Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul

Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul 1

strukturní informaci lze získat v relativně krátkém čase (proto strukturní informaci lze získat v relativně krátkém čase (proto nachází využití například v proteomice)nachází využití například v proteomice)

neomezuje se pouze na statický obrázekneomezuje se pouze na statický obrázek (citlivost ke změnám, (citlivost ke změnám, možnost dynamických studií)možnost dynamických studií)

velikost studovaných molekul a povaha okolního prostředí velikost studovaných molekul a povaha okolního prostředí nepředstavují žádné omezení (a nebo jen výjimečně)nepředstavují žádné omezení (a nebo jen výjimečně)

je to mimořádně vhodná metoda pro zkoumání vztahu mezi je to mimořádně vhodná metoda pro zkoumání vztahu mezi strukturoustrukturou aa funkcí biomolekulfunkcí biomolekul

Proč vibrační spektroskopieProč vibrační spektroskopie ? ?


Výhody vibračníVýhody vibrační spektroskopiespektroskopie

RS a IČ jsou nedestruktivní metody (možnost testování biologické aktivity po skončení měření).

Aplikovatelné na vzorky libovolné morfologie (roztoky vodné i nevodné, suspenze, precipitáty, gely, vrstvy, vlákna, prášky, monokrystaly, …). Pro biomolekuly lze tak ověřit nakolik se shoduje či naopak odlišuje jejich struktura v krystalu a v roztoku.

Nenáročné na objem vzorku (cca 10 l pro konvenční RS, 20 l pro IČ).

Rychlá časová škála absorpce i rozptylu ( 10-15 s) využití vibrační spektroskopie pro časově rozlišené studie procesů, které nejsou přístupné pomocí fluorescence či NMR.

Existence rozsáhlé databáze IČ a Ramanových spekter (včetně přiřazení pásů jednotlivým vibracím a známých strukturně-spektrálních korelací).


Specifické výhody Ramanovy spektroskopieSpecifické výhody Ramanovy spektroskopie

Voda pVoda přředstavuje pro Ramanovu spektroskopii edstavuje pro Ramanovu spektroskopii ideální rozpouštědloideální rozpouštědlo (na (na

rozdíl od Irozdíl od IČČ). ).

Intenzívní pásy v Ramanových spektrech pocházejí od vibrací, pIntenzívní pásy v Ramanových spektrech pocházejí od vibrací, přři i kterých dochází k velké zmkterých dochází k velké změěnněě polarizovatelnosti (nap polarizovatelnosti (napřř. aromatické . aromatické molekuly).molekuly).

RelativnRelativněě snadné m snadné měřěření i v oblasti nízkých vlnoení i v oblasti nízkých vlnoččttůů (pod 400 cm (pod 400 cm-1-1, , daleká Idaleká IČČ oblast) oblast)

Selektivní rezonanSelektivní rezonančční zesílení (tzv. rezonanní zesílení (tzv. rezonančníční Raman Ramanůův jev).v jev).

Povrchem zesílený RamanPovrchem zesílený Ramanůův rozptyl (SERS)v rozptyl (SERS)


NevNevýhody vibrační spektroskopieýhody vibrační spektroskopie

Spektrální rozlišení je sice vyšší než v elektronových spektrech, ale nižší ve srovnání s NMR. Nedostatečné rozlišení může být částečně kompenzováno chemickou (izotopická zámizotopická záměěnana) nebo biologickou (bodová mutacebodová mutace) modifikací.

Jsou potřeba relativně vysoké koncentrace vzorku ( 10-100 g/l) byť v malých objemech.

Jak H2O tak i D2O nejsou ideálním rozpouštědlem pro IČ spektroskopii

(na rozdíl od Ramanova rozptylu).

Ramanův jev (nepružný rozptyl světla) je ze své podstaty slabý jev (ve srovnání s absorpcí nebo emisí světla). Je tedy nutná značná čistota vzorků a péče při manipulaci s nimi (velmi vadí fluorescence příměsí).


Pásy ve vibračním spektru představují detailní a jedinečný „otisk prstu“ dané molekuly.

Složité molekuly vibrační módy a jim příslušející spektrální pásy nemohou být přímo přiřazeny souřadnicím výchylek atomů ani z nich jednoduše vypočítány.

vibrační spektrum nelzenelze použít pro výpočet struktury.

Vibrační spektrum daného strukturního motivu nemůže sloužit jako „otisk prstu“ této struktury dokud s ní není korelováno pomocí nezávislé metodynezávislé metody.

Jako základ pro stanovení takové korelace zpravidla slouží struktury určené pomocí difrakčních nebo NMR metod.

Každý pás ve spektru odpovídá vibraci specifické skupiny atomů (tzv. normální vibrační módnormální vibrační mód) s dobře definovanými geometrickými charakteristikami (délka vazby, vazebné úhly, atd.) správně přiřazený pás může sloužit jako jednoznačný indikátor (strukturní marker)jednoznačný indikátor (strukturní marker) tohoto strukturního rysu.

Vibrační konformační markeryVibrační konformační markery


C2’ endo/anti C3’ endo/anti C2’ endo/anti (pyrimidiny)C3’ endo/syn (puriny)

B-DNA A-DNA Z-DNA

Obrázky skeletu B-DNA, A-DNA, a Z-DNA. Každé vlákno B-DNA a A-DNA obsahuje 20 nukleotidů stejné sekvence. Z-DNA je tvořena alternujícími GC páry.

Kanonické strukturyKanonické struktury DNA DNA


Ramanova spektra krystalů A-, B-, a Z-DNA. Označeny jsou nukleosidovénukleosidové a páteřnípáteřní konformační markery.

Spektra kanonických strukturSpektra kanonických struktur DNA DNA


A·B hybrid

B-form

A-form

A-form

A.A. poly(rA)poly(rA)..poly(dT)poly(dT), pH 7.5 , pH 7.5 vv 0.1 M NaCl ( 0.1 M NaCl (AA··BB hybrid hybridní strukturaní struktura))B.B. poly(dA-dT).poly(dA-dT)poly(dA-dT).poly(dA-dT), pH 7.5 , pH 7.5 vv 0.1 M NaCl ( 0.1 M NaCl (B-formB-form))C.C. poly(dA-dT).poly(dA-dT)poly(dA-dT).poly(dA-dT) vláknovlákno připři 75% 75% relativní vlhkostirelativní vlhkosti ( (A-formA-form))D.D. ppoly(rA).poly(dT)oly(rA).poly(dT) vláknovlákno připři 75% 75% relativní vlhkostirelativní vlhkosti ( (A-formA-form))

Určení strukturyUrčení struktury RNARNA··DNADNA hybridhybridu v roztokuu v roztoku

RamanRamanovaova spektraspektra


Raman spectra of poly(rA)+poly(rU) mixtures

Raman shift (cm-1)

600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800

Inte

nsity

(re

lativ

e un

its)

0

50

100

150

2000 % A5 % A10 % A15 % A20 % A24 % A30 % A36 % A42 % A50 % A56 % A65 % A75 % A85 % A95 % A100 % A

InteraInterakcekce poly(rA) poly(rA) ss poly(rU) poly(rU) v roztoku v roztoku

Soubor Ramanových spekter série vzorků poly(rA) a poly(rU) s postupně se měnícím poměrem A:U od čistého poly(rU) (červené) k čistému poly(rA) (fialové). Spektra byla normalizována a signál rozpouštědla byl odečten.


InteraInterakcekce poly(rA) poly(rA) ss poly(rU)poly(rU)

Výsledky faktorové analýzy aplikované na první derivaci souboru Ramanových spekter směsi poly(rA) s poly(rU) s měnícím se poměrem A:U.

faktorová dimenze = 4faktorová dimenze = 4

11

Constructed RS of poly(rA)

wavenumbers / cm-1600 800 1000 1200 1400 1600

Inte

nsi

ty /

rel.

un

its

0

20

40

60

80

100

120

140

Constructed RS of poly(rU)

wavenumbers / cm-1600 800 1000 1200 1400 1600

Inte

nsi

ty /

rel.

un

its

020406080

100120140160180200220

Constructed RS of poly(rA).poly(rU)

wavenumbers / cm-1600 800 1000 1200 1400 1600

Inte

nsi

ty /

rel.

un

its

0

20

40

60

80

100

120

140

Constructed RS of poly(rU).poly(rA).poly(rU)

wavenumbers / cm -1600 800 1000 1200 1400 1600

Inte

nsi

ty /

rel.

un

its

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

Constructed UV abs. spectrum

of poly(rA)

wavelength / nm220 240 260 280 300

Ab

sorb

an

ce /

rel.

un

its

0

1

2

3


of poly(rU)

wavelength / nm220 240 260 280 300

Ab

sorb

an

ce /

rel.

un

its

0

1

2

3


of poly(rA).poly(rU)

wavelength / nm220 240 260 280 300

Ab

sorb

an

ce /

rel.

un

its

0

1

2

3


of poly(rU)poly(rA).poly(rU)

wavelength / nm220 240 260 280 300

Ab

sorb

an

ce /

rel.

un

its

0

1

2

3

Calculated fractions of species

poly(rA) content / %0 20 40 60 80 100

Re

lativ

e f

ract

ion

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

single str. poly(rA)single stranded poly(rU)duplex poly(rA).poly(rU)triplex poly(rU).poly(rA).poly(rU)

78

2

99

8

10

92

12

30

16

27

14

711

39

7

16

87

72

7

11

01

78

48

14

12

32

13

02

13

38

14

82

15

74

16

22

16

89

63

26

30

64

7

72

77

82

81

6

86

9 10

91

11

02

11

83

12

36

12

62

13

01 1

34

81

38

1

14

80

13

78

15

13 1

57

61

61

51

67

01

69

41

72

9

92

39

81

10

06

15

10

91

9

98

51

00

8

64

3

91

8

64

4

72

7

81

1

10

08

10

98

11

77

12

19

12

52

13

05

13

38

13

79

14

25

14

84

15

09 1

57

9

InteraInterakcekce poly(rA) poly(rA) ss poly(rU) poly(rU)

Byly identifikovány 4 složky:Byly identifikovány 4 složky:

jednovláknová poly(rU),

jednovláknová poly(rA),

poly(rA).poly(rU) duplexduplex

a

poly(rU):poly(rA)*poly(rU) triplextriplex.

Byla izolována spektra čistých Byla izolována spektra čistých komponent.komponent.


Povrchem zesílený Ramanův rozptyl (SERS)Povrchem zesílený Ramanův rozptyl (SERS)

Mechanismy zesíleníMechanismy zesílení = . E

povrchový povrchový plasmonplasmon


Příklady SERS aktivních povrchů IPříklady SERS aktivních povrchů I

zdrsněná elektrodazdrsněná elektroda

Sanchéz-Cortés et al. Langmuir 17, 1157 (2001)

ostrůvkovité filmyostrůvkovité filmy


Příklady SERS aktivních povrchů IIPříklady SERS aktivních povrchů II

kovové koloidy kovové koloidy (připravené chemicky nebo laserovou ablací)

vlnová délka (nm) vlnová délka (nm)vlnová délka (nm)


Laserová ablaceLaserová ablace

Procházka et al., Anal. Chem. 69, 5103 (1997)

Nd/YAG pulzní laser, 1064 nm, opakovací frekvence 10 Hz , délka pulzu 20 ns,

7 ml Ag koloidu je připraveno během 15 minutové ablace

Munro et al., Langmuir 11, 3712 (1995)

laserová ablace - příprava chemicky čistého koloidulaserová ablace - příprava chemicky čistého koloidu


Příklady SERS aktivních povrchů IIIPříklady SERS aktivních povrchů III

koloidní částice imobilizované na silanizovaných skleněných podložkáchkoloidní částice imobilizované na silanizovaných skleněných podložkách

PORPHYRIN METALATION IN Ag COLLOIDAL SYSTEMS

FREE BASE PORPHYRIN METALATED PORPHYRIN

5, 10, 15, 20-tetrakis(1-methyl-4-pyridyl) porphyrin (H2TMPyP)

NH N

N HN

+NCH3

+N

CH3

N+

CH3

N+

CH3

+NCH3

+N

CH3

N+

CH3

N+

CH3

Ag

N

N N

NAg+

PORPHYRIN METALATION(Undesirable or desirable effect?)

Direct adsorption of free base porphyrin onto the metal surface PORPHYRIN METALATION

• Impossible to obtain SERS spectrum of unperturbed free base porphyrin • Irreproducibility of spectral measurement

Can metalation serve to obtain information about Ag colloid/porphyrin

system and porphyrin itself?

• Detail investigation and quantitative analysis of metalation process

• Determination of metalation kinetics as a probe of Ag colloid/porphyrin

systems

Can we protect porphyrin against metalation?

Yes, by appropriate molecular spacer

QUANTITATIVE ANALYSIS OF METALATION PROCESS

3. Determination of METALATION KINETICS as a time-dependent

fraction of pure metalated porphyrin forms in the original spectra

2. Construction of SERRS spectra of PURE PORPHYRIN FORMS as a linear combination of subspectra

1. FACTOR ANALYSIS (singular value decomposition algorithm)

Hanzlíková et al., J. Raman Spectr. 29, 575 (1998)

= 1 - exp (- t / )


Návrh rychlého DNA sekvenátoru na principu SERSNávrh rychlého DNA sekvenátoru na principu SERS

Kneipp et al., Appl. Spectrosc. 60, 322A (2007)


Time-elapsed video image of intermittent light emission recorded from a single silver nanoparticle.The elapsed time between images is 100 ms, and the signal intensities are indicated by gray scales.

Single molecule SERSSingle molecule SERS

„„blinking“blinking“


Localized Localized Surface Surface Plasmon Plasmon

ResonanceResonance(LSPR)(LSPR)

Surface PlasmonSurface Plasmon ResonanceResonance

(SPR)(SPR)

Surface-Enhanced Surface-Enhanced RamanRaman Scattering Scattering

(SERS)(SERS)

max of LSPR depends on the size, shape, interparticle spacing, dielectric properties of particles and

local environment

SERS can detect the presence of particular species and/or their interactions

Biosenzory založené na SERS ? Biosenzory založené na SERS ?


JACS 127, 2264 (2005)




Date post:	17-Jan-2016
Category:	Documents
Upload:	faris
View:	53 times
Download:	11 times

Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul

Documents