ProteomikaProteomikazabývá se převážně hodnocením exprese genetické zabývá se převážně hodnocením exprese genetické informace na úrovni bílkovin (proteomem)informace na úrovni bílkovin (proteomem)

zkoumá též strukturu a interakce proteinůzkoumá též strukturu a interakce proteinů

>gi|288870250|ref|ZP_06409683.1| putative type II restriction-modification enzyme [Clostridium hathewayi DSM 13479]

MDEKTFKLNAKIVREIVELLQAYKFRYEQKHEFLGNFFELLLNTSMKQEAGQFFTPVPITRFIISSLPLKEFVQGKINSRERNVLPTVMDYACGSGHFLTEYMEQLQHVLDEKLDISHAAPDIRKQVSAWQGAVKFAWAKDSVYGIDLDNRLVKTTKVSAFFNGDGEANIIWANGLANFEKAEEYRGLLRQTQHYDRKNNGQFDILISNPPYSVEAFKSTQYGEETFELYDNITDNSSEIECLFVERMKQLLKVGGWAGVILPSSILSNGGIYSKAREIIFKYFRVKAIVELGSGTMKTGTNTVVLFLERRSDNDVITIEKAISTFFSSPKDVTVMGIENAFSKYVANIYDGLAFDDYISFISGRASVAMQEHELYSDYIKAFGDDVYTKGIALEKEKMLYFFLTYTQNIVLVKTGKKQDEKTFLGYEFSERRGHEGIKRLPGGTKLFDENGDLLNPKKANSYIYNAFLGKEIVIDESLSHNVSYGRMSGFISYGTSKFDKAVNLSKKTTFTSSFPSVRLGELVQIIKGVTYSKEDQVYNETNNVILTADNITNSGDFDVVKKVFLRADLTIDGTKKLKQNDIFMCFSSGSKSHVGKSAYISYNTEYFAGGFMGVLRCKSEDVSMKYLWAILSSNQFRHIISQESTGININNLSANLADIKIPLPPLDVQKKIVAEIEEIDREESYIIEQVDALRYSILSAVKNGAAGEPLEKLGVVASYSQDRISCAELSSDTYVGVDNLLQNMEGKGSSQFVPKSGTAIAYSKGNILLSNIRPYLKKIWLADNDGGSSGDVLVLKMDDTKISSKYLYYLLATDEFFEYEMQHIKGVKMPRADKASVLNYNVPIPSLFKQQEIVAEIEKIESEITTRKMRLE

LKKQKGKVLDKYL

Peptidové mapováníPeptidové mapování

I. Štěpení proteinu(ů)(malá variabilita; volba enzymu, reakčních podmínek)

II. Analýza vzniklých peptidových fragmentů (značná variabilita)

1. Chromatografické a elektroforetické metody

2. Hmotnostní spektrometrie na principu MALDI-TOF

3. Hmotnostní spektrometrie na principu LC-MS/MS

Hmotnostní spektrometrie proteinůHmotnostní spektrometrie proteinů

Hmotnostní spektrometrie MALDI-TOFHmotnostní spektrometrie MALDI-TOF

Peptidové hmotnostní mapování (PMM – Peptide Mass Mapping)Peptidové hmotnostní mapování (PMM – Peptide Mass Mapping)

soubor hmotností peptidových fragmentů vzniklých specifickým soubor hmotností peptidových fragmentů vzniklých specifickým štěpením je pro daný protein charakteristický podobně jako otisk prstu štěpením je pro daný protein charakteristický podobně jako otisk prstu pro člověka –proto též PMF (Peptide Mass Fingerprint) pro člověka –proto též PMF (Peptide Mass Fingerprint)

identifikace proteinu porovnáním změřených hmotností peptidů identifikace proteinu porovnáním změřených hmotností peptidů s teoretickými hmotnostmi peptidů v databázi odvozené ze známé s teoretickými hmotnostmi peptidů v databázi odvozené ze známé genové sekvence; genové sekvence;

lze využít též pro detailní studium proteinů (modifikace proteinů, zjištění lze využít též pro detailní studium proteinů (modifikace proteinů, zjištění prostorové lokalizace určitých aminokyselinových zbytků)prostorové lokalizace určitých aminokyselinových zbytků)

Hmotnostní spektrometrie LC-MS/MS

LC-MS/MS

informace o sekvenci peptidových fragmentů

využití - v situacích, kdy není možné spolehlivě separovat proteiny před štěpením trypsinem (např. nelze 2 DE)

Integrální membránové proteiny

lokalizace mezi dvěma světy - komunikace

významné x málo prostudované

Kvantifikace proteinů pomocí hmotnostní spektrometrie

Proč kvantifikovat?

• Znalost hladin proteinů => formulace biologických otázek

• Jak lze proteiny kvantifikovat?

- přímo v gelu po jejich vizualizaci; podmínka – rozdělení proteinů (2 DE)

-pomocí hmotnostní spektrometrie

2 DE

STAV I. STAV II.

NEVÝHODY 2 DE

• Relativně značná technická náročnost

• Nepoužitelnost pro:

- silně hydrofobní membránové proteiny

- analýzu proteinů v pevné fázi

• Proč 2 DE vydržela tak dlouho?

ICAT (Isotope Coded Afinity Tags)

Kvantifikace proteinů s využitím iTRAQ

Jednotlivé kroky iTRAQ

• specifické štěpení různých studovaných vzorků trypsinem

• označení jednotlivých vzorků různými značkami iTRAQ a následné smíchání vzorků

• frakcionace pomocí chromatografie na měničích iontů

• odstranění vedlejších produktů (ZipTip)

• analýza získaných frakcí pomocí LC-MS/MS

• identifikace a kvantifikace proteinů

,

Část fragmentačního spektra obsahující pásy odpovídající signálním skupinám izobarických značek vzorků, v nichž byl poměr kvantit měřeného peptidu 1:1:1:1 (levá část obrázku) a 1:5:2:10 (pravá část obrázku). Převzato z Ross et al. 2004.

štěpení (trypsin)

směs proteinů

2 DE

In gel digest (300)

iTRAQ 1

MALDI/TOF MS (/MS) LC-MS/MS

jednotlivých frakcí

směs proteinů

SDS-PAGE

In gel digest (15-30)

LC-MS/MS

směs proteinů

frakcionace IEC

směs proteinů

štěpení (trypsin)

iTRAQ 2

Smíchání

Rozpustnéproteiny

Membránové proteinyKvantifikace

(gel-free approach)

2 DE

In gel digest (300)

směs proteinů

2 DE

In gel digest (300)

směs proteinůsměs proteinů

2 DE

In gel digest (300)

SDS-PAGE

směs proteinůsměs proteinů

2 DE

In gel digest (300)

směs proteinů

SDS-PAGE

směs proteinůsměs proteinů

2 DE

In gel digest (300)

směs proteinůsměs proteinů

SDS-PAGE

směs proteinůsměs proteinů

2 DE

In gel digest (300)

štěpení (trypsin)

směs proteinůsměs proteinů

SDS-PAGE

směs proteinůsměs proteinů

2 DE

In gel digest (300)

štěpení (trypsin)štěpení (trypsin)

směs proteinůsměs proteinů

SDS-PAGE

směs proteinůsměs proteinů

2 DE

In gel digest (300)

iTRAQ 1

štěpení (trypsin)štěpení (trypsin)

směs proteinůsměs proteinů

SDS-PAGE

směs proteinůsměs proteinů

2 DE

In gel digest (300)

iTRAQ 2iTRAQ 1

štěpení (trypsin)štěpení (trypsin)

směs proteinůsměs proteinů

SDS-PAGE

směs proteinůsměs proteinů

2 DE

In gel digest (300) Smíchání

iTRAQ 2iTRAQ 1

štěpení (trypsin)štěpení (trypsin)

směs proteinůsměs proteinů

SDS-PAGE

směs proteinůsměs proteinů

2 DE

In gel digest (300)

frakcionace IEC

Smíchání

iTRAQ 2iTRAQ 1

štěpení (trypsin)štěpení (trypsin)

směs proteinůsměs proteinů

SDS-PAGE

směs proteinůsměs proteinů

2 DE

In gel digest (300)

LC-MS/MS

frakcionace IEC

Smíchání

iTRAQ 2iTRAQ 1

štěpení (trypsin)štěpení (trypsin)

směs proteinůsměs proteinů

SDS-PAGE

směs proteinůsměs proteinů

2 DE

In gel digest (300) In gel digest (15-30)

LC-MS/MS

frakcionace IEC

Smíchání

iTRAQ 2iTRAQ 1

štěpení (trypsin)štěpení (trypsin)

směs proteinůsměs proteinů

SDS-PAGE

směs proteinůsměs proteinů

2 DE

In gel digest (300)

MALDI/TOF MS (/MS)

In gel digest (15-30)

LC-MS/MS

frakcionace IEC

Smíchání

iTRAQ 2iTRAQ 1

štěpení (trypsin)štěpení (trypsin)

směs proteinůsměs proteinů

SDS-PAGE

směs proteinůsměs proteinů

2 DE

In gel digest (300)

MALDI/TOF MS (/MS)

In gel digest (300)

MALDI/TOF MS (/MS)

2 DE

In gel digest (300)

MALDI/TOF MS (/MS)

směs proteinů

2 DE

In gel digest (300)

MALDI/TOF MS (/MS)

směs proteinůsměs proteinů

2 DE

In gel digest (300)

MALDI/TOF MS (/MS)

SDS-PAGE

směs proteinůsměs proteinů

2 DE

In gel digest (300)

MALDI/TOF MS (/MS)

In gel digest (15-30)

SDS-PAGE

směs proteinůsměs proteinů

2 DE

In gel digest (300)

MALDI/TOF MS (/MS)

LC-MS/MS

In gel digest (15-30)

SDS-PAGE

směs proteinůsměs proteinů

2 DE

In gel digest (300)

MALDI/TOF MS (/MS) LC-MS/MS

jednotlivých frakcí

LC-MS/MS

In gel digest (15-30)

SDS-PAGE

směs proteinůsměs proteinů

2 DE

In gel digest (300)

MALDI/TOF MS (/MS)

frakcionace IEC

LC-MS/MS jednotlivých frakcí

LC-MS/MS

In gel digest (15-30)

SDS-PAGE

směs proteinůsměs proteinů

2 DE

In gel digest (300)

MALDI/TOF MS (/MS)

Smíchání

frakcionace IEC

LC-MS/MS jednotlivých frakcí

LC-MS/MS

In gel digest (15-30)

SDS-PAGE

směs proteinůsměs proteinů

2 DE

In gel digest (300)

MALDI/TOF MS (/MS)

iTRAQ 1

Smíchání

frakcionace IEC

LC-MS/MS jednotlivých frakcí

LC-MS/MS

In gel digest (15-30)

SDS-PAGE

směs proteinůsměs proteinů

2 DE

In gel digest (300)

MALDI/TOF MS (/MS)

iTRAQ 2iTRAQ 1

Smíchání

frakcionace IEC

LC-MS/MS jednotlivých frakcí

LC-MS/MS

In gel digest (15-30)

SDS-PAGE

směs proteinůsměs proteinů

2 DE

In gel digest (300)

MALDI/TOF MS (/MS)

štěpení (trypsin)

iTRAQ 2iTRAQ 1

Smíchání

frakcionace IEC

LC-MS/MS jednotlivých frakcí

LC-MS/MS

In gel digest (15-30)

SDS-PAGE

směs proteinůsměs proteinů

2 DE

In gel digest (300)

MALDI/TOF MS (/MS)

štěpení (trypsin)štěpení (trypsin)

iTRAQ 2iTRAQ 1

Smíchání

frakcionace IEC

LC-MS/MS jednotlivých frakcí

LC-MS/MS

In gel digest (15-30)

SDS-PAGE

směs proteinůsměs proteinů

2 DE

In gel digest (300)

MALDI/TOF MS (/MS)

směs proteinů

štěpení (trypsin)štěpení (trypsin)

iTRAQ 2iTRAQ 1

Smíchání

frakcionace IEC

LC-MS/MS jednotlivých frakcí

LC-MS/MS

In gel digest (15-30)

frakcionace - C4

směs proteinůsměs proteinů

2 DE

In gel digest (300)

MALDI/TOF MS (/MS)

směs proteinůsměs proteinů

štěpení (trypsin)štěpení (trypsin)

iTRAQ 2iTRAQ 1

Smíchání

frakcionace IEC

LC-MS/MS jednotlivých frakcí

LC-MS/MS

In gel digest (15-30)

SDS-PAGE

směs proteinůsměs proteinů

2 DE

In gel digest (300)

MALDI/TOF MS (/MS)

Membránové proteinyKvantifikace

(gel-free approach)Rozpustné

proteinyMembránové proteiny

Kvantifikace(gel-free approach)

frakcionace - C4 frakcionace - C4