+ All Categories
Home > Documents > Proteinová sekrece buněk savců aneb jak si buňky povídají...

Proteinová sekrece buněk savců aneb jak si buňky povídají...

Date post: 09-Mar-2020
Category:
Upload: others
View: 16 times
Download: 0 times
Share this document with a friend
4
Komunikace mezi buňkami využívá po- měrně jednoduché nástroje. Buňka, která vysílá signál, vytváří určitou chemickou molekulu. Ta je rozpoznána senzorem (re- ceptorem) buňky, jež signál přijímá. Mole- kulou přenášející signál mohou být bíl- koviny, peptidy, aminokyseliny a jejich deriváty, steroidy, nebo i některé plyny. Je nutné zdůraznit, že k signálům jsou vnímavé pouze ty buňky, které nesou spe- cifický receptor pro danou signální mole- kulu. Ostatní buňky jsou k tomuto signálu hluché. Po navázání signální molekuly na re- ceptor se v cílové buňce signál z vnějšího prostředí převede na nitrobuněčné signá- ly, které vedou ke změně chování buňky. Např. signál k dělení buňky (mitogenní signál) rozeznává receptor na buněčném povrchu. Po aktivaci receptoru je postup- ně předán až do buněčného jádra, kde spouští transkripci genů a tvorbu enzymů a dalších proteinů potřebných pro repli- kaci DNA a buněčné dělení. Komunikace mezi buňkami savčího organismu probíhá na malé i velké vzdá- lenosti (obr. 1). Malé skupiny buněk mo- hou být mezi sebou v přímém kontaktu. Pokud spolu těsně sousedí, mohou si pří- mo vyměňovat některé malé molekuly mezi svými cytoplazmami pomocí kanál- ků v membránách (gap junctions). Tato komunikace je nezbytná např. pro buňky srdeční svaloviny, kde se signál pro stah svalu předává právě pomocí přímých propojení cytoplazmy sousedních buněk a vede tak k efektivní kontrakci svaloviny jako celku. V jiných případech přímého kontaktu buněk se určitá bílkovina na povrchu jedné buňky přímo váže na receptor na povrchu sousední buňky. Tato signalizace závislá na kontaktu podává informace o umístění buňky mezi jinými buňkami a okolním prostředím a je nezbytná pro udržení ce- listvosti a správné organizace tkání nebo migraci buněk vyvíjejícího se embrya. Mezibuněčná komunikace na větší vzdá- lenosti je zprostředkována pomocí sekre- ce, tedy uvolňování signálních molekul z buňky do mimobuněčného prostředí. Zde se mohou signální molekuly šířit v okolním mezibuněčném prostoru, nebo vstupovat do lymfatických či krevních cév a být roznášeny po celém organismu. Po- kud jsou sekretovanou molekulou ovlivňo- vány buňky v blízkém okolí, hovoříme o parakrinní signalizaci. V případě, že jsou signální molekuly uvolňovány do těles- ných tekutin, jako je krevní sérum, a tak transportovány na velké vzdálenosti po celém organismu, jde o endokrinní signa- lizaci. Endokrinní signalizace je např. vy- užívána u bílkovinných hormonů vylučo- vaných žlázami s vnitřní sekrecí. Zvláštním druhem signalizace je přenos signálu mezi dvěma neurony. Neuron vy- sílá výběžkem – axonem – elektrické sig- nály vysokou rychlostí a často na velké vzdálenosti. V místě specializovaného spoje mezi dvěma nervovými buňkami (synapse) se elektrický signál mění na chemický. Z nervového zakončení axonu se do úzké štěrbiny mezi buňkami uvolní molekuly nervových mediátorů, které jsou ihned navázány na receptory cílové buň- ky. Podobně se přivádí signál z axonů nervových buněk na svalová vlákna, kde mediátory uvolněné z nervového zakon- čení řídí stah např. kosterního svalu. V tomto článku se zaměříme na mezi- buněčnou komunikaci pomocí sekrece proteinů a popíšeme metody, kterými lze bílkoviny uvolňované z buněk do mimo- buněčného prostředí studovat. živa 2/2013 50 ziva.avcr.cz Helena Kupcová Skalníková Proteinová sekrece buněk savců aneb jak si buňky povídají a jak jim naslouchat Přežití každé společnosti závisí na komunikaci mezi jedinci. Ať už je to spole- čenství bakterií a kvasinek (viz články M. Kuthana a Z. Palkové, Živa 2000, 1: 5–8 a 2002, 1: 2–5), včel v úlu, lidská společnost se všemi svými komunikační- mi vymoženostmi nebo mikroskopický svět buněk utvářejících jeden rostlinný, zvířecí nebo lidský organismus. Buňky se musí mezi sebou „domlouvat“, aby zajistily správný růst, správnou funkci tkání a orgánů, tvorbu energie, tvorbu nových buněk a jejich specializaci do jednotlivých tkání (diferenciaci), ale i zánik opotřebených nebo poškozených buněk. To vše s jediným cílem: zajistit přežití organismu a zachování druhu. 1 1 Způsoby komunikace mezi buňkami na malé a velké vzdálenosti (bližší vysvětlení v textu) 2 Koncentrace bílkovin krevního séra člověka. Graf ukazuje obrovský rozsah koncentrací různých bílkovin v séru zdravého člověka. Proteinové a peptidové hormony, růstové faktory, interleukiny a cytokiny dosahují víc než milionkrát nižších koncentrací než většina klasických sérových bílkovin. Analýza málo koncentrovaných molekul vyžaduje vysoce specializované laboratorní techniky. 3 Přehled sekreční dráhy. Klasicky sekretované bílkoviny se z buněk uvol- ňují sekreční dráhou probíhající přes endoplazmatické retikulum a Golgiho aparát. V těchto organelách dochází k úpravám molekul, čímž proteiny získávají svou strukturu a funkci. Trvale (konstitutivně) sekretované proteiny jsou k povrchu buňky dopravovány v transportních váčcích. U regulované sekrece se obsah sekrečních váčků uvolňuje ven z buňky až po přijetí určitého signálu. Způsoby mezibuněčné komunikace přímé propojení cytoplazmy dvou buněk signalizace závislá na vnějším kontaktu nervová signalizace parakrinní signalizace endokrinní signalizace spojovací kanálky (gap junctions) signální proteiny ukotvené v membráně lokálně působící molekula vytvářená signalizující buňkou endokrinní buňka vylučuje signální molekulu do krevního řečiště buňka v okolí přijímá signál svým receptorem tělo neuronu rozpoznávané receptorem sousední buňky molekuly nervového mediátoru axon cílová buňka cílová buňka přijímá signál na velkou vzdálenost přenos signálu mezi buňkami v místě synapse
Transcript
Page 1: Proteinová sekrece buněk savců aneb jak si buňky povídají ...ziva.avcr.cz/files/ziva/pdf/proteinova-sekrece-bunek-savcu-aneb-jak-si-bunky-p.pdf · Endokrinní signalizace je

Komunikace mezi buňkami využívá po -měrně jednoduché nástroje. Buňka, kterávysílá signál, vytváří určitou chemickoumolekulu. Ta je rozpoznána senzorem (re -ceptorem) buňky, jež signál přijímá. Mole-kulou přenášející signál mohou být bíl -koviny, peptidy, aminokyseliny a jejichderiváty, steroidy, nebo i některé plyny.Je nutné zdůraznit, že k signálům jsouvnímavé pouze ty buňky, které nesou spe-cifický receptor pro danou signální mole-kulu. Ostatní buňky jsou k tomuto signáluhluché.

Po navázání signální molekuly na re -ceptor se v cílové buňce signál z vnějšíhoprostředí převede na nitrobuněčné signá-ly, které vedou ke změně chování buňky.Např. signál k dělení buňky (mitogenní

signál) rozeznává receptor na buněčnémpovrchu. Po aktivaci receptoru je postup-ně předán až do buněčného jádra, kdespouští transkripci genů a tvorbu enzymůa dalších proteinů potřebných pro repli-kaci DNA a buněčné dělení.

Komunikace mezi buňkami savčíhoorganismu probíhá na malé i velké vzdá-lenosti (obr. 1). Malé skupiny buněk mo -hou být mezi sebou v přímém kontaktu.Pokud spolu těsně sousedí, mohou si pří-mo vyměňovat některé malé molekulymezi svými cytoplazmami pomocí kanál-ků v membránách (gap junctions). Tatokomunikace je nezbytná např. pro buňkysrdeční svaloviny, kde se signál pro stahsvalu předává právě pomocí přímýchpropojení cytoplazmy sousedních buněk

a vede tak k efektivní kontrakci svalovinyjako celku.

V jiných případech přímého kontaktubuněk se určitá bílkovina na povrchu jednébuňky přímo váže na receptor na povrchusousední buňky. Tato signalizace závislána kontaktu podává informace o umístěníbuňky mezi jinými buňkami a okolnímprostředím a je nezbytná pro udržení ce -listvosti a správné organizace tkání nebomigraci buněk vyvíjejícího se embrya.

Mezibuněčná komunikace na větší vzdá-lenosti je zprostředkována pomocí sekre-ce, tedy uvolňování signálních molekulz buňky do mimobuněčného prostředí.Zde se mohou signální molekuly šířitv okolním mezibuněčném prostoru, nebovstupovat do lymfatických či krevních céva být roznášeny po celém organismu. Po -kud jsou sekretovanou molekulou ovlivňo -vány buňky v blízkém okolí, hovořímeo parakrinní signalizaci. V případě, že jsousignální molekuly uvolňovány do těles-ných tekutin, jako je krevní sérum, a taktransportovány na velké vzdálenosti pocelém organismu, jde o endokrinní signa-lizaci. Endokrinní signalizace je např. vy -užívána u bílkovinných hormonů vylučo-vaných žlázami s vnitřní sekrecí.

Zvláštním druhem signalizace je přenossignálu mezi dvěma neurony. Neuron vy -sílá výběžkem – axonem – elektrické sig-nály vysokou rychlostí a často na velkévzdálenosti. V místě specializovanéhospoje mezi dvěma nervovými buňkami(synapse) se elektrický signál mění nachemický. Z nervového zakončení axonuse do úzké štěrbiny mezi buňkami uvolnímolekuly nervových mediátorů, které jsouihned navázány na receptory cílové buň-ky. Podobně se přivádí signál z axonůnervových buněk na svalová vlákna, kdemediátory uvolněné z nervového zakon-čení řídí stah např. kosterního svalu.

V tomto článku se zaměříme na mezi-buněčnou komunikaci pomocí sekreceproteinů a popíšeme metody, kterými lzebílkoviny uvolňované z buněk do mimo-buněčného prostředí studovat.

živa 2/201350ziva.avcr.cz

Helena Kupcová Skalníková

Proteinová sekrece buněk savců aneb jak si buňky povídají a jak jim naslouchat

Přežití každé společnosti závisí na komunikaci mezi jedinci. Ať už je to spole-čenství bakterií a kvasinek (viz články M. Kuthana a Z. Palkové, Živa 2000, 1:5–8 a 2002, 1: 2–5), včel v úlu, lidská společnost se všemi svými komunikační-mi vymoženostmi nebo mikroskopický svět buněk utvářejících jeden rostlinný,zvířecí nebo lidský organismus. Buňky se musí mezi sebou „domlouvat“, abyzajistily správný růst, správnou funkci tkání a orgánů, tvorbu energie, tvorbunových buněk a jejich specializaci do jednotlivých tkání (diferenciaci), alei zánik opotřebených nebo poškozených buněk. To vše s jediným cílem: zajistitpřežití organismu a zachování druhu.

1

1 Způsoby komunikace mezi buňkamina malé a velké vzdálenosti (bližšívysvětlení v textu)2 Koncentrace bílkovin krevního séračlověka. Graf ukazuje obrovský rozsahkoncentrací různých bílkovin v séruzdravého člověka. Proteinové a peptidové hormony, růstové faktory,interleukiny a cytokiny dosahují víc než milionkrát nižších koncentrací nežvětšina klasických sérových bílkovin. Analýza málo koncentrovaných molekulvyžaduje vysoce specializované laboratorní techniky.3 Přehled sekreční dráhy. Klasickysekretované bílkoviny se z buněk uvol-ňují sekreční dráhou probíhající přesendoplazmatické retikulum a Golgihoaparát. V těchto organelách docházík úpravám molekul, čímž proteiny získávají svou strukturu a funkci. Trvale(konstitutivně) sekretované proteiny jsou k povrchu buňky dopravoványv transportních váčcích. U regulovanésekrece se obsah sekrečních váčků uvolňuje ven z buňky až po přijetí určitého signálu.

Způsoby mezibuněčné komunikace

přímé propojení cytoplazmy dvou buněk

signalizace závislá na vnějším kontaktu

nervová signalizace

parakrinní signalizace

endokrinní signalizace

spojovací kanálky (gap junctions)

signální proteiny ukotvené v membráně

lokálně působící molekula vytvářená signalizující buňkou

endokrinní buňka vylučuje signální molekulu do krevního řečiště

buňka v okolí přijímá signál svým receptorem

tělo neuronu

rozpoznávané receptoremsousední buňky

molekuly nervového mediátoru

axon

cílová buňka

cílová buňka přijímá signál na velkou vzdálenost

přenos signálu mezi buňkami v místě synapse

Page 2: Proteinová sekrece buněk savců aneb jak si buňky povídají ...ziva.avcr.cz/files/ziva/pdf/proteinova-sekrece-bunek-savcu-aneb-jak-si-bunky-p.pdf · Endokrinní signalizace je

Sekretované bílkovinyTypické sekretované bílkoviny se z buněkuvolňují neustále (konstitutivně). Patřímezi ně bílkoviny krevního séra vytváře-né převážně jaterními buňkami nebo bíl-kovinné složky mezibuněčných prostor(extracelulární matrix) uvolňované buň-kami pojivové tkáně. Jsou tvořeny ve vel-kém množství – např. albumin krevníhoséra dosahuje koncentrací desítek mili -gramů v mililitru séra.

V jiných buňkách jsou bílkoviny určenék sekreci skladovány a uvolní se ven až popřijetí určitého signálu, tedy regulovaně.Takto řízeně jsou vylučovány např. pre-kurzory trávicích enzymů z buněk sliniv-ky břišní nebo bílkoviny mléka z buněkmléčné žlázy. Zvláštním případem jsoubílkoviny, jejichž koncentrace v tělesnýchtekutinách jsou mizivé, ale zároveň dosta-čující k tomu, aby vyvolaly potřebný efektu cílových buněk. Mezi takové bílkoviny

s velmi silným účinkem se řadí proteinovéa peptidové hormony (např. inzulin, gluka -gon, prolaktin, oxytocin a gastrin) a cyto-kiny (interleukiny, interferony, chemokinya růstové faktory, jako např. erytropoetin,epidermální růstový faktor, fibroblastovýrůstový faktor). Koncentrace cytokinů v lid-ském séru dosahují často jen několikajednotek či desítek pikogramů na mili litr,což je o 9 řádů méně než koncentracealbuminu (obr. 2). Tyto vysoce aktivní mo -lekuly nacházejí široké uplatnění v biolo-gickém výzkumu, kde se využívají např.k aktivaci buněk imunitního systému,podpoře množení buněk v buněčnýcha tkáňových kulturách nebo k jejich dife-renciaci do požadovaných buněčnýchtypů. V lékařství se cytokiny a protilátkyproti nim a jejich receptorům začínajíširoce používat v tzv. biologické léčbě (člá-nek o tomto tématu vyjde v následujícímčísle Živy).

Jak sekrece probíháVětšina bílkovin je z buněk vylučovánasekreční dráhou probíhající přes endo-plazmatické retikulum a Golgiho aparát(obr. 3). Tyto dvě buněčné organely jsoutvořeny systémem váčků ohraničenýchlipidovou membránou. Bílkoviny určenék sekreci vstupují dovnitř váčků endo-plazmatického retikula již během své syn-tézy. V endoplazmatickém retikulu a Gol -giho aparátu jsou proteiny upraveny, abyzískaly správnou strukturu a funkci. Váčkyobsahující hotové funkční proteiny na -konec vyprázdní svůj obsah mimo buňkusplynutím membrány váčku s cytoplaz-matickou membránou (tzv. exocytóza).

Typická savčí buňka obsahuje kolem10 000 různých druhů proteinů a každýz nich se musí nacházet na správnémmístě (např. uvnitř mitochondrií, v jádře,lyzozomech, cytoplazmě, nebo být sekre-tován mimo buňku). Třídění proteinů docílových destinací začíná již během jejichsyntézy na cytoplazmatických ribozomech.Většina proteinů určených k sekreci nesena začátku polypeptidového řetězce (N-ko -nec) specifickou sekvenci, která se sklá-dá z jedné nebo více kladně nabitých ami-nokyselin následovaných nepřerušenouřadou 6–12 hydrofobních aminokyselin.Tato signální sekvence dává informaciribozomu, aby se během překladu mRNAdo proteinu navázal na endoplazmatickéretikulum. Vznikající polypeptidový řetě-zec je přímo během své syntézy přenášendo vnitřního prostoru retikula. V něm do -chází k posttranslačním úpravám proteinu,které zahrnují odštěpení signální sekven-ce, správné sbalení proteinu do trojroz-měrné struktury, tvorbu disulfidickýchmůstků, navázání cukerných řetězců a se -stavení proteinů skládajících se z více pod -jednotek. Správně poskládané proteinyjsou transportovány do Golgiho aparátu,zatímco chybně složené jsou odbourány.

Většina sekretovaných proteinů obsahu-je jeden nebo několik cukerných řetězců.V Golgiho aparátu probíhá vazba dalšíchcukerných zbytků na proteiny a zároveňsložitá enzymatická úprava cukerných ře -tězců. Velká část sekretovaných proteinů(např. albumin, inzulin, glukagon) je synte -tizována ve formě neaktivních proproteinůa vyžaduje odštěpení části polypeptidu

ziva.avcr.cz51živa 2/2013

2

3

albu

min

prot

ilátk

y lg

Gtr

ansf

erin

C1

inhi

bito

1-an

titry

psin

prot

ilátk

y lg

1-lip

opro

tein

kom

plem

ent 3

ß-lip

opro

tein

ceru

lopl

asm

inko

mpl

emen

t C4

thyr

oxin

e bi

ndin

g gl

obul

inC

-rea

ktiv

ní p

rote

infe

rriti

nm

yogl

obin

trop

onin

Ipr

osta

ta-s

peci

fický

ant

igen

neur

on-s

peci

fická

eno

láza

tran

skob

alam

incy

toke

ratin

8m

yelin

ový

bazi

cký

prot

ein

trop

onin

Tin

terle

ukin

8pr

okal

cito

nin

inte

rleuk

in 2

TN

inte

rfer

on γ

inte

rleuk

in 6

inte

rleuk

in 1

0

Koncentrace bílkovin krevního séra

klasické sérové bílkoviny

1011

1010

109

108

107

106

105

104

103

102

101

100

bílkoviny uvolněné z tkání

cytokiny

konc

entr

ace

[pg/

ml]

mg/ml

μg/ml

ng/ml

pg/ml

sekreční váček

regulovaná sekrece

uvolnění proteinů do mimobuněčného prostoru

cytoplazmatická membrána

konstitutivní sekrece

transportní váček

transport proteinů ve váčcíchobalených membránou

Golgiho aparát

proteiny určené k sekreci

drsné endoplazmatické retikulum

mRNA

ribozomy

mRNA se do proteinu přepisuje na ribozomechnavázaných na endoplazmatické retikulum

protein během své syntézyvstupuje do vnitřního prostoruretikula

Page 3: Proteinová sekrece buněk savců aneb jak si buňky povídají ...ziva.avcr.cz/files/ziva/pdf/proteinova-sekrece-bunek-savcu-aneb-jak-si-bunky-p.pdf · Endokrinní signalizace je

ke své aktivaci. Tato proteolytická aktiva-ce nastává v Golgiho aparátu, nebo přímov sekrečních váčcích transportovaných odGolgiho aparátu k buněčnému povrchu.Obsah váčků je vyprázdněn ven z buňkypomocí exocytózy.

Některé proteiny, jako např. fibroblas -tový růstový faktor nebo interleukin 1 beta(IL-1ß), nenesou signální sekvenci a ne -vstupují tedy do klasické sekreční dráhypřes endoplazmatické retikulum a Golgi-ho aparát. Takové proteiny se z buněkuvolňují alternativními způsoby. Jednímz nich je přenos proteinu přes cytoplaz-matickou membránu pomocí specializova-ných membránových transportérů, kteréjsou schopné přenést i poměrně objemnéproteiny sbalené do finální trojrozměrnéstruktury. Proteiny se mohou z buněk uvol-ňovat také ve váčcích obalených membrá-nou (mikrovezikuly nebo exozomy), kterémohou navíc obsahovat mediátorovou RNAa krátké nekódující RNA (miRNA z anglic-kého micro RNA), a hrají tak velmi význam -nou úlohu v mezibuněčné komunikacia signalizaci. Existují i další mechanismyneklasické sekrece, které však dosud ne -jsou dostatečně objasněny.

Studium sekretovaných bílkovin v praxiV posledních pěti letech došlo v mnohavědních oblastech k velkému nárůstu zá -jmu o sekretované molekuly. V mikrobiolo -gii probíhá výzkum proteinů uvolňovanýchbakteriemi, kvasinkami a plísněmi, kteréje možné využít v biotechnologiích, potra-vinářském průmyslu, zemědělství nebopři ochraně životního prostředí. Výsledkytěchto studií se uplatňují nejčastěji přivýrobě biopaliv, syntéze chemických lá -tek, potravních doplňků a léčiv, odbourá-vání toxických látek, odpadů a při likvi-daci ropných havárií. Podrobně se takézkoumají interakce mezi mikroorganismya člověkem při infekčních onemocněních.V oblasti základního výzkumu ve vývojo-vé biologii se studují vztahy buněk přiutváření tkání a orgánů vyvíjejícího seembrya. V zemědělství probíhá mimo jinéanalýza složení rostlinných buněčnýchstěn. To vede k získání nových odrůd ovo-ce a zeleniny (např. rajčat) s upravenýmibuněčnými stěnami, které jsou odolnéproti nechtěnému měknutí a znehodnoce-ní plodů během přepravy a skladování.

Problematika sekretovaných bílkovinje snad nejaktuálnější v lidské medicíně,a to zejména v onkologii. Pokud budounalezeny bílkoviny typické pouze pro ná -dorové buňky a přítomné v měřitelnémmnožství v krvi pacienta, bude možné jesnadno využít k odhalení nádorovéhobujení v časném stadiu, kdy onemocněníbývá obvykle ještě poměrně dobře léčitel-né. Molekuly uvolňované z nádorovýchbuněk lze využít nejen pro určení diagnó-zy, ale i pro sledování účinnosti léčby.Další velmi studovanou oblastí jsou lidskácivilizační, metabolická a degenerativníonemocnění, jako např. obezita, cukrovka,vysoký krevní tlak, opotřebení kloubníchchrupavek (artróza) nebo degenerativníonemocnění nervového systému. Zde seintenzivně zkoumají bílkoviny sekreto -vané tukovou tkání, svalovými buňkami,buňkami cévní stěny (endotelové buňky),

ale také kmenovými buňkami, které bybylo možno použít k hojení a obnově po -škozených tkání. Poslední dobou se ukazu -je, že za obnovu poškozené tkáně nemusíbýt zodpovědné pouze kmenové buňky –po dobný efekt mají často molekuly sekre-tované těmito buňkami. Ty pak podporujídělení buněk přítomných v tkáni, zabra-ňují jejich odumírání, a tím se podílejí naregeneraci poškození. S trochou nadsáz-ky můžeme říct, že takto by bylo možnépacientovi ušít na míru koktejl růstovýchfaktorů a dalších molekul, které by mubyly schopny obnovit poškozenou chru-pavku v koleni, srdeční sval po infarktu,nebo třeba zmírnit úbytek nervových bu -něk při Alzheimerově chorobě. Zároveňby zde odpadly některé etické a technic-ké problémy se získáním dostatečnéhopočtu kmenových buněk, zajištěním tole-rance přenesených buněk imunitním systé-mem příjemce apod.

Kdo to tady vlastně mluví?Velmi často nás zajímá, která buňka jezdrojem vysílaných signálů, nebo naopak,které proteiny je buňka schopna za urči-tých podmínek tvořit. To lze jen velmiobtížně zjistit ze vzorku krevního séra,které proudí celým organismem a unášíproteiny produkované různými buňkami.Proto bývá nutné vydat se jinými cestami.

Zdá se, že nejjednodušším řešením jevyjmutí studovaných buněk ven z orga-nismu a jejich pěstování in vitro, tedyv umělém živném roztoku ve formě bu -něčných kultur. Přežití a množení větši-ny buněk v umělém živném médiu závisína přítomnosti séra jako zdroje růstovýchfaktorů a dalších látek. Přítomnost séraa zejména albuminu a dalších hlavních

sérových bílkovin nám ale značně kom-plikuje analýzu sekretovaných proteinůpomocí proteomických technik (viz dále).Proto se buňky pěstují v živném médiubez séra, a to jen několik hodin (typicky6–24 hodin, podle typu buněk), aby nedo-šlo k jejich odumírání, a tím se do živné-ho roztoku neuvolnily také nitrobuněčné

ziva.avcr.cz 52 živa 2/2013

4 Princip imunologických metod. Imunologické techniky využívají vyso-kou citlivost protilátek. Metodou ELISAlze měřit koncentraci jedné bílkoviny(jako příklad je uveden epidermálnírůstový faktor EGF – blíže v textu).Pomocí protilátkových mikročipů nebometody Luminex lze detekovat desítkyaž stovky sekretovaných bílkovin v jed-nom experimentu (zde pro zjednodušeníuvádíme příklad detekce čtyř různýchbílkovin). Ve zkoumaném vzorku je ve větším množství přítomen interleu-kin 2 (IL-2) a v menší koncentraci EGFa tumor nekrotizující faktor alfa (TNFα).Všechny tři metody umožňují stanovitkoncentraci zkoumaného proteinu ve vzorku. U metody ELISA docházík tvorbě barevného produktu enzymemnavázaným na protilátce. Intenzita barvyodpovídá koncentraci měřené bílkoviny.U mikročipů a metody Luminex je proti-látka značená biotinem, na který se vážefluorescenčně značený streptavidin –intenzita jeho fluorescence odpovídámnožství měřené bílkoviny. Fluorescenceprotilátek na mikročipu se detekujepomocí fluorescenčního skeneru.U metody Luminex procházejí kuličkytenkou kapilárou, kde dva lasery zjišťujíbarvu kuličky (tedy který cytokin měří-me) a zároveň fluorescenci streptavidinu.

4

Princip imunologických metod

ELISA Protilátkové mikročipy Luminex kuličky

detekce intenzity barvy

protilátky navázané nakuličkách (každý typ proti-látky na kuličce jiné barvy)

fluorescenční detekce

soubor protilátek rozpoznávajících

růstové faktory, cytokinya jiné sekretované

proteiny

fluorescenční nebo chemiluminiscenční detekce

protilátky natištěné na sklíčkunebo na membráně

přidání vzorku

přidání druhé protilátkyznačené biotinem

IL-2 IL-6 EGF TNF-α

přidání fluorescenčněznačeného streptavidinu

detekce signálu a analýza dat

IL-2IL-2 IL-6

EGF TNF-α

IL-2

IL-2

IL-6

EGF

EGF

EGF

TNF-α

TNF-α

TNF-α

protilátka proti EGF navázaná nadně jamky v mikrotitrační destičce

přidání vzorku

na protilátku se navážerozpoznávaný antigen(EGF)

přidání druhé protilátkyznačené enzymem

druhá protilátka se vážena jiné místo (epitop)antigenu

přidání chromogenníhosubstrátu

tvorba barevného produktu enzymemvázaným na protilátce

Page 4: Proteinová sekrece buněk savců aneb jak si buňky povídají ...ziva.avcr.cz/files/ziva/pdf/proteinova-sekrece-bunek-savcu-aneb-jak-si-bunky-p.pdf · Endokrinní signalizace je

bílkoviny. Médium se poté zkoumá na pří-tomnost proteinů vylučovaných z buněk.V některých případech je vhodné buňkypřed analýzou povzbudit ke zvýšené se -kreci. Pokud jde o řízenou sekreci z buněk,tj. sekreční váčky uvolní svůj obsah ven ažpo přijetí určitého signálu, můžeme zvýše-nou sekreci stimulovat vhodným signálem.Takto se využívá např. lipopolysacharidbuněčné stěny bakterií, tumor nekrotizu -jící faktor alfa (TNFα), interleukin 1 betanebo interferon gama (IFNγ) ke stimulacisekrece buněk imunitního systému (lymfo-cyty, monocyty), některých podpůrných bu -něk nervového systému (astrocyty, mikro -glie) nebo i některých kmenových buněk(mezenchymové kmenové buňky, kmenovébuňky tukové tkáně).

Umělé prostředí buněčných kultur ne -musí zcela napodobovat přirozené pro-středí v organismu a může tedy pozmě-nit buněčnou sekreci. Proto je v určitýchpřípadech výhodné vyjmout celou tkáňa ex vivo sledovat proteiny uvolněné z tká-ně do živného média. Tato strategie bylaúspěšně využita např. k identifikaci pro-teinů sekretovaných buňkami lidské chru-pavky nebo tukové tkáně.

Nejvýhodnější se logicky zdá být ana-lýza sekrece in vivo, tedy přímo v živémorganismu. Toho lze dosáhnout rozboremněkterých lokálně tvořených tělních teku-tin, jako jsou mozkomíšní mok, sliny, moč,plodová voda, synoviální tekutina v klou-bech nebo intersticiální tekutina v tkáních.Nejzajímavější, ale technicky nejnáročnějšíje analýza intersticiální tekutiny, která vy -plňuje mezibuněčné prostory a obsahu-je proteiny lokálně uvolňované buňkamiv jejich přirozeném prostředí. Přímo dotkáně je možné zavést velmi tenkou tru-bičku a odebírat vzorek mezibuněčné teku -tiny pomocí mikrodialýzy nebo kapilárníultrafiltrace. Tyto techniky byly úspěšněpoužity ke studiu sekrece v různých oblas-tech mozku u zdravých a nemocných je -dinců, ale také v jiných tkáních, jako jsoutuková, svalová a jaterní tkáň nebo někte-ré nádory.

Jak naslouchat aneb metody pro analýzu sekretovaných bílkovinPoznávání sekretovaných bílkovin je mož-né zejména díky obrovskému rozvoji ana-lytických metod, k němuž došlo v posled-ním desetiletí. V současnosti existují dvahlavní metodické přístupy – proteomic-ké a imunologické metody.� Proteomické metody využívají k určeníidentity bílkoviny hmotnostní spektro-metrii, která velmi přesně stanoví mole-kulovou hmotnost bílkoviny (nebo bílko-viny rozštěpené na menší peptidy) a podlení se určí, o jaký protein jde. V posledních10 letech byly vyvinuty vysoce speciali-zované techniky umožňující nejen určit,jaké proteiny jsou ve vzorku obsaženy, aletaké zjistit jejich množství. Pomocí hmot-nostní spektrometrie lze velmi úspěšněanalyzovat bílkoviny přítomné v méně slo-žitých proteinových směsích nebo sekre-tované ve větším množství. Složitější smě-si proteinů je vhodné předem rozdělit navíce frakcí, abychom byli schopni deteko-vat i bílkoviny přítomné v menších kon-centracích. Ve velmi složitých směsích,jako je např. krevní sérum, může být alepoužití hmotnostní spektrometrie omeze-né. V analýze krevního séra metoda zatímnení dostatečně citlivá, aby mohla dete-kovat cytokiny a některé růstové faktoryvytvářené tělními buňkami, zejména pakv přítomnosti albuminu a dalších pro -teinů, které jsou v séru mnohonásobněv přebytku. Pro stanovení těchto velmi

málo koncentrovaných bílkovin jsou protovhodné imunologické metody.� Imunologické metody využívají vyso-kou citlivost protilátek k detekci antigenůa mohou se uplatnit i při stanovení bílko-vin přítomných ve velmi malém množství(obr. 4). Pro měření hladiny jedné bílko-viny se používá ELISA (z anglického Enzy-me-Linked ImmunoSorbent Assay). V jam-kách mikrotitrační destičky je navázanáprotilátka proti námi zkoumanému antige-nu (např. epidermálnímu růstovému fak-toru EGF). Po přidání vzorku se moleku-ly EGF ze vzorku zachytí na protilátkyv jamce. Po promytí přidáme další protilát -ku proti EGF, která však rozpoznává jinoučást molekuly EGF (jiný epitop). Na tétodruhé protilátce je navázán enzym, jenž popřidání substrátu vytvoří barevný produkt.Čím bylo více EGF ve vzorku, tím vzniknesytější barva. Proměřením intenzity barvytak můžeme stanovit, jestli byl EGF vevzorku přítomen a v jakém množství.

Nedávno byly vyvinuty imunologickétesty umožňující zároveň detekovat ně -kolik desítek až stovek bílkovin v jednomvzorku, což výrazně snižuje dobu analý-zy i spotřebu samotného vzorku. Principtěchto testů se podobá principu metodyELISA. Protilátky se v tomto případě ne -nacházejí v jamkách destičky, ale jsou na -vázány na membráně či sklíčku ve forměprotilátkových mikročipů (obr. 4 a 5), nebojsou umístěny na kuličkách s definovanouspektrální adresou (zjednodušeně barvou)v případě metody Luminex (obr. 4). Druháprotilátka bývá většinou fluorescenčněznačena. Podle pozice protilátky na čipunebo podle barvy kuličky proto víme, jakýantigen stanovujeme, a na základě in -tenzity fluorescenčního signálu zjistímemnožství stanovovaného proteinu ve vzor-ku. Výhodou fluorescenčního značení jevelký dynamický rozsah, tedy široké roz-mezí koncentrací, v němž lze spolehlivěměřit množství analyzovaných látek vevzorku. To je velmi důležité např. pro sta -novení koncentrací cytokinů, které mohouv případě aktivace buněk nebo při urči-tých onemocněních vzrůst i 100 až 1 000ná -sobně.

ZávěremSekretované bílkoviny hrají velmi význam -nou úlohu v komunikaci mezi buňkamia pomáhají udržet stálost (homeostázu)organismu. Výzkum bílkovin uvolňovanýchbuňkami se těší velkému zájmu vzhledemk možnostem využití výsledků v ekologii,zemědělství, při výrobě chemických látek,ale především v lékařství. V poslednímdesetiletí došlo k obrovskému rozvoji la -boratorních technik pro studium sekreto-vaných bílkovin, které umožnily studo-vat a popsat sekreci mnoha typů buněk.I přes tyto významné pokroky stále nenípřesně známa funkce jednotlivých mole-kul, zejména pak jejich fungování za urči-tých podmínek (např. ve zdraví či nemoci)a jejich účinek v kombinaci s dalšímisekretovanými faktory. Výzkum bílkovinuvolňovaných z buněk tak bude jistě po -pulární i v příštích desetiletích.

Práce vznikla za podpory projektu ME10044.

živa 2/2013 53 ziva.avcr.cz

5 Protilátkové mikročipy pro detekcisekretovaných proteinů.A – Protilátkový mikročip pro měřeníhladin 10 prasečích cytokinů. V každémpolíčku ohraničeném rámečkem je analyzován jeden vzorek prasečího séra. Mikročip umožňuje měřit hladiny 10 cytokinů – po řádcích interleukiny IL-1ß, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, růstový hormon pro granulocytární řaduleukocytů a makrofágy (GM-CSF), inter -feron gama (IFNγ), transformující růstovýfaktor beta 1 (TGFß1), tumor nekrotizujícífaktor alfa (TNFα), každý ve čtyřech opakováních. B – Protilátkový mikročippro detekci 80 různých sekretovanýchproteinů. Jako vzorek byl použit živnýroztok, v němž byly pěstovány lidskéneurony. Buňky do roztoku uvolňovaly některé cytokiny a růstové faktory. C – Mapa mikročipu z obr. B ukazuje rozmístění protilátek detekujících jednot-livé sekretované proteiny. Neurony za daných podmínek uvolňovaly IL-8,monocytární chemotaktický protein 1(MCP-1), vazebný protein 2 pro inzulinupodobný růstový faktor (IGFBP2), osteo-pontin aj. Orig.: H. Kupcová Skalníková

5A B

C


Recommended