Prezentace aplikace PowerPoint - biocev.lf1.cuni.cz filevýsledkem je fyzická agregace,...

2018

• Co je proteomika ? Proteom? Protein?

• Experimentální strategie proteomiky

• Vlastnosti AMK a proteinů

• dezintegrace, lyzace, frakcionace

• detergenty

• srážení, precipitace, denaturace

• koncentrace, filtrace

• stanovení koncentrace

• značení bílkovin

• separace proteinů

METODY PRÁCE S PROTEINY

Precipitace v praxi :

• Nízkou iontovou silou

• Vysolováním (salting-out)

• Organickými rozpouštědly

Rozpustnost proteinu je výsledkem:

• polárních interakcí s vodným rozpouštědlem

• iontových interakcí s přítomnými solemi• odpudivých elektrostatických sil mezi shodně nabitými molekulami

Rozpustnost proteinu závisí na:

• struktuře proteinu

• pH, I a typu soli, T

• struktuře vody v solvatačním obalu

Precipitace je POTENCIÁLNĚ spojena s DENATURACÍ!

Precipitace bílkovinPrecipitace bílkovin

Snížení solvatačního potenciálu rozpouštědla vedoucí k tvorbě

precipitátu

Precipitace

Denaturace

Stabilita proteinu

Precipitace

Denaturace

Stabilita proteinu

Jednotlivé soli se liší schopností precipitovat/denaturovat proteiny

SALTING-OUT - VYSOLOVÁNÍ

Franz

Hofmeister

(1850-1922).

Precipitace

Denaturace

Stabilita proteinu

Precipitace

Denaturace

Stabilita proteinu

Precipitace síranem amonným

Denaturace guanidinium thiokyanátem

[CH6N3]+.

PRECIPITACE ORGANICKÝMI ROZPOUŠTĚDLY

Vytěsnění vody ze solvatačního obalu– převáží elektrostatické a van

der Waalsovy síly (přitahují se opačně nabité úseky což způsobí

precipitaci)

Etanol

Aceton (méně denaturující, více volatilní)

Mělo a by být provozováno v teplotách pod bodem mrazu

(prevence denaturace – malá konformační flexibilita,

solvent se nedostane dovnitř molekuly)

Precipitace 10 % kyselinou trichloroctovou (TCA)

výsledkem je fyzická agregace, „zamotají“ se do sebe

- pokud je I nízká, a pH daleko od pI, protein nemusí precipitovat

(odpudivé síly nabitých skupin)

• teplotní (zvýšení pohyblivosti molekul naruší vodíkové můstky)

• pH (změna náboje, vnitřní odpuzování, ztráta solventu)

• organickým rozpouštědlem (vyvázání hydrofobních úseků

rozpouštědlem, při nízkých teplotách neproniká organika dovnitř

molekul a nedenaturuje je) agregace je způsobena interakcí

opačně nabitých úseků na površích

• detergenty

Denaturace

Dezintegrace terciální struktury narušením vodíkových, S-S

a jiných slabých interakcí – ztráta funkce proteinu





• detergenty







• precipitací

• odpařením solventu

• dialýzou proti nevodnému solventu (polyvinylpyrrolidon)

• přidáním suché matrice přijímající vodu (Sephadex)

• (centrifugační) ultrafiltrací na molekulárních filtrech

Zahušťování roztoku bílkovin

Filtry s definovaným

filtračním rozsahem pro různé

MW a pro různá rozpouštědla

100 000

30 000

10 000

5 000

3 000





• detergenty







• UV spektrofotometrie 280 nm (Trp, Tyr)

• UV spektrofotometrie 190-205 nm (peptidická vazba)

• Redukce Cu2+ na Cu 1+ ionty – Biuret, Lowry nebo BCA (kys. bicinchonová)

• Komplexy AA s pigmenty (CBB G250) – dle Bradforda

Stanovení celkové koncentrace proteinu ve vzorku





• detergenty




• značení a imobilizace bílkovin



ZNAČENÍ A ZAKOTVOVÁNÍ

PROTEINŮ

Reaktivní skupiny bílkovin

sulfhydryl (–SH)

primární amin (–NH2)

karboxyl (–COOH)

karbonyl sacharidu (–CHO)

Cys

Maleimid

SH-

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/f/f1/Maleimide.png

Iodacetyl

Cys

SH-

N´, epsilon aminoskupina Lys

N-hydroxysuccinimid

NH2-

-COOHProtein +

C´, Asp. Glu

COOH-

Crosslinker EDC

Biotin Hydrazide bind to oxidized carbohydrates through the hydrazide group (–NH-NH2), forming a hydrazone linkage. Oxidation of glycoproteins generates reactive aldehydes that react specifically with hydrazide groups.

Cukry

hydrazid





• detergenty







Liquid Chromatography (LC)

Liquid flow

Liquid

flow

Time 1 2 3 4 5

Separation according to:

-molecular weight/ size

-charge

-hydrophobicity

-affinity

Sample containing

proteins or peptides

•Vzorek se rozděluje mezi mobilní a stacionární (pevnou) fázi

METODY Chromatografické SEPRACE BIOMOLEKUL

VELIKOST

AKTUÁLNÍ NÁBOJ

SPECIFICKÉ

INTERAKCE

Gelová filtrace

(Size-exclusion chromatography)

Iontoměničová chromatografie

(Ion exchange chromatography)

Afinitní chromatografie

(Affinity chromatography)

HYDROFOBICITA Chromatografie v reverzní fázi

(Reverse phase chromatography)

HYDROFILNOST Chromatografie hydrofilních interakcí

(Hydrophilic interaction LC)

•Atmosférická

•Nízkotlaká (FPLC, MPLC)

•Vysokotlaká (HPLC)

Klesá : objem vzorku, průtok

a průměr kolony

Roste: rychlost separace

MATRIX :

• kroslinkovaný dextran (Sephadex)

• kroslinkovaná celulóza (Sephacel)

• kroslinkovaná agarosa (Sepharose)

• polyakrylamid (Sepahacryl)

• silica - kyselina ortokřemičitá

• polystyren a jiné synt. polymery

KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE (LC)

SIZE-EXCLUSION CHROMATOGRAPHY

GEL-PERMEATION CHROMATOGRAPHY

Částice se v porézní matrix rozdělují na základě velikosti

Lze provádět za nativních podmínek !

Separační rozmezí až do 1000-2 000 000 Da

Vhodná pro proteiny.

GELOVÁ FILTRACE

ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY

IONTOMĚNIČOVÁ CHROMATOGRAFIE

• Dělí na základě aktuálního celkového náboje

+-

Anex je pozitivně nabitý

Katex je negativně nabitý

Funkční skupiny iontoměničů

+++ (DEAE) - - - (CM)

KATEXANEX

- +

ELUCE:

Zvýšená iontová síla =

snížení ES interakcíZměna pH = chromatofokusace

+++ (DEAE)

ELUCE:



- - - (CM)

+-

AFINITNÍ CHROMATOGRAFIE

Interakce proteinu s jeho

specifickým ligandem

metabolit, kov, DNA,

protilátka…..

Eluce:

• ligand

• pH

• iontová síla

• denatuační činidlo

Aktivované matrice:

NHS Sepharose……lze vázat za aminoskupinu (succiimid)

CNBr Sepharose…..lze vázat za aminoskupinu

EAH Sepharose …..lze vázat protein za karboxyl (karbodiimid)

Thiol sepharose……lze vázat za SH cysteinu

Matrice s afinitou pro IgG

Protein G Sepharose

Protein A sepharose

Protein A, G magnetic beads

Matrice s afinitou pro glykoproteiny

ConA Sepharose

Velké ligandy (DNA, protein) lze vázat přímo na matrix.

Malé ligandy (nukleotid, NADP, hormon…) se váží přes inertní „spacer arm“.

AFINITNÍ MATRIX

REVERZNÍ FÁZE (REVERSE PHASE CHROMATOGRAPHY)

Dělení na základě interakce s hydrofobní matricí

(na základě odlišné hydrofobicity peptidů/proteinů)

•Matrice a ligand:

vysoce hydrofobní

alifatické řetězce

•Vzorek je v hydrofilním

rozpouštědle

•Eluce: gradientem

organického rozpouštědla

H3

Matrice - nerozpustná, odolná organice a vysokému tlaku

– silica, polystyren…

Ligandy – hydrofobní alifatické řetězce C2-C18

Vhodnost: proteiny, peptidy

Kompatibilita s MS!

C18

HILIC – hydrophilic interaction liquid

chromatography

(chromatografie hydrofilních interakcí)

Stacionární fáze – polární, retenční čas roste s polaritou analytu

Mobilní fáze – organické rozpoštědlo, eluce zvyšující se polaritou

(podílem vody a/nebo soli)

Dělí analyty na základě jejich schopnosti polárních interakcí

Komplexní proces - Podílí se více typů interakcí a mechanismů separace

Polární interakce OH peptidu s

polární skupinou stacionární fáze

HILIC matrice

Nano

HPLC25-100 μm 24-4000 nL/min

Capillary

HPLC

100-100

μm0.4-200 μL/min

Micro

HPLC

1.0-2.1

mm50-1000 μL/min

Normal

HPLC

4.0-5.0

mm1.0 -10.0 mL/min

Vnitřní průměr

kolony Průtok

HPLC podle průtoku

On-line MS

Zip-TipsMacrotrapHPLC

Komplexita proteomu – Kolik je proteinů?

~20 600 lidských genů

Kódující

gen

mRNA

mRNA

mRNA

mRNA

mRNA

? mRNA ?

x 4-6 variant

??? Proteinů ???

JAK JE DEFINOVÁN PROTEIN?

GENOCENTRICKÝ vs. PROTEOCENTRICKÝ POHLED

PROTEIN a PROTEOFORMA

Jaká je koncentrace jednotlivých proteinů

a dynamický rozsah?

V savčí buňce: 1-10 000 000 kopií/buňku (108)

V séru/plazmě: pg/ml až mg/ml (1010)

Separace směsi BÍLKOVIN

Elektroforéza, chromatografie a jejich kombinace

Štěpení vybraných

bílkovin + čištění

peptidů

Získání hmotnostních

spekter

Měření přesné hmotnosti peptidů

( a jejich fragmentů)

Identifikace bílkovin (+ kvantifikace)

Porovnání hmotností sady

peptidů (jejich fragmentů) s

údaji o všech dostupných

ORFs v databázích

PROTEOMICKÝ EXPERIMENT

Štěpení všech

bílkovin (trypsin)

Separace směsi PEPTIDŮ

„SHOT-GUN“

STRATEGIE

„KLASICKÁ“

STRATEGIE

KLASICKÁ

STRATEGIE

2-DE-MS

„SHOT-GUN“

STRATEGIE2D-LC-MS

IEF-LC-MS

(proteiny)

(peptidy)

• chromatografie

• elektroforézy

SEPARAČNÍ METODY

2-DE • příprava vzorků

• izoelektrická fokusace

• ekvilibrace

• SDS-PAGE

• detekce bílkovin a DIGE

• zpracování dat a vyhodnocení

• digesce vzorku a extrakce peptidů

• limty a záludnosti 2-DE

Liquid Chromatography (LC)

Liquid flow

Liquid

flow

Time 1 2 3 4 5

Separation according to:

-molecular weight/ size

-charge

-hydrophobicity

-affinity

Sample containing

proteins or peptides

•Vzorek se rozděluje mezi mobilní a stacionární (pevnou) fázi

METODY Chromatografické SEPRACE BIOMOLEKUL

VELIKOST

AKTUÁLNÍ NÁBOJ

SPECIFICKÉ

INTERAKCE

Gelová filtrace

(Size-exclusion chromatography)

Iontoměničová chromatografie

(Ion exchange chromatography)

Afinitní chromatografie

(Affinity chromatography)

HYDROFOBICITA Chromatografie v reverzní fázi

(Reverse phase chromatography)

HYDROFILNOST Chromatografie hydrofilních interakcí

(Hydrophilic interaction LC)

•Atmosférická

•Nízkotlaká (FPLC, MPLC)

•Vysokotlaká (HPLC)

Klesá : objem vzorku, průtok

a průměr kolony

Roste: rychlost separace

MATRIX :

• kroslinkovaný dextran (Sephadex)

• kroslinkovaná celulóza (Sephacel)

• kroslinkovaná agarosa (Sepharose)

• polyakrylamid (Sepahacryl)

• silica - kyselina ortokřemičitá

• polystyren a jiné synt. polymery

KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE (LC)

SIZE-EXCLUSION CHROMATOGRAPHY

GEL-PERMEATION CHROMATOGRAPHY

Částice se v porézní matrix rozdělují na základě velikosti

Lze provádět za nativních podmínek !

Separační rozmezí až do 1000-2 000 000 Da

Vhodná pro proteiny.

GELOVÁ FILTRACE

ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY

IONTOMĚNIČOVÁ CHROMATOGRAFIE

• Dělí na základě aktuálního celkového náboje

+-

Anex je pozitivně nabitý

Katex je negativně nabitý

Funkční skupiny iontoměničů

+++ (DEAE) - - - (CM)

KATEXANEX

- +

ELUCE:



+++ (DEAE)

ELUCE:



- - - (CM)

+-

AFINITNÍ CHROMATOGRAFIE

Interakce proteinu s jeho

specifickým ligandem

metabolit, kov, DNA,

protilátka…..

Eluce:

• ligand

• pH

• iontová síla

• denatuační činidlo

Aktivované matrice:

NHS Sepharose……lze vázat za aminoskupinu (NHsucciimid)

CNBr Sepharose…..lze vázat za aminoskupinu

EAH Sepharose …..lze vázat protein za karboxyl (karbodiimid)

Thiol sepharose……lze vázat za SH cysteinu

Matrice s afinitou pro IgG

Protein G Sepharose

Protein A sepharose

Protein A, G magnetic beads

Matrice s afinitou pro glykoproteiny

ConA Sepharose

Velké ligandy (DNA, protein) lze vázat přímo na matrix.

Malé ligandy (nukleotid, NADP, hormon…) možnost vazby přes inertní „spacer arm“.

AFINITNÍ MATRIX




H3

Matrice - nerozpustná, odolná organice a vysokému tlaku

– silica, polystyren…

Ligandy – hydrofobní alifatické řetězce C2-C18

Vhodnost: proteiny, peptidy

Kompatibilita s MS!

C18




•Matrice a ligand:

vysoce hydrofobní

alifatické řetězce

•Vzorek je v hydrofilním

rozpouštědle

•Eluce: gradientem

organického rozpouštědla

HILIC – hydrophilic interaction liquid

chromatography

(chromatografie hydrofilních interakcí)

Stacionární fáze – polární, retenční čas roste s polaritou analytu

Mobilní fáze – organické rozpoštědlo, eluce zvyšující se polaritou

(podílem vody a/nebo soli)

Dělí analyty na základě jejich schopnosti polárních interakcí

Komplexní proces - Podílí se více typů interakcí a mechanismů separace

Polární interakce OH peptidu s

polární skupinou stacionární fáze

HILIC matrice

Nano

HPLC25-100 μm 24-4000 nL/min

Capillary

HPLC

100-100

μm0.4-200 μL/min

Micro

HPLC

1.0-2.1

mm50-1000 μL/min

Normal

HPLC

4.0-5.0

mm1.0 -10.0 mL/min

Vnitřní průměr

kolony Průtok

HPLC podle průtoku

On-line MS

Zip-TipsMacrotrapHPLC

Date post:	04-Apr-2019
Category:	Documents
Upload:	duongdan
View:	214 times
Download:	0 times

Prezentace aplikace PowerPoint - biocev.lf1.cuni.cz filevýsledkem je fyzická agregace,...

Documents