.
Existuje několik typů součástek, kde je takovýto proces možno uskutečnit. Jejich podstatou je vždy manipulace s nábojem uskutečňovaná prostřednictvím elektrostatické energie v ultraminiaturních vodivých „ostrůvcích“ oddělených tunelovými spoji. Na každý z těchto spojů je možno pohlížet jako na jakýsi nedokonalý kondenzátor, charakterizovaný kapacitou C a odporem R . Je-li odpor R konečný, může docházet k průchodu elektronu bariérou prostřednictvím tunelovacích procesů. Kvantování náboje vede k tomu, že se náboj přes tunelový spoj může přemísťovat pouze v celočíselných násobcích e . Energie tohoto systému se v důsledku tunelování elektronů bariérou mění po stupních o velikosti
eC
EC
2
2= . (4)
Energii EC označujeme jako nabíjecí energii.. Řízené tunelování jednotlivých elektronů se může uskutečnit tehdy, bude-li tato energie velká ve srovnání s ostatními charakteristickými energiemi systému. Především musí být splněna podmínka
EC >> kB T . (5)
V opačném případě bude tepelná energie vyvolávat nekontrolovatelné tunelovací procesy.
Tunelové spoje musí být extrémně malé, aby měly dostatečně nízkou kapacitu C a bylo tak možno splnit podmínku (5) při experimentálně dosažitelných teplotách. Přenos náboje přes tyto spoje musí být ovládán pouze pomocí napěťových zdrojů. Kontrolní napětí je přiváděno k hradlům, kterými jsou opatřeny vodivé oblasti po obou stranách tunelového spoje, a tím je na něm indukován požadovaný náboj. Prakticky všechny reálné struktury používané v experimentech s jednoelektronovým tunelováním vycházejí z tohoto principu.
30
Nejjednodušší z nich je jednoelektronový tunelovací tranzistor , na němž je možno ilustrovat podmínky, za nichž JET skutečně funguje.
Zjednodušené schéma JET transistoru je uvedeno na obr.3 . Tvoří jej dva do série zapojené tunelové spoje, představované kondenzátory C, a hradlo, které je přes kapacitu CG připojeno ke zdroji napětí U. Přiložením napětí U k hradlu pak měníme celkový náboj q vodivého ostrůvku mezi oběma tunelovými spoji. Druhý napěťový zdroj umožňuje měnit napětí V na obou kondenzátorech C a vhodnou volbou napětí U a V je možno určit, zda součástkou bude či nebude procházet proud I .
Obr. 3 : Schématické uspořádání jednoelektronového tunelovacího (JET) transistoru
C C
V/2 CG −V/2 U
Ostrůvek mezi tunelovými spoji JET tranzistoru obecně obsahuje makroskopický počet elektronů ( typicky 1010 ), jejich záporný náboj je však kompenzován kladnými ionty. Tunelovací procesy dodávají n nadbytečných elektronů, které dávají ostrůvku efektivní náboj ne. Pro každou celočíselnou hodnotu n existuje obor napětí U a V, ve kterém je průchod proudu potlačen tzv. Coulombovou blokádou (energie, kterou napěťové zdroje systému dodávají, nedosahuje velikosti nabíjecí energie EC ) a naopak oblast, kde proud volně prochází.. Měřený proud je pak periodickou funkcí napětí na hradle U s periodou e/CG.
Výše naznačený popis je značně zjednodušený a v praxi se JET transistor ztěží může uplatnit jako součástka, kde by bylo možno prakticky aplikovat vztah (3) s dostatečnou přesností. Našel však využití jako velmi citlivý elektrometr. Jelikož kapacita hradla CG může být v reálných součástkách extrémně malá (obvykle CG ≈ 3×10-5 pF), stačí k změně proudu procházejícího součástkou i velmi malý náboj na hradle. Bylo demonstrováno, že tento typ elektrometru může pracovat s citlivostí řádu 10-6 e / Hz . Překážkou přímého využití tunelování jednotlivých elektronů v JET tranzistoru je fakt, že známe pouze jakousi v čase středovanou hodnotu efektivního počtu n nadbytečných elektronů uvnitř ostrůvku a skutečný počet fluktuuje tak, jak elektrony z obou směrů tunelují dovnitř ostrůvku a opět ho oběma směry opouštějí. Bylo by tedy žádoucí mít možnost elektron kontrolovaně zachytit a vzápětí vyslat požadovaným směrem. Takové součástky, ve kterých je možno experimentálně pozorovat kvantování proudu po stupních daných vztahem (3), se objevily poměrně nedávno. Je možno je rozdělit do dvou příbuzných typů, pro které se vžilo označení jednoelektronový turniket a jednoelektronová pumpa.
31
Obr. 4 : C C C C Principiální schéma
V/2 CG −V/2 jednoelektronového turniketu se 4 tunelo- vými spoji. U
V minimální možné konfiguraci je jednoelektronový turniket tvořen nejméně 4 tunelovými spoji a jedním hradlem , které jsou uspořádány tak, jak je schématicky naznačeno na obr.4. Obecně může mít turniket i jakýkoliv sudý počet tunelových spojů větších než 4. Kvantování proudu v JET turniketu bylo poprvé pozorováno v roce 1990.
U JET tranzistoru se oblasti stability pro dvě různé hodnoty n setkávají pouze v jednom bodě při V = 0. Pouze tam je tedy možno zachytit elektron uvnitř ostrůvku, při absenci napájecího napětí V však může se stejnou pravděpodobností opustit ostrůvek v obou směrech. Naopak u jednolektronového turniketu existuje zmíněný překryv i při nenulových napětích V , což umožňuje ovládat směr pohybu elektronu součástkou. Je-li napětí U = e/CG a V ≈ e/2C , je energeticky výhodné, aby elektron tuneloval do krajního vodivého ostrůvku. Vzápětí dojde k dalšímu snížení energie tím, že elektron projde druhým spojem do prostředního ostrůvku a tam zůstane zachycen, protože tento stav za daných podmínek odpovídá minimu volné energie systému. Změníme-li nyní napětí na hradle tak, že U = 0, stává se pro systém energeticky výhodným snížit opět efektivní náboj prostředního ostrůvku o e ( n = 1 → n = 0), což se uskuteční prostřednictvím dvou tunelovacích procesů, kterými elektron přes krajní ostrůvek opustí turniket. Směr pohybu je určován směrem napájecího napětí V , který se během celého cyklu nemění. Znamená to, že pouhou změnou hradlového napětí U z nuly na e/CG a zpět na nulu propustíme turniketem právě jeden elektron. Konstantní proud pak dostaneme, přiložíme-li k hradlu střídavé napětí o frekvenci f a amplitudě e/CG . Na voltampérových charakteristikách součástky se pak objeví kvantové prodlevy při hodnotách proudu I = ± e f.
Jednoelektronová pumpa se svým provedením poněkud liší od turniketu, i když pracuje na tomtéž principu. Na rozdíl od turniketu ji tvoří libovolný počet tunelových spojů větší než 2 a ke každému vodivému ostrůvku je přiváděno střídavé hradlové napětí téže frekvence a amplitudy, avšak různě časově zpožděné. Elektron je tak „pumpován“ z jednoho ostrůvku na druhý a kvantovaná hodnota proudu I = e f je pozorována i při nulovém napájecím napětí V. Právě to odlišuje JET pumpu od JET turniketu. Dnes probíhá paralelně výzkum na obou typech těchto součástek.
Uvažujeme-li potenciální metrologická využití JET , je pochopitelně klíčovou otázkou přesnost, s jakou lze realizovat vztah (3). Je totiž principiálně nemožné přesně prostorově lokalizovat kvantově mechanickou částici, takže (3) má vždy pouze omezenou platnost. Zmíníme se zde o 3 hlavních faktorech, které ovlivňují činnost JET turniketu i jiných obdobných součástek.
1.) Existuje nenulová pravděpodobnost, že během charakteristického času τ ≅ 1/f nedojde k tunelování elektronu. Je-li četnost tunelování Γ , je tato pravděpodobnost úměrná e−τ Γ a s ní spojená neurčitost v proudu δI / I ≈ e−Γ/ f . Tato podmínka vede k požadavku nízké budící
32
frekvence f a nízkého odporu bariéry R , který podporuje vysokou četnost tunelování Γ. V praxi se ukazuje, že tato chyba se začíná výrazněji uplatňovat při f ≥ 10 MHz , což omezuje obor dostupných kvantovaných proudů na I ≤ 1,6 pA .
2.) Pro každou konečnou teplotu existuje nenulová pravděpodobnost, že k přenosu náboje dojde i v režimu Coulombovy blokády . Proběhne tedy proces, který zvýší energii systému , což může být výrazným zdrojem chyb zvláště pro součástky s malou hodnotou nabíjecí energie EC . Tento faktor vede k neurčitosti δI / I ≈ e E k TC B− / , což v praxi vede k požadavku co nejmenší kapacity C a tudíž i co nejmenších rozměrů vodivých ostrůvků.
3.) Mohou existovat vícestupňové tunelovací procesy (tzv. co-tunneling). I když výsledný stav má nižší energii než stav počáteční, může některý z dílčích přeskoků energii zvyšovat. Tento jev významně ovlivňuje přesnost všech JET součástek. Jelikož jeho příspěvek je potlačen u součástek s větším počtem tunelových spojů, přechází se dnes v praxi např. od turniketů se 4 spoji k turniketům se 6 a více spoji i za cenu komplikovanější technologie přípravy i ovládání.
Chceme-li realizovat kvantový etalon elektrického proudu, stojíme tedy před problémem, jak měřit proud I ≅ 1 pA s přesností lepší než 1 ppm ( 10-6). Pro ilustraci uveďme, že to znamená rozlišit proudy, při kterých se za sekundu přemístí 6 elektronů !
Shrňme zde nejprve požadavky kladené na technologii přípravy součástek, použitelných pro praktické využití JET. Hlavním úkolem je získat spoj kov-izolátor-kov, u nějž pro kapacitu mezi elektrodami platí C < 1 fF = 10-15 F a jehož tunelový odpor se pohybuje v rozmezí od 25 kΩ do několika MΩ . Toho lze dosáhnout u spojů o rozměru řádu 100 nm nebo menších s izolačními bariérami tlouštky řádově 1 nm. K tomuto účelu je třeba mít k dispozici elektronový litograf se svazkem, který je možno fokusovat lépe než na 30 nm, a vhodný, na elektrony citlivý fotorezist.
Používaným materiálem je dnes výhradně Al , především proto, že lze dokonale kontrolovat růst oxidové vrstvy Al2O3, vytvářející izolační bariéry. Miniaturizace plochy spoje je dosahována speciální technikou, kde spoj vzniká na překryvu dvou vrstev, napařených postupně přes stejnou masku, ale pod různými úhly. Původně se všechny potřebné spoje včetně hradel a přívodů připravovaly současně v jedné vrstvě, v poslední době se vyvíjejí postupy, kde jsou hradlové elektrody umístěny nikoliv vedle vodivých ostrůvků, nýbrž v jiné vrstvě pod nimi. To umožňuje potlačit velikost parazitních kapacit, kterými je dané hradlo vázáno k sousedním ostrůvkům.
Klíčem ke kvantovému etalonu proudu je tedy přesné měření velmi malých proudů. Nejjednodušší metoda měření proudu je založena na konverzi proudu na napětí prostřednictvím známého ohmického odporu. V našem případě by to však vyžadovalo použití odporů velikosti 10 - 100 MΩ , které je obtížné ocejchovat s dostatečnou přesností. Proud je ovšem možno měřit přímo pomocí výše diskutovaného kryogenního proudového komparátoru (CCC). CCC by vlastně působil jako jakýsi zesilovač proudu s koeficientem zesílení daným poměrem počtu závitů N1 : N2. Ten sice z praktických důvodů nemůže být libovolně veliký, nedávno však byly představeny fungující komparátory s poměrem N1 : N2 = 1 : 20 000 a dokonce i 1 : 30 000. Tato zařízení jsou schopna detekovat proudy s přesností řádu 0,1 fA (tj. 10-16 A !!), což je stále nedostačující, pokud se nějakým způsobem nepodaří zvýšit hodnotu budící frekvence f a tím i velikost proudu generovaného součástkami na bázi JET.
Takovou možnost představuje zcela nová metoda, kterou na posledních dvou metrologických konferencích představil prof. Michael Pepper s kolegy z university v anglickém Cambridge. Tamní skupina se již několik let zabývá interakcí elektronů v dvourozměrných elektronových systémech (2DES) s tzv. povrchovými akustickými vlnami (SAW). Tyto vlny vznikají v piezoelektrických materiálech, jakým je např. GaAs, v důsledku elektro-mechanické vazby. Vznikne modulace potenciálu, která se pohybuje spolu s SAW a je
33
schopna “unášet” elektrony zachycené v minimech potenciálu. Je-li těmto elektronům do cesty postaven jednorozměrný vodivý kanál kontrolované šířky (který vzniká na 2DES přiložením napětí k hradlu speciálního tvaru), je možno teoreticky dosáhnout stavu, kdy každé minimum potenciálu spojené s SAW “nese” právě jeden elektron a proud procházející kanálem je dán kvantovým vztahem I = e fSAW . Vtip je v tom, že frekvence fSAW v heterostrukturách GaAs/AlGaAs je podstatně vyšší ( fSAW ≅ 2,8 GHz ) , než je pracovní frekvence existujících jednoelektronových pump či turniketů, která nepřevyšuje 10 MHz . To by vedlo k výstupnímu proudu na úrovni I ≅ 0,5 nA , což by spolu s výše zmíněnými CCC už mohlo vést k dosažení kýžené relativní přesnosti pod 10-6. Metoda je dosud ve stadiu základního výzkumu a dosažená přesnost kvantování proudu podle vztahu I = e fSAW zatím nepřesahovala 5x10-5, je to však nesporně slibná možnost.
Dnes pravděpodobně nejnadějnější přístup k měření velmi malých proudů ze součástek, pracujících na základě JET, je založen na tzv. proudovém integrátoru, v němž je proud převáděn na napětí prostřednictvím kondenzátoru Cs známé velikosti. Kondenzátor je nabíjen kvantovaným proudem I a měří se časový průběh napětí na kondenzátoru V(t). Proud je pak určen ze vztahu
I = Cs dVdt
. (6)
Abychom nabili proudem I = 1 pA kondenzátor Cs za 100 s na napětí 1 V, potřebujeme kondenzátor o kapacitě Cs = 100 pF. Zařízením, pracujícím na tomto principu, změřili pracovníci University v Delftu proud I ≅ 1 pA odebíraný z JET turniketu se 4 spoji, s přesností 10 ppm (10-5). To je stále ještě dost daleko od toho, co metrologové nazývají přesným měřením, je to ale krok správným směrem.
V tomtéž roce 1994 publikovala americká skupina z NIST podstatně přesnější měření, dosažené s poněkud jinou součástkou, a sice s JET pumpou s 5 spoji. Zaměření tohoto experimentu bylo poněkud jiné : nešlo zde o absolutní měření proudu, nýbrž o pokus realizovat kvantový etalon kapacity, vycházející přímo z definice této veličiny. JET pumpa sloužila jako čítač elektronů, přiváděných na kondenzátor C a měřilo se napětí , které se na něm vytvářelo. Problém přesného měření malého napětí V, při kterém se neodebírá prakticky žádný proud, byl vyřešen použitím další součástky využívající jevu Coulombovy blokády, totiž JET tranzistoru. Elektronová pumpa s 5 spoji pracovala s neurčitostí 500 ppb (5×10-7). Vývoj kvantového etalonu kapacity v NIST stále pokračuje. V poslední verzi, představené v roce 2000, zařízení sestává z jednoelektronové pumpy se 7 spoji, která dodává známý počet elektronů N (s nejistotou δN/N ≈ 10-8 ) na desky speciálního kryogenního kondenzátoru s vakuovou mezerou o C ≈ 2 pF a svodovém odporu R > 1019 Ω. Známý náboj Ne indukuje na tomto kondenzátoru napětí ∆V (v rozmezí od 4 do 22 V, podle zvolené hodnoty N ), které se měří vysoce citlivým JET transistorem se 2 tunelovými spoji. Celková neurčitost takto stanovené kapacity kondenzátoru činila δC/C ≅ 1x10-7 .
Na rozdíl od kvantových etalonů elektrického napětí a odporu tedy dosud vyvinutá zařízení na bázi JET nedovolují realizovat jednotku elektrického proudu ani kapacity s přesností lepší, než kterou poskytují "klasické" postupy, i když se k ní již v obou případech blíží. Je ostatně pochybné, že se kdy podaří realizovat součástku poskytující elektrický proud kvantovaný obdobně přesně, jako je tomu u napětí na Josephsonových spojích a u odporu v režimu kvantového Hallova jevu. Jak však uvidíme v následujícím odstavci, JET může i tak být považováno za metodiku umožňující testovat vnitřní konzistentnost fyzikálních teorií resp. základních přírodních konstant.
34
2.5. Metrologický trojúhelník Fyzika pevných látek tedy poskytla metody, jak vztáhnout měření elektrických veličin k
základním přírodním konstantám, elementárnímu náboji e a Planckově konstantě h. Ty jsou v tomto kontextu považovány za známé a jejich neurčitost je stanovována jinými, fyzikálně zcela odlišnými experimenty.
Vzájemnou souvislost kvantových jevů, diskutovaných v této přednášce, ilustruje metrologický trojúhelník zakreslený na obr.5. Každý z těchto jevů spolu svazuje 2 ze 3 měřitelných fyzikálních veličin, kterými jsou napětí U , proud I a frekvence f . Dvě z ramen trojúhelníku již byly realizovány a poskytly tak „nejlepší“ hodnoty kvantových konstant KJ = 2e/h a RK = h/e2. Ty je ovšem možno získat i z jiných experimentů a konfrontace výsledků tak umožňuje testovat konzistentnost teorií, na nichž jsou jednotlivé experimenty založeny.
Hodnotu RK , získanou měřením KHJ, je tak možno srovnávat s hodnotou získanou pomocí alternativního odporového etalonu , který využívá vypočitatelný kondenzátor Thompsonova - Lampardova typu. Jinou cestou, jak dospět k RK, je měření konstanty jemné struktury α, protože RK = µ0 c / 2α a permeabilita µ0 i rychlost světla ve vakuu c jsou definované veličiny s nulovou neurčitostí. Konstantu α je přitom možno určit měřením anomálního magnetického momentu elektronu či z velikosti hyperjemného rozštěpení atomových hladin. Tyto experimenty definují RK s neurčitostí 2×10-7, nejméně o 2 řády horší než je reprodukovatelnost měření KHJ.
Rovněž Josephsonovu konstantu KJ je možno určit alternativními metodami. Je např. možno realizovat volt kombinací vypočitatelného kondenzátoru a Wattových vážek, kterými je realizována jednotka výkonu. Wattovy vážky porovnávají elektrické teplo, generované napětím, s mechanickou energií. I když je přesnost těchto experimentů zatím omezená, v budoucnu by se limitujícím faktorem mohla stát neurčitost, s kterou je realizována jednotka hmotnosti kilogram. Hodnotu KJ je možno odvodit i jinak, např. z měření gyromagnetického poměru protonu kombinovaného s etalonem ohmu. Kombinace těchto experimentů poskytuje hodnotu KJ v soustavě SI se standardní odchylkou přibližně 4×10-7 , opět mnohem větší než u Josephsonova jevu.
35
Obr. 5 : Metrologický trojúhelník
f
Josephsonův jev JET U = ( h/2e ) × f I = e × f
U I Kvantový Hallův jev U = (h / e2)× I
Ve světle těchto údajů zvlášť vyniká potřeba doplnit i třetí větev metrologického trojúhelníku realizací kvantového etalonu proudu pracujícího s neurčitostí menší než 10-7. Tím by elektrická měření tvořila úplný systém a bylo by možno znova uvažovat, zda přeci jen nezměnit soustavu SI a neučinit např. jednotku hmotnosti jednotkou odvozenou. V následujících odstavcích se zmíním o tom, jaké kroky již v tomto směru byly podniknuty.
3. Moderní metody realizace kilogramu
Kilogram je dnes již jedinou základní jednotkou soustavy SI, který je reprezentován artefaktem - mezinárodním prototypem, který je uložen v Sévres u Paříže. Od něj jsou odvozeny národní prototypy, které se v pravidelných intervalech přivážejí do Sévres k porovnání, aby se posoudil časový drift jejich hmotnosti a zajistila tak jednotnost vážení v různých zemích. Tato situace trvá již od roku 1889. I když je časový posuv hmotnosti národních prototypů zpravidla nepatrný - pro zajímavost uveďme, že např. švédský národní prototyp kilogramu změnil za 100 let svoji hmotnost pouze o cca 2 µg - je toho dosahováno za cenu složitých a velmi přísně dodržovaných podmínek jejich přechovávání a nemalých komplikací při převozu k mezinárodnímu porovnání. Bylo by tedy nanejvýš žádoucí nalézt metodiku, která by umožnila vztáhnout i kilogram k fundamentálním, časově invariantním přírodním konstantám alespoň s relativní přesností řádu 10-8, které dosahuje "klasický" postup.
36
Tento cíl si vytkla metrologie již před delší dobou a dnes se stal jednou z hlavních priorit, alespoň pokud jde o základní jednotky SI. Zhruba v posledním desetiletí se prosadily dva odlišné přístupy k řešení tohoto problému. Jak uvidíme dále, ani jeden z nich dosud nedosahuje požadované úrovně přesnosti, přinejmenším jeden z nich je však velmi nadějný.
3.1. Avogadrovo číslo a křemíkové koule První přístup se obvykle označuje jako tzv. atomový kilogram a využívá vlastně opět
artefakt - co nejdokonalejší kouli o hmotnosti 1 kg, vyrobenou z vysoce kvalitního monokrystalu křemíku (což odpovídá průměru cca 93,6 mm). Ta je však pouze východiskem k přesnému stanovení Avogadrova čísla NA , definovaného jako poměr molární a atomové hmotnosti neboli jako počet atomů v jednom molu dané látky. Známe-li NA , může pak být kilogram definován v souladu s definicí molu jako hmotnost (1000 NA / 12) atomů uhlíku 12C v klidu. Tento přístup tedy svazuje jednotku hmotnosti s atomovými konstantami.
Celý proces zahrnuje výrobu a dokonalé proměření parametrů vyleštěné monokrystalické koule křemíku a stanovení její hustoty. Křemík byl vybrán proto, že to je jeden z nejprozkoumanějších prvků vůbec s perfektně zvládnutou technologií růstu monokrystalů (základní to suroviny polovodičového průmyslu), jehož krystalová struktura je známa a u něhož navíc izotopické složení téměř neovlivňuje mřížkové konstanty. Měření zahrnuje určení 5 parametrů : molární hmotnosti M(Si) (hmotová spektroskopie), mřížkové konstanty a0 (rentgenová difrakce), počet atomů v elementární buňce (tj. mimo jiné analýza obsahu defektů a nečistot ve výchozím krystalu), hmotnost koule Si (přesné váhy) a její poloměr (optická interferometrie). Poslední dvě jmenované veličiny slouží k stanovení hustoty ρ . Avogadrovo číslo je pak vypočteno ze vztahu
NA = 8 × M(Si) / (ρ × a03) = 8 × V0 / a0
3 , (7)
kde V0 je molární objem křemíku.
Bohužel se ukazuje, že experimenty tohoto druhu jsou mimořádně obtížné a spotřebují mnoho času. Přesto, že se na nich v posledních letech podílí přes deset špičkových laboratoří v mnoha zemích, nebylo dosud nikde dosaženo nejistot menších než 1 × 10-7. Zdá se, že problém je především v dokonalosti výchozího materiálu, monokrystalu křemíku, konkrétně v nedostatečné možnosti ovládat na této úrovni přesnosti koncentraci a typ defektů krystalové mřížky, především vakancí a dutinek. Připomeňme, že už koncentrace defektů řádu 1014 m-3 je na samé hranici rozlišení současných analytických metod. Tato nejistota se projevuje v hodnotě molárního objemu V0 , jejíž neurčitost je dominantním faktorem při stanovení celkové přesnosti určení hodnoty Avogadrova čísla.
3.2. Kilogram a kvantové etalony elektrických veličin Druhý přístup, který se dnes zdá být mnohem nadějnější, spočívá v porovnání mechanické
a elektrické práce prostřednictvím Wattových vah , což dovoluje svázat jednotku hmotnosti s kvantovými etalony elektrického napětí a odporu, tedy s Planckovou konstantou h . Proto se někdy hovoří o tzv. elektrickém kilogramu. Zařízení vychází z principu, který navrhl B. P. Kibble již v 70. letech, a zařízení tohoto druhu bylo původně budováno pro účely přesného stanovení jednotky mechanického výkonu - wattu - v soustavě SI.
Princip experimentu lze stručně popsat takto : Váha nějakého tělesa (etalonu) je vyvažována elektrickou silou, vytvářenou proudem, který prochází stacionární cívkou, umístěnou v magnetickém poli. Poměr mezi elektrickou silou a proudem je úměrný magnetickému poli a je ocejchován v další fázi experimentu, kdy se cívka ( bez proudu ) pohybuje konstantní rychlostí kolem své rovnovážné polohy a měří se indukované elektrické
37
napětí. Tato kombinace dvou oddělených experimentů jednak eliminuje vlivy geometrie cívky nebo detailního průběhu magnetického pole, jednak také vylučuje vliv ztrát působených třením či ohřevem procházejícím proudem. Pro referenční těleso hmotnosti m0 pak platí vztah
m0 .g . v = I .U , (8)
kde g je tíhové zrychlení v místě konání experimentu, v je rychlost pohybu cívky v poli, I je proud, procházející cívkou a U je napětí indukované na pohybující se cívce.
Rychlost v je možno určit měřením dráhy (laserovou interferometrií) a času (atomové hodiny), napětí U přímým srovnáním s Josephsonovým polem slabých spojů, proud I z napětí, vznikajícího na odporu, zapojeném do série s cívkou a ocejchovaném prostřednictvím KHJ. Gravitační konstantu v dané lokalitě je možno určit s nejistotou řádu 10-9. Hmotnost je tedy vyjádřena pomocí veličin, svázanými vesměs s atomovými konstantami (délka a čas) a fundamentálními přírodními konstantami (napětí a odpor). Zbývá jen dosáhnout potřebné přesnosti na úrovni 10-8 či lepší.
Tady ovšem platí, že jednoduchý princip je často mimořádně obtížné uplatnit v praxi. V současné době jsou na celém světě provozovány pouze 2 takovéto aparatury, jedna v britské Národní fyzikální laboratoři ( NPL - pracoviště výše zmíněného Bryana Kibbla ), druhá v NIST. V obou případech se jedná o vpravdě monstrózní zařízení, které zaplňuje celou velkou místnost. Klíčové části zařízení musí být navíc umístěny ve vakuu. Při stavbě bylo třeba vyřešit mnoho technických problémů a i pak je třeba počítat se značným počtem nutných korekcí, nehledě k dříve zmíněným problémům se stíněním kvantových etalonů odporu a napětí. Vývoj stále pokračuje, ve Švýcarsku se již několik let buduje třetí aparatura značně odlišné, kompaktnější konstrukce. Je třeba si uvědomit, že aplikace vztahu (8) ve skutečnosti zahrnuje několik disciplin moderní metrologie na nejvyšší dnes dosažitelné úrovni přesnosti. Přesto se zdá, že cíle - stanovení hmotnosti s celkovou relativní nejistotou 1×10-8 - bude velmi brzy dosaženo na obou zmíněných pracovištích. To by v první fázi umožnilo monitorovat časové změny národních prototypů kilogramu, po delším období důkladného testování a porovnávání ( které pracovníci NPL odhadují na 10 - 20 let ) by to pak mohlo přimět příslušnou mezinárodní komisi k definitivní změně stávající reprezentace kilogramu v soustavě SI.
4. Závěrem : jak jsme na tom v ČR ? Také Česká republika, reprezentována v těchto záležitostech Českým metrologickým
institutem (ČMI), se nedávno vydala na cestu osvojení si kvantových etalonů odporu a napětí. Historicky dříve byly zahájeny práce na etalonu odporu na bázi kvantového Hallova jevu, nejprve ve Společné laboratoři Fyzikálního ústavu AVČR, Katedry měření FEL ČVUT a ČMI, založené v r. 1995. Později bylo rozhodnuto zakoupit kompletní komerční aparatury pro kvantový etalon odporu, včetně CCC, která je momentálně (s potížemi) uváděna do provozu na pražském pracovišti ČMI techniky dodavatelské firmy. Zatím však je český národní etalon odporu stále reprezentován skupinou drátových odporových etalonů, navazovaných pravidelně na kvantový etalon v BIPM.
Pokud jde o napětí, i tam se v blízké budoucnosti počítá se zakoupením komerčního Josephsonova etalonu. Na rozdíl od odporu pracují komerční Josephsonovy etalony napětí v řadě národních laboratoří a neočekávají se tedy obdobné potíže při jejich instalaci. Ostatně, kromě Josephsonova pole slabých spojů s příslušnými mikrovlnnými obvody, vše ostatní jsou běžně používané přístroje. Brzy tedy bude moci být i dosavadní "klasický" národní etalon napětí, přechovávaný v Brně, nahrazen kvantovým.
38
BIOINFORMATIKA – ZÁKLADNÍ NÁSTROJ GENOMIKY
Jan Pačes ([email protected]), Ústav molekulární genetiky AVČR, Flemingovo nám. 2, 16637 Praha 6 Molekulární genetika v datech 1859 Darwinova práce „O původu druhů“ 1865 Mendelovy zákony dědičnosti 1869 Poprvé izolovaná DNA 1879 Objev mitózy 1902 Dědičné choroby se řídí mendelovými zákony 1902 Chromozómová teorie dědičnosti 1909 Vznik termínu gen 1911 Na mušce octomilce dokázána chromozómová teorie dědičnosti 1911 Gen jako základní jednotka dědičnosti 1941 Jeden gen, jeden enzym 1943 Rentgenová difrakce DNA 1944 DNA (ne proteiny) je „transformující princip“ 1952 Geny jsou z DNA 1953 Dvoušroubovicová struktura DNA 1955 Člověk má 46 chromozómů 1955 DNA polymeráza – enzym kopírující DNA 1958 Semikonzervativní replikace DNA 1959 Identifikovány chromozomové abnormality (Downův syndrom) 1961 mRNA přenáší genetickou informaci v buňce 1961 První kontrola dědičných metabolických poruch u novorozenců 1966 Rozluštěn genetický kód 1968 Objev prvního restrikčního enzymu 1972 První rekombinantní DNA 1973 Naklonován první zvířecí gen 1975 Sekvenování DNA 1977 Objev intronů 1981 První transgení myš a moucha 1982 Vznik GenBank, databáze „přečtené“ DNA 1983 Identifikován první gen zodpovědný za genetickou chorobu (Huntingtonova nemoc) 1983 Vynález PCR 1987 Genetická mapa lidského genomu 1989 Genetické markery (mikrosatelity, STS) 1990 HUGO: Projekt sekvenace lidského genomu 1994 Prodej první geneticky modifikované plodiny: FLAVR SAVR rajče 1994 Detailní genetická mapa člověka 1994 První mikrobiální genomový projekt 1995 První mikrobiální genom osekvenován: Haemofilus influenza 1996 První eukaryotický genom osekvenován: kvasinka Saccharomyces cerevisiae 1996 První archea genom osekvenován: Methanococcus janaschii 1996 Začátek faktické sekvenace lidského genomu 1998 Privátní projekt sekvenace lidského genomu (Celera) 1998 První mnohobuněčný organismus osekvenován: červ Caenorhabtitis elegans
39
1999 Osekvenován nejmenší lidský chromozóm 22 2000 Osekvenován genom mušky octomilky 2000 Lidský chromozóm 21 2000 První pracovní verze „kompletního“ lidského genomu Současný stav genomiky
Současné metody sekvenování DNA jsou tak účinné, že se daří stanovit nukleotidové
sekvence celých genomů. Obor genomiky se zaměřuje na komplexní analýzu genomů založenou právě na znalosti pořadí nukleotidů v DNA. V současné době je známa úplná struktura několika desítek genomů (viz například http://kegg.genome.ad.jp/kegg/catalog/org_list.html nebo http://www.tigr.org/tdb/mdb). Většina jsou bakteriální genomy. Tyto genomy jsou zpravidla tvořeny jedním chromozómem případně ještě jedním nebo několika malými cirkulárními molekulami DNA zvanými plazmidy. Celkový počet nukleotidů v prokaryotickém genomu se pohybuje v řádu miliónů. Byly ale již stanoveny úplné nukleotidové sekvence genomů vyšších organismů, například kvasinky Saccharomyces cerevisiae (12 Mbp), hlístice Caenorhabditis elegans (97 Mbp) a mušky octomilky (137 Mbp). V roce 2000 byla stanovena prakticky úplná nukleotidová sekvence lidského genomu (3000 Mbp). Téměř ukončeny jsou analýzy genomů mnoha dalších bakterií a několika vyšších organismů (myš, rostlina Arabidopsis thaliana aj.). Z těchto čísel je zřejmé, že není možné zpracovávat takové množství nukleotidových sekvencí v genomech bez velmi účinného počítačového vybavení. Vznikl nový obor, bioinformatika, který se mimo jiné věnuje právě zpracování a počítačové analýze velkých souborů nukleotidových sekvencí, jaké jsou generovány například právě v genomových projektech a na ní navazující analýze aminokyselinových sekvencí proteinů.
Pro získání úplné nukleotidové sekvence genomu skládáme do kontinuálních lineárních řetězců nukleotidové sekvence získané sekvenováním jednotlivých klonů. V typickém případě stanovíme jedním sekvenováním pořadí několika set až jednoho tisíce nukleotidů. Z takových parciálních sekvencí pak postupně skládáme delší a delší řetězce (tzv. kontigy) až v ideálním případě získáme celou sekvenci, například sekvenci genomu nebo velkého úseku DNA který studujeme. To jsou první počítačové operace v sekvenačních projektech.
Takto získanou sekvenci pak podrobíme další počítačové analýze. Snažíme se identifikovat všechny geny přítomné ve stanovené nukleotidové sekvenci, jejich strukturu (například exon-intronovou organizaci), elementy regulující expresi genů (například promotory, enhancery, terminátory transkripce) a další důležité úseky DNA. Geny překládáme do sekvence aminokyselin proteinů a stanovíme jejich základní charakteristiky, například základní rysy sekundární struktury. Obvykle stanovíme celkovou charakteristiku DNA, jako je zastoupení jednotlivých bazí.
Po této základní charakterizaci DNA přistupujeme zpravidla ke srovnání nukleotidové sekvence s údaji v mezinárodních databázích. Ty jsou dnes již velmi rozsáhlé. Například databáze nukleotidových sekvencí EMBL obsahuje skoro čtrnáct miliard nukleotidů tvořících mnoho genů a genomů z různých organismů. Následuje vyhodnocování identifikovaných homologií. Z něho potom můžeme sestavit mnoho metabolických drah, které tvoří podstatu života buňky. Důležitým výsledkem srovnávacích studií jsou evoluční vztahy mezi organismy, kterými lze charakterizovat velmi přesně jednotlivé taxony.
40
Databáze biologických sekvencí na internetu
Formátů pro záznam sekvencí a jejich variant je skoro tolik, jako je programů a databází, které s nimi pracují. Zmíníme se jenom o nejběžnějších z nich, tj. těch, které jsou používány v základních databázích a které jsou v textové formě a jsou použitelné i pro nespecialistu.
DNA/RNA sekvence se ukládají v jednopísmenném IUB kódu, ve kterém lze zaznamenat i variantní sekvence nukleotidů v určité poloze (Tab. 1A). Protože má DNA dvoušroubovicovou strukturu, kde jsou obě vlákna k sobě navzájem antiparalelní, můžeme ke každému kódu přiřadit i jeho kód komplementární.
Pro aminokyseliny v proteinech se také převážně používá jednopísmenný IUB kód, i když je možné se ve starších archívech setkat i s třípísmenným kódem (Tab. 1B). U proteinů se variantní kód nepoužívá s výjimkou asparagová kys./asparagin a glutamová kys./glutamin a samozřejmě X pro jakoukoliv aminokyselinu.
Tabulka 1:
A: IUB kód pro nukleotidy kód nukleotidy komplement A A T C C G G G C T T A (U U) A M AC K R AG Y W AT S S CG W Y CT R K GT M V ACG B H ACT D D AGT H B CGT V N ACGT N - mezera -
UB kód pro aminokyseliny třípísmenný kód
aminokyselina
Ala alanin Cys cystein Asp asparagová kyselina Glu glutamová kyselina His histidin Ile isoleucin Lys lysin Leu leucin Met methionin Asn asparagin Pro prolin Gln glutamin Arg arginin Ser serin Thr threonin Val valin Trp tryptofan Tyr tyrosin Asx asparagová k. nebo asparagin Glx glutamová k. nebo glutamin Xxx jakákoliv aminokyselina --- stop
41
Nejpoužívanější programy bioinformatiky FASTA
FASTA je formát pro archivaci a práci s biologickými sekvencemi. Je to nejběžnější a (když pomineme "holou" sekvenci) nejjednodušší formát. Jeho hlavní výhoda – úspora místa - je současně i jeho nevýhodou: je kompaktní a obsahuje pouze minimum dodatečných informací o sekvenci. EMBL databáze
Databáze EMBL je organizována Evropskou molekulárně biologickou laboratoří (EMBL). Je to veřejná evropská primární nukleotidová databáze se sídlem v Anglii na adrese http://www.ebi.ac.uk/embl. Databáze je vytvářena v součinnosti s ostatními nukleotidovými databázemi GENBANK (USA) a DDBJ (Japonsko) a je velmi dobře přístupná spolu s mnoha odvozenými a dalšími databázemi přes SRS (Sequence Retrieval System) například na adrese http://srs6.ebi.ac.uk. Databáze obsahuje všechna data zaslaná vědeckou komunitou, a to bez kontroly. Z tohoto důvodu může obsahovat určité procento chyb. Manuál k databázi je k dispozici na adrese http://www.ebi.ac.uk/embl/Documentation/User_manual/usrman.html. SWISSPROT
SWISSPROT je formát proteinových sekvencí podobný formátu EMBL. Databáze SWISSPROT je anotovaná proteinová databáze organizovaná hlavně švýcarským bioinformatickým institutem. Přístupná je na adrese http://www.expasy.ch/sprot. Úzce spolupracuje s EMBL a společně vytvářejí TrEMBL, také proteinovou databázi. Tyto dvě databáze dohromady pokrývají všechny "existující" či "smysluplné" proteinové sekvence. Autoři z literatury průběžně doplňují nové informace a v současné době se pravděpodobně jedná o nejkvalitnější molekulárně-biologickou databázi. Pro vědecké použití je SWISSPROT volně k dispozici. Manuál lze nalézt na adrese http://www.expasy.ch/txt/userman.txt. GENBANK
Distribuční formát nukleotidové databáze GENBANK, který je podobný formátu EMBL je lépe čitelný – místo dvoupísmenného identifikátoru používá celé slovo. Databáze GENBANK je nukleotidová databáze, kterou organizuje Národní institut zdraví (NIH) v USA. Díky výměnné spolupráci s ostatními nukleotidovými databázemi obsahuje v podstatě stejná data jako EMBL. GENBANK je výborně propojena s mnoha dalšími databázemi a výše uvedená adresa je výchozím bodem hledání pro velkou část vědecké komunity. Bohužel, je třeba mít při práci na paměti, že (stejně jako EMBL) neobsahuje všechny dostupné sekvence, hlavně z velkých genomových projektů. Podrobnější informace o databázi lze najít například na adrese http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/GenbankOverview.html PIR
Stejně jako v případě EMBL/SWISSPROT je i formát PIR formát požíván pro proteiny. Organizován je podobně jako GENBANK v NCBI. Zde s dalšími organizacemi vytváří PIR-International, anotovanou databázi analogickou SWISSPROT. Obě databáze jsou přístupné na adrese http://www-nbrf.georgetown.edu.
42
Porovnávání biologických sekvencí
Porovnávání sekvencí, ať už nukleotidových nebo proteinových, se v jednom směru významně liší od všech ostatních typů vyhledávání – většinou se snažíme najít sekvenci pouze podobnou sekvenci jiné a ne s ní totožnou, tedy sekvence lišící se mnoha záměnami, inzercemi a delecemi. Proto není možné použít běžný vyhledávací algoritmus ale bylo nutno vyvinout algoritmus specifický pro tento typ problému. Automatická metoda vyhledávání byla prvně popsána v roce 1970 a je známa jako Needleman-Wunschovo hledání. Jejím principem je tzv. "pairwise alignment", srovnávání sekvencí pár po páru a nalezení maximální podobnosti ("similarity"). Posléze byla rozšířena a upravena pro identifikaci lokálních podobností a tato moderní verze je známa jako Smith-Watermanovo hledání. Princip Vezměme dvě sekvence (nukleotidové či aminokyselinové) a = a1,a2,a3 .. am b = b1,b2,b3 .. bn
Chceme je porovnat mezi sebou a vytvořit alignment A, který sestává z řady párů A = (ai bj) .. (ak bl)
kde 1 ≤ i < .. < k ≤ m 1 ≤ j < .. < l ≤ n
Pro výpočet skóre alignmentu A přiřadíme každému páru hodnotu s(ai,bj) (pozitivní nebo negativní) v závislosti na tom, zda se jedná o totožný, příbuzný nebo nepříbuzný pár. Dále ohodnotíme mezery ("gaps") v alignmentu, nejčastěji funkcí wx = y + zx pro x ≥ 0; y,z ≤ 0
kde x je délka mezery ("gap"). Parametr y bývá nazýván "open gap penalty" nebo "gap existence penalty", parametr z "gap extension penalty" nebo "per residue gap penalty". Celkové skóre alignmentu je tak S = Σ s(ai,bj) pro i=1..m, j=1..n
Hledání nejlepšího alignmentu je vlastně hledáním maximálního skóre ze všech možných alignmentů. Toto skóre je nazýváno "Smith-Watermann score" a bývá často uváděno jako jedna z veličin charakterizujících alignment.
Jak je uváděn výše zmíněný princip do praxe si nejlépe ukážeme na příkladu:
Vezměme dva oligopeptidy: AGTDRCTDKRL ACTDKLRCTKRL
43
Nejprve vytvoříme tabulku podobností ("similarity matrix"). V nejjednodušším případě totožnost ohodnotíme 1 a vše ostatní 0. Pak můžeme spočítat tabulku všech možných alignmentů ("sum matrix"). Pak skóre subalignmentu Si,j získáme jako maximální skóre předcházejících subalignmentů plus skóre páru si,j: Si,j = max ( Si-1,j, Si,j-1, Si-1,j-1 ) + si,j
Po spočtení celé tabulky vybereme z posledního sloupce/řádku nejvyšší skóre a zpětně vyhledáváním nejvyšších předcházejících skóre rekonstruujeme nejlepší "alignment". V našem případě získáme alignment: AGTD--RCTDKRL * ** *** *** ACTDKLRCT-KRL
Evoluční stromy
Při porovnávání dvou nukleotidových sekvencí se nemusíme zabývat tím, jak si jsou jednotlivé nukleotidy v páru příbuzné a vystačíme s totožností (i když ani toto zjednodušení neplatí vždy). Jiná je situace u aminokyselinových sekvencí. Při porovnávání evolučně příbuzných sekvencí bylo objeveno, že pro funkčnost enzymu je často důležitá pouze obecná biochemická vlastnost jeho aminokyselin na určitém místě (například hydrofóbní aminokyseliny v transmembránové doméně) a proto můžeme jednotlivé aminokyseliny seskupit podle jejich biochemické příbuznosti (hydrofobicita, náboj, velikost, polárnost atd.). Záměna podobných aminokyselin pak může být penalizována méně než záměna aminokyselin nepříbuzných.
Zároveň bychom také měli uvažovat i genetickou (evoluční) příbuznost. Například tryptofan je kódován pouze jedním kodónem, UGG. Jednokrokovou mutací z něj může vzniknout kodón pro glycin (GGG), serin (UCG) a leucin (UUG), dva kodóny pro cystein (UGU,UGC), arginin (CGG,AGG) a dva stop kodóny (UGA,UAG). Je tedy pravděpodobnější, že dojde k záměně tryptofanu na arginin než například na glycin. Přesto jsou biochemické vlastnosti tryptofanu a argininu maximálně odlišné – tryptofan je hydrofóbní aromatická aminokyselina, arginin naopak hydrofilní polární kladně nabitá aminokyselina.
Z těchto úvah vycházíme při tvorbě tabulek pravděpodobností přechodu z jedné aminokyseliny na jinou. Vezmeme-li homologní proteiny z několika druhů a spočteme logaritmy pravděpodobností, se kterými došlo k přechodům mezi jednotlivými aminokyselinami, získáme evoluční strom například bakterií nebo savců, ale též základních typů organizmů (Obr. 1).
44
Obrázek 1: Evoluční strom základních typů organizmů.
45
ENVIRONMENTÁLNÍ VĚDA A VZDĚLÁVÁNÍ VČERA, DNES A ZÍTRA
Přednáška pro projekt ASTRA (nadace Charty 77) Doc. RNDr. Martin Braniš, CSc., tel.2195 3278, Univerzita Karlova v Praze, Přírodovědecká fakulta, Ústav pro životní prostředí
NA ÚVOD: JE EKOLOGIE VĚDA?
Obecná metodologie vědy zjednodušeně definuje vědecký obor, jako soubor poznatků určitého typu, které jsou získávány určitou metodu, vyjadřovány specifickým jazykem (terminologií/nomenklaturou), přičemž tyto poznatky mají specifické myšlenkové pozadí - paradigma. Není žádný problém ukázat, že výše uvedené atributy jsou v případě ekologie k dispozici.
Badatelé v ekologii (=odvětví biologických věd) soudí, že organismy nejsou na Zemi rozšířeny náhodně, ale že výskyt druhů, typů, skupin je vždy dán nějakými specifickými podmínkami a schopnostmi organismů na ně reagovat – přizpůsobit se jim, tedy že vždy lze nalézt určité souvislosti mezi typem a vlastnostmi prostředí (teplotou, vlhkostí, půdou) a tvarem těla, způsobem výživy a dalšími vlastnostmi určitého živočicha nebo rostliny. Ekologie tedy zkoumá zákonitosti rozmístění organismů v prostředí, jinými slovy, vztahy organismů a prostředí. Ekologie také vychází z faktu (podobně jako ekonomie), že zdroje (živiny, potrava, prostor, úkryt) nejsou na Zemi rozděleny rovnoměrně a že organismy o tyto zdroje „soutěží“, případně že jeden organismus může být zdrojem pro jiný (kořist – dravec, parazit – host) a že v těchto „meziorganismálních“ vztazích lze nacházet určitá pravidla. Předmětem studia ekologie je tedy nejen vztah mezi organismy a prostředím, ale i vztah mezi organismy navzájem. Úkolem vědců - ekologů je popsat a vysvětlit tyto vztahy a principy vztahů zobecnit do pravidel a teorií.
Dokladem, že ekologie patří mezi ostatní „řádné“, tedy objektivní vědy, je také to, že má svou materiální infrastrukturu (instituce, přístroje), své publikace (vědecké časopisy, monografie, databáze), grantové agentury nebo grantové programy a hlavně badatelské týmy, které spolu právě prostřednictvím literatury (a dnes už i elektronických sítí) komunikují. Posuzování kvality práce v ekologii je stejně jako u jiných oborů vědecké recenzní řízení většinou anonymní (peer review), což je jedinou zárukou toho, že se k odborné i laické veřejnosti nedostanou neprověřené a neprodiskutované argumenty. O ekologii se také hovoří v širších souvislostech jako o předmětu, který se zabývá vztahy člověka k prostředí a k ostatním organismům. Tento směr si většinou všímá více nepříznivých vlivů činnosti člověka na přírodu, a to nejen na živé organismy, ale i na ovzduší, vodu, půdu i vlivů na zdraví samotného člověka. Ekologie v tomto širším pojetí bývá nazývána jako nauka/věda o životním prostředí (angl. environmental science, Earth system science). Vzájemné postavení ekologie a nauky o životním prostředí lze přirovnat ke vztahu mezi biologickými disciplínami - anatomií a fyziologií - a medicínou („lékařskou vědou“). Zatímco anatomové a fyziologové zkoumají stavbu a funkci normálního, tedy zdravého organismu, lékaře zajímá organismus nemocný, tedy ve stavu změn navozených nějakým zevním nežádoucím vlivem (infekcí, zraněním, otravou). Také nauka o životním prostředí zkoumá přírodu (organismy a prostředí včetně člověka) v okamžiku nějaké nežádoucí změny. Jelikož hlavním vlivem, který nepříznivě působí na přírodu a poškozuje ji je člověk, zkoumá environmentální věda vztahy v prostředí pod vlivem člověka. Podobně jako lékařská věda – medicína - není jednotný obor, ale skládá se z mnoha specializací (interna, chirurgie, dermatologie), platí totéž o nauce o životním prostředí. Obě
46
disciplíny spojuje to, že jsou vlastně průnikem celé řady příbuzných a souvisejících oborů a jejich základní role tkví v řešení konkrétních problémů na základě vědeckých poznatků.
Nauka o životním prostředí odhaluje nejen podstatu nových dějů - např. proč lesy odumírají, ale hledá k nim praktická řešení – např. které druhy odolných dřevin vysazovat v postižených oblastech. Výsledkem bádání v tomto oboru jsou také návrhy postupů, které vedou ke zmírnění poškozování přírody a zejména pak návrhy preventivních opatření, které jsou nejúčinnějšími nástroji při péči o životní prostředí. Je nutné dodat, že jako jiné užité vědy, kromě své praktické „užitečnosti“ je i významným zdrojem otázek pro různé jiné obory, zabývající se tzv. základní vědou. Ekologie a nauka o životním prostředí se mají k sobě podobně jako anatomie a fyziologie k medicíně. Platí tedy, že bez základů ekologie není možno pochopit většinu složitých vztahů a jevů, které probíhají okolo nás v prostředí.
O tom, zda ekologie nebo nauka o životním prostředí patří mezi vědecké disciplíny, nerozhodují tedy v žádném případě politici. Politické rozhodování o právu na existenci nebo kvalitě určitého oboru vědy je nepřípustné, i když ze současnosti i z minulosti známé. Obvykle k němu dochází tehdy, když jsou výstupy z výzkumu nepohodlné vládnoucí politické síle. Ze středověku jsou známy případy, kdy byly vědecké objevy trestány smrtí (astronomi), v době moderní měly podobný osud například kybernetika (systémová věda), mikrobiologie, či genetika, odsuzované komunistickým režimem jako pavědy odporující stávajícím dogmatům v padesátých letech dvacátého století. Dnes s nevůlí politiků občas setkává ekologe a environmentální věda. MONODISCIPLINARITA A ITERDISCIPLINARITA
Jak bylo výše naznačeno, studium životního prostředí není možné bez průniku celé
řady klasických oborů/předmětů, jako je biologie, chemie, matematika, klimatologie … Základním předpokladem k provozování výuky v rámci komplexní problematiky ochrany životního prostředí je tedy posun od tradičního monodisciplinárního modelu (= např. jen biologie, jen chemie …) k interdisciplinaritě. Položené environmentální otázky totiž neodpovídají obsahově, metodicky ani terminologicky paradigmatu určitého oboru (biologie, chemie …), ale hledají komplexní odpověď na určitý problém. Jedná se tedy o zřejmý posun od tradiční oborové k „problémové“ a systémové výuce. V reálném světě se málo kdy vyskytují environmentální problémy řešitelné rámci paradigmatu (myšlenkového rámce a poznatků, či metod) jedné vědecké discipliny. Komplexní jevy v přírodě ani nelze popsat a vysvětlit pouze v kontextu poznatků jedné discipliny.
Tato situace ale není opět nepodobná medicíně, kde není finálním objektem studia (a terapie) jednotlivý orgán, funkce nebo proces, ale celkový stav pacienta a konečným cílem určitý žádoucí stav - tedy jeho zdraví. Podobně v problematice životního prostředí není cílem pouze zodpovědět otázku kolik čeho je, jak to vypadá a jak funguje, ale jak se dostat co nejblíže k požadovanému stavu. Na rozdíl od většiny základních disciplin vědy, které vystačí s popisem a vysvětlením (odpovídají na otázky typu co, jak a proč, kdy) zajímá se nauka o životním prostředí (podobně jako medicína) i otázkami typu „jak zabránit“, „jak umožnit“, tedy prevencí a asanací. Vzhledem k nutné interdisciplinaritě musí environmentální studijní programy více než tradiční disciplíny licitovat o obsahu, formě a typu výuky a usilovat o vhodné vyvážení typického vertikálního způsobu výuky (do hloubky poznání jednotlivé disciplíny) s horizontálním (do šířky spektra dílčích disciplin) (obr. 1).
47
obr. 1: Specializace versus šíře záběru výuky
Šíře expertního záběru a jeho hloubka však nejsou jedinými proměnnými, s nimiž je nutno při vzdělávání odborníků pro životní prostředí počítat. Dalším rozměrem je zcela jistě i otázka zkušenosti v práci s přicházejícími problémy (obr. 2). obr. 2: Tři aspekty (rozměry) environmentální výuky
Jak je na obr. 1 a 2 naznačeno, ten, kdo chce otázky životního prostředí zařadit do výuky, musí vzít všechny tři aspekty (šíři znalostí, jejich hloubku a zkušenost) vnímat jako neoddělitelné. Zkušenostní aspekt však (snad s výjimkou některých praktik a prakticky vedených exkursí) chybí a měl by se do nově připravovaných nebo starších inovovaných kurikul rozhodně dostat. Jak ale na to, když času vyhrazeného k výuce je stále stejně?
zkušenostspecializace
šíře znalostí
voda půda ovzduší biota ostatní obory
šíře vzdělání (odbornosti)
hloubka (specializace)
48
FAKTA – VZTAHY – ZKUŠENOSTI - POSTOJE
Navzdory průkopnickému úsilí nestora české pedagogiky J. A. Komenského vtáhnout žáka a studenta do výukového procesu s využitím jeho zvídavosti a aktivity, tradice výuky v českých školách v posledních třech staletích odpovídala spíše postavení národa vůči vládnoucí garnituře. S výjimkou krátkého období první republiky mezi lety 1918 a 1938 měla vždy „vrchnost“ zájem na nekonfliktním a poslušném občanovi. Stát (a jeho úřednický aparát) si nepřál zvídavého občana, partnera, případně kritika, který by mohl nahlížet do karet a mohl případně porozumět mechanizmům politiky a moci nebo prohlédnout triky oficiální propagandy a cíle ideologie. Proto také státem a konformními organizacemi řízené školy vychovávaly žáky a studenty především k poslušnosti, k tomu, aby se naučili, co je žádoucí, nepřemýšleli o příčinách a následcích, nevyjadřovali názor. Mládež navštěvující školu nebyla připravována k řešení problémů, vychovávána ke kritice a k tvůrčímu myšlení.
I řadě dnešních učitelů vyhovuje spíše poslušný a klidný student, který se dobře naučí probranou látku, moc nediskutuje a také nezkoumá hodnověrnost a případná úskalí učitelova sdělení. Tento jednosměrný výukový proces (učitel ⇒ student) je však v dnešní dynamické a interaktivní globalizující se společnosti neudržitelný. Neposkytuje příjemci o mnoho více než soubor údajů, schémat a daností. Na rozdíl od dnešní praxe se po studentovi většinou nežádá, aby získaná data kriticky analyzoval, zobecnil a interpretoval v kontextu moderních poznatků, či našel nová řešení. Ještě méně je ve výuce obsažen prvek, který by studentům ukázal cesty a možnosti, jak to, co se naučili lze aplikovat, tedy dokázat využít získaných poznatků při řešení konkrétního problému v praxi. Jednosměrnost předávání informací direktivní formou také způsobuje, že jsou studenti v hodinách pasivní a při prezentaci vlastních výsledků či názorů, nezvyklí diskutovat a obhajovat své názory.
Díky „tradičnímu“ způsobu výuky, kdy je podstatné se naučit vyložené téma a při zkoušce odříkat „našprtanou“ látku na co nejlepší známku, o informacích nediskutovat, nepochybovat o řečeném nebo napsaném slově učitelově, je na školách velký problém s využitím kritiky, jako nástroje k odhalení problémů, chyb. Kritika je ponejvíce chápána jako bariéra (negativní postoj) mezi tím, kdo kritiku vyslovuje a kdo ji přijímá (resp. komu je vyslovována). Kritika je v tomto smyslu v současné době stále spíše podkladem a argumentem k pokárání nebo k udělení horší známky (ze strany učitele) nebo vzpoura proti pedagogovým projevům a postojům (ze strany studentů) a ne významným nástrojem k vyhledávání slabých míst a k odstraňování chyb – tedy ke zlepšování. Klasickým problémem výuky na školách všech úrovní a typů (vysoké školy nevyjímaje) je stálý důraz na faktografickou výuku – na fakta. Memorování telefonních seznamů, důraz na papouškování formulací ze skript a vůbec výuka, která se soustřeďuje především na poznávání prvků systému jsou charakteristickým rysem tzv. informativního typu vzdělávání. K pochopení funkce systému je však třeba poznat, analyzovat a vysvětlit to, jak systém funguje, jak jednotlivé prvky systému spolu souvisí, jaké jsou mezi nimi vztahy (vazby). V extrémních případech se proto dnes některé výukové programy (někteří učitelé) od faktografické výuky do značné míry odklánějí. Ani takový přístup však nelze doporučit. Hlavním důvodem pro „nezatracování“ faktů, dat, čísel, … je to, že jedině na určitém materiálu, který fakta vytvářejí je možno pracovat se vztahy a vazbami.
Lze namítnout, že se i funkce systému (tedy vazby mezi jeho prvky) je možno naučit zpaměti. To jistě. Poznat prvky systému i jeho vazby tedy stále náleží k informativní složce vzdělávání. To, co doplňuje studentův rozhled a schopnosti, je naučit se získanými informacemi pracovat, vědět, jak jich využít, znát jejich uplatnění v praktickém (odborném) životě. Ideální výuka tedy musí obohatit studenty o zkušenosti podobné praktickým „opravdovým“ situacím.
Zahrnutí aktivit, které podporují získání zkušeností – tedy určitých praktických schopností - už za doby pobytu ve vzdělávacím zařízení znamená opřít se i o tzv. formativní vzdělávací složku. K tomu slouží různé modelové situace, případové studie, praxe atd.
49
V poslední době se ale ukazuje, že ani ideální vysokoškolská výuka vhodně propojující faktografické znalosti s jejich uplatněním v rámci konkrétních projektů „neprodukuje“ vždy zcela optimálně připravené absolventy. V období, kdy globalizační trendy řídí především hnací síla volného trhu a ekonomická schémata oceňování zahrnují pouze stránku finanční hodnoty, se dostává otázka ochrany životního prostředí do ohniska zájmu i z aspektu etického. Rozumné čerpání zdrojů, ochrana přírody a udržitelný život nelze studenty „naučit“ bez diskuse, analýzy a přijetí určitých postojů.
Studenti na středních školách musejí být, podobně jako např. studenti medicíny konfrontováni s přijatelností a nepřijatelností určitých hodnot. Výuka tedy musí začít zahrnovat nejen materiální (vědecké a praktické), ale i etické a estetické aspekty. Probíraná témata, praktická cvičení, modelové situace by měly, tam, kde je to možné, takové prvky obsahovat. Pouze vhodné propojení všech výše uvedených složek - fakta, vazby, zkušenosti a postoje - je možné dosáhnout požadované kvality studijního programu. POTŘEBA INOVACE A AKTUALIZACE VÝUKY
Prakticky ve všech oborech přichází student i pedagog každým rokem do kontaktu s novinkami a změnami. Problematika životního prostředí ale rozhodně patří mezi obory nejdynamičtější a je výhodné tohoto pohybu myšlenek a názorů ve výuce využít. obr. 3 Posun nosných environmentálních paradigmat:
19. stol. 1. pol. 20. stol. 2. pol. 20 stol. poč. 21. stol. Nové úkoly, které před studenta a pedagoga klade dnešní svět, však nenahrazují úkoly tradiční. Spíše je obohacují a rozvíjejí. Má-li obstát absolvent studia v dnešním komplikujícím se světě, nestačí už příprava zaměřená na to, jak dosáhnout více znalostí, ale (jak již bylo výše naznačeno) jak těchto znalostí využít k řešení konkrétních situací v praxi. I když nelze v žádném případě přijmout odklon od vědecké přípravy studentů, přesto je třeba akceptovat to, že jejich role v praxi představuje mnohdy spíše než vědce, odborného zprostředkovatele informací mezi veřejností, vědou a decisní sférou, případně „plánovače“ a koncepčního pracovníka. obr. 4: hybné síly a vztahy mezi jednotlivými aktéry environmentální reality
Z obrázku č. 4 jasně plyne význam environmentalistů v současné společenské praxi:
návrat k přírodě
ochrana přírody
ochrana živ. prostředí
trvale udrži-telný rozvoj
vědecká komunita
odborníci, „plánovači“ environmentalisté
občané veřejnost
politici - decizní sféra
50
• Environmentalisté jsou s vědci obvykle v dobrém kontaktu. Jedni využívají
poznatků nebo námětů druhých (oboustranně silné šipky), užívají stejný odborný jazyk;
• Environmentální experti – „plánovači“ ovlivňují politiky výstupy svých projektů, stejně jako politici je prostřednictvím norem, zákonů a poptávky po řešení problémů (silné šipky);
• Politici ovlivňují veřejnost silně prostřednictvím úřadů a zákonů, občané (voliči) politiky málo, v dnešních podmínkách u nás vlastně pouze při volbách.
• Vědci a veřejnost se ovlivňuje málo. Podobně se málo ovlivňují vědci s politiky;
• Environmentalisté ovlivňují občany dost podstatně svými projekty, ale občané je velmi málo, neboť u nás není zatím dostatečně rozvinutá participace veřejnosti na projektových pracích.
• Role environmentalistů je veliká (silné šipky od environmentalistů všemi směry).
Studenti, kteří jsou vystaveni naznačeným vztahům, jsou velmi pravděpodobně také
daleko lépe připraveni k řešení konkrétních problémů, jsou tedy dobře zaměstnáváni, mají úspěch a své pracovní povinnosti plní ke spokojenosti všech navazujících subjektů a ku prospěchu ochrany životního prostředí. Otázky spojené s dnešními globálními i lokálními problémy životního prostředí jsou vynikajícím modelem pro zahrnutí tzv. interaktivní (participativní) výuky do všech typů škol. Změny ve vědě, společnosti i praxi tedy nevyžadují pouze přípravu nových a aktualizaci starých témat, ale také inovaci výukových metod.
Bude-li dána studentům možnost setkávat se během studia s možností řešit skutečný nebo učitelem připravený (navozený) problém, bude také větší pravděpodobnost, že při takové výuce získají potřebné zkušenosti a návyky. JAK NA TO:
1) KLASICKÉ FORMY VZDĚLÁVÁNÍ
Klasická výuka, tak známá a tak stále nejčastěji provozovaná na středních a vysokých
školách, i dnes probíhá formou učitel za katedrou kontra žáci v lavicích. obr. 5: Tradiční interakce pedagoga a studenta
výklad kontrola znalostí Žáci nabývají znalostí především cestou výkladu (v lepším případě bývá zařazena
ukázka a/nebo praktikum), studují vyloženou látku v (jedné) doporučené učebnici a/nebo z poznámek. Jejich znalosti jsou kontrolovány při individuálním zkoušení vedeném buď formou ústního pohovoru nebo písemného testu.
51
Bylo by naivní domnívat se, že výklad/přednáška je jedinou formou dnešní výuky. Mnohde je přednáška doplněna seminářem, praktikem, cvičením nebo exkursí. Ty je na rozdíl od přednášky možno považovat za mnohem aktivnější formy výuky. Styl a zažité vzorce chování však často nenutí studenta a pedagoga ke zvýšení osobní aktivity ani v rámci těchto metod. Na cvičení se počítají stále stejné příklady v přednášce probraných obecností, seminář s externistou je opět spíše 95% projevu jednotlivce za katedrou a sotva 5% diskuse.
Praktikum je zatím nejrozšířenější výukovou formou, v níž je používáno řešení jednotlivých problémů (problem - based learning). Problém je však v drtivé většině případů již formulován v rámci zadání (např.: „stanovte obsah kyslíku ve dvou vzorcích vody a zhodnoťte míru organického znečištění“) a praktikum je doprovázeno léty osvědčenými návody a zavedeným protokolem. Interaktivita mezi učitelem a studentem, nebo mezi jednotlivými studenty (případně i jejich kooperace) je mizivá, neboť práce jsou většinou samostatné a učitel vstupuje do interakce pouze tehdy, odpovídá-li na dotaz nebo hodnotí-li hotovou práci.
Cílem exkurse je buď návštěva podniku kvasného průmyslu (jistě s následným žádoucím utužením kolektivu v podnikové nálevně) nebo má daný itinerář, v drtivé většině případů také s výkladem – monologem vedoucího exkurse nebo najatého odborníka CHKO, vedoucího rekultivací, technologa provozu apod. Jednou z forem, která se stává stále méně formální a přispívá k formování schopností a názorů studenta, je tzv. odborná praxe (i když je známo, že v mnoha případech se jedná více-méně o nepříliš aktivní a atraktivní pobyt studenta v rámci studijního programu na pracovišti státní správy, samosprávy, v praktickém provozu apod.). Kvalita praxe velmi záleží na kontaktu pracoviště, na němž je praxe absolvována, se školou a ještě lépe s konkrétním vědeckopedagogickým pracovníkem a také s úlohami, které jsou studentům dány k řešení. 1. TAB. 1: KLASICKÉ FORMY VÝUKY
• Výklad/přednáška • cvičení • praktika • seminář (a další podobné formy) • exkurse • praxe
Také kontrola znalostí studentů zahrnuje stále častěji (než pouze ústní a písemné zkoušení) psaní seminárních prací a esejů. I přes tato fakta lze však (ze zkušenosti autora) většinou přirovnat interakci pedagoga se studentem ke schématu na obr. č. 5.
Uvedené klasické formy výuky však nejsou pasivní samy o sobě. Vždy záleží především na pedagogovi, do jaké míry využije svých osobních schopností a odborných znalostí přednášené (procvičované) látky k povzbuzení studentské aktivity.
52
JAK NA TO:
2) INTERAKTIVNÍ (participativní) A KOOPERATIVNÍ FORMY A PRVKY VÝUKY
Obohacení výuky předmětů o interaktivní, případně kooperativní formy neznamená
vždy zavedení nových „exotických“ metod. Jde spíše o obohacení dosavadních metod o některé známé, ale opomíjené didaktické prvky.
Následující uvedené prvky mohou být někdy zavedeny zvlášť – mohou tedy být s použitím vhodného tématu hlavním obsahem samostatného kursu (výukové hodiny, výukového bloku), jako například diskuse, samostatná a týmová práce (viz dále „projekt“), jindy (a ve většině případů) mohou obohatit strukturu a formu již existujících kursů. TAB. 2: INTERAKTIVNÍ FORMY VÝUKY
• skupinová diskuse (diskusní semináře) • projekt (samostatná, nebo týmová práce) • případová studie • interaktivní hra rolí • instruktivní hra
DISKUSE
Klasickým interaktivním prvkem ve výuce je diskuse, neboli výměna názorů. Ačkoli za diskusi považujeme spíše možnost ke vznesení otázek na konci přednášky, semináře nebo obhajoby písemné práce, kvalitativního skoku dosahuje tato forma výuky v případě, když jde o diskusi cílenou a řízenou. V ní může pedagog vystupovat jednak jako hlavní účastník, je-li nositelem diskusního tématu a reaguje-li postupně na otázky a poznámky studentů (obvykle na konci přednáškové hodiny) nebo může být také „jen“ řadovým účastníkem při skupinové diskusi. V každém případě je však nutné, aby pedagog diskusi řídil, nebo ustanovil jednoho ze studentů (nebo jiného kolegu) řídícím chystané diskuse. Role řídícího ovšem není vždy role arbitra, ale spíše usměrňovatele, který dává slovo, určuje (spravedlivě) pořadí diskutujících a také ve většině případů (a to je v mnoha případech obzvláště nutné u kontroverzních diskusí) sumarizuje výsledky diskuse. Diskusi tedy nemůže řídit každý. obr. 6: formy diskuse
„klasická“ diskuse skupinová diskuse
Diskuse může být nejen nad stanoveným nebo náhodným tématem, jak bývá obvykle na seminářích s externistou nebo na konci přednášky nebo přednáškového cyklu. Velmi vhodné je zařazovat diskusi například i do praktik. Jednotliví studenti nebo skupiny mohou řešit konkrétní úkol (např. stanovení obsahu látky – škodliviny) dvěma (nebo více) různými
53
metodami. Výsledky je po skončení úkolu možno diskutovat a přitom se za řízení vedoucím praktik seznamovat s úskalími (přesností, výhodami …) obou (více) užitých metod.
Podobně je možno zařadit diskusní část po ukončení tak tradiční výukové metody, jako je exkurse. Rozbor a diskuse o exkursi může nejen obohatit „dojmy“ studentů o některé hlubší poznatky a souvislosti, ale poskytnout i vedoucímu exkurse zpětnou vazbu pro pořádání dalších akcí. Klasická terénní biologická exkurse (na níž se obvykle seznamují studenti s faunou a florou daného území, často hlavně ze systematického hlediska) může být doplněna i poznámkami či úlohami týkajícími se kulturních, historických, ekonomických či sociálních charakteristik navštíveného území a jejich vztahu ke zde žijící biotě. Diskuse na témata kombinující systematické či ekologické aspekty s doplňkovými bude pro mnoho pedagogů příjemným překvapením (pakliže ale budou oni sami chtít diskutovat).
Diskusi samozřejmě zkvalitňuje také její příprava. Na některých školách probíhají pravidelně nebo nepravidelně semináře s externisty. Je-li k dispozici účastníkům krátký syllabus chystané přednášky, je diskuse mnohem kvalitnější, neboť se na ni mohou případní posluchači dobře připravit a plánované téma alespoň okrajově nastudovat. Velmi důležité je představit možnosti a výstupy diskuse studentům, kteří hodlají pokračovat na vysoké škole. Pro ně je možno připravit diskusi na řadu dílčích témat, s nimiž se budou během svého studia často setkávat, aniž je budou moci zkoumat, popisovat nebo definovat. Jedná se např. o některé klíčové environmentální koncepty. Diskuse však musí probíhat na vysoké znalostní úrovni a musí být řízena zkušeným pedagogem. Zde uvádíme jako příklad diskusi na téma často užívaných antagonistických termínů (konceptů), jako jsou: 1) přírodní/antropogenní 2) přirozený/kulturní 3) globální/lokální 4) městský/venkovský 5) rozvojový/rozvinutý 6) západní/východní 7) minulý/současný/budoucí 8) atd.
Takovou diskusi je možné (a vhodné) podnítit diapozitivy, obrázky, titulky z novin, kreslenými vtipy. Např. pro první téma je možno užít snímky z vesnice „přírodních národů“ a soudobé vesnice, ad 2) diapozitivy nebo fotografie typické české krajiny s kostelíkem, nebo chráněné horské louky, ad 3) reklamní materiál supermarketu a tištěné oznámení o prodeji jablek u zahrádkářské kolonie, ad 4) dokumentovat kontrast mezi industrializací zemědělské výroby a snahou městských lidí vracet se na „klasický venkov“ za odpočinkem a za hledáním rustikální idylky se slepicemi, králíky a sedláky s kosou, atd., atd. Diskuse o výše uvedených „antagonistických“ termínech je vhodným polem též pro (v úvodních kapitolách zmíněné) zahrnutí postojových aspektů environmentálních výukových programů či kurzů.
Zařazení prvku diskuse je pravděpodobně nejjednodušší cestou k postupnému zvyšování „interaktivity“ ve výuce. Je však bohužel známo (mezi studenty i pedagogy), že diskuse je pro řadu pedagogů nežádoucím narušováním jejich mnohaleté rutiny v přednášení a také, že mnoho studentů vyhledává (možná právě proto) krátká období vyhrazená pro otázky (diskusi) k tomu, aby dotyčného pedagoga „dostalo“ na nějaké chybě nebo nesrovnalosti. Oba tyto přístupy však mají s konstruktivní diskusí pramálo společného.
54
PROJEKT
Výuka projektem (project teaching/learning) vychází z myšlenky, že každá situace, kterou řeší odborník v praxi obsahuje nejen složku znalostní, ale také další složky, mezi které patří schopnost formulovat problém, nalézt adekvátní metodu, spolupracovat v týmu, přihlédnout k časovým a finančním aspektům atd. (které se obvykle v klasickém kurikulu neučí). Rozdíl mezi „problémovou výukou“ (problem-based learning/teaching), provozovanou dnes zejména v rámci praktik a „výukou projektem“ je především v tom, že při učení cestou řešení problémů pracují studenti na určitém problému (často fiktivním), který je stylizován vyučujícím a pro který má i vyučující připravené vzorové řešení i algoritmus jeho dosažení. Na konci úlohy pak může velmi snadno zkontrolovat dosažené výsledky a ukázat na chyby, kterých se studenti dopustili. Výhodou (pro pedagoga) je, že hodnocení takových úloh je pak často jednoduché a nevyžaduje složitý rozbor činností studenta. Naproti tomu výuka cestou projektu počítá s tím, že není zpočátku jasné, jaká znalost a jaké dovednosti (know-how) budou potřeba k dosažení výsledku. Rozdíl mezi těmito dvěma typy výuky tedy také tkví v tom, že zatímco řešení problému je více zaměřeno na získání znalostí, při zpracování projektů studenti spíše musí dosažené znalosti aplikovat. A právě zde je obrovská síla projektové výuky, neboť schopnost aplikace získaných znalostí není v tradičních formách výuky obvykle hodnocena a při ústních nebo písemných zkouškách se hodnotí pouze dosažení určitých znalostí bez jakékoli návaznosti na situace v reálném životě. Problematika životního prostředí je pro zařazení projektů do škol pro svou interdisciplinaritu takřka ideální. PRAVIDLA PRO PRÁCI S PROJEKTY
Každý projekt musí mít před započetím jasné zadání. Musí být zřejmé, zda jde o projekt individuální nebo týmový. Pakliže je projekt týmovým úkolem, musí být známo složení týmu a jeho vedoucí. Ten (obvykle po předchozí dohodě s pedagogem) určuje dělbu práce a koordinuje činnosti. Důležité je stanovit přesně dobu zpracování projektu, formu výstupu a způsob prezentace výsledků (písemná práce na určený počet stran, ústní prezentace, obhajoba, diskuse ...). Nezbytné je uvést před přijetím zadání též způsob hodnocení. Vhodné je, aby alespoň z počátku, kdy se studenti setkávají s projekty poprvé, připravil témata pedagog. Později ale výběr některého tématu mohou provést i sami studenti. Je vhodné nechat studenty z jedné třídy/studijní skupiny (20-30 studentů) zpracovat více různých témat projektů, tak, aby jeden tým měl okolo 4-5 členů. Před definitivním zadání, v hodině, kdy se studenti seznamují s nabídkou témat mohou být některá z témat po diskusi i upravena. Jelikož návrhy na změny přicházejí obvykle ze strany studentů (a pedagog nemusí mít vždy připraveny varianty), mělo by být změněné téma prodiskutováno s ostatními a prověřena jeho „zpracovatelnost“, ať už co do úsilí, tak i času, případně také „nosnost“ tématu. Nezpracovatelné (rozsáhlé, neurčité, příliš náročné) téma je vždy téma špatné.
Témata projektu mohou být různá. Nikdy by se však neměl zadavatel ani řešitelský tým smířit s výsledkem pouze v podobě popisu situace daného problému. Vždy by se měl pokusit o analýzu zjištěných informací a pokusit se navrhnout řešení nebo konstatovat a formulovat další problémy k řešení.
Příprava projektu je časově a někdy i materiálově náročnější, než klasické formy výuky. Ať jde o projekt jednoduchý nebo komplikovanější, vždy je třeba věnovat jednotlivým fázím určitý čas. Jelikož u nás není běžné, že studenti mají v rámci studia vyhrazen čas na zpracovávání projektu (vždy simultánně běží obvyklá výuka), jsou projekty zadávány buď v rámci praktika nebo jako domácí úkol. Zpracování samotné tedy mnohdy probíhá mimo školu (v rámci jejich volného „studijního“ času). Třídě/skupině může být zadán jenom jeden projekt nebo nabídnuto více projektů. Spolupracují-li studenti na jediném projektu, pak se po první fázi dělí na podskupiny a je třeba, aby spolu alespoň částečně při plnění dílčích úloh spolupracovali, nebo alespoň komunikovali. Společně pak také připravují prezentaci.
55
V každém případě je nutné, aby si pedagog, pokud již nemá s podobnými pracemi zkušenosti, vytvořil jakousi svou verzi formy projektu, který nabídne nebo předloží studentům (zpracuje sám případovou studii – viz níže). Dosáhne-li určité zkušenosti, pak by měl obvykle dojít k pravidlům naznačeným v tab. 3. VĚDECKÝ PROJEKT
Zpracovávat vědecké projekty vyžaduje obvykle více času a hodí se tedy jako osnova pro zadání delší práce (ročníkové, SOČ). Projekt bývá obvykle náročnější i na materiál, vybavení laboratoří nebo dostupnost přístrojů, tedy na finance. Zásadní je též přístup k literatuře a její předběžné prostudování. Vědecký projekt také vyžaduje pečlivé a stálé vedení erudovaným vědecko-pedagogickým pracovníkem a jeho zájem (obvykle již na zadaném tématu sám pracuje). Interaktivita vědeckého projektu se orientuje na individuální konzultace s odborníky, diskuse se školitelem a referování o průběhu prací na seminářích. Za nejjednodušší téma vědeckého projektu je pokládán popis jevu, případně srovnání. Ke složitějším náleží analýza problémové situace a experiment. Bohužel, řada studentských vědeckých projektů je stále zadávána způsobem „dělejte něco, zjistěte něco o …“, místo aby byla zadavatelem pečlivě formulována otázka, na níž je třeba odpovědět, nebo dokonce hypotéza, kterou je cílem potvrdit nebo vyvrátit. TAB. 3 SCHÉMA PRŮBĚHU PROJEKTU
příprava témat Témata připravuje a vybírá učitel průběžně a často nezávisle na studentech. Téma však mohou vybrat i sami studenti po dohodě s učitelem.
seznámení s tématem/tématy
Nejlépe na první hodině přednášky, cvičení seznámí učitel studenty s tématem (výběrem témat) nebo vyzve studenty k formulování vlastního tématu projektu. Je dán program („itinerář“) a také stanovena forma výstupu a způsob hodnocení.
výběr tématu, dílčích okruhů řešení, rozdělení do týmů
Výběr témat probíhá obvykle v období mezi první a druhou hodinou (jeden týden) a nutí studenty, aby se sešli nebo dohodli bez kontaktu s učitelem. Na druhé hodině by měli studenti seznámit učitele s tématem, které si vybrali (je-li témat více) a jak je složen tým (týmy).
upřesnění zadání Často je třeba upřesnit zadání, formulovat cíle a stanovit směr prací. To lze na téže hodině, jako je proveden definitivní výběr témat/u. Upřesnění však také může probíhat konzultační formou mimo vyučovací hodiny.
zpracování Studenti zpracovávají své téma nebo dílčí téma mimo probíhající výuku, podle toho, zda se jedná o rozdílné projekty nebo o dílčí podtémata jednoho většího společného projektu. Doba prací je obvykle 6-8 týdnů
předběžná diskuse o problémech zpracování
V polovině nebo ve dvou třetinách práce na projektu je vhodné zařadit „kontrolní den“. Na něm studenti referují o postupu prací a o problémech. Je také zařadit požadavky na prezentaci
prezentace spojená s diskusí
Prezentace probíhá na zvlášť určené obvykle poslední hodině daného předmětu. referování studentů je důležitá část projektu. Musí být formálně dobře připravena a technicky i časově zabezpečena (minimálně 2 vyučovací hodiny, zpětný projektor, diaprojektor …). Diskuse je důležitým uzavřením výstupů práce.
56
odevzdání písemných prací Projekt by neměl být uzavřen pouhou prezentací, ale písemnou zprávou, která zohledňuje i diskusi. Zprávy by měla mít dohodnuté náležitosti a měl by být stanoven přibližný percentuální a odborný příspěvek jednotlivých členů (kdo co dělal, a kolik % práce projektu „věnoval“).
hodnocení Hodnocení může provést pedagog, nebo může dát posoudit projekt nezávislému kolegovi, případně mohou při větším počtu projektů hodnotit spolu s učitelem projekty navzájem studenti (tento typ hodnocení často pokulhává, neboť studenti si navzájem neradi vytýkají chyby a problémy).
PŘÍPADOVÉ STUDIE
Jedním z velmi rozšířených (bohužel ne u nás) typů výukových projektů užívaných v rámci environmentálního vzdělávání je využití konkrétních situací, které nastaly nebo mohou nastat a opakovat se nebo které je nutno podrobně poznat aby se neopakovaly. Jde o tzv. případové studie. Mohou být zaměřeny jak na získání informací v rámci konkrétního oboru, tak i na procvičení technik nebo zažití procesu týmové spolupráce (dělba práce, vedení, pracovní diskuse, kontakt s odbornými pracovišti, institucemi státní správy, či samosprávy …).
Případové studie jsou v zásadě trojího typu. Jako studie mohou být využity případy extrémní (ukázka zvláštnosti podmínek, nebezpečnosti jevu, originality řešení), variabilní (ukázka spektra podmínek, možností přístupů, jevů …), opakovatelné neboli kritické (je-li takto tento případ, pak všechny budou podobné, není-li takto tento, pak žádný podobný tak nebude vypadat). Případové studie mohou být připraveny „de novo“ (žádná podobná studie ještě nebyla dělána a informace z ní budou sloužit při jejich opakováních) nebo je případová studie již připravena a výsledek práce týmu se porovnává se skutečností. Většinou je jako případová studie vybrána již podrobně zpracovaná situace, údaje jsou známy a studenti pracují pouze s daty s jejichž pomocí by se měli dobrat ke známým výsledkům.
Cílem využívání případových studií je možnost zobecnění jejich kroků a výsledků podle schématu:
případová studie ⇒ specifická znalost ⇒ obecná znalost ⇒ další specifická situace s vyšší pravděpodobností lepšího (rychlejšího, efektivnějšího …) postupu.
Účast na více studiích (projektech) tedy zvyšuje jejich účinnost a schopnost vyznat se
v konkrétních situacích při řešení konkrétních problémů. Dovoluje také osvojit si (nacvičit) některá opakující se schémata práce, jako je organizace týmu, dokumentace, předvídání problémových situací, formy prezentace, kultivuje diskusi, učí vnímat termíny, dodržovat časový plán apod. Význam tzv. případových studií tkví v tom, že počáteční stav každého problému představuje pro řešitele černou skřínku. Nezná výsledek, může ho jen odhadovat. Seznámení s problémem je první stupeň jeho řešení (fáze přípravy).
Pak je třeba problém popsat, jak vypadá, jak se navenek projevuje, jak se mění, jací jsou jeho účastníci (fáze definice).
V dalším stupni je obsah černé skřínky analyzován, rozdělen na další jednotlivé části (vlastně další podproblémy) pro jednotlivé „subtýmy“ (či jednotlivce v týmu) a zjištěny jejich vnitřní a vnější návaznosti, důležitost, zákonitosti, chování apod. (fáze analýzy - realizace).
Konečně je z dosažených informací možno odvodit jakousi kauzalitu, tedy proč se ta původní „černá skřínka“ chovala tak, jak jsme popsali a jaké jsou cesty k námi řízené změně -vysvětlení a pochopení funkce (fáze syntézy).
57
Problémy a pozitiva případových studií Pozitiva
• Ve fázích přípravy a definice problému je pozitivní počáteční zájem a „know how“ některých jedinců;
• Ve fázi realizace (analýzy) dílčí znalosti (schopnosti) jedinců; • Ve fázi syntézy identifikace s výsledkem (hrdost na spoluautorství zprávy).
Negativa
• Ve fázi přípravy stud, odpor k tématu jako k invenci učitele (lze odstranit, je-li možno vybrat téma samotnými studenty);
• Ve fázi realizace dlouhé diskuse, frustrace z nedostatku údajů a neznalosti metod (lze odstranit kvalitní přípravou dat a řízením diskuse – jejím omezením);
• Ve fázi syntézy nechuť a neschopnost formulovat závěry, případně obava z neúplnosti dat, z tlaku pedagoga na „vědeckost“ výsledku apod.
HRANÍ ROLÍ (SIMULAČNÍ HRY) Hraní rolí (role plays) je v mnohém podobné případovým studiím. Činnost se však odehrává v jednom časovém úseku, obvykle během dvou, či více hodin. Problémová situace je připravena a účastníci hry si rozdělují dopředu dané role. Úkolem je připravit, absolvovat a analyzovat modelové situace, do nichž se může dostat nejen odborník na problematiku životního prostředí, ale mnohý občan při řešení konkrétních (obvykle kontroverzních projektů nebo úkolů). Výtěžkem pro studenty je spíše pochopení chování a motivace jednotlivých účastníků a určitá předběžná zkušenost se spektrem názorů, než získání věcné odbornosti. Tento vyučovací prvek sestává obvykle ze čtyř fází:
1. příprava (učitele před hrou) - určit cíl modelové situace (např. poučit studenty o existenci rozdílných názorů na jadernou energetiku); - vytvořit situaci podobné realitě nebo přejmout po důkladné analýze již existující téma (záznam z veřejného projednávání umístění centrálního meziskladu vyhořelého jaderného paliva do lokality blízko konkrétní obce); - definovat problémy, které má modelová situace řešit (odliv rekreantů, pokles odběru zemědělských produktů, zvýšení zaměstnanosti, stavební ruch); - určit počet zúčastněných skupin a hráčů, jmenování nestranných pozorovatelů; - vytvoření rolí s charakteristikami (zástupci samosprávy, občané, zástupci stavební firmy, představitelé ministerstva …); - stanovit způsob provedení, dobu a případné rekvizity; - připravit soubor otázek pro následnou diskusi;
2. úvod do problematiky/tématu
- popsat účel hry; - přiblížit situaci (doplňující informace pro méně znalé); - přiřadit role (rozdání „partitur, jmenovek ...); - ponechat čas na přípravu účastníků; - uvést vlastní hru zklidňujícím, ale motivujícím proslovem;
58
3. vlastní sehrání - probíhá bez přímé účasti vedoucího (zásahy omezeny pouze na případy, kdy se sehrávka dostává do slepé uličky a nehýbá se z místa); - nedospěje-li hra k přirozenému konci, lze ji opatrně a nenásilně přerušit; - „herci“ odevzdají role a jmenovky a stávají se „sami sebou“, zaujímají jiná místa, než zaujímali při sehrávce; - vedoucí končí hru s poděkováním účastníkům a navozuje následující diskusi;
4. diskuse s rozborem situací (po hře)
- diskusi může začít kdokoli, první obvykle diskutují studenti (v našem příkladu třeba ti, co prosazovali stavbu centrálního meziskladu); - dále diskutují nezávislí pozorovatelé o sledované hře i o vlastních názorech a pocitech; - je-li přítomen odborník, který se podobného jednání účastnil, vyjadřuje své názory; - vedoucí shrnuje výsledky a zjišťuje, do jaké míry si studenti učinili představu o reálné situaci.
Uvedené schéma představuje pouze velmi stručné shrnutí kroků, které obecné simulační
hry obsahují. Pouze na základě výše popsané osnovy se však nedoporučuje hry aplikovat. Hraní rolí vyžaduje velmi podrobné nastudování tohoto způsobu výuky z příslušné literatury a především několikerou vlastní účast pedagoga při některé ze simulačních her připravených odborníkem.
ZÁVĚR
Moderní výuka problematiky životního prostředí se rozhodně nemůže „zbavit“ osvědčených a klasických informativních přístupů, tedy výkladu, cvičení, samostudia atd. Na druhou stranu by také na nich neměla ustrnout. Zahrnutí formativních přístupů, které upřednostňují zkušenost, samostatnost i kooperativitu, totiž umožní ponechat na mnoha místech výukového procesu studentům prostor pro to, by si našli odpověď na otázky sami a učitele vnímali pouze jako pomocníka či zprostředkovatele. Studenti by měli být schopni dojít ke svým vlastním závěrům a ne pouze papouškovat naučené „správné“ formulace. Obzvláště v oblasti praktické ochrany životního prostředí totiž mnohdy neexistují správné a nesprávné odpovědi, ale rozdílná stanoviska zúčastněných stran. Interaktivní (participativní) formy výuky jsou pro získání takových zkušeností ideálním mediem, neboť cíleně zařazují a užívají následujících prvků (tab. 4): TAB. 4: VÝHODY INTERAKTIVNÍCH FOREM VÝUKY
• možnost výběru metody k dosažení výsledku • volba zorného úhlu pohledu na výsledek (interpretace)• prezentace výsledku • obhajoba názoru (postupu, interpretace) • omezení autoritativní role pedagoga • podobnost s realitou okolního světa • mezilidské vztahy • atd.
Aktivita studentů je přínosná pro ostatní a mnohdy i pro učitele. Celá řada problémů
životního prostředí je totiž stále nahlížena především tradičním ochranářským způsobem, který nemusí být vždy správný nebo nemusí poskytovat nejvhodnější vysvětlení ( = člověk
59
přírodu poškozuje, je nutno přijmout přísné zákony, některé činnosti zakázat …). Interakce studentů mezi sebou a studentů s učitelem mohou v mnoha případech všem zúčastněným stranám ukázat netušená řešení zdánlivě jasných a nekonfliktních situací nebo naopak pomoci nalézt jednoduchá a efektivní řešení komplikovaných problémů.
Pro svou mnohotvárnost a mnohooborovost je problematika životního prostředí ideálním médiem v němž lze skloubit a aplikovat všechny atributy moderního způsobu vzdělávání, jehož cílem by měla být příprava aktivního, znalého, kritického a uvědomělého občana.
60
Chaos a fraktální geometrie – nový obraz světa
Jiří Drahoš a Miroslav Punčochář Ústav chemických procesů AV ČR, 165 02 Praha 6
Úvod
Položme si otázku, co mají společného kouřící komín, kapající kohoutek, fronty aut na dálnicí, srdeční rytmy, sněhová vločka, zemětřesení nebo vlny na mořském pobřeží. Ještě před zhruba čtvrtstoletím by odpověď zněla – nic, protože jde o odlišné systémy mající logicky zcela odlišné chování. Dalším axiomem té doby bylo tvrzení, že jednoduché systémy se chovají vždy jednoduše a proto složité chování musí mít složité příčiny. Bouřlivý rozvoj teorie chaosu v posledních zhruba třech desítkách let však dramaticky změnil náš pohled na svět: víme už, že chování jednoduchých systémů může být velmi složité, zatímco mnohé velmi komplikované systémy lze popsat až nápadně jednoduchými modely. Zjistili jsme také, že tyto jednoduché modely vyjadřující zákony složitosti mají obecnou povahu: všechny výše zmíněné systémy jsou typické soustavy měnící se dynamicky v čase a podléhající univerzálním zákonitostem chaosu. Toto chaotické chování zanechává celou řadu na první pohled neuspořádaných stop a otisků obrážejících dynamickou aktivitu těchto systémů a reflektujících energii jejich vnitřních změn a transformací (tak jako v písku zůstávají stopy po pouštní bouři a odliv zanechává stopy na pláži). Tyto stopy mají často poměrně komplikovanou strukturu, které říkáme fraktální a pro jejíž popis klasická euklidovská geometrie nepostačuje. Účelem našeho příspěvku je stručně objasnit oba zmíněné základní pojmy, fraktály a chaos, a ilustrovat je některými jednoduchými příklady.
Geometrie „nedokonalého“ světa Západní kultura byla po dlouhá léta poznamenaná syndromem elementární symetrie a
plynulých křivek. Symetrické, dokonale hladké a uzavřené tvary a formy byly po staletí ideálem krásy v malířství a sochařství, hudbě a koneckonců i v poezii. Již ve starém Řecku byla ideální euklidovská geometrie použita k popisu tzv. reálného světa, platónského světa idejí, světa věčných a neměnných obrazů a vzorců, které stojí za všemi v přírodě se vyskytujícími tvary. Námi pozorovaný svět, svět smyslů, je pak pouze jeho hrubou, nedokonalou a pomíjivou kopií.
Fraktální geometrie je geometrií tohoto „nedokonalého“ světa. Na rozdíl od euklidovské geometrie, využívající přímky a roviny, kruhy a koule, trojúhelníky a kužely, je základem fraktální geometrie složitost a členitost. Jednotlivé objekty již nejsou variacemi několika ideálních forem, ale vyznačují se nekonečnou složitostí: čím důkladněji je zkoumáme, tím složitější detaily můžeme odhalit. Vzpomeňme například na obrázek vánoční jedle, idealizované v dětských kresbách pomocí kužele, nebo soustavy trojúhelníků. Všichni ale víme, že struktura skutečné jedle má ke kuželu nebo trojúhelníku velmi daleko. Jednotlivé větve a větvičky se do značné míry podobají celému stromu, přitom žádné dvě větve nejsou zcela shodné, stejně jako nejsou zcela shodné žádné dva stromy stejného druhu.
Fraktální geometrie reflektuje skutečnost, že velké množství přírodních objektů je z hlediska pozorování tvaru nezávislé na měřítku, ve kterém je toto pozorování prováděno, a to často v rozsahu několika řádů měřících jednotek. Např. mapy pobřeží zobrazeného v určitém měřítku, vykazují značnou podobnost se zobrazeními ve větším, či menším měřítku. Totéž platí pro kmen stromu, ze kterého jdou větve a z nich zase menší větve až k nejmenším
61
větvičkám. Nezávisle na zvoleném měřítku, objevují se před námi stále stejné tvary. Tato invariance ke změně měřítka, zvaná soběpodobnost (angl. „self-similarity“), není zdaleka ojedinělá, ale má kořeny v iterativních mechanismech vývoje řady přírodních procesů.
Důležitým problémem aplikace euklidovské geometrie na reálný svět je otázka rozměru neboli dimenze. Předměty, s nimiž se v reálném životě setkáváme, jsou třírozměrné (jakkoliv je účelné některým objektům pro jejich zvláštní formu přiřadit nižší efektivní dimenzi: např. listu papíru dimenzi 2, lidskému vlasu dimenzi 1 apod.). Ve smyslu této geometrie jsou však třírozměrnými objekty pouze struktury zcela vyplněné pevnou hmotou. Klasické euklidovské míry (délka, šířka a výška) nedokáží zachytit podstatu nepravidelných tvarů. Například včelí plástev není typický třírozměrný objekt, přestože má tři jasně definované základní rozměry. Jaký rozměr má třeba list papíru zmuchlaný do tvaru koule nebo obyčejná kuchyňská drátěnka? Navíc, naše subjektivní vnímání dimenze závisí na vzdálenosti od objektu: již zmíněná vánoční jedle z dálky připomíná dvourozměrný trojúhelník, z bližší vzdálenosti pak třírozměrný kužel. S dalším přibližováním začneme rozlišovat strukturu kmene a větví, nejprve jako dvourozměrnou konstrukci, při bližším pohledu pak jako složitou soustavu třírozměrných tyčí či trubek. Tento proces změn dimenzí je zcela plynulý a pozorovaný objekt není v žádném okamžiku pouze dvou- nebo třírozměrný, ale jeho dimenze je vždy někde mezi těmito mezními hodnotami. Z tohoto pohledu funguje klasická geometrie zcela opačně, neboť její struktury se s rostoucím rozlišením formálně zjednodušují: třírozměrný kužel přechází na dvojrozměrný trojúhelník, tvořený jednorozměrnými čárami, skládajícími se z bezrozměrných bodů, přičemž uvedené změny jsou skokové, diskontinuální.
Je zřejmé, že euklidovská geometrie není dostačující ke konstrukci repliky skutečného stromu. Může postihnout jeho základní symetrii (a vytvořit vcelku výstižné logo), ne však rozmanitost jeho struktury. Tato rozmanitost je dána kombinací symetrie, deterministické náhodnosti a rostoucí složitosti jednotlivých detailů. Neadekvátnost klasické geometrie pro popis každodenní prostorové reality vyjádřil výstižně Benoit Mandelbrot, tvůrce pojmu fraktál (z latinského přídavného jména fractus, odvozeného od slovesa frangere – zlomit) a zakladatel fraktální geometrie, když řekl: „mraky nejsou koule, kopce nejsou kužely a blesk se nepohybuje po přímce”. Fraktální geometrie je geometrií důlků, jamek a hrbolů, pokřivenin, spletenin a deformací. Tato nová geometrie, charakterizovaná pojmy jako „soběpodobný“ nebo „soběodpovídající“, kdy každá část studovaného objektu je podobná celku, je sice rovněž určitou idealizací, jako ostatně každá část matematiky, je však daleko adekvátnějším prostředkem pro popis otisků a stop dynamiky přírodních dějů.
Výše zmíněná analogie ideálního platónského světa a fraktálního světa smyslů byla použita rovněž v noetice k zajímavém pokusu o vysvětlení našeho vnímání času. Čas může být pojímán dvěma zcela odlišnými způsoby: pro platónský přístup je určující bezčasovost bodového vjemu, tedy čas vnímajícího subjektu. Reálná je pouze přítomnost, okamžik „teď“, v němž je reflektována jak minulost (už byla), tak i budoucnost (teprve bude). Druhé, fyzikální pojetí času vychází z relace dříve, později a mezi, která odpovídá struktuře reálně měřitelného rozměrového času jako číselného kontinua. Je známo, že v případě mnohých časových událostí vykazuje tvar časových řad popisujících danou událost výrazné rysy soběpodobnosti. Znamená to, že naše vnímání těchto událostí je závislé na zvoleném stupni rozlišení, tedy na charakteristickém měřítku časového „okna“, jímž událost posuzujeme. Naše mysl je schopna propojit vnímání v okamžiku „teď“ s asymetrickým světem fyzikálního času, tedy spojit bezčasově neměnný platónský svět s reálným světem, v němž přijímáme informace během plynoucího času. Jako ilustraci lze uvést schopnost některých hudebních skladatelů (např. Mozarta či Bacha) „přečíst“ skladbu (nebo její významnou část) prakticky jediným pohledem: faktická bezčasovost tohoto děje kontrastuje se skutečnou délkou potřebnou k provedení té které skladby v reálném čase.
Za zmínku rovněž stojí průkopnické práce psychiatra Montague Ullmana a dalších, z nichž vyplývá, že i struktura našich snů může mít fraktální charakter. Výzkumníci věří, že "příběh"
62
snu obsahuje opakování podstatných problémů snícího. Reflexe těchto problémů se dají najít jak v celém "příběhu", tak v jeho stále jemnějších detailech.
Vhodnou mírou fraktality je neceločíselná fraktální dimenze. Skutečnost, že mnoho objektů reálného světa je nutno charakterizovat neceločíselnou dimenzí, se z intuitivního hlediska zdá značně překvapivou a byla zprvu rovněž těžce přijatelnou. Přispěl k tomu i fakt, že fraktální dimenze byla nejprve zavedena v rámci “čisté” matematiky F. Hausdorffem jako zobecnění pojmu dimenze a její výpočet podle teoretické definice je velmi obtížný. Až B. Mandelbrot vypracoval prakticky použitelné postupy pro výpočet fraktální dimenze reálných objektů. Vzhledem k důležitosti soběpodobnosti a fraktální dimenze jsou oběma pojmům věnovány samostatné odstavce.
Soběpodobnost
Soběpodobnost geometrických objektů se zdá být intuitivně snadno pochopitelným pojmem: vyřízneme-li nějakou část soběpodobného útvaru a vhodným způsobem ji zvětšíme, dostaneme opět výchozí útvar. U jednoduchých tvarů buď tato vlastnost neexistuje, anebo je splňována elementárně. Kružnice není například totožná s libovolně zvětšenou svojí částí, avšak vyřízneme-li z kruhu menší kruh, je soběpodobnost zachována. Podobně lze demonstrovat triviální soběpodobnost na úsečkách, čtvercích, krychlích a jiných objektech euklidovské geometrie. Pro účely fraktální geometrie se ukazuje užitečným poněkud přeformulovat původní představy o soběpodobnosti. Vyjdeme přitom z okolnosti, že soběpodobné množiny jsou sestaveny z částí, které jsou geometricky podobné celku zmenšenému v určitém měřítku.
Množina K je považována za soběpodobnou, jestliže ji lze sestavit z několika zmenšených kopií jí samé, přičemž sestavení původní množiny probíhá aplikací posunutí, otočení, popř. zrcadlení na jednotlivé kopie. Kopií je v této souvislosti myšleno zobrazení zachovávající podobnost. Například pro soběpodobný dvourozměrný útvar K v rovině (x,y) platí podobnost mezi K(x,y) a K(rx,ry), přičemž r se nazývá redukční faktor (v našem případě je samozřejmě 0 < r < 1).
Soběpodobnost lze sice nejlépe ilustrovat graficky, ale i bez názorného obrázku si lze poměrně snadno představit konstrukci jednoho z neznámějších fraktálů, tzv. Kochovy křivky: vezmeme úsečku o libovolné délce, vztyčíme nad její prostřední třetinou rovnostranný trojúhelník a odstraníme jeho základnu. Dostaneme lomenou čáru složenou ze čtyř stejně dlouhých úseček. Popsaný postup, tj. konstrukci rovnostranného trojúhelníka nad prostřední třetinou zopakujeme u každé ze čtyř úseček a dostaneme tak druhou iteraci Kochovy křivky – lomenou čáru složenou ze šestnácti úseček. Pokračujeme-li uvedeným způsobem dále, získáváme další iterace Kochovy křivky. Soběpodobnost vzniklého limitního objektu je dána samotným procesem konstrukce. Každá ze čtyř částí, z nichž se skládá k-tá iterace, je tvořena (k-1)ní iterací zmenšenou na jednu třetinu. Iterativní charakter procesu tvorby soběpodobného objektu, který byl ukázán na příkladu Kochovy křivky, je právě tím charakteristickým rysem, odlišujícím soběpodobné tvary studované ve fraktální geometrii od soběpodobnosti triviální. Uvedeným způsobem vzniká totiž tzv. jemná struktura fraktálních objektů vyznačující se tím, že při libovolně malých měřítcích, resp. rozlišeních, je stále patrné velké množství detailů. Fraktály takto generované se nazývají deterministické nebo též lineární.
Některé fraktály nemají přísně soběpodobnostní charakter, mohou však vykazovat rysy soběodpovídajících (angl. “self-affine”) struktur. Pro soběodpovídající dvourozměrný fraktál platí statistická podobnost mezi K(x,y) a K(rx,rHy), přičemž parametr H je charakteristický pro danou strukturu. Soběodpovídající fraktál tedy není izotropní a pro každou souřadnici je redukční faktor odlišný.
Je důležité si uvědomit, že soběpodobnost je limitní vlastnost a jako taková v přírodě existuje pouze přibližně. Invariance ke změně měřítka je z nejrůznějších důvodů vždy omezená, např. velikost největších i nejmenších větví stromu. Zvětšená kopie části je navíc totožná s originálem pouze ve statistickém slova smyslu vzhledem k různým rušivým vlivům
63
majícím často nahodilou povahu. Fraktálům vyskytujícím se v reálném světě kolem nás se říká náhodné nebo přírodní, typickým příkladem takových fraktálů je květák nebo brokolice. Fraktální dimenze
Přejdeme nyní k základnímu nástroji fraktální geometrie - fraktální dimenzi. Jako fraktální označujeme, nomen omen, každou dimenzi, která může nabývat neceločíselných hodnot. V geometrii i fyzice byla definována řada takových dimenzí, v následujícím zmíníme dvě nejdůležitější a nejčastěji užívané.
V přímé návaznosti na pojem soběpodobnosti lze definovat podobnostní dimenzi (angl. „similarity dimension“). Představme si úsečku rozdělenou na dvě poloviny. Znamená to, že úsečka se skládá ze dvou kopií sebe samé, zmenšených na jednu polovinu. Tato úsečka se nachází v euklidovském prostoru o dimenzi 1 = -log2/log(1/2). Libovolný čtverec, který je útvarem náležejícím do dvourozměrného euklidovského prostoru, může být rozdělen na čtyři kopie zmenšené v obou souřadnicích na jednu polovinu. Pro jeho dimenzi proto platí 2 = -log4/log(1/2). Analogicky je dimenze krychle složené z osmi kopií rovna 3 = -log8/ log(1/2). Pro triviálně soběpodobné geometrické útvary tedy platí jednoduchý vztah mezi parametry soběpodobnosti a dimenzí d euklidovského prostoru, v němž se nacházejí: d = - logN / logr, kde N značí počet zmenšených kopií, z nichž se skládá originál, zatímco r je symbolem pro redukční faktor. Přesněji řečeno, d je nejnižší dimenze, v níž mohou tyto útvary existovat - například úsečku můžeme samozřejmě umístit i do roviny nebo trojrozměrného prostoru.
Uvedený vztah nás opravňuje definovat podobnostní dimenzi DS následujícím způsobem
DNrS = −
loglog
. (1)
U jednoduchých objektů platí, že DS = d. V případě Kochovy křivky však dostaneme
DS = log4 / log3 ≈ 1,26, neboť tato křivka se skládá ze čtyř kopií sebe samé, zmenšených na jednu třetinu. Vidíme, že definice (1) může vést v případě netriviálního objektu k neceločíselné, tedy fraktální hodnotě dimenze.
Podobnostní dimenzi lze sice snadno vypočítat na základě rov. (1), avšak její přímé použití je možné pouze tehdy, dokážeme-li úplně charakterizovat soběpodobnost zkoumaného objektu: v takovém případě nám ovšem dimenze nepřinese žádnou podstatnou novou informaci (nehledě na praktickou neuskutečnitelnost takového výpočtu).
Odhlédneme tedy od případné skryté soběpodobnosti zkoumaných útvarů a budeme se zabývat jiným, v praxi mnohem vhodnějším typem dimenze. Základní myšlenka je velmi jednoduchá a vystihuje skutečnost, že plocha úsečky je rovna nule, stejně tak objem čtverce, zatímco délka čtverce i krychle je nekonečná. Chceme-li tedy dostat smysluplný údaj při měření úsečky, čtverce a krychle, musíme zvolit jako míru pro úsečku délku, pro čtverec plochu a pro krychli objem. Měření velikosti, míry, nějakého geometrického útvaru v prostoru může přitom probíhat tak, že pokrýváme body tohoto objektu testovacími množinami (úsečkami, čtverci, kruhy, koulemi nebo krychlemi) o lineárním rozměru δ žství těchto testovacích množin, N(δ ), nutných k úplnému pokrytí objektu. Lze ukázat, že pro fraktální dimenzi musí platit vztah N(δ) δ d ≈ konst., tzn. N(δ ) ≈ δ -d .
Podstatné je, že počet testovacích objektů N(δ), jimiž pokrýváme zkoumaný útvar, lze snadno stanovit experimentálně. V běžném případě, kdy máme k dispozici obrázek (fotografii) zkoumaného objektu, můžeme pokrývat obrysy tohoto obrázku čtverci (angl. „boxes“) o velikosti strany δ. Poté vyneseme graficky závislost δ vs. N(δ) v logaritmických souřadnicích: pokud získáme pro “dostatečně malé hodnoty δ rozumnou lineární závislost”, je možno definovat směrnici získané přímky jako fraktální dimenzi zkoumaného objektu. V této souvislosti hovoříme o dimenzi založené na počítání čtverců (angl. „box dimension“) a značíme ji symbolem DB. Při praktickém stanovení této dimenze je z hlediska počítačového
64
zpracování nejvhodnější postup, při němž je analyzovaný obraz pokryt sítí čtverců o straně δ a N(δ) je poté určeno jako počet čtverců, které obraz protíná. V dalších krocích se síť zjemňuje a postup se opakuje. Pro δ konvergující k nule tak můžeme definovat dimenzi DB vztahem:
DN
B =−→
limlog ( )
logδ
δδ0
. (2)
Fraktální geometrie přírody
Až řadu let poté co B. Mandelbrot publikoval knižně své základy fraktální geometrie, se jejích principů chopili vědci z nejrůznějších oborů a začali nacházet fraktální uspořádání struktur v geofyzice, meteorologii, botanice, biologii, fyziologii a dalších disciplínách. Je mimo možnosti tohoto příspěvku byť jen vyjmenovat všechny dosud známé aplikace fraktální geometrie – v dalším zmiňujeme pouze některé a odkazujeme čtenáře na přiložený seznam literatury.
Jednu z klíčových rolí hrají v přírodě větvící se fraktální struktury, které je možné popsat a generovat s využitím minimálního množství informací. Je třeba říci, že opakování téhož vzoru ve stále menším měřítku bylo vůbec poprvé použito na začátku 20. století některými matematiky při konstrukci tzv. matematických monster, velmi členitých útvarů majících z hlediska tehdejší matematiky řadu překvapujících vlastností - například spojitá funkce, která nemá nikde derivaci, spojité zobrazení úsečky na čtverec, křivka nekonečné délky ohraničující konečnou plochu, křivka procházející všemi body v rovině a nikde se neprotínající apod. Struktury typu Cantorovy množiny (fraktální dimenze DS = 0,63), Kochovy křivky (DS = 1,26), Sierpinského sítě (DS = 1,58), Hilbertových či Peanových křivek vyplňujících celou plochu (DS = 2) – dnes klasické útvary fraktální geometrie – byly dlouho považovány za bizarní produkty „zvrácených“ matematiků, nemající žádnou vazbu na přírodní struktury. Intuitivní genialita Gustava Eiffela, jehož slavná pařížská věž je v zásadě třírozměrnou variantou Sierpinského sítě, vzbuzuje v této souvislosti hluboký obdiv. Konstrukční prvky věže se větví v síť stále tenčích a kratších nosníků a traverz, snižujících výrazně hmotnost ale neubírajících struktuře na nosnosti.
Tentýž soběpodobnostní princip ostatně uplatnila příroda i v případě cévního systému: větvení a rozdělování postupuje od aorty až po nejjemnější kapiláry. Účinnost této struktury, směstnávající do malého objemu plochu s velkým povrchem (DB ~ 2,7), dokumentuje skutečnost, že ve většině tkání není žádná buňka vzdálená od cévy více než několik málo buněčných průměrů. Rovněž bronchiální větvení v plících (včetně propojení dýchacích trubic se žílami a tepnami), uspořádání srdečních vláken přenášejících proudové impulsy do stahujících se svalů (tzv. Purkyňova síť), lymfatický systém, uspořádání mozkových buněk či filtrační schopnost ledvin jsou názornou ilustrací efektivity fraktálních struktur v našem těle. Nedávno vyslovili někteří biologové hypotézu, že fraktální struktury patří k univerzálním principům morfogeneze. Je pravděpodobné, že jednoduché algoritmy pro generování větvících se matematických monster mají svoji obdobu v genetickém kódu organismů: jedním z úkolů současné biologie je výzkum kódování těchto struktur v buňkách a jejich vývoje v čase.
Přejdeme-li od lidského těla k okolní přírodě, vidíme kolem sebe fraktální struktury rostlin, keřů a stromů. Rovněž hory, suťové svahy na jejich úbočí, zvětralé balvany, povrch porézních hornin, korálové útesy – to vše jsou fraktální objekty, jejichž každá část je (se zahrnutím vlivu náhodnosti) podobná celku. Totéž platí pro celu řadu struktur vznikajících při turbulentním proudění plynů a kapalin, např. mraky na obloze, oblaka popela vyvrhované při erupci sopky, kouř nad komínem, víry ve vodě. Nepřehlédnutelná je fraktální krása sněhových vloček stejně jako větvení blesků při bouřce. Struktura Saturnových prstenců i celých galaxií jsou příkladem existence fraktálů v blízkém i vzdáleném vesmíru. Jak už bylo zmíněno v úvodu, jde v řadě těchto případů o stopy chaotického chování mnohdy složitých dynamických
65
systémů. Abychom pochopili strukturu těchto stop, je třeba se zmínit o pojmu chaosu a některých souvisejících termínech.
Chaos
Kořeny studia chaotického chování sahají ke konci minulého století, kdy se H. Poincaré zabýval studiem chováním soustav tří těles s vlastní gravitací v souvislosti s modelováním pohybu těles sluneční soustavy. Samotný pojem chaosu byl zaveden až později u disipativních dynamických soustav americkým meteorologem Lorenzem (1963) v souvislosti se snahou o popis konvektivního proudění v atmosféře. Soustava tří jednoduchých nelineárních diferenciálních rovnic (Lorenzovy rovnice) vykazovala neočekávaně složité chování v závislosti na hodnotách charakteristických parametrů a názorně demonstrovala nemožnost dlouhodobé předpovědi počasí. Od té doby se chaos stal fenoménem, používaným v celé řadě oborů lidského poznání v souvislosti s popisem dynamiky chování systémů v čase. Tradiční ”černobílý” přístup, převládající po více než půlstoletí, využíval pro popis chování systému dva základní modely: deterministický a stochastický. Teorie deterministického chaosu nabídla alternativu, vyplňující širokou oblast mezi oběma zmíněnými variantami a reflektující skutečnost, že i velmi jednoduché (v zásadě deterministické) nelineární systémy mohou vykazovat velmi komplikované, zdánlivě náhodné chování.
Klasickým příkladem je tzv. populační (též logistická) rovnice, použitá k popisu chování každoročně se měnící populace živočichů: populace X v roce (t+1) je určena populací v roce (t) a hodnotou jediného parametru A v diferenční rovnici Xt+1 = A Xt (1 – Xt). Důvodem velmi komplikovaného chování tohoto jednoduchého nelineárního modelu je, že pro určité hodnoty parametru A původně takřka zanedbatelný rozdíl mezi dvěma výchozími stavy (tedy počátečními hodnotami X0) roste exponenciálně s časem a komplikuje tím přesnou předpověď chování studované populace v delším časovém intervalu. Na druhé straně, krátkodobá předpověď je samozřejmě možná: k tomuto účelu byly navrženy nejrůznější metody, vycházející z experimentálně získaných záznamů chování systému v čase (např. ve formě časové řady charakteristické veličiny), které zkoumají deterministickou podstatu problému a následně možnost použití deterministického modelu.
Klíčovými slovy v terminologii chaosu jsou nelinearita a citlivost na změnu počátečních podmínek. Nezbytnou podmínkou existence chaosu je nelinearita soustavy; ne každý nelineární systém však vykazuje chaotické chování. Jak již bylo zmíněno, ani znalost deterministického modelu takové soustavy neumožňuje předpověď jejího chování v delším časovém horizontu. Tato skutečnost přitom nemusí být důsledkem přítomnosti náhodné složky (šumu), ani extrémní složitosti soustavy - její příčinou je obecná citlivost nelineárních systémů na změnu počátečních podmínek.
Pro popis chování chaotických systémů se nejčastěji používá fázový (též stavový) prostor, vzniklý projekcí všech relevantních proměnných na systém ortogonálních os: každé proměnné pak odpovídá jedna osa (např. dynamiku pohybu jednoduchého kyvadla lze zcela popsat ve dvojrozměrném fázovém prostoru, kde proměnné jsou poloha a rychlost kyvadla). Dynamický stav systému v určitém čase je tedy jednoznačně určen bodem ve fázovém prostoru.
Vývoj systému v čase lze pak popsat posloupností bodů ve fázovém prostoru - tzv. trajektorií. V případě disipativních systémů konvergují trajektorie k charakteristické struktuře ve fázovém prostoru, která se nazývá atraktor. Např. pro kyvadlo tlumené třením je atraktorem bod (kyvadlo se po určitém čase zastaví), pro kyvadlo s pohonem (případ periodického děje) je atraktorem uzavřená smyčka ve fázovém prostoru - tzv. limitní křivka. Jednoduchost obou zmíněných atraktorů kontrastuje s extrémně složitou strukturou atraktorů charakterizujících systémy s chaotickým chováním: v těchto případech mluvíme o tzv. podivných atraktorech.
Charakteristickým znakem chaosu je citlivost na změnu počátečních podmínek či jakékoli perturbace. Původně takřka identické trajektorie exponenciálně divergují v čase, přičemž k této divergenci dochází v rámci mikroměřítka, zatímco v makroměřítku lze sledovat složité
66
ohýbání a proplétání trajektorií. Zde je třeba opět zdůraznit, že chaotické systémy nejsou periodické: trajektorie tvořící atraktor se nikde neprotínají a platí pro ně známé Herakleitovo „nikdy nevstoupíš dvakrát do stejné řeky“. Přes svou komplikovanou vnitřní strukturu jsou podivné atraktory dobře definovatelné, globálně stabilní geometrické útvary, charakteristické pro daný systém. Herakleitův paradox ostatně neplatí pouze pro strukturu trajektorií v podivných atraktorech, ale pro všechny výše zmíněné přírodní fraktály: neexistují například dvě totožné sněhové vločky stejně jako neexistují dva zcela identické stromy stejného druhu - tvar každého jednotlivého stromu je struktura dynamicky se měnící v čase vlivem celé řady vnějších podmínek, jako jsou gravitace, magnetické pole, složení půdy, vítr, směr slunečního svitu, postavení okolních stromů a mnoha a mnoha dalších.
Důležitým problémem je kvantifikace chaotického chování, tj. odpověď na otázku, nakolik chaotické je chování chaotického systému? Používáme zde dva základní typy kvantifikátorů, popisujících jednak dynamiku chaotického chování a dále geometrii atraktoru. Do první skupiny patří Ljapunovovy exponenty a Kolmogorovova entropie, postihující rychlost divergence sousedních trajektorií. Pro charakterizaci složité geometrie atraktoru se používá nám již známá fraktální dimenze.
Řadu aplikací teorie chaosu lze najít v přiložené literatuře. Zmiňme alespoň jedno zajímavé využití nelinearity v procesu regulace a řízení ze zpětnou vazbou. Významným důsledkem takové zpětnovazební regulace je stabilita dynamických systému. Zjednodušeně řečeno, pokud udělíme mírný impuls lineárnímu systému, zůstane mírně vychýlený. Nelineární systém se však při stejném impulsu spolehlivě vrací do původního stavu, charakterizovaného příslušným atraktorem. Náš organismus musí stále reagovat na měnící se podmínky a není proto dost dobře možné, aby byl tep srdce, rytmus dechu nebo ostatní rytmy v organismu striktně periodické – naše odolnost vůči vnějším poruchám by v takovém případě byla velmi malá. Bylo zjištěno, že obrazem rytmu zdravého srdce je podivný atraktor, zatímco tep nemocného může být často nápadně periodický. Zdá se tedy, že to, co je z matematického hlediska patologické, tj. chaos, může znamenat zdraví. Ve fyziologii lidského těla začal být chaos chápán jako projev zdravě fungujícího organismu.
Fascinující struktura fraktálů a podivných atraktorů v nás často vyvolává silný pocit opětovného poznání, pocit, že jsme něco takového už někde viděli. Podobné pocity máme například při pohledu na rafinovaně splétané keltské obrazce z doby bronzové či na složité vzory na rituální nádobě z éry Šang, nebo při poslechu iterativních jazykových her dětí či nápěvků takzvaných "primitivních" národů. Harmonické tvary a formy klasického západního umění se v této souvislosti mohou zdát bezmála nepatřičné. Podíváme-li se však detailněji na díla největších umělců, najdeme i v jejich klasických formách téměř vždy reflexi dynamiky chaosu ve srozumitelnosti řádu. Zdá se, že právě toto napětí mezi řádem a chaosem, mezi stagnací a růstem, je jedním z atributů každého velkého umění, bez ohledu na dobu a místo jeho vzniku. Závěr
Stále více vědců se dnes kloní k názoru, že ke dvěma nesporným „revolucím“ dvacátého století, teorii relativity a kvantové mechanice, patří i třetí – teorie chaosu. Je zajímavé, byť v jistém smyslu nepříliš potěšující, že všechny tři zmíněné oblasti stanovují určité meze našemu poznání okolního světa: prvá udává mez rychlosti přenosu energie a informací (danou rychlostí světla ve vakuu), druhá pak dolní mez velikosti interakcí mezi systémy (určené Planckovou konstantou). Chaos a nelineární dynamika konstatují zásadní omezení přesnější předpovědi chování jednoduchých systémů v delším časovém horizontu. Vzhledem k současnému bouřlivému vývoji v těchto disciplinách bychom se definitivní odpovědi na otázku položenou v názvu tohoto příspěvku mohli dočkat poměrně brzy.
67
Poznámka Text příspěvku je upravenou verzí článku ‘Fraktály a chaos: věda o běžných věcech‘,
publikovaného ve sborníku Vybraná témata na přelomu tisíciletí (Editoři M. Mareš, J. Nekola a R. Řeřicha), Česká asociace Římského klubu, Praha, str. 33-45 (2001). Použitá literatura Briggs J.: Fractals – the Patterns of Chaos. Thames and Hudson, London 1994. Briggs J., Peat F. D.: Turbulent Mirror. An Illustrated Guide to Chaos Theory and the Science of Wholeness. Harper & Row, New York 1989. Falconer K. J.: The Geometry of Fractal Sets. Cambridge University Press, Cambridge 1985. Feder J.: Fractals. Plenum Press, New York 1988. Gleick J.: Chaos – vznik nové vědy. Ando Publ., Brno 1996. Hausdorff F.: Dimension und äusseres Maß. Mathematische Annalen 79 (1919) 157. Horák J., Krlín L.: Deterministický chaos a matematické modely turbulence. Academia, Praha
1966. Kůrková V.: Fraktální geometrie. Pokroky matematiky, fyziky & astronomie 34 (1989) 267. Mandelbrot B.: The Fractal Geometry of the Nature. W.H. Freeman, New York 1982. Marek M., Schreiber I.: Chaotic Behaviour of Deterministic Dissipative Systems. Academia,
Praha 1991. Moon F.C.: Chaotic and Fractal Dynamics. Wiley, New York 1992. Peitgen H.O., Jürgens H., Sauppe D.: Chaos and Fractals – New Frontiers of Science.
Springer, Berlin 1992. Peters E.E.: Fractal Market Analysis. Wiley, New York 1994.
68
Psychofarmakologie drogových závislostí
Doc.MUDr. Oldřich Vinař, DrSc
Termín drogová závislost je nešťastný. Slovo droga je zde užito v pojetí, které začali razit novináři, když se psychiatři nemohli rozhodnout mezi „lékovou závislostí“, což by byl přesnější překlad anglického „drug dependence“ a „látkovou závislostí“, který by byl výstižnější. „Droga“ má znamenat látku, jejíž užití je spojeno s risikem vzniku závislosti. „Léková závislost“ by nezahrnovala alkoholismus a kouření, poněvadž alkohol ani cigarety nejsou léky. „Látková závislost“ je zase příliš obecná a neobvyklá. Název „drogová závislost“ je nevhodný nejen proto, že neodpovídá definici „drogy“ podle farmakologie, ale proto, že vede mnoho lidí k mínění, že farmakologicky účinné látky lze rozdělit na léky a drogy a že je zde tedy kategoriální rozdíl. Skutečnost je však taková, že mezi léčivy, kde risiko závislosti je veliké (morfin) a kde je nepatrné (např. furosemid), je co do velikosti risika kontinuum. Tedy místo rozdělení na černé a bílé máme kontinuum různých odstínů šedi. Bíločerné rozlišování vede totiž k mínění, že na „léky“ závislost nevzniká. To může demobilizovat ostražitost a podcenění risika u takto definovaných „léků“. Průkaz existence závislosti na placebu (Vinař, 1969) ukazuje, že neexistuje látka, na kterou závislost vzniknout nemůže. Protestovat dnes proti termínu „drogová závislost“ je však už neproduktivní a marné. Je už vžité a má výhodu, že můžeme mluvit jako o droze jak o kyselině acetylosalicylové, tak o tabáku. Bude-li dále řeč o biologických mechanismech drogové závislosti, je možno z hlediska podobnosti těchto mechanismů pod pojem závislosti zahrnovat i takové činnosti jako je např. hazardní hra (gambling) nebo workoholismus, kde lze tyto mechanismy právem předpokládat. Další terminologické nesnáze mohou vznikat s termínem toxikomanie (anglicky mu odpovídá „addiction“, někdy přejímán v češtině jako „adikce“). Jde v podstatě o synonymum se syndromem závislosti Historicky předcházel termín toxikomanie termínu závislost. K nutným podmínkám pro jeho diagnostiku patřilo, že vynechání drogy vede k somatickému „fysickému“ abstinenčnímu syndromu (odvykacím příznakům nebo k syndromu z odebrání). Tato definice bránila tomu, aby mezi kontrolované látky byl zařazen amfetamin a jiná stimulancia, po jejichž vynechání k takovým příznakům nedochází. Při diagnostice závislosti je abstinenční syndrom podpůrným, ale nikoli nutným znakem. V průběhu času se měnily názory na důležitost vlastností drogy ve srovnání s významem osobnostních charakteristik nemocného. Přibližně do konce poloviny tohoto století se hledala hlavní příčina v droze a v jejich farmakologických vlastnostech. Pak začala převažovat domněnka o dominanci psychologických rysů pacienta. Závislý byl už eo ipso pokládán za psychopata. Byl to on, kdo hledal pro sebe drogu a pátralo se po takových rysech osobnosti, které risiko vzniku závislosti zvyšovaly. V šedesátých a sedmdesátých letech se přesunul hlavní důraz na sociální faktory a situaci, která vznik závislosti usnadňovala: atmosféra fetující party, rozvrácená rodina, ve které vyrůstá mladistvý bez laskyplné péče rodičů, chudoba, kriminální subkultura, atd. Pak nastal nečekaný obrat, když se objevily důkazy o genetické determinaci závislostí u některých lidí a poslední dvě desetiletí jsou ve znamení hledání a nalézání biologických (genetických, patofysiologických, humorálních) faktorů podílejících se na vzniku závislosti. .
69
Závislost je definována jako zvláštní – patologická – interakce mezi organismem a drogou, která je charakterizovaná nesnadno překonatelnou touhou znovu a znovu drogu užívat. Tato touha má rys nutkavosti. Tato obsedantně-kompulsivní složka vysvětluje, proč není nutnou podmínkou, aby požití drogy přinášelo příjemné subjektivní pocity – i když je to samozřejmě zvláště na počátku rozvoje závislosti pravidlem. Opakované požití drogy je zpravidla – ale ne vždy - udržováno obavami před vznikem velice nepříjemných abstinenčních příznaků (neklid, netrpělivost, úzkost, deprese, třes, pocení, tachykardie). Pravidlem je postupné zvyšování dávek drogy, které je jak následkem, tak příčinou tolerance na drogu, třeba ve vysokých dávkách. Drogy mají farmakologické účinky, které jsou zprostředkovány jejich vlivem na nervové buňky. Nervové buňky (neurony) se mezi sebou domlouvají chemicky – posílají si po nervových vláknech zvláštní chemické látky – neurotransmitéry (přenašeči nervového vzruchu, neuropřenašeče). Aby tito poslové nesoucí zprávy mohli svou zprávu dodat, musí přeskočit synaptickou štěrbinu, která je místem, na kterém na sebe navazují nervová vlákna jednoho neuronu s vlákny neuronu, kterému je poselství předáváno. Na membránách nervových zakončení v synaptické štěrbině jsou zvláštní citlivá místa, receptory, na které se molekuly neurotransmitérů navážou a tím umožní průchod nervového vzruchu. Drogy mohou měnit jednak množství neurotransmitérů, jednak stav receptorů – mohou zablokovat jejich schopnost přijmout zprávu nebo naopak zvýšit jejich citlivost, mohou např. způsobit, že receptor si molekuly neurotransmitérů aktivněji přitahuje. Příroda zajišťuje velmi důkladně průchod nervových vzruchů přes synapsi. Uvolní z nervového zakončení odkud se zpráva předává dál, asi dvacetinásobek množství neurotransmitéru, než je pro průchod vzruchu nutné. Je však na druhé straně velmi spořivá. Ty molekuly neurostranmitéru, které se nenavážou na receptory neuronu, který má zprávu přijmout, jsou vychytány zpět receptory vysílajícího neuronu, aby mohly být znovu využity. Tomuto procesu se říká zpětné vychytávání a mechanismus, kterým působí mnoho léků – ale i drog – je blokáda tohoto zpětného vychytávání, které pak zvýší množství neurotransmitéru v synapsi třeba dvacetkrát. Velmi častý průběh předávání zpráv na synapsi mění stav synapse více méně trvale, může se např. zvýšit počet receptorů. Jsou to bílkovinné struktury, což znamená, že k jejich syntéze se musí aktivovat aparát genů. Čerstvý laureát Nobelovy ceny, Eric Kandel, obdržel tuto cenu mimo jiné za to, že prokázal, že jsou to organické změny synapsí, které jsou podkladem paměti. Drogy jsou užívány dlouhodobě a vedou tedy postupně k přestavbě nervového sytému. Tato velká plasticita, pohotová schopnost nervového systému přizpůsobit se radikální přestavbou svých struktur nárokům, které jsou na něj kladeny, by byla těžko pochopitelná, kdyby nebylo vyvráceno asi sto let trvající přesvědčení vědců, že počet neuronů mozku je největší při narození a během života se může jen snižovat. Platil názor, který se nyní pokládá za mýtus, že během života nemůže žádný nový neuron vzniknout. Pro pochopení role neurotransmitérů je onen rys nutkavosti s eventuální absencí libosti, kterou by musela droga vyvolávat. Význam sociálních faktorů včetně deficitu láskyplné péče, zvláště v útlém dětství zase souvisí s rolí chronického stresu, který vznik závislosti usnadňuje. Dlouhodobý stres může organicky poškozovat mozek, tak např. těžká stresová situace, která bývá počátkem onemocnění, které má jméno posttraumatická stresová porucha, vede ke ztrátě 10 – 15 % nervových buněk hipokampu, což je část mozku důležitá pro intelektové funkce. Naštěstí může léčba tento stav napravit.
70
Dochází-li k těžké stresové zátěži v útlém dětství, může top na mozku zanechat jakousi jizvu, jejíž nepříznivý vliv se projeví až v pubertě nebo později v dospělosti. Už z této skutečnosti vyplývá, že neurobiologické teorie nenahrazují bývalé koncepce, ale že je svým způsobem doplňují a integrují.. Nejčastěji přijímanou teorií vysvětlující neurobiologické základy závislosti je paradigma odměny související se stimulací mozku (Brain Stimulation Reward Paradigm), BSR. Opírá se o pokusy Oldse a Milnera (1954), kteří implantovali laboratorním zvířatům elektrody do určitých míst mozku a operantním podmiňováním vypracovali reflex, při kterém si potkan elektricky stimuloval tato místa stiskáváním páky. Řada drog, především stimulancia zvyšovala frekvenci stimulací a tedy posilovala chování vedoucí k „odměně“. (Killam et al. 1957). Místa v mozku, kde bylo možno stimulací docílit „odměny“, nazvali centra radosti (pleasure center). Patří k nim např. ventrální tegmentum. Kanadský neurochirurg Penfield později při hledání míst v mozku, odkud bylo možno vyvolat epileptický paroxysmus, implantoval elektrody do některých míst mozku pacientů epilepsií, kde se předpokládalo, že budou moci být vyléčeni excisí epileptogenního ohniska. Při lokalizaci elektrod v místech obdobných lokalizaci center radosti si je pacienti stimulovali stiskáváním tlačítka na opasku velmi často. Penfield očekával, že tak činí proto, že je to pro ně příjemné. Pacienti vypověděli, že určitou libost pociťují, avšak že se tato libost postupně přeměňuje spíše v nutkavost. Jejich jednání se tedy podobalo rituálům nemocných obsedantně-kompulsivní poruchou, kteří se těmito rituály zbavují úzkosti. Obsedantně-kompulsivní poruchu lze poměrně úspěšně léčit serotoninergními antidepresívy. To je teoretickým vysvětlením, proč je opakované užívání drogy často kompulsivním chováním a proč jsou antidepresíva někdy účelná při léčbě závislosti. Tak jako rituál snižuje úzkost, tak je požití drogy obranou proti nepříjemnostem odvykacího syndromu. * V dalším textu se budeme věnovat roli jednotlivých neurotransmitérů při rozvoji závislosti. Dopamin je neurotransmitér, zajišťující promptní reakce na nové stimuly, iniciativu a spontaneitu. Morfologické struktury mozku, které se nejvíce podílejí na dopaminergní neurotransmisi (průběh nervové aktivity zprostředkované doapminem) jsou mesokortikolimbické dráhy. Nervové dráhy, které jsou podkladem pro positivní posilování (živočich má tendenci opakovat chování, které provází tuto nervovou aktivitu), se koncentrují v dopaminergním spojení mezi ventrálním tegmentem v mozkovém kmeni a nucleus accumbens , který je části basálních ganglií. Aktivace těchto drah je zpravidla prožívána jako příjemná. Je-li vystupňována, může být spojena s neklidem a může provokovat i hostilitu a agresivitu. Neklid může být u některých lidí spojen s napětím a úzkostí. Ke zvýšení dopaminergní aktivity dochází aspoň v určité fázi rozvoje téměř všech závislostí a je zpravidla považována za hlavní článek usnadňující její vznik. Role dopaminu je o to zajímavější, že nejenže řada drog podporuje nebo zvyšuje jeho účinek, ale že se dopamin pravděpodobně podílí na vytváření takových rysů osobnosti, které jsou časté u lidí, kteří se stávají na drogách závislými. Jde o lidi, kteří rádi vyhledávají situace, při kterých se děje něco nového. Jsou zvědaví a zvídaví, rádi experimentují a nebojí se riskovat. Jde o chování vyhledávající sensaci nebo nové prožitky (sensation seeking behavior).
71
Dopamin dodaný drogou tak sytí jejich hlad po tomto neurotransmitéru stejně jako ho sytí dobrodružné setkání s něčím nečekaným. Začátek experimentování s drogami bývá také chováním směřující k nalezení něčeho nového, senzačního. Tendenci vyhledávat nové prožitky se projevuje ve čtyřech oblastech: touha po napětí a dobrodružství, touha po silných prožitcích, desinhibice (odbrzdění) určitých aktivit a snížená tolerance nudy. Dopamin má dominantní úlohu v první dimensi třídimensionálního psychobiologického modelu osobnosti podle C.R.Cloningera, která je charakterizována tendencí vyhledávat nové. Lidé s tímto povahovým rysem rádi cestují, věnují se hudbě a jiným uměním, snaží se o stimulaci v sociální oblasti seznamováním se se stále novými lidmi, pořádají večírky, mění často sexuální partnery. Tito lidé rádi skáčou s padákem, potápějí se do moře, závodí na motocyklech, pěstují bojové sporty a hrají hazardní hry. Někdy vidíme, že člověk závislý na droze dokáže aspoň dočasně zaměnit drogu za intenzivní činnost uměleckou nebo za jinou vysoce kreativní práci a pokud se jí intenzivně věnuje – a zvláště dokud je tato aktivita pro něho uspokojivá a vede k úspěchu – drogu nepotřebuje. Droga je jen jinou cestou vedoucí ke zvýšení vytoužené dopaminergní hyperaktivity, než je vyhledávání senzací. Droga a prožívání dobrodružného nebo i kreativního napětí jsou vzájemně zaměnitelné. Drogu volí spíše lidé s jednoduchou genetickou anomálií, variantní podobu genu pro dopaminový receptor D2 označovaný jako alela A1 Závislost je z tohoto hlediska důsledkem syndromu narušené závislosti na odměně (viz Hoschl, 1996). Dopamin spouští chování, které je důležité pro přežití druhu jako je přijímání potravy, pití a sexuální aktivity. Toto chování musí být spojeno s libostí, která se pak stává motorem pro positivní posilování. Jakmile dojde k ukojení, nastoupí pocit sytosti, která celý proces zastaví. Jestliže se však farmakologickým zásahem zvýší koncentrace dopaminu (např. blokádou zpětného vychytávání kokainem) v synapsi, je potlačen pocit nasycení a přetrvává aktivita nervových drah, které způsobují neustálou touhu znovu užít drogu (craving). Nora Volkowová et al. (1997) našla, že místem, kde dochází k maximálnímu efektu kokainu a ke zvýšení koncentrace dopaminu není n.accumbens, nýbrž thalamus, tedy místo, které filtruje sensorické podněty před jejich příchodem do mozkové kůry a dodává jim afektivní náboj. Opakované dlouhodobé požívání drogy vede k adaptaci specifických buněčných a molekulárních mechanismů. Při chronickém podávání se začínají rozvíjet takové adaptace, které jsou obranou proti akutním účinkům drogy. Tyto adaptace se odehrávají na místech primárního účinku drogy nebo v dalších systémech, které reagují na tyto primární adaptace, tedy zpravidla v jiných neurotransmitérových systémech (Koob et al. 1993). Chronická exposice drogám vede ke změnám v expresi genů a to způsobuje změny ve funkcích receptorů v místech centrálního nervového systému, která regulují chování. Tyto adaptace zůstávají aktivní i v okamžiku, kdy se droga přestane podávat. Dochází ke změnám v motivačních systémech v tom smyslu, že zúží repertoár, ze kterého může jedinec volit mezi stimuly, které uspokojují jeho touhu po novém a senzačním. Jednoznačně se začne dávat přednost droze před jinými formami chování vedoucími k odměně, což je jedním z hlavních znaků patřícím k příznakům závislosti podle diagnostických manuálů (American Psychiatric Association 1994). To nakonec vyústí ve ztrátě kontroly nad užíváním drogy a lze to ukázat i na modelech chování laboratorních zvířat (Markou et al. 1993). Neuroadaptace na opakované podávání drogy vede k tomu, že po jejím odebrání (např. při závislosti na stimulancia, opiáty a alkohol) dochází k poklesu dopaminergní neurotransmise v limbické oblasti mozku. Stimuly, které přináší život bez drogy, nemohou vést k tak vydatnému uvolňování a syntéze dopaminu, jako to činila droga.
72
Noradrenalin je neurotransmitér, který se syntetizuje z dopaminu. Už s tím může souviset skutečnost, že jeho psychotropní účinky jsou podobné jako u dopaminu. Hlavní jeho roli lze spatřovat v regulaci psychomotoriky, kterou urychluje. Je také neurotransmitérem důležitého neuronálního okruhu podílejícího se na biologii odměny mezi locus coeruleus a hipokampem. Význam noradrenalinu v patofysiologii závislosti se dnes vidí především v regulaci stavů vznikajících při odebrání drogy. Morfologickým substrátem je právě locus coeruleus. Aktivita v tomto místě je vysoká zvláště při odvykacím syndromu při závislosti na opiátech a na alkoholu,. Serotonin je látkou regulující impulsivitu a afektivitu. Neporušené serotoninergní neurotransmise brzdí impulsivitu, zabraňují vzniku deprese a některých úzkostných poruch. K těmto úzkostným poruchám patří i obsedantně-kompulsivní porucha. Rys nutkavosti provázející závislost dokládá důležitost serotoninu při rozvoji a udržování této poruchy. Při deficitu serotoninových neurotransmisí dochází také k impulsivitě, která může provázet ztrátu kontroly nad užíváním drogy. Acetylcholin je neurotransmitérem zajišťujícím většinu neurotransmisí podílejících se na vědomé motorické činnosti. Je látkou potřebnou pro kognitivní (intelektové) funkce. Deficit acetylcholinových neurotransmisí je příčinou desorientace, event. deliria, dojde-li k němu akutně, a demence, jde-li o deficit chronický a dlouhodobý. Abstinenční syndrom po nikotinu vede ke zkrácení latence před nástupem REM spánku doba spánku provázeny rychlými pohyby očí pod zavřenými víčky, při které máme sny) po usnutí a k častějším REM cyklům během noci. Je to způsobeno hypersensitivitou postsynaptických muskarinových receptorů (Sitaram et al. 1979). Podobné změny lze najít u deprese a u modelu mírného chronického stresu u laboratorních zvířat (Breslau a Davis 1986). Je přirozené, že acetylcholinové neurotransmise jsou aktivovány nikotinem a sníženy při odvykacím syndromu. Gamma-aminomáslená kyselina (GABA) Benzodiazepiny, léky které se užívají při léčbě úzkosti, vysokého svalového napětí, záchvatů křečí (např. při epilepsii) a nespavosti, usnadňují GABA-ergní neurotransmise. Při odebrání benzodiazepinů nebo alkoholu dochází k opaku – ke snížení GABA-ergní aktivity, což se projevuje úzkostí a nespavostí. GABA-receptory jsou umístěny také na dopaminergních neuronech ve ventrálním tegmentu a tak se může zvýšení GABA-ergní neurotransmise podílet na positivním posilování zprostředkovaném dopaminem. Kortikotropin-releasing faktor (CRF, kortikoliberin) je peptid syntetizovaný v hypothalamu, v korových oblastech limbického systému a v některých jádrech mozkového kmene. Je uvolňován ve stresu podobně jako serotonin.
73
Podle některých teorií předchází uvolnění serotoninu sekreci CRF a díky positivní zpětné vazbě je sekrece CRF zase podnětem k dalšímu uvolňování serotoninu. Tuto řadu lze ještě prodloužit, poněvadž na nový podnět reaguje mozek aktivací dopaminovou. CRF se může podílet na positivním posilování, jak je to zřejmé v situacích, které jsou spojeny se stresem (nebo spíše s tzv. eustresem, což je stav stresu, který si člověk sám úmyslně způsobuje), např. při sportovním běhu nebo v sauně. Pokud se někdy opakované vystavování se takovým činnostem nebo situacím přirovnává k závislosti, pak zde pravděpodobně neplatí, že by docházelo k patologické adaptaci. Odvykací syndrom při většině drogových závislostí je totiž také spojen se zvýšenou sekrecí CRF. Tato patologická adaptace vede k porušení homeostázy, což je systém udržující stabilitu ve fysiologických mezích. U drogové závislosti je homeostáza nahrazena allostázou, která udržuje stabilitu cestou změn v neurobilogických sytémech odměny, které fysiologické meze překračují. Neurotransmitéry odměny, dopamin a opioidy (látky s podobným účinkem jako opium nebo morfin) mají omezenou schopnost udržet funkce vedoucí k „odměně“ v hranicích homeostázy. Allostáza je pokusem zachovat prožitky hedonie (radosti, dobré pohody, slasti) za cenu překroční hranic homeostázy. Chronické užívání drogy vede postupně ke změnám které :navozují posun v subjektivních zážitcích po podání drogy od libosti k potřebě drogy (drug liking vs. drug wanting). Pacient se v podstatě marně snaží dosáhnout normálního hedonického stavu. Jeho systém odměny musí pracovat stále namáhavěji za cenu vyčerpání reserv. Dosud popsané změny ukazují, že při rozvoji závislosti dochází k orgaaickým změnám, mozek se reorganizuje nejen funkčně, nýbrž i organicky. Výstižný je zde termín „rewirining“, tedy „předrátování“ To ste týká především dvou struktur odměny, 1 komplexu mesolimbické oblasti- accumbnens-amygdala 2 komplexu frontální kůra-cingulum spojeného se striátem a palidem Obě tyto oblasti jsou aktivovány drogou a jejich sensitizaci lze prokázat po chronickém podávání drog laboratorním zvířatům na řezech tkáně striáta in vitro. Okolnosti, za kterých se droga podává, modulují sensisitizaci. Tak např. indukce změn genů závisí na prostředí, ve kterém se droga podává. Záleží na tom, zda potkan dostává opakovaně drogu ve všedních laboratorních podmínkách nebo v bohatém prostředí, které je pro něho zcela nové. Jen v novém pro zvíře nezvyklém prostředí dojde k indukci c-fos mRNA pro dopaminový D2 receptor (Badiani et al. 1998), což zřejmě nastartuje proces vedoucí k morfologickým změnám. Lze to pokládat za analogii vlivu sociálního prostředí party, disko-klubu atd. při spouštění závislosti u lidí. * Řada účinků mnohých drog po akutním jednorázovém podání i při podání opakovaném se podobá účinkům antidepresív. Naopak, při abstinenčním syndromu dochází k podobným změnám, jaké známe při depresích. Vedlo to A. Markou et al. (1989) k hypotéze, že užívání drog je často jakýmsi samoléčením lidí, kteří jsou v jistém smyslu depresivní. Jedním z nejdůležitějších biologických markerů deprese je vysoká koncentrace hormonu nadledvinek kortisolu v krvi, tedy hormonu, který provází stres. Není vyloučeno, že posedlost vyhledáváním nového je spojena s chronickým stresem a to tyto lidi činí fragilními pro vznik deprese, kterou léčí workoholismem a – drogami. Serotoninergní antidepresíva mohou pomoci léčit obé.
74
Vliv na rozvoj drogových závislostí mají také pohlavní hormony. Ženy jsou mnohem citlivější na drogy než muži a jejich citlivost se mění v průběhu menstruáčního cyklu. Může to souviset se psychosociálními faktory jako jsou psychotraumatizace sexuálním zneužitím v dětství a s tím související častější frekvence deprese a posttraumatické stresové poruchy. Žena bývá často obětí násilnosti ze strany partnera. Už proto může žena hledat únik a pomoc v drogách. Na druhé straně je známo, že toxicita kokainu je nižší u žen ve srovnání s muži. Ženy léčené pro závislost se častěji než muži vracejí k užití kokainu po negativních emočních zážitcích, zatímco muži spíše po positivních emocích spojených se společenským úspěchem (Stocker, 1998). * Neurobiologické mechanismy vzniku a udržování závislosti se u jednotlivých typů závislosti liší. Proto nyní budou probrány každý zvlášť. Nikotin Když si kuřák zapálí cigaretu, dojde během několika vteřin k podráždění acetylcholinových nikotinových receptorů. K „odměně“ tedy dochází rychleji než po intravenósním podání drogy. Tato rychlost usnadňuje vzni závislosti. Kuřák tak velmi rychle pocítí příjemné zvýšení nabídky představ, lépe se mu vybavuje z paměti, lépe se mu myslí. V akutních experimentech bylo prokázáno krátkodobé zlepšení kognitivních funkcí. Díky interakci acetylcholinových a dopaminových neurotransmisí nastane asi do 6-10 minut po začátku kouření k aktivaci dopaminových neurotransmisí, což je provázeno se zvýšením iniciativy a spontaneity. Kuřák se snaží hrát dominantní roli v interpersonálních interakcích a je proto často sociálně a ekonomicky úspěšný. Trvá-li kouření dlouho, dochází postupně ke zvýšení syntézy a uvolňování endorfinů. To je pravděpodobně chvíle, kdy se z konsumenta nikotinu stává člověk na kouření závislý. Je to také důvod, proč Světová zdravotnická organizace řadí závislost na kouření k opiátovému typu závislosti. Málokdy si uvědomujeme, že závislost na kouření je nejčastější duševní poruchou vůbec. Jeho nebezpečí souvisí také s tím, že kouření je zpravidla branou k jiným, závažnějším závislostem, alkoholismu, morfinismu, atd. Pokud jde o diagnosu a odlišení, kde je kouření ještě pouhý zlozvyk a kde už jde o závislost, bývá významné chování kuřáka, který např. hladově saje cigaretu po vystoupení z letadla nebo po opuštění divadla nebo kina, kde je kouření zakázáno, nebo zapálení cigarety ráno okamžitě po probuzení. Svědčí to pro snaze zabránit odvykacímu syndromu i po krátké abstinenci. Neuroadaptace na opakovanou stimulaci acetylcholinových neurotransmisí má za následek, že při odvykání kouření dochází k řadě příznaků svědčících pro jejich snížení a z toho resultující převahu sympatiku: zácpa, palpitace, porucha koncentrace pozornosti, dysforie (mrzutá, podrážděná nálada), netrpělivost, zvýšená chuť k jídlu, obezita, atd. Kofein je zpravidla pokládán za nevinnou drogu a risika jeho požívání pro duševní zdraví jsou většinou podceňovány. Jde o nejčastěji užívanou psychotropní látku, která patří do kulturně sankcionovaných společenských ceremoniálů. Kávu nebo čaj pije pravidelně nejméně 80 %
75
dospělých v průmyslově vyspělých zemích, „coffee break“ patří ke každému delšímu jednání. Kofein není obsažen jen v kávě a čaji, ale také v kakau, v čokoládě a v mnoha nealkoholických nápojích. Při diagnostice závislosti se pravděpodobně uplatňuje nechuť lékařů diagnostikovat závislost na drogu, kterou téměř všichni lékaři užívají. Platí zde ovšem, že sotva 3 % z konsumentů kofeinu se stává na něm závislými (u kouření je to přibližně 30 %, u alkoholu 8 %) Kofein je antagonista adenosinu. Adenosin vede k útlumu psychomotriky, má protikřečové, hypnotické, anxiolytické (zmírňuje úzkost) a analgetické účinky, vede k dilataci velkých cév, má antidiuretický účinek (snižuje sekreci moči) inhibuje uvolňování reninu (látka vznikající v ledvinách, která zvyšuje krevní tlak), žaludeční sekreci a respiraci. Teprve v poslední době je rozpoznáván jeho značný význam, který se přirovnává k významu GABA, které konkuruje jako druhý hlavní inhibiční neurotransmitér. (Deckert a Gleiter, 1990) Kofein tedy dělá opak ve všech těchto oblastech: stimuluje centrální nervový systém, má anxiogenní účinky, (napomáhá vzniku úzkosti), snižuje průtok krve mozkem, zvyšuje uvolňování reninu, diuresu (tvorbu moči), žaludeční sekreci a stimuluje respiraci. Při pravidelném užívání dochází k toleranci (musí se zvyšovat dávky, aby docházelo k očekávanému účinku). Přerušení pravidelného pití kávy vede k bolestem hlavy, únavě, ospalosti a depresi. Symptomy jdou na vrub adaptaci nervového systému na časté podávání kofeinu, která po jeho vynechání převáží, tj. vysoká aktivita adenosinu: rozšíření mozkových cév, útlum, snížení diuresy atd. Prakticky důležitá je zkušenost, že podaří-li se lékaři přesvědčit pacienta užívajícího anxiolytika, aby třeba postupně přestal pít kávu, lze snížit dávku anxiolytik na polovinu, event je vysadit. U nemocných panickou úzkostnou panickou poruchou dovede kofein vyvolat episodu paniky (Boulenger et al. 1984). Tato klinická pozorování získávají nyní teoretické zdůvodnění. Myš s odstraněným genem pro adenosinový receptor A2A (adenosine A2A receptor knockout mouse) projevuje výrazné znánky anxiosity a u samců také agresivity. Kofein tyto příznaky zesiluje (Deckert, 1998). O biologických kořenech závislosti na kofein svědčí také skutečnost (Kendler a Prescott, 1999), že velmi vysoká konsumace kávu a závislost postihuje mnohem častěji obě jednovaječná dvojčata než dvojčata dvojvaječná. Alkohol je drogou , která je podobně jako kofein v průmyslově vyspělých zemích společensky a kulturně přijímána jako součást životosprávy. Jde o protoplasmatický jed, kde je spočítáno, že 1 g zničí 100 neuronů. Vysoká konsumace může tedy vést a někdy vede k demenci (trvalejšímu poklesu intelektových, kognitivních schopnosti). Akutní podání alkoholu vede k uvolnění serotoninu, což je pravděpodobně příčinou euforie, event. oné dobře známé „spičky“. Do mezibuněčného prostoru uvolněný serotonin je však rychle chemicky rozložen a vyloučen močí jako hydroxy-indol-octová kyselina (HIAA). Přechodně dojde ke snížení serotoninových neurotransmisí, což se projevuje dysforií a depresí („kocovina“). Chronické podávání alkoholu vede k opakovanému uvolňování serotoninu a k jeho rychlé destrukci. To nakonec vyústí v chronický serotoninový deficit a depresi splňující kritéria středně těžké až těžké depresivní poruchy. Časté sebevraždy alkoholiků nejsou většinou důsledkem sociální a ekonomické degradace, nýbrž patří k příznakům této deprese.
76
Vedle serotoninu má při účinku alkoholu význam také GABA. S tím souvisí tlumivý vliv alkoholu a nespavost a úzkost, které provázejí abstinenční syndrom. Jedním z nejvážnějších následků abstinence po vysoké dlouhodobé konsumaci alkoholu je delirium tremens. Je tedy patofysiologicky vysvětlitelný příznivý vliv léčby benzodiazepiny u této život ohrožující nemoci. Podrobně je studována role genetických faktorů u alkoholismu. Ukazuje se, že synové alkoholiků jsou vystaveni nejméně třikrát vyššímu risku vzniku závislosti na alkohol než ostatní lidé. Kandidáty na geny zodpovědné za toto risiko jsou geny pro syntézu enzymů zodpovědných za degradaci alkoholu, alkohol-dehydrogenáza a aldehyd-dehydrogenáza. Později se pozornost obrátila k sekvencím DNA, které jsou zodpovědné za syntézu dopaminových D2 receptorů, především k menší alele D2 dopaminového receptoru (Blum et al. 1990). Tyto nálezy v byly některých studiích potvrzeny, v pozdějších a metodologicky přísnějších však vyvráceny. Nadějnější je dnes výzkum serotoninergních struktur. Ve Finsku nalezli Nielson et al. (1994) u impulsivních alkoholiků korelaci mezi koncentrací HIAA (metabolit serotoninu) v likvoru a genotypem pro tryptofan-hydroxylázu, která syntetizuje serotonin z tryptofanu. Cannabis sativa je jedním druhem konopí, které je zdrojem tetrahydrocannabinolu (THC). Podle způsobu zpracování a užívání se hovoří o hašiši nebo marihuaně. THC má četné farmakodynamické účinky, které souvisí s jeho působením na četné neurotransmitérové systémy. Psychotropní účinek THC se vysvětluje zvýšením syntézy a uvolňování serotoninu, vedle toho však působí i na benzodiazepinové receptory v GABA-ergním receptorovém komplexu, čímž je vysvětlován jeho anxiolytický účinek. Kromě toho inhibuje dopaminové neurotransmise a může vést ke katalepsii. Snižuje aktivitu noradrenergní. Dalším účinkem THC je účinek anticholinergní (blokují se receptory pro acetylcholin), který je pravděpodobně zodpovědný za poruchy paměti, které se při pravidelném delším užívání prohlubují až do obrazu těžké demence. V mozku potkanů byl popsán specifický receptor pro cannabinoidy, po jehož obsazení dochází k aktivaci systému druhých poslů (second messengers, látky, které pomáhají přenášet nervový vzruch po nervovém vláknu po obsazení receptoru v synapsi neurotransmitérem), který inhibuje adenylátcyklázu. Před 5 lety byl objeven specifický antagonista THC, po jehož podání dochází k výraznému abstinenčnímu syndromu u potkanů. K závislosti dochází v důsledku positivního posilování, není však vysvětleno, prostřednictvím kterého neurotransmitérového systému. Abstinenční syndrom je mírný: neklid, podrážděnost, nespavost, nechutenství, nausea, průjem, pocení, třes a deprese. Je velmi závažné, že abstinenci lze předejít heroinem. Překupníci toho využívají tak, že po delší čas zásobují své zákazníky poměrně lacinou marihuanou, pak dodávku náhle zastaví a místo marihuany nabídnou heroin. Není také jasné, jakým mechanismem dochází k psychotickým stavům, k maladaptivnímu chování a k deliriu. Často se popisují úzkostné poruchy, panická úzkostná porucha, fobie a obsedantně-kompulsivní porucha. Při důkladnějším šetření se však zpravidla ukáže, že tyto poruchy už předcházely užívání marihuany. Stejně je to v případě schizofrenie, která je často se závislostí na THC spojena.
77
Kokain způsobuje intensivní euforii, což je příčinou positivního posilování. Vedle euforie vede kokain k psychomotorické stimulaci, která bývá spojena s úzkostí. Kokain se užívá v prášku, který se šňupe. Jindy se připravuje zvláštní gel, který se kouří. Jsou také formy kokainu, které se aplikují intravenosně. K závislosti dochází velice rychle, ta je pak spojena s vážnými problémy v rodinném soužití, legálními problémy a problémy v zaměstnání. K neurobiologickým změnám patří především uvolňování dopaminu a blokáda jeho zpětného vychytávání, což zase přispívá ke zvýšení koncentrace dopaminu v synaptické štěrbině. To se odehrává především v mesolimbické a mesokortikální oblasti, tedy v místě, které je zodpovědné za rozvoj positivního posilování. Opakované užití kokainu vede k mohutné neuroadaptaci, která způsobuje po vynechání kokainu vážné abstinenční příznaky. Ty jsou opakem účinku kokainu, tedy dopaminová hypoaktivita vedoucí k depresi, podrážděnosti a úzkosti: Abstinence po delším užívání kokainu je spojena s těžkou anhedonií (neschopností prožívat radost). Nové světlo do oblasti výzkumu mechanismů, které vedou k nadměrně touze nebo bažení (craving) po droze vnášejí moderní zobrazovací techniky funkcí mozku, které umožňují sledovat chemické změny v různých částech mozku vyšetřovaného člověka, jejich krevní zásobování, spotřebu glukosy a kyslíku. Positronová emisní tomografie (PET) a nukleární magnetická resonance (MR) ukázaly, že u závislých na kokain se „rozsvítí“ nucleus accumbens, amygdala, dorsolaterální prefrontální kůra a cerebellum. Ukazuje se tedy, že nejen oblast zodpovědná za positivní posilování (n.accumbens), ale také oblasti mozku, které jsou zodpovědné za funkce paměti (prefrontální kůra atd.) jsou spojeny se vznikem a udržováním touhy po droze. „Rozsvícení“ znamená buď zvýšenou utilizaci glukosy nebo zvýšený metabolismus fosforu (Volkow et al. 1996). Amfetamin a další stimulancia zvyšují dopaminergní a noradrenergní neurotransmise. Urychlují psychomotoriku. Závislost zpravidla vzniká na metamfetamin nebo na další syntetický derivát 3,4-methylendioxymet-amfetamin, MDMA (Extasy), který má kromě stimulačního také halucinogenní účinek. Opakované zvyšující se dávky amfetaminu vyvolají u zdravých pokusných osob halucinatorně-paranoidní psychosu, která je z psychopatologického hlediska nerozeznatelná od schizofrenie. Psychická alterace odeznívá spontánně během 2 dní bez medikamentosní léčby, jakmile se podávání amfetaminu přeruší. Amfetamin poškozuje organicky dopaminové a serotoninové neurony, MDMA poškozuje selektivně jen neurony serotoninové. U primátů bylo prokázáno, že poškození neuronů v oblastech důležitých pro učení a paměť je ireversibilní, zatímco v oblastech regulujících spánek a chuť k jídlu dochází k výraznému obnovení růstu nervových vláken, což vede k velmi vysokému uvolňování serotoninu (Fischer et al. 1995). Phencyklidin (PCP) byl původně zaveden jako celkové anestetikum (Sernyl). Nedochází však po něm k hlubokému bezvědomí, ale k psychotickým stavům se zrakovými halucinacemi kosmického
78
charakteru, provázenými zvláštní formou extase (Ban et al. 1961). Toxikomané ho nazývají andělský prach (angel s dust). Phencyklidin obsazuje své specifické receptory v mozku, které jsou lokalizovány v iontovém kanálu patřícímu ke komplexu excitační kyseliny N-metyl-D-aspartátu (NMDA). Tím je blokován účinek glutamátu, což vede k vážné psychické poruše, především k poruchám učení a paměti. U zdravých dobrovolníků dochází po malých dávkách phencyklidinu k autismu (staženosti do sebe a k tomu, že člověk nevěnuje pozornost svému okolí), negativismu (člověk ke všem sociálním podnětům zaujímá negativní postoj), myšlení se stává bizarním, tedy k poruchám podobným, které se pozorují u schizofrenie. Podán nemocným schizofrenií vede ke vzplanutí vážnějších příznaků psychosy a zhoršení přetrvává řadu týdnů. Tolerance byla pozorována, ale prokázána je spíše po ketaminu, který má podobné účinky a dodnes se užívá při celkové anestezii. Abstinenční syndrom je charakterizován depresí, poruchami spánku a nechutenstvím. Anodyna (opioidy) jsou definovány účinkem na opioidní receptory. K opioidům patří především morfin a kodein, semisyntetické deriváty jako heroin a syntetické meperidin, methadon, fentanyl, atd. Způsobují hlubokou euforii, která přechází v apatii a později v dysforii a neklid. Abstinenční syndrom je neobyčejně závažný a může ohrozit život. Jde o nauseu, zvracení, slzení, pocení, průjem, zívání a horečky. Lze ho navodit podáním specifického antagonisty opioidních receptorů naloxonem. K závislosti dochází neobyčejně rychle, zvláště jsou-li opioidy aplikovány intravenosně. Psychotropní účinek je vysvětlován tak, že působí stejně jako endogenní ligandy (látky vznikající v organismu, které se za normálních okolností vážou na receptory) jejich receptorů, kterými jsou endorfiny. Benzodiazepiny nahradily barbiturátová hypnotika a sedativa, která se dnes už prakticky neužívají. Už proto jsou málo dostupná a neaktuální pokud jde o risiko, že by často vyvolávala závislost. Benzodiazepiny naopak zůstávájí jednou z nejčastěji předpisovanou skuinou léčiv, ke které patří např. populární diazepam. Obsazují své specifické receptory lokalizované v GABA receptorovém komplexu. Densita (hustota) benzodiazepinových receptorů roste při stresu a po podání kortikosteronu u laboratorních zvířat. Důležitá je interakce s alkoholem, který usnadňuje vazbu benzodiazepinů v mozkové kůře. U synů alkoholiků způsobuje diazepam menší změny okohybných pohybů, které jsou spolehlivými ukazateli účinků benzodiazepinů. Na druhé straně však u těchto osob způsobuje větší libost (Cowley et al. 1994). Benzodiazepiny vedou k poklesu metabolismu glukosy, zvláště v mozečku a v okcipitálním laloku, méně v thalamu, v basálních gangliích a v orbitofrontálním kortexu. Interakce s alkoholem je příčinou nebezpečných příhod, imperativního spánku až soporu (velmi hluboký spánek, ze kterého nemocného jen nesnadno probouzíme) a nebo bezvědomí, často také delirií, při kterých může docházet i k agresivním činům.na které má intoxikovaný amnesii (výpadek paměti). Využívají toho prostitutky „uspávačky“, které svému klientovi do
79
vína dají flunitrazepam (Rohypnol) a pak ho okradou. K poruchám paměti dochází při dlouhém užívání benzodiazepinů i bez interakce s alkoholem. Risiko závislosti na benzodiazepiny se dnes pokládá za méně závažné než dříve. Ukázalo se totiž, že příznaky, které se pokládaly za projev odvykacího syndromu po jejich vynechání, jsou většinou recidivou příznaků úzkostné poruchy, pro kterou byly ordinovány. Jde totiž o úzkost, třes, nespavost a nechutenství, které patří k příznakům této poruchy. K pravým odvykacím příznakům patří nausea, zvracení a křeče. Lze je vyvolat kompetitivním antagonistou benzodiazepinových receptorů, kterým je flumazenil. Náhlé vysazení vyšších dávek je však nebezpečné, poněvadž může dojít k epileptickým paroxysmům S risikem vzniku závislosti, poruch paměti a interakce s alkoholem není spojeno podávání nové generace hypnotik, zolpidemu a zopiclonu. Literatura American Psychiatric Association: Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders IV (DSM IV) Washington DC, American Psychiatric Association (1994) Badiani, A., Oates, , M.M., Day, H.E.W., Watson, S.J., Akil, H., Robinson, T.E.: Amphetamine-induced behavior, dopamine release, and c.fos mRNA expression: modulation by environmental novelty. J.Neuroscience 18, 10579-10593, 1998. Ban, T.A., Lorenz, J.J., Lehmann, H.E.: Observations on the action of Sernyl –a new psychotropic drug. Canad.Psychiatr.Ass.J. 6, 150-156, 1961. Blum, K., Noble, E.P., Sheridan, P.J.: Alelic association of human dopamine D2 receptor gene in alcoholism. J.Amer.Med.Ass. 263, 2055-2060, 1990. Boulenger, J.P., Uhde, T.W., Wolff, E.A., Post, R.M.: Increased sensitivity to caffeine in patients with panic disorder: preliminary evidence. Arch.Gen.Psychiat. 40, 1067-1071, 1984. Breslau, N., Davis, G.C.: Chronic stress and major depression. Arch.Gen.Psychiat. 43, 309-314, 1986. Cowley, D.S., Roy-Byrne, P.P., Radant, A.: Eye movement effects of diazepam in sons of alcoholic fathers and male control subjects. Alcohol Clin.Exp. Res. 18, 324-332, 1994. Deckert, J., Gleiter, C.H.: Adenosinergic psychopharmaceuticals: just an extra cup of coffee? J.Psychopharmacol. 41, 83-187, 1990. Deckert, J.: The adenosine A2A receptor knockout mouse: a model for anxiety? Internat.J. Neuropsychopharmacol. 1, 187-190, 1998. Hoschl, C.: Syndrom narušené závislosti na odměně. Vesmír, 75, 485-489, 1996. Kendler, K.S., Prescott, C.A.: Caffeine intake, tolerance, and withdrawal in women: A population-based twin study. Amer.J.Psychiat. 156, 223-228, 1999.
80
Killam, K.F., Olds, J., Sinclair, J.: Further studies on the effects of cetrally acting drugs on the results of self-stimulation. J.Pharmacol.Exp.Ther. 119, 157-163, 1957. Koob, G.F., Markou, A., Weiss, F., Shulteis, G.: Opponent process and drug dependence: Neurobiological mechanisms. Semin.Neurosci. 5, 351-358, 1993. Markou A., Weiss, F., Gold, L.H., Caine, S.B., Shulteis, G., Koob, G.F.: Animal models of drug craving. Psychopharmacology 112, 163-182, 1993. Markou, A., Kosten, T.R., Koob, G.F.: Neurobiological similarities in depression and drug dependence: A self-medication hypothesis. 18, 135-174, 1998. Nielsen, D.A., Goldman, D., Virkunen, M.: Suicidality and 5-hydroxyindolacetic acid concentration associated with a tryptophan hydroxylase polymorphism. Arch.Gen.Psychiat. 51, 34-38, 1994. Olds, J., Milner, P.: Positive reinforcement produced by electrical stimulation of septal area and other regions of the rat brain. J.Comparative Physiological Psychology 47, 419-427, 1954. Sitaram, N., Moore, A.M., Gillin, J.C.: Scopolamine induced muscarinic supersensitivity in normal man. Changes in sleep. Psychiatry Res. 1, 9-16, 1979. Stocker, S.: Men and women in drug abuse treatment relapse at different rates and for different reasons. National Inst. on Drug (NIDA) Abuse Notes 13, (No.4) 5-6, 1998. Vinař, O.: Dependence on a placebo: a case report. British J.Psychiat. 115, 1189-1190, 1969.. Volkow, N.I., Ding, Y.-S., Fowler, J.S., Wang, G.J.: Cocaine addiction: Hypothesis derived from imaging studies with PET. J.Addictive Diseases, 15, 55-71, 1996. * Poznámka: tento článek se zabývá neurobiologií závislostí. Informace o prevenci, diagnostice a léčbě lze najít v monografii K.Nešpora a L.Csémyho Léčba a prevence závislostí. Příručka pro praxi. Psychiatrické centrum Praha, 1996. Oldřich Vinař Závěr Začátek užívání drog není ničím jiným než chemickou manipulaci mozku zdravého člověka. Mozek se tomu brání rozvojem rozvojem adaptačních procesů, na jejichž konci jsou strukturální změny umožněné expresí genů, které zajistí změny stavu a počtu receptorů. Mozek tedy přestává být organicky „normální“. Není jasné, zda jsou tyto změny reversibilní. Zpravidla však znamenají, že se ustálí nová patologická homeostáza, k jejímuž udržení je třeba, aby nemocný drogu neustále užíval. Tak lze dát zapravdu toxikomanovi, který tvrdí, že se cítí „normálně“, když užívá svou drogu.Zpravidla se však snaží ignorovat vážné risiko, že
81
pokračování v užívání drogy povede k prohlubování poškození mozku, které může vyústit v pomalou intelektovou deterioraci a demenci. Odebrání drogy vede k porušení patologické homeostázy, dané křehkou rovnováhou mezi účinky drogy a mechanismy neuroadaptace na její podávání. Tato porucha je následkem náhlého převládnutí původně obranné neuroadaptace na drogu při absenci „vetřelce“, kterým byla droga. Tato porucha se většinou projeví jednak odvykacími příznaky, po psychické stránce zpravidla depresí a anxiositou. Při rozvoji závislosti hraje klíčovou roli mechanismus positivního posilování, které se odehrává především v dopaminergních podkorových strukturách. Dopaminergní aktivace se prožívá zpravidla jako příjemná a tato libost se stává odměnou. Droga je v podstatě jakousi podvodnou cestou k této odměně, které jinak člověk dosahuje chováním vedoucím k uspokojení jeho hlavních životních potřeb: přijímání potravy a uspokojení sexuálního pudu vedoucího k zachování rodu. Risiku vzniku závislosti jsou vystaveni především lidé toužící po nových zážitcích. Tento jejich osobnostní rys může být determinován geneticky a týká se pravděpodobně určité ještě ne zcela přesně určeném posunu v jejich dopaminergních neurotransmisích. Rozdíly v mechanismech vzniku a udržování závislostí různého typu podle druhu drogy jsou dány rozdílnými interakcemi mezi dopaminovými, serotoninovými, GABA-ergními, acetylcholinovými transmisemi a transmisemi zprostředkovanými excitačními aminokyselinami. Význam biologických mechanismů pro vznik a udržování drogové závislosti nesnižuje význam faktorů sociálně-psychologických. Vzájemná interakce biologických a sociálně-psychologických faktorů může jak incidenci závislosti usnadnit, tak může risiko jejího vzniku snížit. Stres související se sociální situací snižuje práh pro výběr drogy při možnosti výběru mezi chováním vedoucím k libosti nebo odměně aktivitou v reálném světě (např. prací) na jedné straně a drogou.na straně druhé. Biologická podmíněnost vzniku a udržování drogových závislostí neznamená snížení zodpovědnosti nemocného za jejich vznik. Potravový a pohlavní pud je také biologicky podmíněn a člověk zůstává zodpovědný za své chování vedoucí k jejich ukájení bez ohledu na to, že někdo má zděděnou disposici být náruživější než jiný.
82
LARS LEKSELL A GAMA NŮŽ
Roman Liščák Švédský neurochirurg Lars Leksell se narodil v roce 1907. Jako mladík plánoval studovat
práva. Ve svých 19 letech však při jízdě prašnou cestou na svém motocyklu přehlédl na cestě
výmol a havaroval. Z pobytu v nemocnici mu zůstal hluboký dojem, zejména z chirurgů, jak
chodili v bílém na vizitu obklopeni všudypřítomnými sestřičkami. Tehdy si vzpomněl na
slova svého učitele – „Ach právo! To je většinou špína o špíně.“ Nehoda na motocyklu ho
přiblížila skutečnější životní realitě. Když se uzdravil, procházel se jednoho dne centrálním
Stockholmem a potkal svého přítele, jak kráčí s přihláškou na medicínu do Karolinska
Institutu. Impulzivně se rozhodl jít s ním. Lars Leksell byl ke studiu přijat, jeho přítel nikoliv.
Předklinické studium bylo nudné, takže téměř uvažoval o tom, že medicínu zanechá. Tyto
myšlenky rychle rozptýlilo setkání s významným švédským neurochirurgem Herbertem
Olivecronou, jehož žákem se později stal. Úmrtnost pacientů při neurochirurgických
operacích byla v té době z dnešního pohledu závratná. I když Olivecrona snížil úmrtnost
svých pacientů ze 70 % na 40 %, nebyla o drásavé zážitky, jak je popisuje Leksell ve své
biografii, nouze. Jednou dával Leksell anestezii malému židovskému chlapci z Varšavy
s oboustranným neurinomem akustiku. Operoval Olivecrona. Došlo ke krvácení, které se
nedařilo zastavit. Chlapec dýchal stále mělčeji, až přestal dýchat úplně. Když Leksell
odcházel ze sálu a procházel parkem, potkal chlapcova otce, rabína v kaftanu, s kulatým
kloboukem a loknami, jak se bledý a neklidný prochází sem a tam a čeká na výsledek
operace. Leksell ho pozdravil, ale nenašel sílu za ním zajít a říct, jak operace dopadla. Jindy,
ještě jako mladý student medicíny, byl přítomen operaci pacienta s typickou mozečkovou
poruchou chůze. Po obnažení mozečku nebyl žádný nádor viditelný, ale pacient začal být
agitovaný, křičel a snažil se slézt z operačního stolu. Olivecrona na pacienta volal – „Ležte
klidně, ležte klidně!“. Mozeček začal otékat a tlačit se z rány. To již pacient ležel bez pohnutí.
Když si Olivecrona sundával gumové boty potřísněné krví a odcházel ze sálu, řekl – „Byla to
hlavně jeho vlastní chyba, měl ležet klidně“. Takové zážitky vedly Larse Leksella
k přesvědčení, že medicína by měla usilovat o vyléčení pacienta co nejméně traumatickým a
co nejvíce bezpečným způsobem. Jeho mottem bylo, že chirurg je lidská bytost, která se může
dopustit chyby, ale přístroj musí vykonat, co se mu zadá, ale vlastní chybu udělat nesmí. Je
ale samozřejmé, že žádný nástroj nemůže být lepší než ruce, které ho používají - „Hlupák
s nástrojem je stále jenom hlupák.“
Po druhé světové válce začal Lars Leksell pracovat na svém stereotaktickém přístroji a
v roce 1949 představil svůj stereotaktický arkopolární systém. Stereotaktická neurochirurgie
83
v dnešním slova smyslu započala již v roce 1908, kdy Horsley a Clark navrhli a sestrojili svůj
stereotaktický přístroj za účelem studia mozkových funkcí u opice. Již název „stereotaktický“
definuje metodu tím, že má za úkol zasáhnout v prostoru definovaný cíl. V humánní medicíně
našla stereotaxe uplatnění až v roce 1946, kdy Spiegel a Wycis vyvinuly svůj
stereoencefalotom. Předností Leksellova stereotaktického arkopolárního systému byla jeho
jednoduchost a univerzálnost. Na rozdíl od předchozích systémů se hodil k rutinnímu využití.
Oblouk Leksellova systému drží nástroj, který je naveden do cíle v mozku snímkem
zhotoveným s nasazeným stereotaktickým aparátem na hlavě pacienta. Arkopolární systém je
založen na tom, že cíl operace je totožný se středem stereotaktického oblouku. Když je tato
podmínka splněna, je možné operační nástroj zavést kdekoliv po obvodu oblouku, případně
s obloukem podle osy rotovat a nástroj vždy zasáhne definovaný cíl.
Leksell brzy pochopil, že nástrojem připevněným na oblouk stereotaktického přístroje
může být také rentgenová lampa. Ta postupně vyšle paprsek záření z různých poloh na
obvodu oblouku, přičemž se tyto paprsky protnou ve společném ohnisku. Dávka záření
z každé jednotlivé pozice je natolik nízká, že je neškodná. Ve společném ohnisku, kde se
jednotlivé svazky paprsků kříží, se dávka sečte a vyvolá ohraničenou destrukci tkáně. Tak
položil v roce 1951 Leksell základ radiochirurgie jako stereotaktické neurochirurgické
operace, při které je nitrolební cíl po jeho stereotaktickém zaměření ohraničeně zaléčen bez
otevření lebky pomocí fokusovaného záření ze zevních zdrojů. Ohnisko vysoké dávky záření,
do kterého je zaměřeno chorobné ložisko je proti okolí dostatečně ostře ohraničeno. Mimo
toto ohnisko je pokles dávky do zdravého okolí velmi strmý, takže nevyvolá kromě
patologického cíle umístěného v ohnisku nežádoucí poškození normální tkáně.
Prvním pacientem, kterého Leksell touto metodou léčil, byl nemocný s neuralgií trojklaného
nervu a radiochirurgickým cílem bylo Gasserovo ganglion. Léčba byla úspěšná, ale bylo
zjevné, že rentgenová trubice není vhodným zdrojem záření pro dosažení dostatečné dávky
v hlubokých mozkových strukturách. Aby bylo možné radiochirurgii využít v klinické praxi,
bylo potřebné vyvinout radiochirurgický nástroj, který bude přesný, spolehlivý, jednoduchý a
praktický. Spolu s fyzikem a biologem Börje Larssonem hledal cestu, jak tohoto cíle
dosáhnout. V té době se v radioterapii právě objevil lineární urychlovač. Ten produkuje
fotonové „X-záření“ nárazem urychleného vysokoenergetického svazku elektronů na
wolframový terč. Výsledná přesnost je proto závislá na přesnosti, s jakou urychlené elektrony
bombardují tento vnitřní terč. Vytvořené fotonové záření vystupuje jako úzký paprsek, který
musí při radiochirurgické operaci okolo chorobného ložiska v mozku rotovat. Toho je
docíleno tak, že kolem pacienta musí rotovat několikatunové rameno, ve kterém se X-záření
vytváří a současně se ještě otáčí lůžko, na kterém pacient leží. Koncem padesátých a
84
začátkem šedesátých let byla stereotaktická neurochirurgie téměř synonymem pro léčbu
funkčních a pohybových poruch. Proto také Leksell původně zamýšlel používat svůj
radiochirurgický nástroj pro léčbu pouze funkčních onemocnění vytvořením malé ohraničené
nekrotické léze ve specifických mozkových jádrech nebo drahách. Aby mohla být
radiochirurgická nekrotická léze srovnatelná s podobnou lézí vytvořenou invazivním
způsobem při zanoření mozkové sondy, musel radiochirurgický přístroj pracovat
s milimetrovou přesností. Takovou přesnost soudobé lineární urychlovače neposkytovaly a
proto se ukázaly pro použití v radiochirurgii jako nepřesné, těžkopádné, nespolehlivé a proto
nevhodné.
Další možností, kterou Leksell s Larssonem zkoumali, bylo záření nabitých částic. Použily
protonová jádra tvořená v synchrocyklotronu. V té době byl již Leksell profesorem
neurochirurgie v Karolinska Institutu a Larsson ředitelem Institutu Gustava Wernera
univerzity v Upsalle. Navázali tak na průkopnickou práci Tobiase, Lawrence a ostatních
z Berkeleyovy laboratoře v Kalifornii. Leksellův stereotaktický systém pomohl zvýšit
přesnost zaměření protonového záření a spolu s Larssonem provedli řadu fyzikálních a
radiobiologických studií. Zařízení nutné pro produkci protonů je ale extrémně nákladné a
dodneška je tato technologie omezena jenom na několik center ve světě a její dostupnost pro
medicínské účely je velmi omezená.
Brzy bylo zjevné, že řešením musí být uživatelsky nenáročný přístroj a jako optimální
výsledek mnohaletého úsilí byla nakonec konstrukce gama nože, jehož první prototyp byl
hotový v roce 1967. Jeho vznik byl financován ze soukromých zdrojů. Název gama nůž
navozuje představu operačního nástroje, který neurochirurg uchopí do ruky, ale ve skutečnosti
je toto zařízení těžké téměř 20 tun. Jako zdroj záření byl zvolen radioaktivní isotop kobaltu - 60Co, jehož poločas rozpadu je 5,26 let. Při tomto rozpadu se uvolňuje elektron a dvě kvanta
gama záření. Elektron je v gama noži absorbován ještě než doputuje k pacientovi a
k chorobnému ložisku v mozku pronikne pouze fotonové gama záření, které v cílové tkáni
vyvolá radiobiologický efekt.
V prvním prototypu bylo použito 179 jednotlivých zdrojů 60Co. Přístroj je založen na
stejném principu jako Leksellův arkopolární stereotaktický systém. Zdroje radioaktivního
isotopu jsou umístěny v centrální stíněné gama jednotce a jsou hemisféricky prostorově
uspořádané. Záření, které z isotopu vyzařuje všemi směry je pomocí kolimátoru odcloněno do
úzkého svazku rovnoběžných paprsků, které se protínají ve společném ohnisku uprostřed
centrální gama jednotky. Situaci si můžeme představit tak, že se podíváme na svoji dlaň
s rozevřenými a nataženými prsty. Na konečku každého prstu je umístěn zdroj radioaktivního
85
isotopu. Prst představuje kolimátor, kterým proudí úzký paprsek záření a uprostřed dlaně se
všechny paprsky ve společném ohnisku protínají.
Pokusy na zvířatech v Larssonově laboratoři prokázali, že pomocí gama nože je možné
bezpečně vytvořit malou ohraničenou nekrotickou lézi, přičemž tkáň v okolí tohoto ložiska
zůstává normální. Pokusy prováděli zejména na kozách. Tyto pokusy na zvířatech jim
usnadňovala skutečnost, že v té době bylo ve volném čase Leksellovou zálibou farmaření.
První pacient byl léčen gama nožem ještě ve výrobní hale Studsvik Nuclear Company
v listopadu 1967, která se tak stala kuriózním operačním sálem. Je zajímavé, že i když byl
prototyp gama nože navržen pro funkční operace, indikací u tohoto pacienta byl
kraniofaryngeom, což je nádor v oblasti hypofýzy. Poté byl gama nůž instalován v soukromé
nemocnici Sophiahemmet ve Stockholmu a práce pokračovala již v méně extravagantním
prostředí.
Indikační prioritou prvních léčených pacientů byla nezvladatelná bolest při zhoubném
onemocnění a cílem bylo vytvořit malou nekrotickou lézi v thalamu. Protože otvory
výměnného periferního kolimátoru měly rozměry 3x5 mm nebo 3x7 mm, mohli být léčeny
pouze malé objemy patologické tkáně. Takový rozměr kolimátoru byl zvolen proto, aby
v ohnisku vznikla léze diskovitého tvaru, jaká se zdála optimální pro přerušení drah nebo
destrukci specifických mozkových jader. Další indikací kromě kraniofaryngeomu byl adenom
hypofýzy, neurinom akustiku a arteriovenózní malformace. První neurinom akustiku byl léčen
v roce 1969 a zástava růstu nádoru trvala až do roku 1998, kdy pacient zemřel bez souvislosti
s tímto onemocněním. První arteriovenozní malformace, kterou Leksell spolu se Steinerem
v roce 1970 léčili, byla poměrně velká. Záření proto směřovali pouze na dvě přívodné tepny.
Výsledek byl dramatický a na angiografii provedené za 2 roky se cévní malformace více
nezobrazovala. Pokus o tuto „gama ligatúru“ byl poté mnohokrát opakován, ale bez úspěchu.
Tento z dnešního pohledu náhodný úspěch přesto podnítil hledat indikace pro léčbu gama
nožem u větších cílových objemů patologické tkáně, ať už šlo o cévní malformace, nebo
nádory. To si vyžádalo konstrukci druhé generace gama nože s většími kolimátory, které
umožňovaly léčbu objemnějších cílů.
Přes silnou opozici radiačních onkologů a po překonání neuvěřitelného množství
administrativních a politických překážek, byl prototyp druhé generace gama nože instalován
v nemocnici Karolinska v Stockholmu v roce 1974. Také tento gama nůž měl 179 zdrojů
izotopu 60Co, ale průřezy periferními kolimátory byly již okrouhlé a k dispozici byly
kolimátory o průměru kolimačních otvorů 4, 8 a 14 mm. Protože doposud chyběli větší
zkušenosti s jednorázovou aplikací radiační dávky, postupoval pokrok v klinickém uplatnění
radiochirurgie pomalu. Použití více izocenter k pokrytí větších a nepravidelnějších objemů
86
vedl k vývoji počítačového programu pro plánování dávky, tak aby účinná dávka co
nejpřesněji kopírovala tvar nitrolebního chorobného cíle. V průběhu prvních deseti let
provozu gama nože byla frekvence léčených pacientů průměrně jeden týdně. V té době sám
Leksell váhal s indikací maligních nádorů k léčbě gama nožem. Měl k tomu dva důvody: za
prvé považoval biologické chování těchto nádorů za natolik nepříznivé, že nevěřil v možnost
zlepšení pacientova osudu a za druhé počet pacientů s benigními nádory, cévními
malformacemi nebo funkčními nemocemi plně vytěžovali stávající kapacitu gama nože. Po
pětiletém provozu byl první prototyp gama nože věnován profesoru Randovi v Los Angeles a
ten na něm pokračoval v experimentální práci.
Další rozvoj radiochirurgie pomocí gama nože v rozhodující míře závisel na pokroku a
vývoji neuroradiologických zobrazovacích metod. Původní uplatnění radiochirurgie ve
funkční neurochirurgii bylo dáno možnostmi radiodiagnostiky v padesátých letech. Tehdy
byla v klinické praxi k dispozici pouze roentgenová lampa a patologické intracerebrální
procesy nebylo možné přímo zobrazit. Ve funkční neurochirurgii to nebylo bezpodmínečně
nutné, protože namísto samotného cíle postačilo zobrazit standardní referenční struktury.
Takovou strukturou byla například přední a zadní komisura zobrazená při
pneumoventrikulografii a od nich se pomocí stereotaktického atlasu odvodily prostorové
souřadnice samotného operačního cíle v thalamu nebo bazálních gangliích. Zobrazení kontur
nádoru pneumoencefalografií bylo možné, i když velmi nedokonale, u neurinomu akustiku a
někdy u kraniofaryngeomu. Přímé zobrazení bylo možné pouze u arteriovenózních
malformacích díky katetrizační angiografii. Toto zobrazení je však pouze dvourozměrné.
Přímé zobrazení mozkových nádorů umožnilo v sedmdesátých letech až CT (výpočetní
tomografie). Kvalita CT snímků vhodná pro potřeby radiochirurgie byla přijatelná až na
přelomu osmdesátých let. Posledním zásadním přínosem pro radiochirurgii pomocí gama
nože bylo zavedení MRI (magnetické rezonance) do klinické praxe v polovině osmedásátých
let a její použítí pro stereotaxi od začátku devadesátých let. Přínos magnetické rezonance pro
radiochirugii lze přirovnat přínosu mikroskopu pro otevřenou neurochirurgickou operaci.
Spolu s novou generací plánovacího systému je nyní možné ozařovat pomocí gama nože
nitrolební chorobná ložiska komplikovaných rozměrů, přičemž typickým rysem pro gama nůž
je dosažení vysoké konformity dávkové distribuce. To znamená, že ozáření je ušito na míru
patologickému procesu a účinná dávka záření je v prostoru téměř totožná s tvarem
chorobného ložiska a padne mu jako těsný oblek.
Protože se radiochirurgická léčba provádí bez otevření lebky, je zjevné, že patologický
proces není z hlavy odstraněn a nelze se pokochat nádorovou tkání spočívající na stolku
instrumentářky. Cíl léčby musí být proto definován jinak, než u otevřené neurochirurgické
87
operace. U funkční operace je však cíl stejný – vytvoření malé nekroticé léze. U tumorů je
cílem radiochirurgie usmrtit nádorovou buněčnou populaci a tím nádor sterilizovat a
inaktivovat. Je to v protikladu hluboce zakořeněné představě každého chirurga – vždy když je
to možné, nádor odstranit. Faktem ale je, že trvalé zastavení růstu nádoru je pro pacienta
stejně hodnotný výsledek, jako jeho odstranění. Pakliže je tohoto cíle dosaženo s nulovou
mortalitou a minimální morbiditou, je to výsledek naopak ještě hodnotnější. U
arteriovenozních malformací je cílem radiochirurgické léčby úplná obliterace patologických
cév, ke které dochází s latencí 1-3 roky po ozáření.
Jak bylo řečeno na začátku, Leksell snil o atraumatické léčbě v dobách, kdy výsledky
neurochirurgických operací byly většinou tristní. Od té doby pokračoval pokrok také
v samotné neurochirurgické operativě a mikrochirurgické zákroky jsou dnes na vyspělých
pracovištích zatíženy jen několikaprocentní mortalitou. Přes to pokračuje vzestup
radiochirugie ze tří důvodů. Za prvé ani dnešní pokročilé možnosti mikrochirurgie
neumožňují s přijatelným rizikem operovat všechny nemocné, zejména v
případě patologického procesu v hlubokých mozkových strukturách, které jsou naopak pro
gama nůž snadno dosažitelné. Za druhé, ne každý houslista je virtuóz a ne všechna
neurochirurgická pracoviště mají mortalitu jednocifernou. Samozřejmě takové výsledky se
obvykle nepublikují. Za třetí, i při dokonalé mikrochirurgii jde vždy o náročný a zatěžující
výkon, z kterého má pacient strach. Radiochirurgie je naopak neinvazivní, má ambulantní
charakter a poté co pacient opustí lůžko gama nože, může ihned pokračovat v životním
režimu, jaký měl před léčbou. Radiochirurgie nezná pojem pooperační rekonvalescence.
Pracoviště profesora Leksella ve Stockholmu navštěvovalo mnoho zahraničních stážistů a
renomovaných neurochirurgů a mnozí z nich projevili zájem pokračovat v radiochirurgii ve
své vlastní zemi. Většinou tomu zabránili místní regulační opatření, skepticismus a problémy
s financováním. Třetí generace gama nože měla již 201 zářičů a k dispozici kolimátory o
průměru 4, 8, 14 a 18 mm. Tento gama nůž byl instalován v roce 1985 v Argentíně v Buenos
Aires. Čtvrtý gama nůž byl určen pro Anglii a v témž roce instalován v Sheffieldu. Po stáži ve
Stockholmu v roce 1980 se L.Dade Lunsford z Pittsburghu rozhodl, že gama nůž získá pro
použití ve Spojených státech. Prototyp gama nože věnovaný profesoru Randovi povolili
americké úřady používat pouze k experimentálním účelům. Poté, co padlo rozhodnutí
zakoupit gama nůž do Pittsburgské univerzitní nemocnice v roce 1984, trvala realizace tohoto
projektu 3 roky a gama nůž byl uveden do provozu v roce 1987. Profesor Lunsford popisuje
tento proces jako frustrující boj s regulačními nařízeními a neváhal si postěžovat, že zavedení
nové technologie v USA nikdy není lehké. Nástup devadesátých let se již nese ve znamení
88
explozivního rozšiřování této metody a počet pacientů léčených gama nožem roste na celém
světě exponenciálním růstem.
Do tehdy ještě Československa dorazila tato progresivní léčebná metoda v roce 1992.
Způsob, jakým byl gama nůž v naší republice pořízen, je ve světě zcela ojedinělý a z dnešního
pohledu je až neuvěřitelné, že se něco takového podařilo. Vše začalo v roce 1990, kdy byl
v Karolinské nemocnici ve Stockholmu operován gama nožem dvanáctiletý slovenský
chlapec Míša. Jeho léčení bylo umožněno díky sbírce organizované Nadací Charty 77 ve
Stockholmu. Brzy po této operaci se na Nadaci obrátili s žádostí o pomoc další lidé, pro které
byl gama nůž jedinou nadějí. Tehdejší vedení ministerstva zdravotnictví a neurochirurgové
projevili velký zájem o získání tohoto přístroje a tak Nadace Charty 77 společně s Výborem
dobré vůle Olgy Havlové zahájili národní sbírku na nákup tohoto výjimečného zařízení, jehož
cena tehdy činila 90 milionů korun. Sbírka vyhlášená na jaře 1991 měla ohromující ohlas a
přispěli téměř dva miliony českých a slovenských občanů a tisíc podniků a pomoc přišla také
ze zahraničí. Tak jako téměř všude ve světě, i u nás se zvedla opoziční vlna radiačních
onkologů. Protože však šlo o financování z nadačních a nikoliv rozpočtových prostředků,
vyšel tento lobbyistický pokus naprázdno. Výrobní číslo gama nože, který byl instalován
v pražské nemocnici Na Homolce je 37, a do konce roku 1999 na něm bylo provedeno 2684
radiochirurgických operací. Provozní náklady na léčení těchto pacientů v Praze stály naše
zdravotnictví kolem 100 milionů korun. To je asi polovina nákladů, které by si vyžádalo
operování otevřeným způsobem. Kdyby se měl tento počet nemocných léčit gama nožem
v zahraničí, náklady by tvořily téměř 2 miliardy korun.
Lars Leksell zemřel náhle v roce 1986 ve věku 78 let během procházky na zdravotní
dovolené ve Švýcarských Alpách. Až do konce byl plně zaujat tvůrčí prací a ještě krátce před
smrtí telefonicky navrhoval svému synovi další technické nápady rozvíjející se
radiochirurgické metody. Smrt ho zastihla v době, kdy si radiochirugie teprve ztěžka a pomalu
získávala mezi neurochirurgickými postupy svoji pozici. Jak vzpomíná Olaf Backlund na
slova svého učitele: „Stěží si lze představit konzervativnější bytost, než je zavedený chirurg.“
Kdyby Lars Leksell žil dnes, asi by byl současným stavem radiochirurgie pomocí gama nože
velmi překvapen. V současné době je na celém světě v provozu více než 130 gama nožů a
každý měsíc se instaluje nejméně další jeden. Ročně se nyní gama nožem léčí 20 000 pacientů
a celkový počet léčených pacientů tímto přístrojem přesáhl 100 000. Křivka znázorňující
roční počet léčených nemocných stále pokračuje v exponenciálním růstu a prognózy
předpokládají, že během 10-20 let se v některých indikacích, jako je například neurinom
akustiku poměr mezi otevřenou neurochirurgickou operací a radiochirurgickou léčbou obrátí a
léčba gama nožem bude převažovat. Mimo to se otevírají stále nové možnosti pro uplatnění
89
této léčebné metody a na pražském pracovišti je například prioritní použití gama nože v léčbě
jinak nezvladatelného očního glaukomu.
Ideálním cílem medicíny je vyléčení pacienta se 100 % účinností a s nulovým rizikem.
Radiochirurgie pomocí gama nože tímto ideálem není. Představuje ale další krok na cestě
lidského génia za tímto ideálem a odráží úroveň medicínského poznání v neurochirurgii na
přelomu tisíciletí.
MUDr. Roman Liščák, CSc.
90
Stereotaktická radiochirurgie pomocí Leksellova gama nože.
Roman Liščák
Koncept radiochirurgie vyslovil ve svém sdělení Lars Leksell v r. 1951, ale cesta k prvnímu klinicky využitelnému radiochirurgickému nástroji, kterým je gama nůž trvala 16 let. Radiochirurgie je způsob stereotaktické neurochirurgické operace, při které je dosaženo žádoucího biologického efektu v cílovém objemu normální nebo patologické intrakraniální tkáně bez otevření lebky aplikací jedné dávky kolimátory usměrněného záření úzkých svazků paprsků z mnoha hemisféricky rozložených zevních zdrojů radiačního záření. Zatímco dávka záření jednotlivého svazku paprsků je relativně nízká, v ohnisku, kde se svazky paprsků protínají se tyto dávky sčítají. Dávka v ohnisku je vysoká a vyvolá v živé tkáni biologickou odpověď, dávka vyvolaná jednotlivým svazkem paprsků signifikantní biologickou reakci nevyvolá. Dávkový gradient mimo ohnisko, ve kterém se svazky paprsků protínají, v rozmezí několika milimetrů do okolí velmi prudce klesá. Pokud do ohniska umístíme cíl, který chceme při radiochirurgické stereotaktické operaci postihnout, vytvoříme při vhodné dávce ostře ohraničenou lézi, přičemž okolní tkáň je šetřena. V této ostře ohraničené lézi tkví i původ názvu "gama nůž", protože ohraničenost léze koresponduje s chirurgickou představou ostrého zásahu skalpelu.
Záření používané v radiochirurgii je buď fotonové nebo tvořeno nabitými částicemi. Fotonové záření je využito v radiochirurgii pomocí gama nože nebo lineárního urychlovače. V případě gama nože vzniká fotonové "gama záření" rozpadem nestabilního isotopu prvku Co60, zatímco v případě lineárního urychlovače vzniká fotonové "X-záření" nárazem urychleného vysokoenergetického svazku elektronů na wolframový terč. Záření nabitými částicemi, v radiochirurgii jsou to protonová jádra nebo ionty Helia, je tvořeno pomocí synchrocyklotronů a je vázáno na fyzikální výzkumná centra vlastnící tato zařízení.
Bezprostředně po skončení radiochirurgického výkonu nelze v ozářeném objemu detekovat žádnou makroskopickou ani mikroskopickou změnu, protože změny probíhají teprve na molekulární úrovni. Ve zlomcích sekundy probíhají fyzikální změny v atomových jádrech vedoucí ke vzniku volných radikálů anebo přímému poškození DNK. Tyto změny v závislosti na dávce vedou k buněčné smrti. Ta nastane velmi brzy v buněčné populaci, která se rychle dělí, ale v populaci s pomalým růstem dojde k buněčné smrti s odstupem několika měsíců i let. Protože buněčné přežívání je radiobiologicky definované jako schopnost buňky dále se dělit a tvořit kolonie dceřinných buněk, pod buněčnou smrtí nechápeme pouze vznik koagulační nekrózy, ale i ztrátu reprodukční integrity buňky, přičemž životaschopnost a další funkce buňky mohou být zachovány. Z tohoto pohledu je potřebné hodnotit i průběh hojení po radiochirurgické léčbě, protože u mnoha případů nádorových onemocnění je výsledným efektem radiochirurgické léčby nikoliv úplná nekroza, ale sterilizace nádoru. To znamená, že nádor dál neroste a nemění svou velikost.
U funkčních onemocnění CNS je cílem radiochirurgické léčby vytvoření malé ohraničené koagulační nekrosy v thalamických jádrech nebo na specifickém místě nervových drah. Zvláštní kapitolu funkční radiochirurgie tvoří supresivní léčba hormonální hypersekrece adenomů hypofysy.
U benigních nádorů, z kterých jsou nejčastější neurinomy akustiku a meningeomy, je cílem radiochirurgické léčby zastavení růstu nádoru. To je dosaženo výše popisovanou buněčnou smrtí, která může vést k nahrazení tumorosní tkáně fibrotickou nebo nekrotickou tkání. Na kontrolních neuroradiologických vyšetřeních při kontrolách vidíme "vyhaslý nádor", který
91
svůj objem nezvětšuje, nebo se dokonce částečně svrašťuje. Významným podílem na kontrole nádorového růstu může být radiační poškození cévního zásobení tumoru.
Arteriovenózní malformace po radiochirurgickém ozáření jejího kapilárního nidu obliterují v průběhu 1-3 let. Tím dojde k eliminaci rizika krvácení z malformace a normalizaci lokálních hemodynamických poměrů.
Primární maligní cerebrální tumory tvoří pro radiochirurgickou léčbu nevyhraněnou indikační skupinu. Zásadním problémem jejich radiochirurgického ošetření je infiltrativní růst za hranice, které jsou viditelné při neuroradiologickém zobrazení. To je v protikladu s ostře ohraničenou dávkovou distribucí, která je pro radiochirurgii charakteristická. Jako nejvhodnější se prozatím jeví radiochirurgie jako "boost" terapie v kombinaci s frakcionovanou radioterapií.
Cerebrální metastázy jsou proti primárním maligním nádorům dobře ohraničené a radiochirurgie je nezatěžující terapií s malou morbiditou a nulovou mortalitou, která zlepšuje pacientům kvalitu a délku přežívání. Často lze pozorovat, že se po radiochirurgické léčbě metastáza výrazně svraští nebo zcela vymizí, i když je ke konvenční frakcionované radioterapii rezistentní (melanom, Grawitzův tumor).
Leksellův gama nůž: Název gama nůž navozuje představu operačního nástroje, který neurochirurg uchopí do ruky, ale tento název je pouze registrovanou obchodní známkou firmy Elekta Instruments pro zařízení téměř 20 tun těžké -obr.1. Leksellův gama systém tvoří 5 hlavních komponent - radiační jednotka se zdroji Co-60, operační stůl s kolimátorovými helmicemi, kontrolní panel s elektrickým ovládacím systémem, stereotaktické instrumentarium a plánovací systém.
Radiační jednotka obsahuje 201 zdrojů záření izotopu Kobalt-60. Každý z 201 kobaltových zdrojů je tvořen sloupcem 11-13 kobaltových disků o průměru a výšce l mm. V době plnění je celková aktivita 5400-6600 Ci a dávkový příkon v ohnisku je přibližně 4 Gy/min. Poločas rozpadu Co60 je 5,26 roků. Rozpadem nestabilního isotopu Co60 se uvolňuje elektron a dvě kvanta gamma záření.Většina elektronů je absorbována, než dosáhne intrakraniálního cíle, ale gama fotony mají dostatečnou energii (1.17 MeV a 1.33 MeV) aby penetrovali tkání až k cíli uloženému v hloubce. Použité zdroje záření je potřebné asi po 10 letech vyměnit, protože dávkový příkon klesá a ozařovací časy by byly neúměrně dlouhé. Výměna zdrojů za nové je sice nákladná, ale ekologicky naprosto bezpečná, protože zdroje se recyklují a dodavatel si je odebírá zpět.
Zdroje jsou umístěny v hemisférické centrální jednotce o průměru 400 mm na 5 kružnicích, které jsou od sebe odděleny úhlem 7,5 stupně. Toto uspořádání zaujímá v podélné ose prostor, ve kterém je aplikována iradiace o úhlu asi 36 stupňů a při otevření gama jednotky žádný ze svazku paprsků z ní nevychází přímo do prostoru ozařovny.
Svazek paprsků z každého jednotlivého zdroje Co60 je usměrněn kolimátorem, který je tvořen stacionárním kolimačním systémem umístěném v centrální gama jednotce, a výměnným koncovým kolimátorem umístěným v kolimační helmici. Pokud je kolimační helmice v terapeutické pozici zasunuta uvnitř centrální gama jednotky, každý kolimátorový otvor tvoří kónický kanál s kruhovitým průřezem. Ohnisko je lokalizované uprostřed prostoru, ve kterém se protínají osy všech kolimačních kanálů. Každý svazek paprsků kolimovaný jednotlivým kanálem konverguje do společného ohniska v centru polosférické radiační jednotky s přesností 0,3 mm. Centrální kolimátor je tvořen 65 mm silným wolframovým primárním kolimátorem a 92.5 mm silným olověným kolimátorem. Koncové kolimátory v kolimátorové helmici jsou z 96% wolframové slitiny a jsou 60 mm silné.
92
Koncový kolimátor v helmici může být nahrazen zátkou, která příslušný svazek paprsků odstíní. Toho je využíváno k zaslepení svazků paprsků, které by procházely oční čočkou, nebo zaslepením více kolimátorů může být optimalizován tvar isodos v ohnisku.
Na kraniálním konci operačního lůžka gama nože jsou podpěry pro kolimátorovou helmici. K příslušenství patří 4 helmice tvaru přílby, které obsahují periferní kolimátory s průsvitem determinujícím výsledný průměr protínajících se svazků paprsků na 4, 8, 14 a 18 mm. Váha helmice je asi 130 kg a je vyměnitelná pomocí speciálního hydraulického zvedáku. V léčebné pozici periferní kolimátory v helmici korespondují s centrálními kolimátory v radiační jednotce, na jejichž konci jsou zdroje Co60. Pouze když jsou tyto kolimátory v přesném zákrytu kontrolovaném mikrospínači, svazky gama záření se protínají v cílovém bodě.
K radiační gama jednotce je připojen operační stůl. Ten je opatřen pohyblivým lůžkem, na kterém leží pacient, s hlavou umístěnou v kolimátorové helmici. Helmice je připevněna k pohyblivému lůžku podpěrami a spolu s pacientem po otevření ozařovacího prostoru do něj zajíždí. V podpěrách nesoucích kolimátorovou helmici je 1 pár reproduktorů a mikrofon, pomocí nichž je možná komunikace s pacientem během ozařování. Pacient je dále během celého výkonu sledován pomocí televizní kamery. Gama nůž je ovládán z kontrolního panelu v přilehlé ovladovně.
Plánovací systém: Maximální intenzita záření je v centru ohniska, ve kterém se jednotlivé kolimované svazky paprsků protínají. Od tohoto bodu dávkový gradient strmě klesá a dle výpočtů a měření s fantómem je znám tvar isodos v prostoru (isodosa je spojnice bodů se stejnou dávkou). Tvar isodos závisí především na velikosti kolimátoru, t.j. na průměru otvorů v kolimátorové helmici, které determinují průměr svazku paprsků gama záření. Tvar isodosních křivek ve třech rovinách zobrazí počítačový plánovací systém.
Cílem tvorby léčebného plánu při ozáření gama nožem je vytvoření isodosy na zvoleném procentu z dávky v maximu tak, aby v prostoru přesně korespondovala s objemem ozařované patologické léze. Flexibilita prostorového tvarování zvolené izodózy je docílena tím, že můžeme kombinovat jednotlivé kolimátory s různým průměrem kolimačních otvorů, které vytvářejí různě veliká ohniska. Postupným posunem pacientovy hlavy upevněné v koordinačním rámu uvnitř konkavity kolimátorové helmice můžeme provést ozáření v několika izocenterch. Tím se pacient vystaví radiaci s ohniskem v různých prostorových koordinátách x,y,z a tak se postupně vyskládá žádaný tvar ozařovaného ložiska. Každé takové jednotlivé expozici říkáme "shot".
Další flexibilita ve tvarování prostorového rozložení isodosních křivek je dána možností uplatnit různý váhový faktor (t.j. relativní ozařovací čas) pro ozáření v jednotlivých izocentrech, kterými je vyskládán žádaný objem. Konečně tvar vzniklého ohniska při použití jednotlivého kolimátoru můžeme modifikovat již vzpomenutou možností postupně zaslepovat, t.j. vyřadit různé kombinace jednotlivých zdrojů Co60, čímž docílíme nejenom nestandardní tvary dávkové distribuce, ale zvýšením strmosti spádu okrajové dávky v určitém směru můžeme chránit přilehlé funkčně významné struktury.
Komerčně jsou dostupné 2 plánovací systémy. Starší KULA systém a nyní nový GammaPlan systém. Zobrazení získané neuroradiologickým vyšetřením je přeneseno do plánovacího systému GammaPlan pomocí scanneru, pásky, diskety nebo spojením on-line. Plánovací systém počítá absorbovanou dávku z každého zdroje záření Co60 v zadefinované matrici, která má 313 bodů. Výsledná dávka je sumací ze všech 201 zdrojů Co60 vypočtených v každém z bodů matrice. Cílem tvorby léčebného plánu je, aby hranice léčené léze korespondovala nejčastěji s 50-90% isodosou dávkového maxima, protože v tomto pásmu je spád dávky nejstrmější. Výsledkem zpracování zadaných dat je výpočet a zobrazení distribuce dávek v libovolných tomografických řezech ve třech na sebe kolmých rovinách a vytištění
93
protokolu obsahujícího všechny potřebné léčebné parametry, podle kterých provedeme samotné ozáření. Rozhodnutí o výši aplikované dávky do maxima a na okraj patologické léze v každém jednotlivém případě je založeno na zhodnocení histologické povahy léze, jejím objemu a vztahu k přilehlým funkčně významným strukturám. Při plánování je možné srovnání korelace koordinát všech bodů a cílů mezi CT, MRI a angiografickým zobrazením a fúze CT s MRI. Simultánně lze analyzovat více zobrazení, isodosní křivky jsou zobrazené přímo na CT, MRI nebo angiografických snímcích.
Stereotaktické instrumentarium: Nejdůležitější částí stereotaktického instrumentaria je Leksellův stereotaktický koordinační rám. K hlavě pacienta je připevněn pomocí 4 vertikálních podpěr, kterými prochází fixační šrouby a hroty těchto šroubů proniknou do lamina externa kalvy pacienta. Báze tohoto rámu tvoří referenční rovinu pro 3-rozměrnou karteziánskou souřadnicovou soustavu. To znamená, že každý bod v prostoru je jednoznačně definován svými souřadnicemi x,y,z. Patologická léze je geometricky vztažena k této souřadnicové soustavě pomocí kontrastních značek na indikátorech. Ty se zobrazí spolu s patologickou lézí centračním neuroradiologickým vyšetřením. Podle povahy léčeného onemocnění volíme CT, MRI, angiografii nebo jejich kombinaci. Pro každý jednotlivý druh vyšetření je určen speciální indikátor.
Leksellův stereotaktický systém je arkopolární. To v principu znamená, že sonda délkou totožná s poloměrem polokruhovitého oblouku zavedená v pravém úhlu k tangenciále kdekoliv podél půloblouku, dostane se do středu systému. Lineární posun podpěr oblouku ve 3 rovinách umožňuje posunout cílový bod sondy do žádaného cíle v mozku.
V případě gama nože je místo sondy použito kolimovaného svazku paprsků gama záření. Koordinátu X nastavíme horizontálním posunem dvou postranních čepů na pravé a levé straně kolimátorové helmice, které fixují koordinační rám s pacientovou hlavou. Koordinační rám je připevněn do těchto čepů pomocí dvou postranních jezdců, které jsou fixovány na pravé a levé straně koordinačního rámu. Jejich předozadním posunem na tomto rámu měníme koordinátu Y. Tento postranní jezdec je složen ze dvou částí, které se do sebe teleskopicky zasouvají. Změnou výšky tohoto postranního jezdce nastavujeme koordinátu Z. Nastavením patřičných hodnot koordinát x,y,z tak dostaneme do ohniska kolimátoru žádaný definovaný intrakraniální cíl.
Leksellův stereotaktický systém je navržený a vyráběný tak, aby byl univerzální. Po nasazení koordinačního rámu je možné provést stereotaktické CT, MRI, VG, AG ev. PET vyšetření a potom provést srovnání mezi identickými tomografickými řezy a porovnání s angiografií, která zobrazuje lézi jen v předozadní a bočné projekci. Univerzálnosti rámu je docíleno tím, že je vyroben z aluminia, takže je kompatibilní se silným magnetickým polem, a aluminiové podpěry příliš neruší čitelnost CT snímků.
Zobrazovací metody v radiochirurgii: Stereotaktické zobrazení patologické léze má pro radiochirurgii zásadní význam a vývoj zobrazovacích metod se nejvýznamněji podílí na rozšiřování indikací a zlepšování léčebných výsledků. Každé neuroradiologické vyšetření provedené stereotaktickým způsobem je vyšetřením peroperačním a má tedy charakter nikoliv diagnostický, ale stává se součástí operačního výkonu. Operace sama začíná nasazením koordinačního rámu na hlavu pacienta a je nutné ji provést bez zbytečných prodlev mezi jednotlivými kroky.
Ve funkční neurochirurgii předpokládáme, že pracujeme s mozkem pacienta, jehož rozměry odpovídají rozměrům zobrazeným ve stereotaktických atlasech. Není tedy nutné zobrazit přímo cílový bod funkční neurochirurgické operace, ale pouze nějaký jiný snadno zobrazitelný referenční bod a podle něho vyčteme ze stereotaktického atlasu koordináty námi žádaného funkčního cíle. Nejvhodnějšími referenčními body jsou přední a zadní komisura, které je možné snadno zobrazit pomocí ventrikulografie. Toto vyšetření provedeme s
94
připevněním kontrastního měřítka, které má tvar rámu krychle připevněné na stereotaktický koordinační rám. Po zobrazení komisur ve dvou na sebe kolmých projekcích můžeme odečíst jejich prostorové koordináty pomocí příslušného algoritmu. Dnes se ve funkční neurochirurgii stále častěji používá k zobrazení komisur CT s vysokou rozlišovací schopností, nebo MRI.
Indikátor používaný pro stereotaktickou ventrikulografii je vyhovující i pro zobrazování vaskularizovaných patologických procesů, a tak toho mohlo být využito pro stereotaktickou lokalizaci arteriovenozních malformací v radiochirurgii. Zatímco pro funkční neurochirurgii jsou postačující souřadnice bodového cíle, u arteriovenozní malformace potřebujeme znát přesný 3-rozměrný tvar této často komplexní prostorové léze. Protože však není možné provést angiografické vyšetření v axiální projekci, skutečný 3-rozměrný tvar malformace pouze odhadujeme zobrazením procesu ve dvou projekcích - předozadní a bočné.
Skutečný průlom v radiochirurgii znamenal vývoj CT v 70-tých letech Hounsfieldem a Cormackem a jeho zavedení do klinické praxe v r. l974. Tvorba CT obrazu je založena na stejném principu karteziánského souřadnicového systému, jaký užívají stereotaktické postupy, t.j. každý bod je určen třemi souřadnicemi 3-rozměrného prostoru. K CT stereotaktickému vyšetření používáme indikátor, který je tvořen aluminiovými proužky ve tvaru N, zapuštěnými v plexitové destičce a upevněnými na pravé a levé straně koordinačního rámu. Rovina tomografického řezu protíná tento systém ve 3 bodech, při čemž poloha paralelních linií se promítá ve všech řezech na stejném místě a umožňuje určit průmět středu stereotaktického systému a přímé odečtení koordinát v antero-posteriorním a laterálním směru. Třetí bod se pohybuje mezi krajními konstantně umístěnými body v závislosti na vertikální koordinátě. CT vyšetření umožnilo rozšířit indikace radiochirurgie zásadním způsobem na benigní nádorové afekce a metastázy a počet radiochirurgicky léčených pacientů významně vzrostl. CT ovšem často selhává v zobrazení přesné hranice patologické léze a přilehlých funkčně významných struktur a poněkud kritická situace nastává při zobrazování procesů v zadní jámě lební, kde se sčítají artefakty ze stereotaktického rámu a masivních kostěných struktur. V těchto případech je většinou nejvhodnějším řešením zobrazení patologického ložiska pomocí magnetické rezonance.
Nukleární magnetická rezonance jako fenomén je sice známá téměř 50 let, ale v klinické praxi má za CT zpoždění asi jedno desetiletí. Proti CT má magnetická rezonance v radiochirurgii několik zásadních výhod. Umožňuje přímé zobrazení vyšetřovaného objektu ve 3 rovinách bez radiační zátěže pacienta a dokonalejší diferenciaci normální mozkové anatomie, t.j. šedé a bílé hmoty, a zobrazení hlavových nervů. Na rozdíl od CT, obraz není rušen artefakty ze stereotaktického rámu. Výrazně lepší je diferenciace okrajů postihované léze, která může být dále zesílena použitím různých vyšetřovacích sekvencí. O něco horší však zůstává prostorové rozlišení než u CT. Problémem může být případná prostorová nehomogenita magnetického pole. Značně pokročil vývoj MRI- angiografie, která se stává v současné době již rutinní vyšetřovací metodou.
MRI lokalizační indikátor je analogicky jako u CT ve tvaru N, navíc je však umístěn nejenom po stranách hlavy, ale i nad jejím vertexem, takže je možno vyšetřovat v sagitální rovině. Místo aluminiových proužků jsou v indikátoru kanálky vyplněné síranem mědnatým.
Průběh radiochirurgické operace: Radiochirurgická operace znamená pro pacienta minimální zátěž a hospitalizační doba obvykle nepřesahuje 2 dny. Pacient je zpravidla přijatý den před radiochirurgickým výkonem. Večer v den příjmu probíhá příprava vlasů dezinfekčním šamponem, která je ráno před výkonem zopakována benzinalkoholem a podáváme intramuskulární premedikaci Diazepamem, ev. podle charakteru plánovaného neuroradiologického vyšetření antihistaminikem a kortikoidy. V lokální anestézii je potom nasazen stereotaktický
95
koordinační rám. Následuje stereotaktické radiologické vyšetření. Během plánování odpočívá pacient v relaxační místnosti, může sledovat televizi, videoprogramy podle vlastního výběru nebo poslouchat hudbu. Po vypracování ozařovacího plánu začne vlastní ozařování. Stereotaktický rám je mechanicky pomocí posuvných podpěr pevně připevněn do konkavity kolimátorové helmice tak, že predeterminovaný intrakraniální cíl se nachází ve společném ohnisku, ve kterém se protínají svazky paprsků, když je operační lůžko v léčebné pozici. Protože prostor v konkavitě helmice je limitovaný, je naší snahou nasadit rám pokud možno tak, aby se léčený cíl dostal co nejvíce ke středu stereotaktického systému. Během léčby se otevírají štítové dveře radiační jednotky a pacient na operačním lůžku s hlavou upnutou do kolimátorové helmice zajíždí do léčebné pozice a po ukončení ozáření lůžko s pacientem automaticky vyjíždí. Elektromotory zajišťující pohyb lůžka s pacientem a otevírání štítových dveří jsou spouštěny z přilehlé ovladovny a v případě výpadku elektrického proudu jsou poháněny akumulátory. Tento postup se podle potřeby opakuje s případnou výměnou kolimátorových helmic, až jsou pokryty všechny cílové body v léčeném objemu. Ozařovací doba závisí od velikosti a povahy léčené afekce a s poločasem rozpadu Co60 se prodlužuje. Čistého času představuje několik desítek minut.
Po skončení radiochirurgického ozáření je pacientovi sejmut z hlavy stereotaktický koordinační rám a je převezen zpět na lůžkové oddělení. Během celého výkonu s námi spolupracuje psycholog.
Pacient může být propuštěn domů v den výkonu, zpravidla však v den následující a může ihned navázat na životní styl předoperační úrovně.
96
Vývojová schopnost oocytů savců
J.Motlík
Ústav živočišné fyziologie a genetiky, AVČR 27721 Liběchov
FOLIKULÁRNÍ POOL
Embryonální gonády jsou vytvořeny již 13. den u myší a 24.-26. den u prasat po oplození. Primordiální zárodečné buňky migrují z oblasti žloudkového vaku jak pasivně, tak aktivně pomocí pseudopodií do oblasti primitivních ovarií pomocí chemotaxe. Počet primordiálních zárodečných buněk nepřevyšuje několik tisíc a po skončení migrační fáze hovoříme o oogoniích. V průběhu savčí embryogeneze oogonie začínají intenzivně mitoticky proliferovat již několik dní po dosažení genitální lišty. Na příklad 50ti denní prasečí fety mají v ovariích až jeden milion oogonií. Pravděpodobně pod vlivem specifických stimulů z mesovaria mitotická aktivita oogonií ustává a oni vstupují do meiotické profáze. Napříště jsou označovány jako oocyty, které procházejí v průběhu čtyř dnů ze stadia leptotenního do stadia pachytenního. U myší v 18. dnu březosti vstupují první oocyty do diplotenního stadia první meiotické profáze. V tomto stadiu se meiotické dělení zastavuje, především v důsledku vmezeření ovariálních (v budoucnu granulozních) buněk a vytvoření primordiálních folikulů. Všechny oocyty, které nejsou obklopeny jednou vrstvou plochých folikulárních buněk jsou z vaječníků odstraněny v procesu atresie. Primordiální oocyty, které jsou v dictyotenním stadiu (difuzní diplotenní stadium u kterého došlo k dekondenzaci chromozomů) vytvářejí folikulární pool, obrovskou zásobu samičích zárodečných buněk (u prasat až 500 tisíc), ze které již krátce po narození a pak v průběhu celého reprodukčního života vystupují skupiny primordiálních folikulů do růstové fáze. Na počátku růstové fáze mají savčí oocyty v průměru 12-15 µm a musí v průběhu růstové fáze zvětšit svůj průměr 7-10 x, což reprezentuje zvětšení objemu až 300 x. Těmto extrémníV m nárokům jsou podřízeny všechny aspekty následující růstové fáze. RŮSTOVÁ FÁZE FOLIKULŮ A OOCYTŮ
Růst savčích oocytů probíhá ve dvou charakteristických fázích. V první fázi je růst oocytu a folikulu korelován, zatímco v druhé fázi průměr oocytu zůstává konstantni, ale průměr antrálního folikulu se rychle zvětšuje. Není dosud jednoznačně zodpovězena otázka, zda folikulární buňky nebo zárodečná buňka – oocyt je zodpovědná za převzetí signálu pro zahájení růstové fáze. Je evidentní, že v primárních folikulech již folikulární buňky získaly kuboidní tvar a oocyt má ve svém jadru, pro které je užíván termín zárodečný váček, vysoce dekondenzovaný chromatin a funkční, fibrilo-granulární jadérko. Toto uspořádání umožňuje intenzivní jadernou i nukleolární RNA syntézu, takže oocyty s dokončeným růstem obsahují 500-600 pg RNA, tedy asi 200 x více než typická somatická buňka. Další mitotické dělení folikulárních buněk vede k vytvoření sekundárních folikulů s několika vrstvami budoucích granulozních buněk. V těchto folikulech probíhá převážná část růstové fáze oocytu, která je u myší ukončena ještě před vytvořením folikulárního folikulárního antra, které je charakteristické pro terciální folikul. Na konci růstové fáze savčí oocyt obsahuje extrémní zásobu makromolekul a buněčných organel, které jsou mobilizovány v průběhu jaderného zrání, oplození a časného embryonálního vývoje. Myší oocyt má kolem 100 tis. mitochondrií, 100 mil. ribozomů, 4500 kortikálních granulí. Ve srovnání se 15-25 fmol ATP v somatických buňkách je zásoba ATP v oocytu kolem 800 fmol a neobvykle vysoké zásoby jsou charakteristické i pro tubulin a actin. Obrovská zásoba RNA je typická především vysokým obsahem rRNA a polyadenylované RNA, které jsou využívány až do doby aktivace embryonálního genomu.
97
Meiotická kompetence savčích oocytů Morfologická charakteristika rostoucích oocytů savců Přítomnost folikulární tekutiny lze pozorovat ve folikulech prasat a skotu o průměru 0.3-0.4 mm. Folikulární antrum je pak přítomno již od folikulárního průměru 0.5 mm. Toto morfologické uspořádání umožňuje izolaci rostoucích oocytů hospodářských zvířat od velikosti 80-90 µm. Oocyty izolované z folikulů o průměru 0.5-0.8 mm pak dosahují 100-110 µm. Již na oocytech barvených aceto-orceinem a vyšetřovaných ve fázovém kontrastu je patrná přítomnost velkého vakuolizovaného jadérka, vyjímečně dvou i více jadérek. Ultrastrukturální studie prokázaly, že jadérka oocytů mají heterogenní struktůru složenou z fibrilo-granulárních komponentů, fibrilárních center a četných nukleolárních vakuol . V průběhu dalšího folikulárního růstu dosahují oocyty svého finálního průměru (120 µm u prasat a 130 µm u skotu). Ukončení růstové fáze oocytů je doprovázeno postupným vytlačením fibrilárních center na periferii jadérka a zvětšováním nukleolárních vakuol. Především u oocytů skotu je nápadná přítomnost centrální vakuoly v jadérku. V konečné fázi transformace jadérka dochází k lokalizaci rDNA mimo jadérko na perinukleolárním chromatinu a jadérko je složeno výlučně z elektrondenzního fibrilárního materiálu. Takovéto kompaktní jadérko nacházíme v průběhu oogeneze všech savců, ale jeho vytvoření neprobíhá ve stejné fázi folikulárního vývoje. Zatímco u myší je kompaktní jadérko vytvořeno již v plurilaminárních folikulech, před vytvořením folikulárního antra, u prasat a skotu je stejný proces dokončen až v malých antrálních folikulech o průměru 2-3 mm. Kompaktní jadérko je vytvořeno u všech studovaných druhů současně s dosažením finálního průměru oocytů a můžeme ho považovat za obecný rys oogeneze savců. Syntéza RNA u rostoucích oocytů savců Úroveň syntézy ribonukleových kyselin v rostoucích oocytech byla sledována především pomocí autoradiografie na světelné i elektronoptické úrovni. Kultivace oocytů v mediu obohaceném specifickým prekurzorem, 3H-uridinem, po dobu 15-20 min. umožňuje přesně lokalizovat inkorporaci na místě aktivní RNA syntézy. Velmi intenzivní inkorporace je patrná vždy v granulozních buňkách, které obklopují oocyt (kumulární buňky a buňky corony radiaty) a rozhodující měrou se podílejí na transportu živin a regulačních molekul do oocytu. Oocyty prasat a skotu izolované z malých antrálních folikulů mají intenzivně značenou jak nukleoplazmu, tak fibrilo-granulární jadérko. To znamená, že i poslední třetina růstové fáze oocytu je charakterizovaná intenzivní syntézou jaderné heterogenní RNA (mRNA, snRNA) i ribozomální RNA (rRNA). Současně s morfologickou transformací jadérka dochází k nápadnému poklesu rRNA syntézy a konečně k úplné absenci rRNA syntézy, která časově koinciduje s dosažením finálního průměru oocytu. Naproti tomu syntéza jaderné RNA probíhá i po dokončení růstové fáze oocytů a je rozhodující pro utváření jejich meiotické a vývojové kompetence. Kultivace rostoucích oocytů, jejich biochemické a funkční vlastnosti Ooocyty prasat, skotu, ovcí i koz izolované z folikulů do průměru 0.5 mm zůstávají po 24 hod. kultivace ve stadiu zárodečného váčku. Stejně tak oocyty myší o průměru 60 µm zůstávají v kultivačních podmínkách v meiotické profázi. Tyto oocyty jsou označovány za meioticky nekompetentní. Oocyty, které mají u myší do 70 µm a u hospodářských zvířat 100-110 µm jsou schopny v podmínkách in vitro zahájit kondenzaci chromatinu, rozpustit jadernou membránu (proces rozpadu zárodečného váčku) a dosáhnout metafáze prvního meiotického dělení. Tyto oocyty mají pouze částečnou meiotickou kompetenci, protože nejsou schopny dokončit první meiozu. Teprve oocyty s dokončeným růstem jsou meioticky kompetentní, protože jsou schopny vydělit první polární tělísko a uspořádat chromozomy do metafázní figury druhého meiotického dělelí. Jedním z faktorů, který rozhoduje o meiotické kompetenci oocytů je schopnost organizovat mikrotubuly. Zatímco nekompetentní oocyty mají v cytoplazmě paprsčitou síť interfázních mikrotubulů, v kompetentních oocytech jsou přítomna fosforylovaná mikrotubulární organizační centra (MTOCs), ze kterých vycházejí mnohem kratší, perinukleárně lokalizované mikrotubuly.
98
Tyto změny souvisí se zahájením syntézy proteinu p39c-mos, který je produktem c-mos protoonkogenu a je zodpovědný za správnou funkci meiotického vřeténka. Druhým důležitým regulátorem funkce mikrotubulů je mitogeny-aktivovaná protein (MAP) kináza. Ukázalo se, že u meioticky nekompetentních oocytů nedochází k fosforylaci MAP kinázy, která je nezbytná k aktivaci tohoto enzymu. V průběhu zrání meioticky kompetentních oocytů je MAP kináza aktivována již v období rozpouštění jaderné membrány (oocyty skotu a prasat) nebo v období formování meiotického vřeténka (oocyty myší). Aktivní MAP kináza je asociována s MTOCs a s mikrotubuly meiotického vřeténka. Dalšími důležitými molekulárními indikátory meiotické kompetence jsou kompotenty cdc2 kinázy – p34cdc2 a cyklin B. Zatímco rostoucí oocyty myší mají srovnatelné množství cyklinu B jako u oocytů s dokončeným růstem, hladina katalytické podjednotky p34cdc2 se v průběhu růstové fáze oocytů podstatně mění. Nápadný nárůst hladiny p34cdc2 na konci růstové fáze je regulován na úrovni translace, protože není doprovázen výraznými změnami v hladině mRNA pro tento protein. Získání plné meitické kompetence však ještě vyžaduje post-translační modifikaci obou proteinů, která umožní asociaci katalytické a regulační podjednotky a následně aktivaci cdc2 kinázy. Hlavními cílovými proteiny této kinázy jsou jaderné histony a laminy jaderné membrány. Fosforylace těchto proteinů umožní postupnou kondenzaci chromatinu a rozpuštění jaderné membrány oocytů. Jak cdc2 kináza, tak MAP kináza mohou být předčasně aktivovány pomocí kultivace oocytů v mediu s kyselinou okadaikovou. V experimentech, kde aktivace cdc2 kinázy byla inhibována specifickým inhibitorem (butyrolactone I), bylo prokázáno, že i MAP kináza se může podílet na fosforylaci lamin a rozpuštění jaderné membrány. To znamená, že zahájení jaderného zrání oocytů je závislé na přesné časové posloupnosti v aktivaci cdc2 kinázy a MAP kinázy. Metodika buněčné fúze prokázala, že i meioticky nekompetentní oocyty jsou schopny reagovat na faktory indukující zrání (MPF) v cytoplazmě metafázních oocytů. Po fúzi meioticky nekompetentního oocytu s oocytem v metafázi I dochází ve všech případech k rozpadu zárodečného váčku a předčasné kondenzaci chromozomů (PCC). Avsak fúze meioticky nekompetentních oocytů s oocyty kompetentními ve stadiu zárodečného váčku neumožní aktivaci MPF. Přestože podobný fenomén byl pozorován i u somatických buněk, jeho molekulární podstata dosud čeká na své objasnění. Vývojová schopnost savčích oocytů Fyziologické oplození a embryonální vývoj savčích oocytů po oplození je v předovulačních folikulech zajištěn koordinovaným vývojem jejich somatické a zárodečné složky. Tato vzájemná interakce se uskutečňuje pomocí těsného mezibuněčného spojení mezi granulozními buňkami navzájem a také mezi buňkami corony radiaty a oocytem. Neméně významná komunikace je docílena pomocí sekrece parakrinních faktorů. Je jednoznačně prokázáno, že granulozní buňky se významně podílejí na metabolizmu oocytů, hrají klíčovou roli v udržování meiotického bloku oocytů a konečně přijímají ovulační signál luteinizačního hormonu. Ale také parakrinní sekrece oocytu je rozhodující pro proliferaci buněk granulozy, pro jejich steroidogenezi a pro syntézu hyaluronové kyseliny kumulárními buňkami. Pouze tento vzájemný dialog mezi somatickými buňkami a oocytem může zajistit plnou vývojovou schopnost oocytu, kterou rozumíme narození životaschopného potomnstva. V současné době jsou vypracovány metodiky, které umožňují úspěšné zrání oocytů s dokončeným růstem v podmínkách in vitro.Po jejich oplození in vitro a po kultivaci do stadia blastocysty jsou embrya přenášena synchronizovaným příjemcům. Přestože tento postup je prakticky aplikován v mnoha centrech pro přenos embryí u skotu, jeho úspěšnost je limitována kvalitou oocytů, které jsou obklopeny kompaktním kumulem (COCs). Hlavní nevýhodou je fakt, že COCs jsou získávány z velmi heterogenní populace folikulů, které nemohly zajistit pro oocyty shodnou vývojovou kompetenci. Ve snaze nahradit oocytům důležité intrafolikulární prostředí, byla navržena metodika dvoustupňové kultivace v podmínkách in vitro. V prvním kroku jsou COCs kultivovány v přítomnosti specifického inhibitoru cdk kináz (butyrolactone I, roscovitin), které zabraňují zahájení jaderného zrání oocytů, ale umožňují aktivní RNA syntézu a proteosyntézu jak oocytů, tak kumulaárních buněk. Tyto látky také negativně neovlivňují vzájemnou kominukaci mezi kumulárními buňkami a oocytem. Po důkladném odmytí
99
inhibitorů pokračuje kultivace in vitro v druhém kroku v mediu s gonadotropiny, které umožňuje nejen úspěšné jaderné zrání, ale také expanzi kumulu, která je důležitým krokem pro budoucí oplození oocytů. Tento nový metodický přístup umožňuje využití oocytů skotu z malých antrálních folikulů pro biotechnologické účely a do budoucna také umožní kultivaci lidských oocytů ze stadia zárodečného váčku tak, aby bylo dosaženo jaderného i cytoplazmatického zrání a následné plné vývojové potence. Lze tedy uzavřít, že neustálé zlepšování kultivačních metod je předpokladem pro využití stále větší populace oocytů pro potřeby zemědělství, farmaceutického průmyslu, pro záchranu ohrožených živočišných druhů a konečně pro řešení problémů lidské sterility. Protože oocyt je jedinou buňkou, která je vybavena schopností reprogramovat genetickou informaci dárcovského jádra, hraje klíčovou v programu klonování u savců. Klonování ano, ale pouze terapeutické
Od narození ovce Dolly v roce 1996 bylo popsáno mnoho papíru o možnostech a
nebezpečích, která může představovat klonování u savců. Mezi tím se ovšem celá řada světových laboratoří orientovala tímto směrem a tak postupně přicházely zprávy o narození klonovaného potomstva u skotu (1998), myší (1998), koz (1999), prasat (2000) a opic (2000). Ve všech těchto případech je účinnost klonovacích postupů velmi nízká, zpravidla nepřesahuje 1%. Ovšem existence této metodiky je velmi důležitá pro základní výzkum v oblasti vývojové biologie, protože reprogramování, opětné otevření genetické informace somatické buňky, stále zůstává základní otázkou diferenciace, specializace buněčných populací. Nelze ovšem nevidět, že klonované potomstvo, především u ovcí a skotu, má závažné zdravotní problémy. Toto jsou všechno důvody k tomu, aby interakce mezi cytoplazmou enukleovaného oocytu, samičí zárodečnou buňkou bez vlastní genetické výbavy, a dárcovskou buňkou nebo jejím jádrem byla intenzivně studována nejmodernějšími metodami buněčné a molekulární biologie.
Výše popsané experimentální úsilí lze zařadit do oblasti klonování reprodukčního, kdy cílem experimentu je narození klonovaného potomstva. Tento přístup je ve všech státech striktně legislativně zakázán pro člověka. Také v České republice je jakékoliv experimentování s lidskými zárodky vázáno na souhlas Etické komise při Radě vlády. Je proto třeba jednoznačně prohlásit, že nikdo ve vědecké komunitě svými činy ani úvahami nesměřuje k reprodukčnímu klonování u člověka.
Zcela jiná situace nastala po roce 1998 v oblasti klonování terapeutického. Co vlastně rozumíme tímto druhým termínem. Laboratoř profesora Thompsona poprvé prokázala, že z lidského embrya ve stadiu blastocysty (7-8 dnů po oplození) lze izolovat lidské kmenové buňky. Tyto buňky jsou označovány termínem pluripotentní ( z latinského plures = několik), to znamená, že mohou podílet na výstavbě všech tkáních v organizmu. Jinými slovy otevírají možnost pro uplatnění buněčné terapie, která představuje náhradu buněk poškozené tkáně. Terapeutické klonování teoreticky představuje pro každého z nás možnost získat buňky potřebné „k opravě“ našich buněk nervových, jaterních nebo buněk srdečního svalu. Ovšem tato cest vždy vede přes přenos buněčného jádra budoucího pacienta do lidského enukleovaného oocytu a přes vývoj lidského embrya do stadia blastocysty. Proto i tyto budoucí postupy mají svá legislativní úskalí a jejich použití musí být přesně vymezeno. Ve Spojených Státech byl výzkum lidských kmenových buněk financován výlučně ze soukromých zdrojů. V současné době NIH (National Institute of Health – Hlavní federální grantová agentura) podporuje výzkum na lidských kmenových buňkách, ale nikoliv jejich izolaci. Parlament Velké Britanie povolil použití lidských kmenových embryonálních buněk za účelem rozvinutí nových léčebných procesů. Získání takového souhlasu je vázáno na splnění velmi přísných podmínek, které vylučují jakékoliv zneužití tohoto výzkumu. Jak následky úrazu, tak chorobného stavu jsou často spojeny s apoptózou nebo degenerací určité buněčné populace. V mnoha takových případech je buněčná terapie nejvhodnějším přístupem k obnovení funkce určité tkáně. Právě kmenové buňky izolované z časného embrya se úspěšně dělí v podmínkách in vitro a mohou být zdrojem specifických buněčných typů pro
100
regenerativní transplantaci. Jejich největší předností je, že mohou být udržovány in vitro po neomezeně dlouhou dobu a ve vhodných podmínkách diferencují do linií hematopoetických, svalových nebo nervových buněk. Náhrada buněk jako cesta k léčení onemocněni vniklých na základě degenerace nervových buněk nebo jejich poškození je v současné době limitovaná především dostupností vhodné dárcovské buněčné populace. K řešení této závažné otázky se v současné době nabízí několik experimentálních přístupů, které nezbytně vyžadují použití kmenových buněk. Buněk, které budou schopny funkčního zapojení do dospělé tkáně. Tento fakt je dominující právě v nervové tkáni, protože dospělé neurony mají omezenou schopnost adaptace v novém prostředí a také zdroj kmenových nervových buněk z fetální tkáně je omezený. Každý, kdo se setkal s příznaky Parkinsonovy choroby ví, o jak závažný léčebný problém se jedná. Schopnost neustálého sebeobnovování kmenových buněk je pro buněčnou terapii klíčová, protože umožňuje dlouhodobé přežití transplantovaných buněk v obnovujících se tkáních. Není ovšem účelem této krátké úvahy vypočítávat všechna potenciální uplatnění buněčné terapie. Je třeba závěrem jednoznačně říci, že je povinností biologického i lékařského výzkumu tuto nadějnou cestu rozvíjet a za naprosto přesných experimentálních podmínek, které vedou především přes uplatnění vhodných modelů v podmínkách in vitro, vypracovat léčebné postupy pro onemocnění, před kterými dosud stojí lékařská věda s prázdnýma rukama.
![Kone čné řešení náhrady ČSN 73 2601 – provád ění kontrol ... · ocelových konstrukcí“ z roku 1978 [2] (rovn ěž k 1. 9. 2011 zrušena). ... - Funk ční tolerance](https://static.dokumenty.site/doc/80x56/5c8a77bf09d3f22e408bf5ef/kone-cne-reseni-nahrady-csn-73-2601-provad-eni-kontrol-ocelovych.jpg)
