FACULTAD DE MEDICINA.
Departamento de Medicina Física y Farmacología .
Regulación de la Expresión de la Selectina-L
en Leucocitos por Radicales Libres de
Oxígeno (ROS) y Metaloproteasas.
TESIS DOCTORAL
María Jesús Domínguez Luis.
2008
DEPARTAMENTO DE MEDICINA FÍSICA Y FARMACOLOGÍA.
FACULTAD DE MEDICINA.
Regulación de la Expresión de la Selectina-L
en Leucocitos por Radicales Libres de
Oxígeno (ROS) y Metaloproteasas.
Memoria para aspirar al grado de doctor por la
Universidad de La Laguna presentada por
María Jesús Domínguez Luis.
Directores:
Dr. Manuel Feria Rodríguez.
Dr. Federico Díaz González.
La Laguna, a 17 de Julio de 2008.
D. Manuel Feria Rodríguez, Catedrático del Departamento de Medicina
Física y Farmacología de la Facultad de Medicina de la Universidad de la
Laguna.
D. Federico Díaz González, Profesor asociado del Departamento de
Medicina Interna de la Universidad de La Laguna.
CERTIFICAN:
Que Dña. María Jesús Domínguez Luis ha realizado bajo su
dirección el trabajo titulado: Regulación de la Expresión de la
Selectina-L en Leucocitos por Radicales Libres de O xígeno
(ROS) y Metaloproteasas, que presenta para optar al grado de
Doctor por la Universidad de La Laguna.
Para que conste y surta los efectos oportunos, firmamos el presente
certificado en La Laguna a 17 de Julio de 2008.
Manuel Feria Rodríguez. Federico Díaz González
Catedrático del Departamento de Profesor Asociado del
Medicina Física y Farmacología Departamento de Medicina Interna
Dedico esta tesis
a mi madre, a mi hermano,
y también a mi padre que
aunque no esté físicamente,
siempre está conmigo. Por supuesto,
a mis amigos, Lidia, Pili, Noemi y Pedro,
que son mi segunda familia.
Agradecimientos
AGRADECIMIENTOS
En primer lugar quiero agradecer al Dr. Manuel Feria y al Dr. Federico Díaz
González, por darme la oportunidad de llevar a cabo esta tesis doctoral, y por confiar
en mí durante estos años. Por supuesto, a todos los médicos del Servicio de
Reumatología del Hospital Universitario de Canarias, tanto a los que están como a los
que ya se han ido, porque siempre nos han apoyado: Sagrario, Elisa, Iván, Alberto,
Juanjo, Juan Carlos, Sergio, Cristina, Sigrid, Vanesa y Esmeralda.
A mis compañeras, Ada, Mayte, Ana y Elsa por el apoyo incondicional que me
han aportado en todos los sentidos, sin ellas nada hubiera sido lo mismo, ya que
además del apoyo me han dado su amistad, que para mí ha significado mucho.
A todo el laboratorio de Inmunología del Dr. Francisco Sánchez Madrid del
Hospital Universitario de La Princesa en Madrid, por haberme tratado tan bien en mi
estancia allí y por hacerme un hueco en su laboratorio. Además, a Carmen, Isidoro,
Txaro y sobre todo a Mariví, porque con ella aprendí muchas cosas. También a
Paloma, Enrique, Nacho, Laura, y todas las personas que me hicieron sentir allí como
si estuviera en casa.
Al Dr. Agustín Valenzuela y también a sus becarios Jonathan y Laura, que
llegaron tarde pero con fuerza, les agradezco que me hayan dado esos momentos tan
agradables y divertidos.
Al Dr. Ricardo Borges por dejarnos usar parte de su laboratorio. También, a sus
becarios, David, Jose, Jesica, Yezer, Bea, Dani y en especial a Marcial y a Mónica
porque siempre han estado ahí y porque para mi son mucho más que compañeros de
trabajo.
A la Dra. Teresa Giráldez y al Dr. Diego Álvarez de la Rosa por ayudarme con
la biología molecular y otras muchas cosas, y a sus becarios Iván y sobre todo Alberto,
que me ha hecho reír muchas veces.
A las enfermeras del laboratorio central del Hospital Universitario de Canarias
por su apoyo y paciencia.
A todos aquellos/as que no he nombrado pero que me han aportado su ayuda
en la realización de este trabajo.
RESUMEN
Diversos trabajos ya clásicos, han demostrado que la selectina-L, una molécula
de adhesión que se expresa en los neutrófilos, sufre un corte proteolítico por la acción
de una metaloproteasa de superficie durante la fase de rodamiento de la cascada de
adhesión. Sin embargo, los mecanismos que regulan el procesamiento del ectodominio
de la selectina-L y su significado fisiopatológico, durante la respuesta inflamatoria,
están sin aclararse. En este trabajo, presentamos datos que muestran que la pérdida
de expresión de la selectina-L y la producción de radicales libres de oxígeno (ROS) en
neutrófilos humanos son eventos interrelacionados. En experimentos in vitro, el corte
de la selectina-L es desencadenado en respuesta a un factor soluble producido por los
neutrófilos, que actúa por un mecanismo autocrino-paracrino. Este factor es inestable y,
además, es inhibido por compuestos antioxidantes, hecho que podría indicar que
puede ser un ROS. Hemos observado que la producción de radicales libres por
neutrófilos se inicia en respuesta a la interacción neutrófilo-endotelio, y va aumentando
a lo largo del tiempo de interacción con la célula endotelial. Además, nuestros datos
indican que la producción de ROS por neutrófilos puede ser un sistema fisiológico para
regular la respuesta inflamatoria, mediante la inducción del corte de la selectina-L por
un mecanismo que requiere la presencia de ADAM-17 o TACE.
Diversos datos experimentales sugieren que otras metaloproteasas, además de
TACE, pueden estar implicadas en el corte y liberación de la selectina-L en neutrófilos.
EL ADAM-8, otro miembro de la familia ADAM, se expresa en varios tipos celulares
incluyendo neuronas, osteoclastos y leucocitos, y además, está implicado en
osteoclastogénesis y procesos neurodegenerativos. En este trabajo, se muestra que el
ADAM-8 se expresa constitutivamente en la superficie celular y en los gránulos de
neutrófilos humanos. Durante la activación celular in vitro e in vivo el ADAM-8 se
sobreexpresa en la superficie de los neutrófilos y se libera al medio por la acción de
una metaloproteasa. Tanto el ADAM-8 presente en la superficie celular como su forma
soluble es capaz de procesar la selectina-L, lo que sugiere un papel muy relevante de
esta metaloproteasa en la respuesta inflamatoria.
1
ÍNDICE
Índice
3
ÍNDICE
ÍNDICE………………………………………………………………………………….1
ABREVIATURAS ……………………………………………………………………..9
INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………….13
1. LA RESPUESTA INFLAMATORIA………………………………….…….13 2. EL NEUTRÓFILO………………………………………..…………………..15
Descripción, morfología y función……………………………………………… 15
Papel de los PMN neutrófilos en la inflamación…………… …………………18
Los eventos tempranos……………………………………………………………18
a) Familia de las selectinas…………………………………..………………19
a.1) La selectina-L ………………………………………………………………21
a.2) La selectina-E ……………………………….……………………………...23
a.3) La selectina-P ………………………………………………………………24
b) Familia de las integrinas…………………………………………………..26
c) Superfamilia de las Inmunoglobulinas……………..…………… ……..30
Los eventos tardíos……………….………………………………………………..33
a) Fagocitosis…………………………………………………………………..33
b) Degranulación……………………………………………………………….33
c) Generación de radicales libres de oxígeno o ROS (reactive oxigen
specie) o estallido respiratorio…………………………………………….. ..33
c.1) Estrés oxidativo ………….…………………………………………………34
c.2) Efectos químicos y biológicos ……………………………………..……36
c.3 ) Efectos dañinos ……………………………………………………………37
d) Síntesis y secreción de los mediadores inflamato rios………...…....39
Índice .
4
d.1) Citoquinas ………………………………………………………..………….39
d.2) Eicosanoides y leucotrienos …………………………………..…………39
3. CASCADA INFLAMATORIA……….……………………………………………40
4. ANTIINFLAMATORIOS NO ESTEROIDEOS…………………………………44
5. ADAM (A Disintegrin And Metalloproteinase )....…………….………….....45
5.1 ADAM-8…………………………………………………………………………..46
OBJETIVOS…………………………………………………………………………..51
MATERIAL Y MÉTODOS …………………………………………………………...55
1.REACTIVOS………………………………………………………………...……..55
1.1 Anticuerpos…………………………………………………….……………….55
1.2 Antiinflamatorios no esteroideos (AINE)……………... …………………...56
1.3 Antioxidantes e inhibidores de metaloproteasas… ……………………...56
1.4 ADAM-8 recombinante………………………………………………………...56
1.5 Otros reactivos………………………………………………………………….56
2. CONSTRUCCIONES DE ADN Y TRANSFECCIONES.……………….….…57
2.1 Transfecciones………………………………………………………………….57
3. CÉLULAS PRIMARIAS Y LÍNEAS CELULARES………………….………. ..58
3.1 Neutrófilos humanos…………………………………………………………..58
3.2 Células HUVEC (células endoteliales de cordón u mbilical)..…………..58
3.3 Células DRM (monocitos de ratón inmortalizados) ……………………...59
3.4 Células HEK 293 (línea celular embrionaria huma na)…………..……….59
3.5 Células CEM (línea T linfoblástica humana)…………… ………………....60
4. PACIENTES………………...……………………………………………….........60
5. CITOMETRÍA DE FLUJO……….………………………………………….……60
5.1 Definición…………………………………………………………………..........60
Índice
5
5.2 Experimentos con H 2O2 y AINE………………………………………………61
5.3 Experimentos con sobrenadante celulares.………………… ……………62
5.4 Experimentos con ADAM-8 recombinante..……………………… ……….62
5.5 Análisis……………………………………………………………………..........62
6. WESTERN-BLOT…………………………………………………………………63
7. CUANTIFICACIÓN POR ELISA DE LA SELECTINA-L Y ADA M-8
SOLUBLE..……………...……………………………………………………………64
7.1 Análisis…………………………………………………………………………..65
8. ENSAYOS DE INTERACCIÓN ENDOTELIO-NEUTRÓFILO EN C ÁMARA
DE FLUJO…………………………………………………………………………….65
8.1 Análisis…………………………………………………………………………..68
9. DETECCIÓN DE ROS……………………...…………………………………….68
9.1 Análisis……………… ………………………………………………………….68
10.INMUNOFLUORESCENCIA…...……………………………………………….69
11. MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA……………...………………………………69
12. FRACCIONAMIENTO SUBCELULAR……..…………………………………70
13. ANÁLISIS ESTADÍSTICO…………………..………………………………….71
RESULTADOS……………………………………………………………………….75
1. La expresión de la selectina-L en neutrófilos se regula por un factor
soluble endógeno……………………………………………………..……………75
2. El factor soluble, liberado por los neutrófilos activados es inestable a lo
largo del tiempo………………..…………………………………………………...78
3. El peróxido de hidrógeno reduce la expresión en superficie de la
selectina-L en neutrófilos humanos…………………………………………… .80
4. La pérdida de expresión de la selectina-L correl aciona con la
producción de ROS intracelular en neutrófilos…..... ....................................82
Índice .
6
5. La pérdida de expresión de la selectina-L en neu trófilos humanos por
H2O2 requiere de la presencia de TACE………..…………………….....… ……84
6. La producción de ROS es inducida en los neutrófi los durante la
interacción dinámica con células endoteliales……………… ..………………85
7. Caracterización del anticuerpo monoclonal anti-A DAM-8……………….90
8. Localización subcelular de ADAM-8 en neutrófilos humanos…..……..93
9. El ADAM-8 es transportado a la membrana celular y s ecretado durante
la activación del neutrófilo……………………………………………………….. 97
10. El ADAM-8 se sobreexpresa en neutrófilos durant e la respuesta
inflamatoria in vivo ……………………………………………………….……….100
11. El ADAM-8 es capaz de inducir el corte de la se lectina-L…….……….102
DISCUSIÓN…………………………………………………………………………109 CONCLUSIONES…………………………………………………………………..119 BIBLIOGRAFÍA …………………………………………………………………….123 ANEXO………………………………………………………………………………141
ABREVIATURAS
Abreviaturas.
9
ABREVIATURAS
AA Aminoácidos Acm(s) Anticuerpo(s) monoclonal(es) ADNc Ácido desoxiribonucleico (complementario) ADAM Dominio disintegrina y metaloproteasa ADAM-8 fl ADAM-8 humano nativo ADAM-8 mut ADAM-8 humano mutado ADAM-8s ADAM-8 humano soluble AINE Antiinflamatorios no esteroideos AR Artritis Reumatoide ARN Ácido Ribonucleico ARNm Ácido Ribonucleico mensajero ATP Adenosina Trifosfato BSA Albúmina Sérica Bovina CE Células Endoteliales Cels Células CEM Línea celular T linfoblásticas humana CGD Enfermedad Granulomatosa Crónica CHL1 Molécula de adhesión celular neural CLA Antígeno Cutáneo Leucocitario Col Colágeno COX Ciclooxigenasas CR Región rica en cisteínas CRD Dominio lectina o de unión a carbohidratos DHE Dihidroetidio DMPS Ácido sulfónico 2,3-dimercapto-1-propano DMSO Dimetil sulfóxido DRM Línea celular de monocitos inmortalizados de ratón DTT DL- Ditiotreitol ECGF Factor de crecimiento de células endoteliales EGF Factor de crecimiento epidérmico EGTA Ácido tetracético etilen glicol (agente quelante) ELAM-1 Molécula de adhesión endotelio-leucocitaria ELISA Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas ERM Ezrina Radixina Moesina ES Error estandar ESL-1 Ligando de selectina-E-1 FCS Suero de ternera fetal FITC Isotiacianato de fluoresceína FMLP Formyl-Methionyl-Leucyl-Phenylalanina GM-CSF Factor estimulador de colonias granulocítico-macrofágica G-CSF Factor estimulador de colonias granulocíticas GM6001 Inhibidor de metaloproteasas basado en ácido hidroxámico GTP Guanosín Trifosfato HBSS Hank's Buffered Salt Solution HEK 293 Línea celular embrionaria de riñón humano HEV Células endoteliales de las paredes altas de las vénulas poscapilares HLA Complejo mayor de histocompatibilidad HRP Peróxidasa de rábano HSVP Proteína hemorrágica de veneno de serpiente
Abreviaturas .
10
HUVEC Célula endotelial de vena de cordón umbilical humana H2O2 Peróxido de hidrógeno HOCL Ácido hipocloroso ICAM-1 Molécula de adhesión intercelular-1 ICAM-2 Molécula de adhesión intercelular-2 IFMr Intensidad de Fluorescencia Media relativa IFN-γ Interferón-gamma IgG1 Inmunoglobulina-1 IL-1 α/β Interleuquina-1 alfa/beta JAM Junctional Adhesion Molecules Jurkat T/J77 Línea celular de leucemia de linfocitos KD-IX-73-4 Inhibidor de metaloproteasas basado en ácido hidroxámico KO Knock out LAD Síndrome de deficiencia en la adhesión leucocitaria Lam Laminina LECAM-1 Molécula de adhesión de leucocitos (selectina-L) LFA Leucocyte function antigen LPS Lipopolisacáridos LS Líquido sinovial MAC Molécula de adhesión celular MadCAM-1 Molécula de adhesión de células de la mucosa MCP-1 Proteína-1 quimiotáctica monocítica MIP-1 Proteína-1 inhibidora de macrófago MMPs Metaloproteasas de matriz MMP-8 Colagenasa-2 MPO Mieloperoxidasa NADPH Fosfato dinucleótido de Nicotiamida-Adenina NCAM Molécula de Adhesión Celular Neural NF-kB Factor Nuclear kB OCL Osteoclastos PADGEM Molécula de adhesión de plaquetas y endotelio activado PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida PBS Tampón fosfato PG Prostaglandinas PMA Miristato acetato de forbol PMN Polimorfonucleares PMSF Fenilmetanesulfonilfluorido o fenilmetilsulfonil fluorido PSGL-1 P-selectin glycoprotein-1 RANTES Quimioquina activadora de leucocitos que se une a CCR5 ROS Radicales libres de oxígeno SCR Repetición consenso corta SDS Dodecil sulfato sódico SOD Superóxido Dismutasa SVMP Metaloproteasa de veneno de serpiente TACE Enzima convertidora del TNF-α TCP Péptido de corte de TACE TGF-β Factor-β de crecimiento transformado TNF-α Factor de necrosis tumoral-alfa TSP Tromboespondina VCAM-1 Molécula de adhesión de célula vascular-1 Vn Vitronectina VLA-4 Receptores de activación muy tardía de linfocitos-4 vWF Factor de von Willebrand
INTRODUCCIÓN
Introducción.
13
INTRODUCCIÓN
1. LA RESPUESTA INFLAMATORIA.
La respuesta inflamatoria es un mecanismo de defensa de los tejidos
conectivos vascularizados, cuya finalidad es la de aislar y destruir al agente
lesivo, ya sean: físicos, como el calor y los traumatismos; químicos, como el
ácido úrico o biológicos, como las bacterias y los parásitos (1-7), permitiendo,
por último, la reparación de los tejidos. Para que la respuesta inflamatoria se
ejecute de forma correcta se debe producir la acumulación de leucocitos
circulantes en los tejidos.
Las dos fases fundamentales de la inflamación son:
1. Aumento del flujo sanguíneo hacia la zona afectada. Se incrementa la
permeabilidad capilar debido a la retracción de las células endoteliales, y al
transporte en vesículas a través del endotelio. De esta forma, pueden escapar
de los capilares moléculas más grandes de lo habitual, lo que facilita la
acumulación de los mediadores solubles de la inmunidad en el foco inflamatorio
(fase vascular).
2. Migración de los leucocitos desde las vénulas postcapilares hacia los
tejidos adyacentes al foco. En las fases iniciales de la respuesta inflamatoria
son muy abundantes los polimorfonucleares (PMN) neutrófilos, cuya llegada
comienza en las primeras dos horas de la actuación del agente lesivo. Entre las
6 y las 12 horas comienzan a acudir hacia la zona inflamada monocitos y
linfocitos (fase celular).
El desarrollo de la respuesta inflamatoria está controlado por factores
solubles como las citoquinas, quimioquinas, productos enzimáticos plasmáticos
y por mediadores vasoactivos que liberan tanto las células residentes en el
tejido como los leucocitos infiltrantes.
Introducción .
14
La respuesta inflamatoria se clasifica según su duración en aguda y
crónica, aunque a veces es difícil establecer límites precisos entre ambas.
• La inflamación aguda es una respuesta estereotipada con un gran
componente vascular. Aunque la respuesta inflamatoria aguda depende de la
intensidad de la agresión y de la susceptibilidad del individuo, ésta suele dar
lugar a una clínica aparatosa, con intenso enrojecimiento, tumefacción y dolor
local, junto con una importante impotencia funcional. La células que
predominan son los PMN neutrófilos. Una vez eliminado el agente lesivo, en la
mayor parte de los casos, el proceso inflamatorio involuciona favoreciendo una
respuesta reparadora que no deja secuelas.
• La inflamación crónica se caracteriza clínicamente por un curso más
larvado, con aumento de temperatura, rubor y dolor, no tan intensos como en la
respuesta aguda. En general, la inflamación crónica es una respuesta
específica, mediada por el sistema inmunológico, frente al agente agresor. A
diferencia de la forma aguda, el infiltrado que se produce es fundamentalmente
a expensas de células mononucleares (macrófagos, linfocitos) y con escasos
PMN. En este tipo de respuesta es habitual la aparición de secuelas, que
pueden conducir a la destrucción tisular y, finalmente, a la aparición de la
fibrosis.
No siempre la inflamación actúa como un mecanismo beneficioso.
Cuando los sistemas reguladores de la inflamación fracasan, la respuesta
inflamatoria causa lesiones titulares que, dependiendo de la intensidad y
duración, pueden llegar a ser irreversibles. Como ya hemos visto, una
respuesta inflamatoria apropiada requiere que granulocitos circulantes
abandonen el torrente sanguineo y se acumulen en los tejidos. Para ello es
necesario, como paso previo, la adhesión de los leucocitos al endotelio de los
vasos que irrigan tejidos dañados. Los avances recientes en el conocimiento de
los fenómenos de adhesión celular, han ayudado a una mejor comprensión de
la patogenia de las enfermedades inflamatorias crónicas. Por tanto, esto ha
Introducción.
15
posibilitado el estudio de unas nuevas estrategias para el control de estos
procesos, a través de bloqueantes específicos de las moléculas de adhesión,
éstas se denominan terapias anti-adhesivas (8).
2. EL NEUTRÓFILO.
2.1 Descripción, morfología y función.
Los neutrófilos , son glóbulos blancos de tipo granulocito. Miden de 12 a 18
µm y es el tipo de leucocito más abundante en la sangre del ser humano (60 al
75%).
Son células altamente especializadas, postmitóticas,
cuya función principal es la de destruir y fagocitar
elementos exógenos (cuerpos extraños y
microorganismos) o endógenos (restos celulares y
detritus tisulares) perjudiciales o inservibles para el
organismo.
Su importancia es vital en la inmunidad innata de defensa, pero sus
respuestas efectoras pueden dañar los tejidos del huesped y contribuir a la
patogenia de múltiples enfermedades no infecciosas.
Los PMN se caracterizan por presentar un núcleo con cromatina compacta
segmentada entre 2 a 5 lóbulos conectados por delgados puentes. Su
citoplasma contiene abundantes gránulos que contienen diversas enzimas
destructoras, así como una sustancia antibacteriana llamada fagocitina,
necesaria para la lucha contra los gérmenes extraños. Es una célula muy móvil
y su consistencia gelatinosa le facilita atravesar las paredes de los vasos
sanguíneos para migrar hacia los tejidos, por medio de un proceso conocido
como la diapédesis. El paso de los neutrófilos desde los vasos sanguíneos al
tejido está condicionado por la liberación de histamina (liberada por mastocitos)
y TNF-α (liberada por macrófagos). Estas sustancias activan a las células
Introducción .
16
endoteliales, las cuales cambian el repertorio de moléculas de adhesión
(selectinas e inmunoglobulinas) y exponen en la superficie IL-8, que activa a los
neutrófilos circulantes. Estos cambios permiten que los neutrófilos estén
presentes en los tejidos 5 h después de comenzar la agresión tisular. Una vez
liberados al torrente sanguineo los PMN tienen una vida media de
apróximadamente 6 horas (9), siendo eliminados por el sistema retículo-
endotelial tras morir por apoptosis. El 95% de estas células son neutrófilos, las
cuales son de origen mieloide y su diferenciación está controlada por citoquinas
y factores de crecimiento hematopoyéticos, siendo los mejores caracterizados
el G-CSF (factor estimulador de colonias granulocíticas) y el GM-CSF (factor
estimulador de colonias granulocíticas-macrofágicas) (10). Además, existen
dos tipos de neutrófilos: tipos I y II. Los neutrófilos del tipo I , son células de
tamaño medio que presentan núcleo excéntrico, esférico, con cromatina
condensada en grumos; con citoplasma claro, de aspecto esponjoso, que
presenta una fina granulación de color salmón y gránulos azurófilos grandes y
pequeños. Sin embargo, los neutrófilos tipo II , se muestran, en general, como
células esféricas grandes, con un núcleo excéntrico, cromatina en grumos y
con lóbulos de aspecto irregular. El citoplasma presenta cuerpos basófilos
distribuidos homogéneamente en toda su extención y, a veces, algunas
vacuolas y gránulos azurófilos.
Los gránulos citoplasmáticos de los PMN tienen dos funciones críticas: en el
lumen contienen numerosas enzimas antimicrobianas y péptidos necesarios
para la defensa (11), y en la membrana tienen un grupo movilizable de
proteínas de superficie que intervienen en la regulación de la respuesta
inflamatoria (12).
Se pueden distinguir tres tipos de gránulos en los PMN según la morfología
y la tinción histoquímica:
a) Gránulos primarios o azurofílicos : Estos gránulos son ovales o
redondos y varían en tamaño. Contienen numerosos agentes antimicrobianos
Introducción.
17
como: lizosima, elastasa, fosfatasa ácida o catepsinas. Una familia
particularmente importante de las proteinasas encontradas en neutrófilos son
las metaloproteinasas de matriz (MMP), incluyendo la colagenasa-2 (MMP-8),
la gelatinasa-B (MMP-9), y estromelisina (MMP-3). Una característica de los
gránulos azurofílicos es la presencia de mieloperoxidasa, una enzima
antibacteriana que cataliza la formación de ácido de hipocloruro en la presencia
de anión superóxido (O2- ) (13).
b) Gránulos secundarios o específicos : no contienen peroxidasa pero sí
lisozima y otras múltiples enzimas (9). En contraste a los gránulos azurofílicos,
los gránulos específicos poseen un extenso arsenal de proteínas asociadas a
membrana incluyendo citocromos, moléculas de señalización y receptores. Los
gránulos específicos constituyen un reservorio de proteínas, destinadas a ser
expresadas en la superficie externa de las vacuolas fagocíticas y de la
membrana plasmática (12)
c) Gránulos terciarios o gelatinasa : Son idénticos en tamaño a los
gránulos específicos y poseen algunas proteínas en común a ellos, sin
embargo, es significativo su gran cantidad de gelatinasa, una enzima con alta
capacidad de destrucción de tejido (14).
d) Vesícula secretora: contienen en su superficie fosfatasa alcalina y se
caracterizan por su capacidad de movilizarse rápidamente hacia la membrana
celular. Su contenido es fundamentalmente proteínas plasmáticas derivadas de
la endocitosis. Su membrana es el principal reservorio de gliproteínas de
superficie, como son el receptor del complemento 1 (15), la integrina
CD11b/CD18 (16), el citocromo b558 (17) y el receptor para el fMLP (formyl-
methionyl-leucyl-phenylalanine) (18). Además, estas glicoproteínas pueden ser
rápidamente transportadas y expresadas en la superficie de los PMN
neutrófilos expuestos a estímulos inflamatorios. Estas vesículas también
pueden servir de “pool” intracelular de membrana, que pueden ser usado para
Introducción .
18
aumentar rápidamente la superficie de la célula y formar lamelipodias, en el
momento de la fagocitosis.
2.2 Papel de los PMN neutrófilos en la inflamación.
Como ya se ha comentado, la inflamación no siempre actúa como un
mecanismo beneficioso. Cuando los sistemas reguladores de la inflamación
fracasan, la respuesta inflamatoria causa lesiones titulares que, dependiendo
de su intensidad y duración, pueden llegar a ser irreversibles. Para una
apropiada respuesta inflamatoria es impresindible la acumulación de células
efectoras (leucocitos) en los tejidos. Para ello, es necesario, como paso previo,
la adhesión de los leucocitos circulantes al endotelio de los tejidos dañados.
El PMN puede actuar tanto en los estadíos tempranos como tardíos de la
respuesta inflamatoria (19). Los eventos tempranos son aquellos en los que el
neutrófilo es reclutado a los sitios de inflamación, incluyendo los procesos de
adhesión, la diapédesis y la quimiotaxis. Sin embargo, los eventos tardíos
constituyen la fagocitosis, desgranulación, liberación de radicales libres y la
producción de mediadores inflamatorios, los cuales están referidos a la
activación neutrofílica . La respuesta interna, por la cual una célula tiene una
respuesta fenotípica producida por los estímulos, ha sido llamada señal de
transducción. En neutrófilos, como en otras células, el estudio de la señal de
transducción ha sido un gran avance en la pasada década (20, 21).
2.2.1 Los eventos tempranos:
El reclutamiento de los leucocitos a los focos inflamatorios está mediado
por una serie de moléculas de superficie de los leucocitos y células endoteliales,
denominadas moléculas de adhesión. Estas moléculas de superficie pertenecen
a tres grandes familias: las selectinas, las integrinas y la superfamilia de las
inmunoglobulinas. Miembros de estas tres familias participan en un proceso
coordinado de interacciones adhesivas entre el neutrófilo y la célula endotelial,
que se denomina cascada de adhesión. La existencia de enfermedades
Introducción.
19
congénitas, como puede ser el síndrome de deficiencia en la adhesión
leucocitaria (LAD), en las cuales una disfunción en los pasos de adhesión
mediados por integrinas (LAD I) (22) o selectinas (LAD II) (23) genera una
respuesta inflamatoria anormal, lo que indica que las diferentes fases de la
cascada de adhesión son esenciales e interdependientes.
Además de en la migración de células desde el torrente sanguíneo hacia
los tejidos, las moléculas implicadas en la adhesión celular participan en otros
múltiples procesos (24). Estas moléculas, juegan un papel esencial en los
cambios de integridad de los endotelios (25), en la reasorción ósea (26), en la
permanencia de las células inmunocompetentes en los tejidos y en las
interacciones de las células involucradas en la función inmune (27). La
adhesión celular no sólo controla la localización física de las células sino que
también influye en sus funciones modificando los programas celulares de
expresión de genes, regulando la proliferación celular o mediando la
transmisión de señales al interior de la célula (14).
Por consiguiente, desde hace algún tiempo, el estudio de la adhesión
celular ha pasado de ser meramente descriptivo a adentrarse en el proceso de
transmisión de señales entre células o entre células y la matriz extracelular.
Este salto en el conocimiento, se debe al descubrimiento de la estructura
molecular de muchos de los receptores de adhesión, lo que ha permitido
clasificar a la mayoría en diferentes familias.
a) La familia de las selectinas.
Las tres selectinas conocidas hasta ahora se describieron originariamente
en plaquetas, leucocitos y en células endoteliales. Por tanto, se denominan
según la letra inicial de la estirpe celular donde se describieron inicialmente
(28): selectinas -E (endotelio), -L (leucocito), -P (plaquetas).
Esta familia interviene en la interacción adherente inicial entre los leucocitos,
las plaquetas y las células endoteliales. Las selectinas son las responsables de
Introducción .
20
establecer uniones lábiles entre las células circulantes y el endotelio,
permitiendo que los leucocitos rueden sobre las paredes de los vasos en la
dirección del flujo sanguíneo, reduciendo su velocidad de circulación. De esta
forma, estos receptores juegan un papel esencial en la primera fase de la
respuesta inflamatoria.
Todas las selectinas conocidas tienen un dominio extracelular, una
región transmembrana y una cola citoplamática (Figura 1 ). Además, el dominio
extracelular consta de un dominio C terminal tipo lectina de unos 120
aminoácidos, un dominio similar al factor de crecimiento epidérmico (EGF) con
unos 30 aminoácidos; y un número variable de dominios homólogos con las
proteínas reguladores del complemento (SCR) (29). Las regiones tipo lectina y
EGF presentan una alta homología entre las selectinas, no así las regiones tipo
SCR, en las que la selectina-L tiene 2, y las selectinas-E y -P tienen 6 y 9,
respectivamente. Por el contrario, en las regiones transmembrana y
citoplasmáticas no existen homologías entre los 3 tipos de moléculas, aunque
sí las hay entre la misma selectina en diferentes especies, lo que sugiere que
estas zonas albergan funciones específicas para cada selectina (30).
Las selectinas reconocen carbohidratos expresados por leucocitos y
células endoteliales activadas, causando una disminución en la velocidad de
Figura 1. Estructura general de las selectinas.
Dominio tipo Lectina
Dominio factor de crecimiento epidérmico
Dominio proteína fijadora del complemento ( 2 en la L, 6 en la P y 9 en la E)
Sitio de corte próximo a la membrana
Región transmembrana
Cola citoplasmática
Dominio extracelular
Dominio tipo Lectina
Dominio factor de crecimiento epidérmico
Dominio proteína fijadora del complemento ( 2 en la L, 6 en la P y 9 en la E)
Sitio de corte próximo a la membrana
Región transmembrana
Cola citoplasmática
Dominio extracelular
Introducción.
21
flujo de los leucocitos sobre estas células (31). La Tabla 1 resume la
distribución celular, los ligandos conocidos y la regulación de la expresión de
las selectinas.
Tabla 1. Familia de las selectinas
a.1) La selectina-L : se expresa prácticamente en todos los leucocitos
(32). Es una glicoproteína tipo I (grupo carboxilo citoplamático), la cual posee
un dominio tipo lectina, un dominio factor de crecimiento epidérmico, dos
dominios tipo proteína reguladora del complemento, una región transmembrana
y una región intracitoplásmica corta en el extremo carboxilo terminal. Se
identificó inicialmente como “homing receptor” de los linfocitos para ganglios
Selectinas Cluster de Diferenciación
Nombre alternativo
Distribución Ligandos conocidos
Regulación
selectina-E (CD62-E) ELAM-1 Endotelio activado
Sialil Lewis x, Sialil Lewis a, selectina-L LFA-1, CD66, ESL-1, CLA (antígeno cutáneo leucocitario)
Expresión aumentada por IL-1, TNF-α, IFN-γ, IL-4, sustancia P, LPS
selectina-L (CD62-L) LECAM-1, Leu-8 Mel-14Ag
Leucocitos en reposo
selectina-E, selectina-P, GlyCAM (PNAd), CD34, MAdCAM-1, PSGL-1, Sialil Lewis x
Aumenta rápidamente, y después de la activación se liberada por corte proteolítico.
selectina-P (CD62-P) GMP-140, PADGEM)
Plaquetas activadas, endotelio activado
Sialil Lewis x (CD15s), Lewis x (CD15), PSGL-1, selectina-L, PNAd.
Expresión aumentada por trombina, histamina, PAF, C5a, LPS, ROIs
Introducción .
22
linfáticos periféricos (33, 34). Los “homing receptor” son las moléculas de
membrana que expresa el linfocito, los cuales interaccionan específicamente
con las células endoteliales de las paredes altas de las vénulas poscapilares
(HEV), en los ganglios linfáticos. La importancia de la selectina-L en el
reclutamiento de leucocitos a los focos de inflamación se ha demostrado en
modelos de inflamación in vivo, mediante anticuerpos monoclonales que
bloquean la función de la molécula (35), y también en ratones deficientes en
selectina-L (ratones KO) (36-38)). Los neutrófilos circulantes expresan
constitutivamente una gran cantidad de selectina-L en superficie. Esta molécula
es la principal responsable de la primera interacción del neutrófilo con el
endotelio durante la cascada de adhesión (39). En la cual, el neutrófilo
comienza a rodar sobre el endotelio reduciendo su velocidad de circulación, y
la selectina-L es procesada y liberada al medio extracelular. En individuos
sanos la forma soluble de la selectina-L está presente en altas concentraciones
(40) en el plasma, a lo que se le ha atribuído un efecto modulador de la
respuesta inflamatoria. El significado biológico del corte y liberación de la
selectina-L durante el rodamiento no se conoce en detalle, pero tanto la
velocidad de rodamiento como la acumulación de los neutrófilos en los tejidos
son incrementadas cuando este corte es bloqueado in vitro (41). Por
consiguiente, la regulación del corte del ectodominio de la selectina-L parece
ser necesario para una extravasación eficiente de los neutrófilos (42).
El corte enzimático de la selectina-L es producido por una
metaloproteasa de membrana (43), en una zona del ectodominio altamente
conservada próxima a la membrana (44). Esta liberación del ectodominio de la
selectina-L al medio extracelular se produce en respuesta a distintos estímulos
como: citoquinas, ionóforo de calcio, ésteres de forbol, etc. Este mecanismo de
regulación mediante corte enzimático y liberación al medio es compartido por
diversas moléculas de adhesión y receptores celulares (45). Un miembro de la
familia de las ADAM (A Disintegrin And Metalloproteinase), el ADAM-17
(CD156b), también conocido como enzima covertidora del TNF-α (TACE), se
Introducción.
23
ha descrito que posee capacidad proteolítica sobre la selectina-L (46). Sin
embargo, la escasa actividad proteolítica del TACE sobre la selectina-L, el
hecho de que las células deficientes en TACE producen un corte significativo
de esta molécula (47), unido a otras evidencias (42), sugiere que deberían
existir otros factores que participan en este proceso.
Los primeros ligandos que se describieron para la selectina-L se
localizaron en las vénulas de las células endoteliales (CE) de los ganglios
linfáticos de ratón, y se relacionaron con el reclutamiento de linfocitos hacia
estos, durante su proceso normal de recirculación en la vigilancia inmunológica.
Estos ligandos son glicoproteínas tipo mucina en las que la unión a la selectina-
L está relacionada con la presencia de un tetrasacárido, el sialil Lewis x (sLex).
Los más conocidos son CD34, GLyCAM y MadCAM-1, de esta última no se
reconoce su equivalente en humanos. Los ligandos de la selectina-L
relacionados con la inflamación son diferentes de los implicados en “homing”
de linfocitos a ganglios. Se especula que la presencia de grupos sLex en la
propia selectina-L permita su interacción con las selectinas-E y -P del endotelio
(48, 49) o de las plaquetas. No obstante, hay ligandos endoteliales para la
selectina-L distintos a estos, como lo muestra el hecho de que en ratones doble
KO para selectinas-P y -E se siga produciendo rodamiento y reclutamiento de
leucocitos, principalmente en neutrófilos (50). También se ha descrito que la
selectina-L podría interaccionar con la PSGL-1 (P-selectin glycoprotein-1)
presente en otros leucocitos y en el endotelio (51).
a.2) La selectina-E: posee un dominio tipo lectina, un dominio factor de
crecimiento epidérmico, seis dominios tipo proteína reguladora del
complemento, una región transmembrana y una región intracitoplásmica corta
en el extremo carboxilo terminal. Esta proteína no se expresa en la superficie
de las células endoteliales en reposo, pero tras la estimulación del endotelio
con citoquinas tales como IL-1, IFN-gamma y TNF-α, comienza su aparición en
la membrana aproximadamente después de una hora, alcanzándose el pico
máximo de expresión a las 3-4 horas y decayendo entre las 8 y 24 horas en los
Introducción .
24
ensayos practicados in vitro (29). Este hecho contrasta con la persistencia de la
expresión in vivo en piezas de piel con reacción de hipersensibilidad retardada
(52), o en los capilares de la membrana sinovial de pacientes con Artritis
Reumatoide activa (53). La expresión de las selectinas-E y -P en zonas de
inflamación son superponibles, y en realidad su función se solapa, como se
demuestra en los ratones deficientes en selectina-E, los cuales muestran un
reclutamiento de leucocitos normal salvo que sean tratados con anticuerpos
bloqueantes anti-selectina-P (54), o que los ratones sean deficientes para
ambas selectinas-P y -E (55). Sin embargo, parece que el reclutamiento de
linfocitos de memoria a la piel en condiciones de inflamación sí está muy
relacionado con la presencia de selectina-E en sus capilares (52).
Respecto a sus ligandos, la selectina-E reconoce los grupos sLex y sialil
Lewis a (56). Sin embargo, algunas mutaciones conocidas suprimen la unión de
la selectina-E al sLex (57, 58). La interacción precisa aminoácido-carbohidrato
que ocurre entre la selectina-E y sus ligandos no ha sido aclarada (57-59).
Tanto la selectina-L como el PSGL-1 pueden interaccionar con la
selectina-E (29, 49). Otros ligandos más específicos son la variante glicosidada
de PSGL-1 denominada CLA (antígeno cutáneo leucocitario), presente en la
mayoría de los linfocitos memoria que migran a las zonas de dermatitis (52).
También una glicoproteína denominada ESL-1 (ligando de la selectina-E-1)
descrita más recientemente en ratones, parece expresarse en células mieloides
humanas y media la interacción de dichas células con la selectina-E
recombinante (60). También se ha demostrado la existencia de un nuevo
ligando de selectina-E en linfocitos B memoria de órganos linfoides secundarios
(61). Esta molécula es sintetizada de novo, ya que se impide su expresión con
inhibidores de la síntesis proteica.
a.3) La selectina-P: esta selectina al igual que las otras, poseen un
dominio lectina, un dominio factor de crecimiento epidérmico, nueve dominios
reguladores del complemento, una región transmembrana y una región
Introducción.
25
intracitoplasmática corta en el extremo carboxilo terminal. Es la de mayor
tamaño de las tres y con un peso molecular de 140 KD. Esta selectina se
describió en primer lugar como marcador de plaquetas activadas, y se vió que
se almacenaba presintetizada tanto en los gránulos alfa de las plaquetas como
en los cuerpos de Weibel-Palade de las células endoteliales.
La activación de plaquetas con trombina conduce a la selectina-P a la
membrana celular de forma muy rápida (62-65). La molécula alcanza su pico
máximo de expresión en membrana entre 3 y 10 minutos, y desaparece a la
media hora por endocitosis. Esta molécula reconoce como ligando al sLex, pero
lo hace con mayor afinidad a los sulfátidos. La selectina-P es parcialmente
responsable de la adhesión de ciertos leucocitos y plaquetas al endotelio.
Adicionalmente, la síntesis de la selectina-P se produce después de 2 h de
estímulo con citoquinas, como la interleuquina-1, TNF-α, y por LPS o radicales
de oxígeno (66, 67).
El principal ligando de la selectina-P es el PSGL-1, una molécula
dimérica rica en O- y N-glicanos, que se expresa de forma constitutiva en todas
las células de estirpe mieloide y linfoide (68). En numerosos experimentos in
vivo e in vitro en ratones KO (knockout) y humanos, ha sido claramente
ilustrado el papel de la selectina-P y PSGL-1 en interacciones leucocito-
plaqueta y en el rodamiento de leucocitos sobre el endotelio (69, 70). Sin
embargo, este no es un ligando específico de la selectina-P ya que también
actúa como ligando de otras selectinas (71, 72). El PSGL-1 se une a Syk
(Soleen Tyrosine kinasa) a través de ERM (Ezrina Radixina Moesina) y es
capaz de señalizar en leucocitos (73).
En los focos de inflamación, la función de las diferentes selectinas se
solapa entre sí, de forma que la ausencia de alguna de ellas puede ser suplida
por las restantes. Sin embargo, cada selectina tiene unas características
específicas que hacen que la cooperación entre ellas de lugar a un
reclutamiento eficiente de leucocitos. Así, la selectina-L está implicada en el
Introducción .
26
rodamiento de alta velocidad (50-150 µm/s) y no funciona a velocidades muy
bajas (74, 75), dado que esta selectina se expresa de forma inapropiada en
leucocitos en zonas de flujo muy bajo. Las velocidades de rodamiento
intermedio (20-50 µm/s) están mediadas por la selectina-P (29) y en el
rodamiento lento (3-10 µm/s) está implicada la selectina-E. Por tanto, los
leucocitos interaccionan inicialmente con las células endotelial por medio de la
selectina-L, y progresivamente van lentificando su rodamiento entrando en
acción las interacciones de la selectina-P y -E con sus ligandos (29).
La función de las selectinas depende del balance entre las formas
expresadas en la superficie celular, que favorecen la adhesión, y la
concentración de las formas solubles, que la inhiben. Además de la liberación
al medio (76), otros factores, como la localización topográfica en la membrana
celular y la relación con el citoesqueleto, juegan un papel en la adhesión entre
las selectinas y sus ligandos.
b) La familia de las Integrinas.
Las integrinas constituyen el grupo conocido más numeroso de moléculas
de adhesión en el ser humano. Son glicoproteínas heterodiméricas de
superficie, ampliamente distribuídas en todas las células eucariotas; desde las
levaduras hasta los vertebrados expresan algún miembro de estos receptores
de membrana. Las integrinas median tanto las interacciones adhesivas de
células entre sí como de éstas con proteínas de la matriz extracelular. Del
estudio de las deficiencias en la expresión de integrinas se ha establecido su
papel esencial en procesos tan importantes como la respuesta inflamatoria (77),
la hemostasis (78), y el desarrollo embrionario (79). Además, las integrinas
desempeñan una función central en la integridad de los endotelios (80).
Las integrinas contienen dos proteínas transmembrana, α y β, que se unen
por enlaces no covalentes. Se clasifican en subfamilias según el tipo de cadena
β, y algunas cadenas α forman heterodímeros con más de una cadena β
(Figura 2 ) (81). Cada unidad es una proteína transmembrana producto de un
Introducción.
27
gen independiente. Algunas de ellas son procesadas proteolíticamente dando
lugar a 2 péptidos que permanecen unidos, ya sea por puentes disulfuro o por
otras interacciones, mientras que el resto de cadenas α contiene una región
extra de unos 200 AA en su región extracelular conocida como dominio I. Por
su parte, la subunidad β contiene 5 dominios repetidos, ricos en cisteínas,
situados en una zona próxima a la región transmembrana. Todas ellas
muestran una gran homología de secuencia en la mitad amino-terminal de la
molécula, la cual podría ser la parte implicada en la interacción con los ligandos.
Las regiones extracelulares participan coordinadamente en la unión del
ligando y se unen a un segmento transmembrana, el cual conecta con una
región citoplasmática, que a su vez interacciona físicamente con proteínas del
citoesqueleto celular. De esta forma, las integrinas constituyen un puente de
unión entre el medio extracelular y el citoesqueleto.
Figura 2. Estructura de la integrinas.
Las integrinas son extraordinariamente versátiles. Las células pueden
regular su capacidad adhesiva mediante el incremento de su expresión al nivel
de transcripción o, en algunos casos (Mac-1 o αMβ2), por el transporte a la
membrana de moléculas preformadas. Además, las integrinas pueden
modificar de forma dinámica su afinidad por el ligando en respuesta a señales
intercelulares, en un proceso denominado “inside-out signaling”. Por otra parte,
Secuencia aminoterminal de la molécula (interacción con los ligandos)
Superficie externa de la membrana
Membrana plasmática
Superficie de laMembrana citoplasmática
Sitio de unión de la talinaUnión al citoesqueleto celular
Secuencia aminoterminal de la molécula (interacción con los ligandos)
Superficie externa de la membrana
Membrana plasmática
Superficie de laMembrana citoplasmática
Sitio de unión de la talinaUnión al citoesqueleto celular
Introducción .
28
estas moléculas también son capaces de transmitir señales hacia el interior de
la célula cuando se produce la unión a sus ligandos específicos o “outside-in
signaling”. Todo ello permite que la célula pueda responder rápidamente o de
forma más mantenida a las diferentes situaciones ambientales, cambiando su
adhesividad, su forma, o promoviendo la síntesis de determinadas proteínas.
Las integrinas no sólo median funciones de adhesión celular sino también
están implicadas en la modulación del crecimiento celular (82), o en el control
de la expresión de genes específicos, como la colagenasa y otras
metaloproteasas en las células sinoviales (83).
Figura 3. La familia de las integrinas y sus ligandos . Las líneas unen entre sí las combinaciones descritas entre las cadenas α y β. A cada lado, entre corchetes, se representan los ligandos conocidos de cada integrina. La osteopontina es una fosfoproteína secretada por linfocitos T activados, osteoblastos, macrófagos y otras células que recientemente ha sido identificada como ligando del CD44 (receptor del hialuronato). Col=colágeno; Fn= fibronectina; Fg= fibrinógeno; Lam= laminina; Vn= vitronectina; vWF= factor de von Willebrand; TSP= tromboespondina.
ββββ 1
ββββ 2
ββββ 4
ββββ 7
αααα 1
αααα 2
αααα X
αααα M
αααα L
αααα 9
αααα 8
αααα 7
αααα 5
αααα 3
αααα 6
αααα 4 [ Lam , Col ]
[ Lam , Col, Fn,Epiligrina
Entactina ] [ Fn (RGD), Invasina ]
[ Lam ]
[ Fn(CS - 1),VCAM,
Invasina ]
[ Fn(CS1 ),VCAM,
MadCam ]
[ Lam,Merosina , Kalinina,Invasina ]
[ ICAM - 1, - 2, - 3 ]
[ iC3b , Fg,Factor X,
ICAM - 1 ]
[ iC3b , Fg ]
[ Lam , Kalinina ]
ββββ 6
ββββ 5
ββββ 3
ββββ 8
αααα IIb
αααα v [ Fn , Vn ]
[ Fn ]
[ Vn ]
[ Vn,Fg,vWf,Fn,Lam , TSP,
Tenascina , Osteopontina ]
[ Fg,Fn,vWf , TSP, Vn ]
[ Vn ]
[ Fn , Vn,Tenascina ]
[ Tenascina ]
αααα E
[ Cadherina ]
αααα D [ ICAM - 3 ]
[ Lam , Col ]
αααα 10 [ Col ]
αααα 11 [ Col ]
ββββ
ββββ
ββββ
ββββ
αααα αααα
αααα
αααα
αααα
αααα
αααα
αααα
αααα
αααα
αααα
αααα
αααα [ Lam , Col ]
[ Lam , Col, Fn,Epiligrina
Entactina ] [ Fn (RGD), Invasina ]
[ Lam ]
[ Fn(CS - 1),VCAM,
Invasina ]
[ Fn(CS1 ),VCAM,
MadCam ]
[ Lam,Merosina ,
[ ICAM - 1, - 2, - 3 ]
[ iC3b , Fg,Factor X,
ICAM - 1 ]
[ iC3b , Fg ]
[ Lam , Kalinina ]
ββββ 6
ββββ 5
ββββ 3
ββββ 8
αααα
αααα v [ Fn , Vn ]
[ Fn ]
[ Vn ]
[ Vn,Fg,vWf,Fn,Lam , TSP,
Tenascina , ]
[ Fg,Fn,vWf , TSP, Vn ]
[ Vn ]
[ Fn , Vn,Tenascina ]
[ Tenascina ]
αααα [ Cadherina
αααα [ ICAM - 3 ]
[ Lam , Col ]
αααα
αααα
Introducción.
29
Las subunidades α se numeran del 1 al 11 para los miembros de la
familia de los β1. La subfamilia β1 se describió originariamente en linfocitos
como receptores de activación muy tardía o antígenos VLA (Very Late
Activation) (84). Las subunidades α se denominan con diferentes letras, con la
excepción de αIIb, que se describió inicialmente como glicoproteína plaquetaria
IIb (GPIIb).
De la gran familia de las integrinas tres de ellas tienen relevancia
demostrada en los fenómenos de migración leucocitarias a través del endotelio:
la molécula VLA-4 (CD49d) de la familia β1 (CD29) y dos de los tres
componentes de la familia β2 (CD18), que son el LFA-1 (CD11a) y Mac-1
(CD11b). Estos tres receptores están constitutivamente expresados, de forma
diferencial, en leucocitos y tienen como ligandos naturales a componentes de la
Superfamilia de las Inmunoglobulinas que se expresan en las CE como ICAM-1
(molécula de adhesión intercelular-1), ICAM-2 (molécula de adhesión
intercelular-2) y VCAM-1 (molécula de adhesión a célula vascular-1). Así, VLA-
4 reconoce a VCAM-1 (85, 86), LFA-1 a ICAM e ICAM-2 (87, 88) y Mac-1 a
ICAM-1 (89).
Las integrinas β2 (LFA1, αL β2; Mac-1, αM β2; p150/95, αxβ2) son de
distribución estrictamente leucocitaria, y están únicamente implicadas en el
establecimiento de contactos intercelulares.
LFA-1 (CD11a/CD18) se expresa en leucocitos de forma constitutiva.
Esta integrina interviene en la citotoxicidad mediada por células T y células NK,
o en la de macrófagos y neutrófilos mediada por anticuerpos. También está
implicada, como molécula accesoria, en el reconocimiento del antígeno por las
células T y B, y por último, en la adhesión de leucocitos al endotelio. Sus
ligandos son miembros de la superfamilia de las inmunoglobulinas: ICAM-1,-2 y
-3, cuya distribución celular es muy variable.
Mac-1 (CD11b/CD18) se expresa principalmente en PMN y monocitos,
donde está de forma constitutiva. Pueden aumentar su expresión en membrana
Introducción .
30
de forma muy importante bajo determinados estímulos, al producirse la fusión
de los gránulos terciarios, en cuya membrana se almacenan preformadas estas
moléculas (90). El ICAM es el ligando de Mac-1 (91, 92), por lo que también
puede intervenir en la adhesión de leucocitos al endotelio activado. Por otra
parte, esta integrina también es capaz de unirse al factor X de la coagulación, a
fibrinógeno y puede actuar como receptor de C3b. Estos últimos ligandos
también lo son para el último miembro de la familia β2 de las integrinas, la
p150/95. De esta manera, estas integrinas intervienen en la fagocitosis, y
enlaza los fenómenos de adhesión de leucocitos al endotelio activado con los
que tienen lugar durante la activación de la cascada de la coagulación.
Cada estirpe celular tiene un repertorio característico de integrinas que
puede variar dependiendo del estado de maduración celular (93), de la
respuesta a las citoquinas (94) o de la transformación neoplásica (95). El
cambio en el repertorio de las integrinas constituye un elemento regulador
importante para la capacidad adherente de las células. Algunas integrinas son
exclusivas de un tipo celular determinado. Así por ejemplo, las integrinas β2 son
específica de los leucocitos, y la cadena αIIb sólo se encuentra en plaquetas y
en sus progenitores, los megacariocitos (96). Por el contrario, otras integrinas
tienen una amplia distribución, como las integrinas β1, que están presentes
prácticamente en todos los tipos celulares.
c) Superfamilia de las Inmunoglobulinas .
Los miembros de esta familia se caracterizan por poseer dominios de
inmunoglobulinas. Estos dominios los conforman estructuras de entre 90 y 100
AA, plegados a modo de lazo y estabilizados gracias a la presencia de un
puente disulfuro interno, que se reconocieron inicialmente en las
inmunoglobulinas y posteriormente en el receptor de linfocitos T (97). Están
ampliamente representados tanto en el sistema inmune, como son los
antígenos de histocompatibilidad (clase I y II), el CD4, el CD2 y el LFA-3 o
Introducción.
31
CD58 (98), como fuera de él, el NCAM (molécula de adhesión de célula neural)
o CD56, presente en células del sistema nervioso.
Los receptores endoteliales para las integrinas pertenecen a la
superfamilia de las inmunoglobulinas: ICAM-1 (CD54), ICAM-2 y VCAM-1, son
las moléculas de esta familia de proteínas que intervienen de forma más
evidente en el reconocimiento leucocitario (99, 100). Las moléculas ICAM-1 y el
ICAM-2 se expresan constitutivamente en células endoteliales, que al ser
estimuladas por citoquinas o productos bacterianos (LPS) aumentan la
expresión basal de ICAM-1 mientras que ICAM-2 no varía sustancialmente
(100, 101). Las integrinas LFA-1 y Mac-1 están expresadas constitutivamente
en leucocitos y reconocen a ICAM-1 e ICAM-2. Por el contrario, VCAM-1 no se
expresa en las células endoteliales en reposo, siendo necesaria la acción de
determinadas citoquinas como el TNF-α o la interleukina-1 (IL-1) para que se
exprese (86, 102). El receptor VLA-4 tiene como ligando celular a VCAM-1. El
ligando del ICAM-1, además, puede ser utilizado por rinovirus y por
Plasmodium falciparum para entrar dentro de las células (103, 104).
Otra molécula perteneciente a la superfamilia de las inmunoglobulinas es
CD31 o PECAM-1. Esta glicoproteína se expresa en leucocitos, plaquetas y
células endoteliales (105), y está implicada en adhesiones intercelulares y en
las últimas fases de la migración transendotelial (106).
Introducción .
32
Tabla 2. Superfamilia de las inmunoglobulinas
Nombre Cluster
de Diferenciación
Distribución Ligando Regulación
ICAM-1 CD54
Endotelio, fibroblastos,epitelio, monocitos,linfocitos, cél. dendríticas y condrocitos
LFA-1, Mac-1 CD43 (leucosialina)
Expresión constitutiva; aumenta por IL-1, TNF-α IFN-γ, LPS. Disminuye por IL-6
ICAM-2 CD102 Endotelio, linfocitos monocitos, plaquetas.
LFA-1 Expresión constitutiva
ICAM-3/ICAM-R CD50 Linfocitos, monocitos, polimorfonucleares
LFA-1, αD/CD18 Aumenta la expresión con la activación
VCAM-1 CD106
Endotelio, monocitos, células dendríticas, fibroblastos, estroma, médula ósea
VLA-4, α4β7, LPAM-1
Aumenta la expresión por IL-1, TNF-α,IL-4 IL-13, LPS
LFA-2 CD2 Linfocitos T, NK LFA-3, CD59, CD48
Expresión constitutiva
LFA-3 CD58 Endotelio, Leucocitos células epiteliales
LFA-2 —-
PECAM-1, EndoCAM CD31 Endotelio, plaquetas
leucocitos, músculo CD31, Heparina, α5β3
Tiene formas muy polimórficas
MadCAM-1 —- Endotelio de mucosas, vénulas de lámina propia y placas de Peyer, bazo
LPAM-1 (α4β7) selectina-L
expresión aumentada por IL-1, TNF-α, IFN-γ
NCAM —- Céls. Neurales, gliales corazón, músculo, riñón NK, algunos T activados
NCAM, sulfato heparina, α5β3
Introducción.
33
2.2.2 Los eventos tardíos:
a) Fagocitosis:
La fagocitosis, tanto de una bacteria como de cualquier otra partícula,
necesita que el elemento que va a ser fagocitado sea previamente opsonizado
(depósito de opsoninas sobre el antígeno). Las opsoninas están constituídas
por inmunoglobulinas y factores del complemento (C3). Los neutrófilos
expresan receptores para el fagmento Fc de las IgG (FcγR1, FcγRIIa, FcγRIIIb)
y para factores del complemento (CR1,CR3).
La fagocitosis es un proceso activo que requiere consumo de energía. El
PMN neutrófilo invagina su membrana en el punto de contacto y rodea a la
partícula formándose una vacuola (fagosoma o vesícula fagocítica) que se
internaliza dentro del citoplasma (107). Posteriormente, se funde el fagosoma
con los gránulos lisosomales (proceso de degranulación) formándose el
fagolisoma, que contienen enzimas y proteínas antimicrobianas que degradan
la partícula.
b) Degranulación:
En respuesta a la activación celular, los gránulos de los neutrófilos
pueden fusionarse con la membrana plasmática, y verter su contenido hacia el
espacio extracelular, o fusionarse con la vacuola fagocítica para formar un
fagolisosoma. Los gránulos contienen numerosas macromoléculas como
enzimas (proteasas, esterasas, nucleotidasas, hidrolasas carbohidrato y
peroxidasas), proteínas no enzimáticas (como la lactoferrina y la proteína de
unión a la vitamina B12), glicosaminoglicanos y péptidos antimicrobianos.
c) Generación de radicales libres de oxígeno (ROS-r eactive oxigen
specie-) o estallido respiratorio:
Los radicales libres de oxígeno incluyen iones de oxígeno, radicales
libres y peróxidos, tanto inorgánicos como orgánicos. Son generalmente
Introducción .
34
moléculas muy pequeñas altamente reactivas, debido a la presencia de una
capa de electrones de valencia no apareada. Estos radicales se forman de
manera natural como subproducto del metabolismo normal del oxígeno, y
tienen un importante papel en la señalización celular. Sin embargo, en
situaciones de estrés ambiental sus niveles pueden aumentar en gran medida,
lo cual puede producir daños significativos a las estructuras celulares. Esto
lleva a una situación conocida como estrés oxidativo.
El sistema inmunitario utiliza los efectos letales de los radicales
oxidantes como una parte central de su mecanismo para eliminar los agentes
patógenos. Estos incluyen el superóxido (•O2-), el óxido nítrico (•NO), en
particular su producto reactivo, peroxinitrito (OONO-), y el peróxido de
hidrógeno (108). Aunque el uso de estos compuestos altamente reactivos en la
respuesta citotóxica de las células fagocíticas puede causar daños en el tejido
huésped, la inespecificidad de estos oxidantes es una ventaja, ya que pueden
dañar casi cualquier estructura biológica (109). Por tanto, esto impide que un
agente patógeno escape de esta parte de la respuesta inmunitaria.
El exceso de producción de ROS participa en la patogénesis de la úlcera
gástrica inducida por patógenos (Helicobacter pylori) y también por los
antiinflamatorios no esteroideos (AINE) (110). Estudios in vitro han sugerido un
papel de los ROS en la degradación del cartílago, como se refleja en su efecto
en los componentes de la matriz y en el comportamiento del condrocito. Sin
embargo, la información es limitada hasta ahora sobre el papel potencial de los
ROS en el inicio y la progresión de la remodelación del cartílago (111).
Respecto a metaloproteasas, los ROS activan el dominio catalítico del TACE al
romper la unión del predominio con el Zn++ en células Mono Mac 6 y Jurkat
(112).
c.1) Estrés oxidativo
El estrés oxidativo es causado por un desequilibrio entre la producción
de oxígeno reactivo y la capacidad de un sistema biológico de detoxificar
Introducción.
35
rápidamente los productos reactivos intermedios o reparar el daño resultante.
Todas las formas de vida mantienen un entorno reductor dentro de sus células,
y éste es preservado por las enzimas que mantienen el estado reducido
mediante un constante aporte de energía metabólica. Desequilibrios en este
estado normal redox pueden causar efectos tóxicos, a través de la producción
de peróxidos y radicales libres, los cuales dañan a todos los componentes de la
célula, incluyendo las proteínas, los lípidos y el ADN.
La fagocitosis de bacterias, u otras partículas está acompañada por una
producción de ROS debida a la acción del NADPH oxidasa, que reduce el
oxígeno a aniones superóxidos por la siguiente reacción:
El superóxido se convierte en peróxido de hidrógeno por la acción de la
superóxido dismutasa (SOD):
El agente bactericida más importante en neutrófilos parece ser el ácido
hipocloroso, HOCL, formado a partir del H2O2 por la mieloperoxidasa (113). Los
macrófagos carecen de mieloperoxidasa y probablemente utilicen otras
especies reactivas de oxígeno para eliminar microorganismos.
El anión superoxido (O2-) y el peróxido de hidrógeno (H2O2) dan lugar al
radical hidroxial reactivo (OH·), por la reacción de Haber-Weiss. Esto debería
dar lugar a estas dos reacciones catalizadas por hierro iónico:
2 O2 + NAD(P)H 2O2
- + NAD(P)+ + H+
2O2- + 2H+ SOD H2O2 + O2
O2
- + H2O2 O2 + OH·+ OH-
Introducción .
36
Primero, el ión superóxido reduce el ión férrico a ión ferroso, y luego, el
peróxido de hidrógeno es reducido a la forma radical hidroxilo por el ión ferroso:
El radical hidroxilo y el oxígeno singlete son, en mayor medida, especies
de oxígeno reactivo, y son capaces de inducir peroxidación de lípidos y el corte
de cadenas polipéptidicas.
c.2) Efectos químicos y biológicos.
En términos químicos, el estrés oxidativo provoca un aumento (114) en
la reducción del potencial celular, o una gran disminución en la capacidad
reductora de los pares redox celulares como el glutatión (114). Los efectos del
estrés oxidativo dependen de la magnitud de estos cambios, de tal manera que
la célula es capaz de superar las pequeñas perturbaciones y de recuperar su
estado original. Sin embargo, el estrés oxidativo intenso puede causar la
muerte celular, bien por apoptosis o bien por necrosis (115).
Un aspecto particularmente destructivo del estrés oxidativo es la
producción de especies de oxígeno reactivas, que incluyen los radicales libres
y los peróxidos. Algunas de las menos reactivas de estas especies, como el
superóxido, pueden ser convertidas por una reacción redox, con metales de
transición u otros compuestos del ciclo redox, en un agente más agresivo, que
puede causar un daño celular extenso (116). La mayoría de estos radicales
derivados del oxígeno se producen en un nivel bajo en condiciones normales
de metabolismo aeróbico, y el daño que causan a las células es reparado
constantemente. Sin embargo, bajo los intensos niveles de estrés oxidativo, el
daño produce agotamiento de ATP impidiendo la muerte celular por apoptosis
controlada, provocando que la célula simplemente se desmorone (117, 118).
O2- +
Fe3+ O2 + Fe2+
Fe2+ + H2O2 Fe3+
+ OH·+ OH-
Introducción.
37
c.3) Efectos dañinos .
La fuente más importante de oxígeno reactivo en condiciones normales y
en organismos aeróbicos, es probablemente la pérdida de oxígeno activado de
las mitocondrias, en la respiración oxidativa.
Los antioxidantes celulares mejor estudiados son las enzimas SOD,
catalasa y glutatión peroxidasa. Antioxidantes enzimáticos menos estudiados,
pero probablemente muy importantes, son la peroxirredoxina y la sulfirredoxina.
Otras enzimas que tienen propiedades antioxidantes son la paraoxonasa, la
glutatión S-transferasa, y la aldehído deshidrogenasa.
Normalmente las células son capaces de defenderse de los daños
producidos por los ROS, mediante el uso de la SOD y la catalasa. Pequeñas
moléculas antioxidantes como el ácido ascórbico (vitamina C), ácido úrico, y
glutatión también desempeñan un papel importante como antioxidantes
celulares. Del mismo modo, los polifenoles antioxidantes colaboran en la
prevención de los daños causados por ROS. Por el contrario, la capacidad
antioxidante del espacio extracelular es relativamente escasa.
Los efectos de los ROS sobre el metabolismo celular han sido bien
estudiados en una gran variedad de especies. Estos incluyen no sólo su papel
en la muerte celular programada y la necrosis, sino también en efectos
positivos, tales como la inducción de genes de defensa y la movilización de los
sistemas de transporte de iones. También están implicados con frecuencia en
funciones de señalización redox o señalización oxidativa. En particular, las
plaquetas que participan en la reparación de heridas y hemostasis de la
sangre, liberan ROS para reclutar más plaquetas en los sitios de lesión.
Introducción .
38
Tabla 4. Tipos de ROS.
Oxidante Descripción
•O2-,Anión
superóxido
Estado de reducción de un electrón de O2, formado en
muchas reacciones de auto-oxidación y también por la
cadena de transporte de electrones. Es poco reactivo,
pero puede liberar Fe2+ de proteínas ferrosulfuradas y
de la ferritina. Sufre dismutación para formar H2O2
espontáneamente o por catálisis enzimática, y es un
precursor para la formación de •OH catalizado por
metales.
H2O2, peróxido
de hidrógeno
Estado de reducción de dos electrones, formado por la
dismutación de •O2- o por reducción directa de O2.
Soluble en lípidos y por eso es capaz de difundir por
membranas.
•OH, radical hidróxilo
Estado de reducción de tres electrones, formado por la
reacción de Fenton y la descomposición de peroxinitrito.
Extremadamente reactivo, y es capaz de atacar a la
mayoría de los componentes celulares.
HOCl,ácido
hipocloroso
Formado a partir de H2O2 por la mieloperoxidasa.
Soluble en lípidos y altamente reactivo. Rápidamente
oxida constituyentes de proteínas, incluyendo grupos
tiol, grupos amino y metionina.
Introducción.
39
d) Síntesis y secreción de mediadores inflamatorios :
d.1) Citoquinas :
Las citoquinas son glicoproteínas de bajo peso molecular (7-30 KD en su
mayoría), que se secretan de forma transitoria por linfocitos, macrófagos, y
otras células de origen no hematopoyético. A través de la interacción con
receptores específicos en las células del microambiente en las que son
secretados, modulan a concentraciones picomolares, la expresión de una gran
variedad de genes. Una parte importante en la investigación en Reumatología,
se ha centrado en el papel de las citoquinas en los fenómenos de amplificación
y perpetuación de los procesos inflamatorios articulares (119-122).
Se ha descrito, tanto in vivo como in vitro que los neutrófilos secretan
diversas citoquinas como la IL-1α, TNF-α, IL-6, IL-8, IL-12, TNF-β, proteína-1
inhibidora de macrófago (MIP-1), oncostatina M, proteína-1 quimiotáctica
monocítica (MCP-1) y factor-β de crecimiento transformado (TGF-β) (123, 124),
en respuesta a estímulos inflamatorios como la bacterias opsonizadas,
levaduras o cristales de urato monosódico (125, 126). Además, secretan un
inhibidor específico de la IL-1 identificado como antagonista del receptor de IL-
1 (IL-1RA).
d.2) Eicosanoides y leucotrienos.
Los neutrófilos liberan productos activados del ácido araquidónico cuando
se exponen a estímulos fagocíticos. Estos incluyen productos de la ruta de la
COX: prostaglandinas (PGs), tromboxanos y productos de la ruta de la
lipooxigenasa, como los leucotrienos.
Después de la estimulación, el ácido araquidónico es liberado de la posición
2 de los fosfolípidos de membrana por activación de la fosfolipasa A2. Varias
enzimas transforman el ácido araquidónico en mediadores lipídicos
introduciendo un oxígeno en las uniones específicas. Dos de estas enzimas
Introducción .
40
mejor estudiadas son las COX (o prostaglandinas H sintasa) y la 5-
lipooxigenasa, que se expresan en neutrófilos, y que producen eicosanoides
(PG y tromboxanos) y leucotrienos respectivamente.
Los endoperóxidos (ácidos grasos), formados por el metabolismo del ácido
araquidónico mediado por la COX (series PGG y PGH), son potenciadores
débiles del edema causado por bradikinina e histamina (127), y además, sirven
como mediadores en la formación, por isomerización, de las PG y de los
tromboxanos más estables. Tanto la PGEs como la PGIs (endoperóxidos
cíclicos) parecen ser los primeros mediadores de la inflamación: producen
vasodilatación local y edema, actuando sinérgicamente con la bradiquinina y la
histamina. En exudados inflamatorios estos compuestos se encuentran a
elevadas concentraciones y su síntesis es inhibida por la mayoría de los
fármacos antiinflamatorios (128). Además, la PGE puede estimular la
producción de AMPc, y también, suprimir las reacciones de hipersensibilidad
inmediata y las reacciones asociadas con la inmunidad celular, como la
mitogénesis de células T inducida por lectina y la degranulación de PMN (129).
3. CASCADA INFLAMATORIA.
Como ya hemos visto, la inflamación puede ser aguda o crónica. En la
primera fase, el infiltrado inflamatorio contiene principalmente PMN neutrófilos,
y en la segunda fase hay mayoritariamente linfocitos y monocitos. La
extravasación de leucocitos es un proceso en el que participan de forma
secuencial diversas moléculas de adhesión y citoquinas, que hacen posible el
desarrollo de las fases de la cascada.
La adhesión de una célula está controlada por la interacción entre sus
receptores de adhesión y sus respectivos ligandos. La capacidad de adhesión
celular depende tanto de la densidad de receptores en superficie como del
grado de afinidad de éstos por sus ligandos. Los cambios en la concentración
de receptores pueden deberse a modificaciones en el patrón de su biosíntesis.
Esto puede ocurrir en respuesta a mecanismos de maduración celular o como
Introducción.
41
consecuencia de la acción de factores solubles en un periodo que va de horas
a dias. El ICAM-1 y el VCAM-1 son ejemplos de este tipo de regulación (86). El
aumento de expresión de estas dos moléculas juega un papel muy importante
en la migración de los leucocitos hacia los tejidos inflamados.
Además, los receptores de adhesión pueden modificar la estructura de
su molécula. Esto puede producirse por la generación de formas alternativas
del ARN mensajero, como ocurre en algunos miembros de la superfamilia de
las inmunoglobulinas, como en el ICAM-1 (98), en la selectina-P (130) y en
algunas subunidades α y β de las integrinas (131). Otros receptores pueden
sufrir modificaciones por acción de enzimas proteolíticas, como la selectina-L,
que se libera de la superficie de los leucocitos por la acción de metaloproteasas
que perteneciente a la familia de las ADAM, como el ADAM-17, en respuesta a
la activación celular (46). Otra forma de modificar la capacidad de adhesión
celular es mediante cambios en el nivel de glicosilación de los receptores de
adhesión, como es el caso de NCAM (molécula de adhesión celular neural),
que presenta un grado de glicosilación diferente dependiendo del estado de
maduración celular, lo cual modifica su capacidad adhesiva (97).
Con respecto a la función del endotelio en la inflamación, ésta se centra
en la regulación de la adhesión celular. Las células endoteliales, posicionadas
entre la sangre y los tejidos, desempeñan un papel esencial en la respuesta
inflamatoria controlando el tráfico de los leucocitos a los lugares de inflamación.
Las células endoteliales están fuertemente ancladas mediante integrinas a una
lámina basal subyacente (132), que se compone de proteínas de matriz
extracelular, como colágeno, laminina y proteoglicanos. Además, las células
endoteliales forman uniones muy firmes entre sus bordes laterales, lo que
contribuye al aislamiento entre el espacio vascular y el tisular. Las células
endoteliales no activadas expresan en su superficie libre varios miembros de la
familia de las integrinas; éstas reconocen: fibronectina (α5β1, α3β1, αvβ3),
laminina (α6β1, α3β1) y colágeno (α2β1, α3β1) (80, 133). Además, las células
endoteliales expresan varios miembros de la superfamilia de las
Introducción .
42
inmunoglobulinas, como el CD31 (134) y los componentes de la familia JAM
(Junctional adhesion molecules) (135) junto a diversas integrinas (α5β1, α2β1)
(80) en este nivel. Finalmente, las células endoteliales en reposo expresan
ICAM-2 y escasas cantidades de ICAM-1, ambos ligandos de la subfamilia β2
de las integrinas. En condiciones normales, los leucocitos circulantes, por
efecto del flujo sanguineo, tienen multiples contactos aleatorios con las células
endoteliales. Sin embargo, cuando un tejido sufre un daño, sus células liberan
mediadores de inflamación, como citoquinas proinflamatorias (IL-1 y TNF-α) y
aminas vasoactivas, que producen cambios en las células endoteliales de los
vasos cercanos. Aunque estas citoquinas pueden alterar la integridad del
endotelio, el mecanismo por el que afectan a las uniones laterales de las
células endoteliales se desconoce. En repuesta a los mediadores de la
inflamación, las células endoteliales redistribuyen la selectina-P desde los
lugares de almacenamiento internos (gránulos) hacia la membrana celular
(136). Una vez expuesta en la membrana, la selectina-P puede unir neutrófilos
circulantes (a través del PSGL-1) (137) facilitando que rueden sobre el
endotelio (138). La selectina-L, contitutivamente presente en la superficie de
leucocitos, se une a mucinas endoteliales (CD34 y MadCAM-1), colaborando
con la selectina-P, para que los leucocitos rueden sobre el endotelio y
disminuya su velocidad (134, 139). La selectina-E comienza a expresarse (140)
marcando esa zona del endotelio como lugar de inflamación. Además, el ICAM-
1 (98) aumenta en varios ordenes de magnitud su expresión reforzando la
unión al endotelio de las células que expresan las integrinas β2. Posteriormente,
la expresión del VCAM-1 se incrementa (86) y permanece elevada en las
células endoteliales sometidas a un estímulo constante. El VCAM-1 es el
ligando para las integrinas α4β1 y α4β7 (85, 141) y puede servir para mediar la
atracción tardía y persistente de las células mononucleares al foco inflamatorio.
Junto a estos cambios en el repertorio de las moléculas de adhesión, las
integrinas del endotelio sufren una serie de cambios de afinidad con sus
ligandos. Se ha visto que las células endoteliales, estimuladas por agentes
Introducción.
43
proinflamatorios, pueden sintetizar una gran cantidad de activadores
leucocitarios, como las citoquinas, cuyo miembro representativo es la IL-8 (142).
En respuesta a estos activadores los leucocitos pierden la selectina-L (38) y
aumentan la densidad en superficie de integrinas β2. Además, la capacidad
funcional de las integrinas β1 y β2 aumenta por cambios conformacionales de
sus estructuras moleculares. Este incremento en la capacidad funcional de las
integrinas causa la finalización del rodamiento de los leucocitos (138). Luego,
éste se desplaza por un mecanismo complejo (143) hacia la zona de unión
intercelular de las células endoteliales, donde se abre camino hacia el espacio
extravacular. Moléculas como el CD31, CD99 y miembros de la familia JAM,
expresados en el ámbito de las uniones intercelulares endoteliales, han
demostrado un papel funcional en esta parte final de la extravasación de
leucocitos durante la respuesta inflamatoria (144). Las integrinas β2 son
absolutamente esenciales para la migración, ya que su ausencia se asocia con
un déficit en la acumulación de leucocitos en la respuesta inflamatoria in vivo,
éste es el denominado (síndrome LAD) (22). Posteriormente, para la
extravasación final del leucocito, el ICAM-1 expresado por el endotelio (145)
junto con el CD31 (106) y el CD99 (146), expresados tanto por el endotelio
como por los leucocitos, parecen tener una relevancia esencial.
Aunque muchos autores lo creen también válido para la migración de
monocitos y linfocitos a los tejidos, este proceso ha sido estudiado en mayor
detalle con PMN, utilizando incluso modelos in vivo mediante técnicas de
microoscopía intravital (35).
Introducción .
44
Figura 4. Cascada de adhesión leucocitaria . Básicamente, este proceso puede ser dividido en cuatro pasos consecutivos. Inmediatamente después de la lesión del tejido, los leucocitos reducen su velocidad de circulación y comienzan a rodar sobre la superficie del endotelio. Esta interacción inicial está mediada por los miembros de la familia de las selectinas que reconocen carbohidratos expresados en los leucocitos y en las células endoteliales activadas. Esta disminución de la velocidad de circulación es esencial para la extravasación final de los leucocitos. En la segunda fase, los leucocitos son activados por factores derivados del endotelio (citoquinas quimiotácticas como la IL-8) lo que origina un aumento en la afinidad de las integrinas leucocitarias (Mac-1, LFA-1, y VLA-4). La interacción de las integrinas activadas con sus ligandos en las células endoteliales (ICAM-1, VCAM-1) causa la adherencia firme de los leucocitos al endotelio. Finalmente, los leucocitos emigran entre las células endoteliales (diapédesis) entrando en el tejido.
ANTIINFLAMATORIOS NO ESTEROIDEOS.
Los antiinflamatorios no esteroideos (AINE) son un grupo heterogéneo
de sustancias químicas con efecto antiinflamatorio, analgésico y antipirético,
que se agrupan en familias con diferencias tanto en respuestas clínicas como
en sus perfiles farmacocinéticos (147). En uso desde hace más de un siglo, los
AINE continúan siendo una importante arma terapéutica para pacientes con
desordenes que causan dolor, fiebre, o inflamación moderada. La inhibición de
la síntesis de prostagladinas por el bloqueo de la ciclooxigenasa (COX) ha sido
ampliamente aceptado como el mecanismo de acción de estos compuestos
(148). Sin embargo, durante la pasada década, diversos grupos han descrito un
número de efectos antiinflamatorios no mediado por prostaglandinas,
Quimioquinas
proinflamatorias
ActivaciónRodamientoAdhesión
firmeExtravasación
Quimioquinas
proinflamatorias
ActivaciónRodamientoAdhesión
firmeExtravasación
Introducción.
45
sugiriendo que la inhibición de la COX no representa la única explicación de la
acción antiinflamatoria de los AINE (149, 150). En neutrófilos, muchos de los
AINE inducen la disminución de la expresión de la selectina-L (151, 152). Este
efecto de los AINE no es una característica común de este grupo de fármacos,
ya que un número de ellos no modifican la expresión basal de esta molécula de
adhesión en neutrófilos (3, 151). Los AINE provocan una disminución de la
expresión de la selectina-L por un mecanismo acoplado a la reducción del
estado energético celular (153).
ADAM (A Disintegrin And Metalloprotease ).
Las ADAM son una familia de metaloproteasas de superficie ampliamente
distribuídas. Estas proteínas también se llaman proteínas MDC
(Metaloprotease, Disintegrin, Cysteine-rich) (154). Los miembros de esta familia
se caracterizan por tener una estructura conservada que consiste en un péptido
señal, seguido de un prodominio, un dominio metaloproteasa, otro disintegrina,
una región rica en cisteínas, que normalmente contiene un motivo EGF (factor
de crecimiento epidérmico), y finalmente un dominio transmembrana y otro
citoplasmático (155). Los fragmentos extracelulares de estas ADAM comparten
una gran similitud con el grupo SVMP (metaloproteasa de veneno de serpiente)
y con las disintegrinas. La mayoría de estas proteínas se sintetizan como
precursores inactivos, donde el prodominio está unido al dominio catalítico
interaccionando con el Zn2+ y manteniendo inactiva la enzima.
Figura 5. Estructura de los dominios de las proteínas ADAM.
Aunque todos los miembros de la proteína poseen un dominio
metaloproteasa conservado, sólo 15 de ellas contienen la secuencia catalítica
Prodominio Metaloproteasa Disintegrina Dominio Trans-membrana
Cys-rich EGF citosólicoZNProdominio Metaloproteasa Disintegrina Dominio Trans-membrana
Cys-rich EGF citosólicoZN
Introducción .
46
de unión del Zn2+ (HEXXH). Sin embargo, se piensa que sólo la mitad de las
ADAM son activas catalíticamente, mientras que el resto carece de esta
actividad (155).
La familia de proteínas ADAM consiste en un número de glicoproteínas
transmembrana que juegan un papel en la unión y fusión de los óvulos al
esperma, fusión de las células del músculo, neurogénesis, susceptibilidad a la
hipersensiblidad tipo I, y proteolisis de las diferentes proteínas de membrana
(156, 157).
Como ya se ha comentado, los neutrófilos usan la selectina-L para rodar a
lo largo del endotelio en la fase inicial de la cascada de adhesión. En segundos,
la selectina-L es cortada de la superficie de los neutrófilos que están rodando,
la velocidad de rodamiento disminuye y su acumulación tisular se incrementa
cuando el corte de la selectina-L es bloqueado in vitro (41). Por tanto, una
correcta regulación de la expresión de la selectina-L es necesario para una
extravasación eficiente de los neutrófilos (42). El ADAM-17 (CD156b), también
conocido como la enzima convertidora del TNF-α (TACE), ha mostrado
actividad proteolítica en la selectina-L (46). Aunque está bien establecido que el
ADAM-17 es requerido para un corte eficiente de la selectina-L, el hecho de
que las células deficientes en TACE generen un corte significativo de esta
molécula (47), sugiere que debería de haber otro corte o factor adicional
envuelto en este proceso.
5.1 El ADAM-8
El ADAM-8 (CD156a), es una proteína transmembrana tipo 1 (98 KDa),
que se clonó originalmente en células monocíticas (157), y está expresada
principalmente en células del sistema inmune, como los monocitos,
granulocitos, y células B. Aunque los ratones que carecen del gen del ADAM-8
no presenta un defecto estructural relevante (158), diferentes publicaciones han
sugerido un papel importante del ADAM-8 en un número de procesos
patológicos (159, 160). Recientemente, se ha observado que el ADAM-8 está
Introducción.
47
implicado en la fusión de osteoclastos (OCL) (161). También, el ADAM-8 ha
mostrado capacidad de procesar a formas solubles el CD23 (162) y la molécula
de adhesión celular neural CHL1 unida a membrana (163). Sin embargo, la
regulación de la expresión y/o función del ADAM-8 en células del sistema
inmune, que es donde está preferentemente expresado, está menos estudiado.
La reciente implicación del ADAM-8 en la respuesta alérgica (160), junto a su
papel potencial en el proceso de infiltración leucocitaria, mostrada por ratones
transgénicos para ADAM-8 (164), han aumentado el interés por esta
metaloproteasa de superficie en la regulación de la respuesta inflamatoria.
OBJETIVOS
Objetivos.
51
OBJETIVOS:
El objetivo fundamental de este proyecto es estudiar los
mecanismos implicados en la regulación de la expresión de la selectina-L
durante el inicio de la fase celular de la respuesta inflamatoria. Nos hemos
centrado en el papel que juegan los ROS y las metaloproteasas de
superficie de la familia ADAM, en el procesamiento de la esta molécula de
adhesión en neutrófilos humanos.
Para ello hemos dividido este trabajo en cuatro objetivos concretos:
1) Estudiar la implicación de los ROS, en especial del peróxido de
hidrógeno, en el corte y liberación de la selectina-L en neutrófilos.
2) Determinar la presencia de ROS en neutrófilos durante la cascada
adhesión y conocer su cinética de producción.
3) Conocer la regulación de la expresión del ADAM-8 en neutrófilos.
4) Determinar la capacidad del ADAM-8 para procesar el ectodominio
de la selectina-L.
MATERIAL Y MÉTODOS
Material y Métodos
55
MATERIAL Y MÉTODOS
1. REACTIVOS.
1.1 Anticuerpos.
La expresión de las diferentes moléculas se estudió por citometría de
flujo o western-blot usando los siguientes anticuerpos monoclonales:
1. Las Inmunoglobulinas (IgG1) monoclonales procedente s de
sobrenadantes de cultivo de hibridomas, producidos en el Laboratorio de
Inmunología del Hospital Universitario de La Prince sa fueron: como
control negativo el P3X63, el anti-CD11b (clon bear-1) y el anti-CD45 (clon
D3/5) (153).
2. El anticuerpo monoclonal anti-selectina-L humana (clon Leu-8) se
obtuvo en Becton Dickinson (Mountain View, CA).
3. Los anticuerpos monoclonales anti-ADAM-8 humano : una
inmunoglobulina IgG1 murina (143338), desarrollada contra el péptido 498–653
del ectodominio del ADAM-8 humano (ADAM-8h), y otro anticuerpo monoclonal
anti-ADAM-8h de cabra. Ambos, se adquirieron en R&D Systems (Minneapolis,
USA).
4. El anticuerpo anti-tubulina humana se obtuvo en Sigma-Aldrich
Chemical Co (St. Louis, Missouri, USA).
5. Como anticuerpos secundarios se utilizaron: una inmunoglobulina de
conejo anti-ratón F(ab´)2 marcado con FITC (Isotiacianato de Fluoresceína) de
DakoCytomation (Dinamarca A/S), un anticuerpo de conejo anti-cabra HRP
(Sigma-Aldrich) y un anticuerpo de cabra anti-ratón HRP (DakoCytomation).
Material y Métodos .
56
1.2 Antiinflamatorios No Esteroideos (AINE).
Los AINE que se usaron fueron: el ac. flufenámico, ac. meclofenámico,
diclofenaco, indometacina, nimesulide, flurbiprofeno, meloxicam, fenilbutazona,
piroxicam, ketoprofeno y aspirina (ácido acetilsalicílico). Todos se obtuvieron en
Sigma-Aldrich Chemical Co.
1.3 Antioxidantes e inhibidores de metaloproteasas.
Los antioxidantes que se emplearon fueron:
• Ditioles: DL-Ditiotreitol (DTT), ácido 2,3-Dimercapto-1-propano-sulfónico
(DMPS) en solución de sal sódica.
• Monotiol: el 2-mercaptoetanol (2-hidroxietilmercaptano; β-
mercaptoetanol). Todos estos reactivos se adquirieron en Sigma-Aldrich.
• Los inhibidores de MMP basado en ácido hidroxámico utilizados para
la prevención del corte de selectina-L fueron: el GM6001 (llomastat),
(Chemicon Internacional Temecula, CA), y KD-IX-73-4, cedido por el Dr. T. K.
Kishimoto (Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Ridgefield, CT) (165).
1.4 ADAM-8 recombinante.
El ectodominio recombinante humano del ADAM-8 soluble (residuo 1–
497) se utilizó inactivándo o activándo con termolisina, y fue adquirido en R&D
system.
1.5 Otros reactivos .
• El peróxido de hidrógeno (H 2O2) al 30%, el cual se obtuvo en
Calbiochem (U.S. y Canada).
• El miristo acetato de forbol (PMA) , se usó como control positivo de
activación celular (Sigma –Aldrich).
Material y Métodos
57
• El dihidroetidio (DHE), se utilizó para cuantificar la concentración de los
ROS en neutrófilos humanos, y se obtuvo en Sigma-Aldrich. Este producto es
permeable a la membrana celular. En el interior de la celula, se transforma en
etidio dependiendo de su estado oxidativo, y al intercalarse en el ADN emite
fluorescencia con una longitud de onda de excitación de 535 nm y emisión de
610 nm, que puede ser cuantificado con un fluorímetro.
• N-Fenilantranílico se obtuvo en Sigma-Aldrich.
2. CONSTRUCCIONES DE ADN Y TRANSFECCIONES.
La secuencia del ADAM-8 nativo (ADAM-8 fl), su forma inactiva (H604A,
H608A) (ADAM-8 mut) y la selectina-L se subclonaron en el vector de
expresión pcDNA3.1 con resistencia a neomicina (162).
2.1 Transfecciones.
Las transfecciones de los plásmidos del ADAM-8 fl y del ADAM-8 mut se
realizarón en células HEK 293 (línea embrionaria de riñón humano) y CEM
(línea T linfoblástica humana) con el kit VCA-1003 (Nucleofector, Amaxa GmbH,
Koeln, Alemania). Las células HEK 293 además se transfectaron
simultáneamente con selectina-L humana.
HEK 293:
• 2 µgr de pcDNA3.1 vacío.
• 0,5 µgr de pcDNA3.1-selectina-L más 1,5 µgr de pcDNA3-ADAM-8 fl.
• 0,5 µgr de pcDNA3.1-selectina-L más 1,5 µgr de pcDNA3-ADAM-8 mut.
• 0,5 µgr de pcDNA3.1-selectina-L.
Material y Métodos .
58
CEM:
• 2 µgr de pcDNA3.1-ADAM-8 fl.
• 2 µgr de pcDNA3.1-ADAM-8 mut.
En las células CEM se observó un corte inespecífico de la selectina-L
endógena inducida por el proceso de transfección. Para evitar este efecto, las
células se incubaron inicialmente en medio que contenía 10 µM KD-IX-73-4
durante 20 h después de la transfección. Luego, el inhibidor se eliminó y las
células se cultivaron en medio completo durante 4h, el sobrenadante se recogió
y 2x106 células se lisaron. El resto de células se utilizó para comprobar la
eficacia de las transfecciones mediante citometría de flujo.
3. CÉLULAS PRIMARIAS Y LÍNEAS CELULARES.
3.1 Neutrófilos humanos.
Los neutrófilos humanos se aislaron de sangre periférica de donantes
sanos por centrifugación en gradiente de densidad en Ficoll (Biochrom AG,
Berlin) durante 30 minutos a 1.500 rpm. Luego se realizó una sedimentación a
1g en dextrano (Sigma Chemical Co) al 1,3% (peso/vol) durante 20 min a
temperatura ambiente. La fracción de neutrófilos se sometió a un choque
osmótico con agua destilada para eliminar los eritrocitos, dando una pureza
mayor al 95% (CD11b positivos en citometría de flujo).
3.2 Células HUVEC (células endoteliales de cordón u mbilical).
Las HUVEC se obtuvieron de cordones umbilicales humanos,
suministrados por el Servicio de Ginecología del Hospital Universitario de
Canarias, previo consentimiento informado de las madres donantes. En primer
lugar, se canuló la vena principal del cordón, posteriormente se instiló una
solución de colagenasa (0,5 mgr/mL) 1mL/cm. Tras la incubación del cordón
Material y Métodos
59
durante 20 min a 37ºC se recuperó la solución de colagenasa. Luego se
lavaron con PBS, las células obtenidas se cultivaron a 37ºC y 5% de CO2 con
medio 199, conteniendo 10% FBS -suero bovino fetal- (PAA Laboratories
GmbH, Pasching, Austria) y penicilina/estreptomicina, en frascos de cultivo
(T25). Tras la confluencia se pasaron a frascos T75 recubiertos con gelatina al
0,5 % en suero fisiológico, durante 1 hora a 37ºC en medio completo: medio
199, 20% de suero, 1% de Hepes, 1% de penicilina/estreptomicina, 5µgr/mL de
ECGF -factor de crecimiento de células endoteliales- y 0,1% de heparina.
Todos los reactivos se obtuvieron en PAA.
3.3 Células DRM (monocitos de ratón inmortalizados) .
Las líneas celulares monocíticas de origen murino, DRM (Dextrex-ras-
myc) fueron donadas por el Dr. Peschon de Immunex Corporation, Seattle,
USA. (46). Tanto las células DRM sin actividad TACE (DRM (-/-)), debido a una
delección en el lugar de unión a Zn++ del dominio catalítico, como las que
expresaban el TACE (DRM (+/+)) estaban transfectadas con selectina-L
humana de forma estable, mediante transfección con un sistema de retrovirus
(166). Estas líneas celulares se cultivaron en RPMI 1640 (Gibco, Auckland,
N.Z.), suplementado con glutamina (Biochrom), 100 units/mL penicilina (PAA),
100 mgr/mL estreptomicina (PAA), 0,1 mM AA no-esenciales (Sigma-Aldrich),
1mM piruvato sódico, 100µM β-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich), 10% FBS
(Gibco), 20 ngr/mL GM-CSF -factor estimulador de granulocitos de ratón-
(ImmunoTools GmbH, Friesoythe; Alemania).
3.4 Células HEK 293 (línea embrionaria de riñón hu mano).
Las células HEK 293 se cultivaron en DMEM (Dulbecco's Modified Eagle
Médium) (PAA), 10% de FBS (PAA), 50 IU/mL penicilina (Biochrom), 50 µgr/mL
streptomicina (Biochrom). Estas células se transfectaron con ADAM-8 fl, con el
ADAM-8 mut y con selectina-L humana.
Material y Métodos .
60
3.5 Células CEM (línea T linfoblásticas humana).
Las células CEM se incubaron en RPMI 1640 suplementado con 10%
FBS (Gibco), 100 U/mL penicilina (Biochrom), y 0,1 mgr/mL streptomicina
(Biochrom). Estas células se transfectaron con el ADAM-8 fl y con el ADAM-8
mut, para observar el corte de selectina-L endógena producido por estas
metaloproteasas.
Las HEK 293 y las CEM no expresan ADAM-8 constitutivamente. Todas
las células se incubaron a 37°C en una atmósfera co n humedad del 100% y al
5% de CO2.
4. PACIENTES.
Las muestras de líquido sinovial y de sangre periférica se obtuvieron de
pacientes con Artritis Reumatoide (AR) y Artrosis (167), previo consentimiento
informado, asistidos en el Servicio de Reumatología del Hospital Universitario
de Canarias y del Hospital Universitario de La Princesa de Madrid, que
presentaban derrame sinovial en rodillas. El líquido sinovial y la sangre
periférica de cinco pacientes con AR y artrosis se procesaron para aislar los
neutrófilos (pto 3.1) y estudiar la expresión en superficie de la selectina-L,
CD11b y ADAM-8. Una muestra del líquido sinovial de estos pacientes fue
procesada para estudiar proteínas solubles. Para ello, se eliminaron las células
mediante centrifugación a 13.000 rpm durante 2 min a 4ºC, después se recogió
el sobrenadante y se ultracentrifugó a 100.000 g durante 90 min también a 4ºC.
Este sobrenadante se recogió y se congeló a -80ºC para realizar detección de
proteína por ELISA.
5. CITOMETRÍA DE FLUJO.
5.1 Definición.
La citometría de flujo es una técnica destinada a la cuantificación de
componentes y/o características estructurales de las células, mediante
Material y Métodos
61
métodos ópticos. Esta técnica puede utilizarse para el análisis de diferentes
tipos celulares en una mezcla o suspensión, mediante la cuantificación de las
características estructurales (tamaño y complejidad). Por inmunofluorescencia
directa o indirecta utilizando anticuerpos, el citómetro permite cuantificar la
expresión de proteínas en las células de forma individual. En este trabajo se
usó citometría de flujo para determinar la expresión en superficie del CD11b,
selectina-L y ADAM-8.
5.2 Experimentos con H 2O2 y AINE.
Los experimentos para estudiar el efecto del H2O2 y AINE en la
expresión de moléculas de adhesión en neutrófilos y DRM, se realizaron en
tubos de polipropileno de 5 mL (Falcon Labware, Oxnard, CA). Los neutrófilos
aislados de sangre periférica de donantes sanos (ver 3.1) y las céluas DRM,
se resuspendieron en HBSS (BioWhitaker, Lonza, Bélgica).
En los experimentos de dosis-respuesta, el H2O2 se usó en un rango de
dosis de 0,15 a 4 mM en una solución de neutrófilos en HBSS durante 20 min a
37ºC. En experimentos con antioxidantes, los neutrófilos se pre-incubaron con
ditoles y monotioles a 5mM durante 20 min y las DRM a 10mM durante 1 hora,
ambos a 4ºC. Los AINE se utilizaron a 20 µgr/mL durante 20 min en neutrófilos,
y en experimentos con células DRM la concentración de los AINE fue doble. El
PMA se usó a 20 ngr/mL en neutrófilos y a 100 ngr/mL en experimentos con
DRM. Para los experimentos con inhibidor de metaloproteasas, las células se
pretrataron con GM6001 a 10µM durante 20min en neutrófilos y 20µM durante
1h en DRM, ambos a 4ºC. Todos los AINE y los inhibidores de MMP se
diluyeron en DMSO (Sigma – Aldrich) a una concentración final de éste ≤ 0,2%,
incluyendo controles. La expresión de selectina-L y CD11b se analizó por
citometría de flujo.
Material y Métodos .
62
5.3 Experimentos con sobrenadantes celulares.
Los neutrófilos (14x106 cels/mL) se incubaron a 37ºC en una placa de
cultivo de 24 pocillos. A diferentes tiempos se recogieron las soluciones
celulares y se centrifugaron durante un minuto a velocidad máxima (biofuge
fresco, Heraeus) a 4ºC. El sobrenadante sin células se añadió rápidamente a
neutrófilos mantenidos a 4ºC y seguidamente se incubaron durante 20 min a
37ºC en tubos de polipropileno.
En experimentos para estudiar la inestabilidad del sobrenadante libre de
células, éste se incubó a 37ºC durante diferentes tiempos (0-10 min) y se
añadió a los neutrófilos que se mantenían a 4ºC. Posteriormente, se incubaron
durante 20 min a 37ºC. La expresión de selectina-L y CD11b se analizó por
citometría de flujo.
5.4 Experimentos con ADAM-8 recombinante.
Para observar si el corte de la selectina-L era producido directamente
por el ectodominio del ADAM-8, los neutrófilos se incubaron con ADAM-8
soluble recombinante humano (residuo del aminoácido 1–497), sin activar y
activado con termolisina, durante 20 min a 37ºC. Posteriormente, la expresión
de la selectina-L y el CD11b se analizó por citometría de flujo.
5.5 Análisis.
Se analizaron 5X103 cels/punto en un citómetro de flujo Epics XL
(Beckman Coulter, CA, USA) y los datos se representaron en una escala
logarítmica. La fluorescencia producida por el anticuerpo secundario solo, por
el P3X63, o por los controles de isotipo correspondientes se consideraron
como fondo. Los datos se normalizaron para expresar la intensidad de
fluorescencia media relativa (IFMr), como se expresa en esta fórmula:
IFMr= (IFMcompuesto -IFMnegativo )/(IFMbasal - IFMnegativo ) x100.
Material y Métodos
63
En experimentos de variación del efecto anti-selectina-L de los
sobrenadantes a lo largo del tiempo, la fluorescencia producida por el PMA se
consideró el nivel de expresión mínimo y el basal se consideró el nivel de
expresión máximo. Los datos se normalizaron para representar los niveles de
expresión relativa de la selectina-L (selectina-Lr), como sigue:
selectina-Lr = (selectina-Lsobrenadante-selectina-Lpma)/(selectina-Lbasal-selectina-
Lpma) x100.
6. WESTERN-BLOT.
Los neutrófilos aislados de sangre periférica (pto 3.1), las células HEK
293 y las CEM se contaron (2x106 cels/punto) y se lisaron con un tampón de
lisis (PBS 1x, 0,5% Triton-X de Sigma-Aldrich y 8x inh. proteasas de Roche,
Austria).
El número total de proteínas en igual cantidad se separó por SDS-12%
PAGE. Se realizó la electroforesis y posteriormente se transfirieron las
proteínas a una membrana de nitrocelulosa. Después de bloquear con 5% de
leche en polvo desnatada en tampón TBS-T (50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM
de NaCl, 0,05% Tween 20), las membranas se incubaron con los siguientes
anticuerpos:
ANTICUERPOS PRIMARIOS USADOS:
• El anti-α-tubulina murino (Sigma) diluído 1:2000.
• El ac. de cabra anti-ADAM-8 humano (R&D system) diluído 1:500.
• El anticuerpo murino anti-selectina-L humana (BD bioscence).
Todos diluídos en TBS-T con 0,5% de leche desnatada durante 1:30 horas en
agitación a temperatura ambiente o toda la noche en agitación a 4ºC.
Material y Métodos .
64
Se realizaron tres lavados de 5 min de las membranas con TBS-T, y
posteriormente, se incubaron con los siguientes anticuerpos secundarios:
ANTICUERPOS SECUNDARIOS USADOS :
• El anticuerpo de conejo anti-cabra HRP (peroxidasa de rábano)
(Dako) dilución 1:2000.
• El anticuerpo de cabra anti-ratón HRP (Immunotools, Friesoythe,
Alemania) dilución 1:2000.
Todos incubados durante 1h a temperatura ambiente.
Para la detección se usó un sistema de revelado ECL Western Bloting
Substrate (Pierce, Rockford, USA). Posteriormente, se observaron las bandas
de proteína mediante una cámara de captación de imágenes (Kodax,
Rochester, NY).
7. CUANTIFICACIÓN POR ELISA DE LA SELECTINA-L Y EL ADAM-8
SOLUBLES.
Para la cuantificación de proteínas solubles en líquido sinovial o en el
sobrenadante de las células HEK 293, las CEM y los neutrófilos se utilizó la
técnica de ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay).
Los neutrófilos (7 x106 cels/mL), aislados de sangre perisférica y líquido
sinovial como se ha descrito anteriormente, se incubaron en HBSS solo, con
20 ngr/mL PMA o con 20 ngr/mL de TNF-α. Después de la incubación durante
los diferentes tiempos indicados, las células se eliminaron por centrifugación
(13.000 rpm durante 2 min a 4°C) y los sobrenadantes sin célula s se recogieron.
Los líquidos sinoviales obtenidos de rodillas de pacientes con AR y Artrosis se
guardaron a -80ºC, después de eliminar las células y fragmentos celulares por
ultracentrifugación como se ha descrito en el punto 4. La concentración del
Material y Métodos
65
ADAM-8 soluble (ADAM-8s) y selectina-L soluble (selectina-Ls) se analizó con
kits de ELISA, que se adquirieron en R&D Systems y Bender Medsystem
(Vienna, Austria) respectivamente, siguiendo las instrucciones del producto.
7.1 Análisis .
Los datos se expresaron como una concentración absoluta en
picogramos por mililitro o en unidades relativas, considerando 1 la
concentración del ADAM-8s en neutrófilos no estimulados y mantenidos a 4°C.
Los datos de selectina-L se expresaron como la concentración relativa con
respecto a la cantidad basal de selectina-L en CEM y en las HEK 293
transfectadas con esta molécula, las cuales se consideraron como 1.
8. ENSAYOS DE INTERACCIÓN ENDOTELIO-NEUTRÓFILO EN C ÁMARA
DE FLUJO.
Es un sistema por el cual se pretende simular el flujo sanguíneo in vitro,
y de esta manera estudiar las interacciones celulares que intervienen en la
cascada inflamatoria.
Material y Métodos .
66
Se sembraron células HUVEC, obtenidas como se describió en el pto 3.2,
a 200.000-300.000 células en placas de 35mm precubiertas con fibronectina
(20 µgr/mL) durante 1h a 37ºC. Al día siguiente, se estimularon durante 6 h con
20ngr/mL TNF-α a 37ºC. Los neutrófilos (1x106 cels/mL) se obtuvieron de
donantes sanos (pto. 3.1), y se resuspendieron en HBSS con 0,5% de
albúmina de suero bovino a 4ºC.
Para los estudios de interacción de neutrófilos-HUVEC se utilizó el
siguiente material y sistema:
• Jeringas de 20mL (B/BRAUN, Alemania).
• Bomba de succión (Harvard apparatus, Massachusetts, USA).
• Equipo calefactor (Warner Instrument Corporation).
Material y Métodos
67
• Microscopio invertido de contraste de fases de fluorescencia
(Zeiss, Axiovert, Alemania).
• Bomba de vacío.
• Un sistema de captación de imágenes (Hamamatsu, Orca, Japón).
• Cámara de flujo (Glycotech, Maryland, USA), con una goma
(ancho de canal: 5 mm y de grosor: 0,2 mm).
La solución celular se inyectó en la cámara de flujo a presión de 4
dinas/cm2. La interacción celular se visualizó, usando un objetivo 10x del
microscopio invertido de contraste de fases, en tres campos diferentes (cada
uno de 1 mm2). El sistema de captación de imágenes, una cámara digital
conectada al microscopio, se usó para realizar videos a 20 Hz (20
imágenes/seg). Las imágenes se grabaron en un ordenador mediante un
programa específico (Wasabi, Hamamatsu, Japón).
Para experimentos con fluorescencia, los neutrófilos se preincubaron
con DHE (50µM) durante 15 min a 37ºC, se lavaron con HBSS. Posteriormente,
Material y Métodos .
68
se resuspendieron en HBSS con 0,5 % de BSA. Se realizaron videos a 20Hz
durante 3 min en fluorescencia roja.
8.1 Análisis.
El análisis del rodamiento de neutrófilos sobre el endotelio activado se
realizó con un programa de análisis de imágenes (Metamorph, CA, USA). Se
calculó el número de células, la distancia, el tiempo y la velocidad con la cual
los neutrófilos rodaban sobre las células endoteliales. Para analizar videos de
fluorescencia se realizó una kimografía siguiendo la trayectoria de cada
neutrófilo, determinándose el nivel de fluorescencia mediante la intensidad de
pixeles.
9. DETECCIÓN ROS.
La medición de radicales libres se realizó mediante el DHE. Este
producto es sensible a la oxidación, el hidroetidio se transforma en etidio, se
intercala en el ADN y emite fluorescencia. El nivel de fluorescencia de las
células cargadas con DHE es proporcional a la concentración de ROS
intracelular. Los neutrófilos (2x106 cels/mL) se preincubaron con 15 µM de DHE
en HBSS durante 15 minutos a 37ºC. Luego, estas células se sembraron en
placas de cultivo celular de 96 pocillos (75µL/pocillo), cubiertas con albúmina
(1% de albúmina en PBS), en la ausencia y presencia de PMA (20ngr/mL) y
diferentes AINE. La intensidad de fluorescencia celular se midió en un
fluorímetro (Spectrafluor Genios, Tecan, Austria) con una longitud de onda de
excitación de 535 nm y emisión de 610nm, cada 3 min durante 30 min.
9.1 Análisis.
La intensidad de fluorescencia se representó en una escala lineal donde
el eje X representa el tiempo y en el Y la intensidad de fluorescencia. De estas
curvas se analizó el área que hay bajo ellas de cada una de las condiciones, se
Material y Métodos
69
restó a todos los valores el valor del basal y posteriormente se expresó en
porcentajes, donde el PMA se consideró 100% y el medio 0%.
10. INMUNOFLUORESCENCIA.
Las inmunofluorescencias se realizaron sobre células sembradas en
cámaras de cultivo de 8 pocillos cubiertos con fibronectina (20µgr/mL) durante
1 hora a 37ºC. Las células se fijaron con 3,7% de paraformaldehído (Panreac,
Barcelona, España), durante 10 min a temperatura ambiente, y se
permeabilizaron con 0,2% Triton X-100 (Sigma-Aldrich) durante 5 min a
temperatura ambiente. Los lugares de unión inespecífica se bloquearon con
10% suero de cabra (Sigma-Aldrich) durante una 1 h a temperatura ambiente.
Posteriormente, las células se incubaron durante 45 min a temperatura
ambiente con el anticuerpo primario diluído en PBS con 10% de suero de cabra.
Después de cinco lavados con PBS e incubados con el anticuerpo secundario
Alexa 488 cabra anti-ratón (Molecular Probes, Oregon, USA) durante 45 min a
temperatura ambiente, se lavaron y se montaron en medio de montaje FITC-
Guard (Testog Inc, Chicago, USA). Posteriormente, se observaron con un
microscopio confocal (Olympus, Hamburgo, Alemania).
11. MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA.
Neutrófilos humanos no activados y los procedentes de una ventana de
piel después de la fagocitosis de esferas de latex, se fijaron durante 24 h en
0,1 M de tampón PHEM (60 mM PIPES, 25 mM HEPES, 2 mM MgCl2, y 10 mM
EGTA (pH 6.9) con un 4% paraformaldehido, y luego fueron procesadas por
criosección ultrafina (168). Las criosecciones (45 nm) se cortaron a -125°C
usando un lápiz de diamante (Drukker Cuijk, Amsterdam, Holanda) en un
ultramicrotomo (Leica Aktiengesellschaft, Solms, Alemania) y se transfirieron,
con una mezcla de sacarosa y metilcelulosa, sobre una rejilla de cobre (169).
Las rejillas se plantaron en discos de 35-mm conteniendo 2% gelatina. Para
doble inmunomarcaje, se utilizó proteína A de 10 y 15 nm de diámetro (170)
conjugada con una sonda de oro coloidal (EM Laboratorio, Universidad de
Material y Métodos .
70
Utrecht, Países Bajos). Después del inmunomarcaje, las criosecciones se
sumergieron en una mezcla de metilcelulosa y uranilacetato y se examinaron
con un microscopio electrónico (Philips CM10, California, USA). Los controles
negativos se prepararon por reemplazamiento de los anticuerpos por un
anticuerpo de ratón o conejo irrelevante. Los anticuerpos usados para el doble
inmunomarcaje fueron: anticuerpo monoclonal ratón anti-ADAM-8 humano
(R&D Systems); el anti-lactoferrina humana de conejo (Cappel Laboratorios,
Detroit, USA); anti-mieloperoxidasa humana de conejo (DakoCytomation); anti-
gelatinasa humana de conejo (171), cedido por Dr. N. Borregaard
(Departamento de Hematología, Hospital Universitario National, Copenage,
Dinamarca); y anti-albúmina humana de conejo (Central Laboratory,
Netherlands Red Cross Blood Transfusion Service, Amsterdam, Paises Bajos).
12. FRACCIONAMIENTO SUBCELULAR .
Los neutrófilos no activados y activados (3–5 x 108) se lisaron y las
fracciones postnucleares se fraccionaron continuamente en gradientes de
sacarosa de 15%–40% (peso/peso) (172). Las fracciones subcelulares se
analizaron por marcaje específico de proteínas para cada organela: la lactato
deshidrogenasa (citosol), HLA (membrana plamástica), la fosfatasa alcalina
(vesícula secretora), gelatinasa (gránulos terciario), lactoferrina (gránulos
especificos), y peroxidasa (gránulos azurofílicos) (172, 173). Las vesículas
secretoras no se separaron de la fracción de la membrana plasmática bajo las
condiciones de fraccionamiento usadas (173). Las membranas de cada
fracción se obtuvieron por dilución de estas fracciones con 50 mM Tris-HCl (pH
8.0) y 100 mM NaCl. Luego se centrifugaron a 45.000 rpm (100.000 X g)
durante 90 min a 4°C, usando un rotor tipo 70 Ti (B eckman Instruments, CA,
USA). Finalmente, los precipitados se resuspendieron en 50 mM Tris-HCl (pH
7.5), conteniendo 2 mM del inhibidor de proteasas, PMSF
(fenilmetanesulfonilfluorido o fenilmetilsulfonil fluorido), y se conservaron a -
20°C hasta su uso.
Material y Métodos
71
Tanto los experimentos de microoscopía electrónica como los de
fraccionamientos subcelular se realizaron por el Dr. Mollinedo del Centro de
Investigación del Cáncer, Consejo Superior de Investigaciones Científicas-
Universidad de Salamanca, Salamanca.
13. ANÁLISIS ESTADÍSTICO.
Los resultados se expresaron como medias aritméticas ± ES de la media. Los
análisis de Test de Wilcoxon y de Pearson por pareja de muestras, se usaron
para determinar la diferencia significativa entre las medias.
RESULTADOS
Resultados
75
RESULTADOS
1. La expresión de la selectina-L en neutrófilos se regula por un factor
soluble endógeno.
La selectina-L se expresa constitutivamente en la superficie de los
neutrófilos y se procesa enzimáticamente, liberando al medio su dominio
extracelular en respuesta a múltiples estímulos (31). La presencia de esta
molécula en la membrana celular de los neutrófilos juega un papel esencial en
la cascada de adhesión, al ser la principal responsable de que los neutrófilos
rueden sobre el endotelio durante la fase de rodamiento de la cascada de
adhesión. El procesamiento del ectodominio de la selectina-L durante la
activación de los neutrófilos es un fenómeno bien conocido, sin embargo, los
mecanismos que lo regulan y la implicación de su pérdida en la respuesta
inflamatoria, están por determinarse (174). Se ha establecido que el corte y
liberación de la selectina-L se produce fundamentalmente por la acción de
metaloproteasa(s) de membrana (46), y aparentemente no por enzima/s
soluble/s (165). En la primera fase de este trabajo, estudiamos la posibilidad de
que un factor soluble pudiera participar en la regulación de la expresión de la
selectina-L en neutrófilos humanos.
Los estudios sobre la implicación de factores solubles en la pérdida de
la selectina-L se realizaron como se describe en la sección de Material y
Métodos. Los neutrófilos (14x106 cels/mL) aislados de sangre periférica de
donantes sanos, se incubaron en condiciones adherentes durante diferentes
tiempos en placas para cultivo sin sustrato a 37ºC. Los sobrenadantes sin
células se añadieron inmediatamente a neutrófilos del mismo donante
mantenidas a 4ºC para evitar su activación. Después de 20 min de incubación
en tubos de polipropileno a 37ºC, la expresión de la selectina-L se analizó por
citometría de flujo. Los histogramas de la Figura 1A muestran la variación de
Resultados .
76
expresión de la selectina-L y del CD11b en neutrófilos incubados con
sobrenadantes de células adheridas durante 20 min a 37ºC, respecto a otras
mantenidas con medio solo. Los datos de la Figura 1B muestran una
reducción dependiente del tiempo de la expresión basal de selectina-L en
neutrófilos (50-60%), sin cambios en el nivel de activación de los neutrófilos,
como lo demuestra una expresión estable del CD11b, una integrina cuyo
aumento de expresión en superficie se considera una medida del nivel de
degranulación celular (90). El efecto del sobrenadante celular fue proporcional
al tiempo de adhesión de los neutrófilos al plástico (Figura 1B ). Estos
experimentos de cinética mostraron que después de 15 min de adhesión, los
sobrenadantes de neutrófilos indujeron una reducción significativa en la
expresión basal de la selectina-L en neutrófilos. A los 30 min de adhesión, el
sobrenadante alcanzó su máximo efecto con una reducción en la expresión
basal de la selectina-L de aproximadamente el 60%. Los sobrenadantes no
modificaron la expresión basal del CD11b en neutrófilos a lo largo del tiempo,
lo que indica que el efecto de la pérdida de la selectina-L no se produjo por
activación celular inespecífica.
Estos datos sugieren que los neutrófilos activados por adhesión liberan
un factor soluble endógeno, con capacidad para inducir la pérdida de la
selectina-L en otros neutrófilos mediante un efecto auto-paracrino.
Resultados
77
A)
B)
Figura1. Un factor soluble, producido por neutrófilos humano s activados, reduce la expresión de selectina-L en neutrófilos no activado s. A) Expresión de la selectina-L y del CD11b analizada por citometría de flujo en neutrófilos humanos. Los histogramas de trazo continuo sin relleno, indican la expresión basal de la selectina-L y del CD11b; los histogramas grises representan la expresión de ambas moléculas de adhesión en la presencia de sobrenadantes procedentes de neutrófilos activados por adhesión; y los histogramas con líneas discontinuas representan el control negativo de fluorescencia. B) Efecto de los sobrenadantes de neutrófilos adheridos a plástico a diferentes tiempos sobre la expresión de selectina-L (●) y del CD11b (▼) por citometría de flujo. Los datos representan la relación de expresión de ambas moléculas por citometría de flujo entre las células tratadas con sobrenadante, con respecto a las cultivadas con medio en cada tiempo. Los datos representan la media ± E.S. de la IFMr de seis experimentos independientes. *, p<0,05 y **, p<0,01 versus medio con el Test de Wilcoxon.
tiempo (min)
0 10 20 30
Exp
resi
ón e
n su
perf
icie
(%
IFM
r)
20
40
60
80
100
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* ***
tiempo (min)
0 10 20 30
Exp
resi
ón e
n su
perf
icie
(%
IFM
r)
20
40
60
80
100
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* ***
Intensidad de fluorescencia
100 101 10 2 10 3 1040
selectina-L64
Núm
ero
de c
élul
as
100 10 1 102 103
CD11b
104
Intensidad de fluorescencia
100100 101101 10 210 2 10 310 3 1041040
selectina-L64
Núm
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élul
as
100100 10 110 1 102102 103103
CD11b
104104
Resultados .
78
2. El factor soluble, liberado por los neutrófilos activados es inestable a
lo largo del tiempo.
El sobrenadante de neutrófilos cultivados en condiciones adherentes
durante 20 min a 37ºC, se recogió e incubó durante tiempos variables a 37ºC
antes de ser añadido a neutrófilos en reposo. La Figura 2A muestra que
después de 10 minutos a 37ºC, el sobrenadante celular perdió totalmente su
capacidad de producir el corte de la selectina-L en neutrófilos no activados.
Estos datos sugirieron que el factor soluble, presente en el sobrenadante de
neutrófilos activados por adherencia, es inestable a tiempos cortos. Se decidió
entonces testar el efecto de agentes reductores (agentes sulfidrilos), DTT y β-
mercaptoetanol, en el corte de la selectina-L inducido por el sobrenadante de
neutrófilos. Los neutrófilos se pretrataron con agentes reductores (5mM) o con
el inhibidor de metaloproteasas GM6001, durante 20 minutos a 4ºC antes de la
adición de los sobrenadantes, que posteriormente se incubaron durante 20 min
a 37ºC. Las células incubadas con medio solo o con PMA (20 µgr/mL) se
utilizaron como controles. La reacción se ralentizó mediante frío (4ºC) y la
expresión de la selectina-L se determinó por citometría de flujo. Tanto el DTT
como el β-mercaptoetanol previnieron el corte de la selectina-L inducido por los
sobrenadandantes de neutrófilos activados (Figura 2B ).
Estos datos sugieren que el/los factor/es soluble/s liberado por los
neutrófilos al activarse se degrada rápidamente y tienen actividad oxidante,
esto indicaría que probablemente se tratan de radicales libres de oxígeno
(ROS).
Resultados
79
A) B)
Figura 2. El factor soluble producido por los neutr ófilos activados es un agente oxidante inestable a lo largo del tiempo. A) Descenso con el tiempo de la actividad de los sobrenadantes de neutrófilos activados sobre la expresión de la selectina-L. El sobrenadante sin células obtenido como se describió en la figura 1, se añadió a neutrófilos en reposo inmediatamente (tiempo 0) o después 2, 5 y 10 min de incubación a 37ºC. La expresión en superficie de la selectina-L se analizó por citometría de flujo tras 20 min de incubación a 37ºC de los neutrófilos con estos sobrenadantes. La IFMr de la selectina-L se comparó con los niveles expresión de células en medio sin sobrenadante, el cual se consideró como 100% (línea de puntos). Los datos representan la media ± E.S. de la IFMr de ocho experimentos independientes. *= p<0,05 y **=p<0,01 vs medio con el Test de Wilcoxon. B) Efecto de agentes reductores sobre el corte de la selectina-L inducido por sobrenadantes (S) de neutrófilos activados por adhesión. Las células se preincubaron con o sin agentes reductores como DTT o β-mercaptoetanol (5mM) o con un inhibidor de metaloproteasas basado en ácido hidroxámico, GM6001 (10µM), durante 20 min a 4ºC. Luego, los neutrófilos se cultivaron en la presencia ( ) o ausencia de sobrenadantes sin células. Las células control se incubaron bajo las mismas condiciones, en medio solo ( ) o en la presencia de PMA ( ). La expresión de la selectina-L se analizó por citometría de flujo y los datos representan la media ± E.S. de IFMr de ocho experimentos independientes. *, p<0,05 y **, p<0,01 por el Test de Wilcoxon.
tiempo (min)
Exp
resi
ón d
e la
sel
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a-L
(% IF
Mr)
0 2 4 6 8 100
20
40
60
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**
tiempo (min)
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+ S
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l 37º
C
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A
DT
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120
140
160
***
***
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100
120
140
160
***
***
Resultados .
80
3. El peróxido de hidrógeno reduce la expresión en sup erficie de la selectina-L en neutrófilos humanos.
Seguidamente decidimos testar el efecto de un ROS, como el peróxido
de hidrógeno (H2O2), sobre la expresión en superficie de la selectina-L en
neutrófilos humanos. La Figura 3A , muestra los cambios en la expresión de la
selectina-L en neutrófilos en respuesta a las diferentes concentraciones del
H2O2. Estos datos indican que el H2O2 a concentraciones ≥ 1mM induce una
reducción significativa en la expresión basal de selectina-L en neutrófilos (50-
60%). La Figura 3B muestra la inhibición producida por agentes reductores del
corte de la selectina-L inducida por H2O2. Los agentes reductores ditioles, DTT
y el DMPS, inhibieron el corte de la selectina-L inducida por H2O2 (80%). El
monotiol, β-mercaptoetanol, indujo un efecto similar (Figura 3B ).
Algunos autores han descrito que, bajo estímulos fisiológicos, la
selectina-L se corta por metaloproteasas de superficie pertenecientes a la
familia ADAM (46). Estas metaloproteasas de superficie pueden ser
bloqueadas por inhibidores basados en el ácido hidroxámico, uno de ellos es el
GM6001 (175). Para descartar la posibilidad de una actividad proteolítica
directa del H2O2 sobre la selectina-L, testamos el efecto del GM6001 en la
disminución de la expresión de la selectina-L inducido por H2O2. Como se
muestra en la Figura 3B , el pretratamiento de los neutrófilos con 10 µM de este
inhibidor previno significativamente la pérdida de expresión de la selectina-L
inducida por H2O2. Además, se muestra en la Figura 3C que, el H2O2 no
modificó la expresión basal del CD11b, excluyendo la activación celular
inespecífica como causa del efecto del H2O2 sobre la selectina-L.
Estos datos indican que el H2O2, uno de los radicales libre de oxígeno
que se producen durante el estallido respiratorio de los neutrófilos, produce la
disminución de la expresión de la selectina-L mediado por metaloproteasas en
neutrófilos humanos, a través de un mecanismo independiente de la activación
celular.
Resultados
81
A)
B) C)
Figura 3. El efecto del H 2O2 en la expresión de la selectina-L en neutrófilos, es dependiente de metaloproteasas e independiente de l a activación celular. A) Dosis-repuesta del H2O2 sobre la expresión de selectina-L basal en neutrófilos. Los neutrófilos se incubaron en medio solo o en la presencia de diferentes dosis de H2O2 (0,1-4 mM) durante 20 min a 37ºC. Los datos representan la media ± E.S. de cuatro experimentos independientes. B) Efecto de agentes reductores sobre el corte de selectina-L inducida por H2O2. Las células se preincubaron con ditioles (DTT y DMPS), monotioles (β-mercaptoetanol) o con el GM6001 durante 20 min a 4ºC, y posteriormente, con H2O2 (4mM) ( ) durante 20 min a 37ºC. Las células control se mantuvieron bajo las mismas condiciones en medio solo ( ) o en la presencia de PMA (20 ngr/mL) ( ). C) Efecto del H2O2 sobre el CD11b en neutrófilos tratados como se describió en el apartado B. Los datos de B y C representan la media ± E.S. de IFMr de ocho experimentos independientes. La expresión de selectina-L y del CD11b se analizó por citometría de flujo y la IFMr de ambas moléculas de adhesión se calcula considerando el nivel de expresión de neutrófilos cultivados en medio solo como 100 %. *, p<0,05 y **, p<0,01 Test de Wilcoxon.
0,1 1
Exp
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20
40
60
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100
120 ** *
Resultados .
82
4. La pérdida de expresión de la selectina-L en neu trófilos se correlaciona
con la producción de ROS intracelular.
Estudios previos han descrito que un grupo de AINE, los derivados de la
difenilamina, inducen el corte de la selectina-L en neutrófilos mediante un
mecanismo no completamente esclarecido, pero que depende del estado
energético celular, y que además, requiere de la presencia de TACE, un
miembro de la familia ADAM (A Desintegrin And Metalloproteinase Domain), en
la superficie celular (176). Otros grupos han demostrado que algunos AINE
inducen un incremento en la concentración de ROS intracelular en los
neutrófilos (153, 177, 178) (150). Nuestro siguiente objetivo fue buscar la
relación potencial entre el incremento de ROS intracelular y el corte de
selectina-L por AINE en neutrófilos.
La producción de ROS intracelular se determinó mediante fluorimetría de
neutrófilos humanos procedentes de donantes sanos precargados con
dihidroetidio (DHE), como se describe en el apartado de Material y Métodos.
Los neutrófilos aislados de donantes sanos (1x106 cels/mL) se cargaron con
DHE (15 µM) durante 10 min a 37ºC, y la expresión en superficie de la
selectina-L se determinó por citometría de flujo mediante inmunofluorescencia
indirecta. La Figura 4A muestra como los agentes reductores previenen la
pérdida de la expresión de la selectina-L inducida por AINE (ac. flufenámico, ac.
meclofenámico y diclofenaco) en neutrófilos humanos. Cuando los datos de
concentración de ROS intracelular y de la expresión de la selectina-L en
neutrófilos tratados con diversos AINE o con PMA se representaron juntos, se
observó una correlación inversa entre la producción de ROS intracelular y la
expresión en superficie de la selectina-L (Figura 4B ) (Test de Pearson , p<
0,001).
Estos datos sugieren que el corte de la selectina-L y el incremento de la
concentración de ROS son eventos que suceden de forma simultánea en los
neutrófilos, y que consecuentemente podrían tener una relación causal.
Resultados
83
A) B)
Figura 4. Implicación del nivel oxidativo en el efecto de los AINE sobre la pérdida de la selectina-L en neutrófilos. A) Efecto de los agentes reductores (DTT, β-mercaptoetanol) en la disminución de la expresión de la selectina-L inducida por AINE en neutrófilos. Las células se preincubaron en medio solo ( ), con DTT ( ), β-mercaptoetanol ( ) (5mM, 10 min a 4ºC) y, posteriormente, se incubaron con ac. flufenámico, ac. meclofenaco y diclofenaco (20µgr/mL, 20min a 37ºC) ( ). Las células control se incubaron bajo las mismas condiciones en medio solo ( ) o en presencia del PMA (20ngr/mL). Los datos representan la media ± E.S. de la IFMr de seis experimentos independientes B) Correlación entre el incremento de la concentración de ROS intracelular y la disminución de la expresión en superficie de la selectina-L producida por diferentes AINE en neutrófilos. Los resultados representan la variación relativa de ROS intracelular y la expresión en superficie de selectina-L. La concentración de ROS intracelular de células en presencia de PMA y la expresión de la selectina-L en células mantenidas en medio se consideraron 100%. Los datos de la concentración de ROS y la expresión de la selectina-L en neutrófilos tratados con AINE se representaron juntos y se expresaron como medias ± E.S. de siete experimentos independientes. Se observó una correlación inversa significativa entre la producción de ROS intracelular y la disminución de la expresión en superficie de la selectina-L en neutrófilos humanos ( r = 0.97, p ≤ 0,001, Test de Pearson).
Expresión de selectina-L (% IFMr )
[RO
S] r
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0 20 40 60 80 100 120 140-20
0
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120
PMA
Flufen.
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FlubiMelo
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N-Fenil.
Expresión de selectina-L (% IFMr )
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PMA
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0
20
40
60
80
100
120 *** * * *
Resultados .
84
5. La pérdida de expresión de la selectina-L en neu trófilos humanos por H2O2 requiere de la presencia de TACE.
Utilizando células DRM, línea celular monocítica murina con TACE
(DRM(+/+)) o sin él (DRM(-/-)), que expresa la selectina-L humana de forma
estable, se describió que el efecto de los AINE sobre la selectina-L requiere de
la presencia de esta metaloproteasa en la membrana celular (176). Utilizando
la misma aproximación experimental decidimos analizar si el efecto del H2O2
sobre la selectina-L requería de la presencia de TACE. La Tabla 1 muestra la
expresión normalizada de selectina-L en células DRM(-/-) y DRM(+/+) tratadas
con diferentes estímulos. Las células DRM(+/+) incubadas durante 1h a 37ºC
con H2O2 (10mM), sufrieron una reducción en la expresión de selectina-L
cercana al 40% respecto a la basal, en rango similar al que produjo el ac.
flufenámico (20µgr/mL) o el PMA. Cuando las células DRM(+/+) se pretrataron
con DTT (8mM), y luego se incubaron con H2O2 o ac. flufenámico (20 µgr/mL)
se observó una inhibición significativa de la pérdida de selectina-L. La
presencia del inhibidor de proteasas GM6001 (20µM) bloqueó el efecto del
H2O2 o ac. flufenámico sobre la expresión de selectina-L en células DRM (+/+).
En las células DRM(-/-), ninguno de los estímulos produjeron una reducción
significativa en la expresión basal de selectina-L.
Estos datos sugieren que el H2O2 produce el corte de la selectina-L por
un mecanismo dependiente de TACE.
Resultados
85
Tabla 1. El corte de la selectina-L por H 2O2 en células DRM requiere de la presencia de TACE. Los datos representan la media ± E.S. de la IFMr de seis experimentos independientes. *, p<0,05 y ***, p<0,001 (Test de Wilcoxon).
6. La producción de ROS es inducida en los neutrófi los durante la
interacción dinámica con células endoteliales.
La fagocitosis de bacterias, cristales y otras partículas es seguida por un
elevado consumo celular de oxígeno y por la producción de diversos ROS.
Estos compuestos participan en la eliminación de los elementos fagocitados, y
pueden causar daños tisulares durante la inflamación al reaccionar con lípidos
y proteínas (179). Debido a esta capacidad de los ROS de dañar los tejidos, se
ha establecido que estos compuestos se producen en los neutrófilos sólo
después de abandonar el torrente sanguíneo y de haber migrado al tejido
inflamado. Nuestra observación de que los ROS ejercen un efecto regulador en
la expresión de la selectina-L en neutrófilos, sugería que estos compuestos
106±1687±10***GM6001 + H2O2
107±883±8 ***DTT + H2O2
106±564±10 *H2O2
103±775±5 *PMA
100±0100±0medio
DRM (-/-)DRM (+/+)
100± 12103 ±4 ***GM6001 + flufenámico
107±1289 ±7 ***DTT + flufenámico
97±969±9 *Ácido flufenámico
106±1687±10***GM6001 + H2O2
107±883±8 ***DTT + H2O2
106±564±10 *H2O2
103±775±5 *PMA
100±0100±0medio
DRM (-/-)DRM (+/+)
100± 12103 ±4 ***GM6001 + flufenámico
107±1289 ±7 ***DTT + flufenámico
97±969±9 *Ácido flufenámico
Resultados .
86
deberían de ser producidos de forma significativa en fases tempranas de la
cascada inflamatoria, en el momento en que se produce el procesamiento
enzimático de la selectina-L en los neutrófilos (31). Para testar esta posibilidad,
decidimos estudiar mediante técnicas de fluorescencia la producción de ROS
intracelular en neutrófilos humanos durante la fase de rodamiento sobre el
endotelio vascular. Se utilizó la oxidación del DHE como marcador de la
producción de ROS intracelular en los neutrófilos. Como se describe en la
sección de Material y Métodos, la interacción dinámica de los neutrófilos con el
endotelio se realizó en una cámara de flujo a una presión de 4 dinas/cm2. Los
cambios de fluorescencia de los neutrófilos se grabaron mediante una cámara
digital y se analizaron utilizando un software específico (Metamorph). La Tabla
2, muestra que los neutrófilos cargados con DHE se comportaron durante la
fase de rodamiento de forma similar a los neutrófilos no cargados en cuanto al
número de células que rodaban, a la velocidad y a la distancia de rodamiento.
Por tanto, estos datos indicaron que la presencia de DHE en el citoplasma de
los neutrófilos no interferiría en su forma de interactuar dinámicamente con el
endotelio activado.
Tabla 2. Velocidad, distancia y número de neutrófilos, carga dos o sin cargar (basal) con DHE, que ruedan sobre células endoteliales en exper imentos de cámara de flujo . Los neutrófilos (1x106 cels /mL) se incubaron 10 min a 37ºC en presencia o en ausencia de 50 µM de DHE en HBSS, se lavaron y posteriormente se resuspendieron en 10 o 20 mL de HBSS con 0,5% de BSA. Se realizaron experimentos de interacción neutrófilo-endotelio en cámara de flujo (4 dinas/cm2). Los datos representan la media ± E.S. de tres experimentos independientes, analizándose en cada experimento al menos 15 células por condición.
4,92±0,925,3±1,1
227,9±45214,2±58
11,2±1,79,8±2,8
DHEBasal
Células /mm 2/ min
Distancia recorrida (micras)
Velocidad (micras/seg)
4,92±0,925,3±1,1
227,9±45214,2±58
11,2±1,79,8±2,8
DHEBasal
Células /mm 2/ min
Distancia recorrida (micras)
Velocidad (micras/seg)
Resultados
87
La Figura 6A muestra cinco fotogramas en fluorescencia, separados por
3 segundos de una secuencia de video de 15 segundos. Se estudiaron los
neutrófilos A, B y C cargados con DHE en la fase de rodamiento sobre HUVEC
activadas. El neutrófilo A está en fase de rodamiento, mientras que el B y el C
se encuentran adheridos firmemente. Los histogramas representan la
distribución de fluorescencia de estas células en cada uno de los fotogramas.
Las células inmóviles muestran una fluorescencia estable a lo largo del tiempo
de exposición, a diferencia de la célula que rueda sobre el endotelio, en la cual
se observa un incremento de fluorescencia aparentemente proporcional a su
desplazamiento. La variación en el ancho medio de la curva de la intensidad de
fluorescencia de las células inmoviles osciló en 10±1%, y la de las células que
estaban en movimiento en 12±3%, lo que indica variaciones del enfoque no
significativas a lo largo del tiempo (Figura 6A ). Mediante kimografía (técnica
para representar la velocidad de una estructura en una serie de imágenes) se
estudiaron los cambios de fluorescencia de estos tres neutrófilos respecto a la
distancia recorrida y al tiempo transcurrido. La Figura 6B muestra el estudio
kimográfico (mediante gama de colores) de las células A, B y C. Las células B y
C están inmóviles y no muestran cambios en su nivel de fluorescencia a lo
largo del tiempo. Sin embargo, la célula A se desplaza e incrementa su
fluorescencia hasta que se detiene, permaneciendo estable a partir de
entonces.
La Figura 7 muestra el incremento de fluorescencia respecto a la
distancia recorrida en cada segundo, durante la fase de rodamiento, de seis
células representativas en tres experimentos independientes.
Estos datos indican que hay una producción de ROS en neutrófilos
durante las fases iniciales de la cascada inflamatoria de forma proporcional al
espacio y el tiempo recorrido.
Resultados .
88
A) célula A célula B célula C
B)
Figura 6. Producción de ROS en neutrófilos durante la fase de rodamiento. A) Secuencia de fotogramas de video en fluorescencia. Tres neutrófilos cargados con DHE, uno rodando, célula A, y dos en adhesión firme, B y C, se siguieron durante 12 segundos mostrándose la fluorescencia roja. Los fotogramas corresponden a la secuencia de video cada 3 segundos de separación entre ellos. Los histogramas representan la distribución de la fluorescencia en cada célula en cada uno de los fotogramas. Experimento representativo de 3 independientes. B) Kimografía de la secuencia completa de video. En el eje vertical se representa el tiempo, en el horizontal la distancia y la gama de colores del trazado representa la intensidad de fluorescencia de las células.
B
)
A
)
A B)
A
A
A
A)
B)
B)
B)
B)
120100806040200
121086420
ancho = 2,2627 ± 0,15
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80604020
121086420
160140120100
80604020
121086420
12010080604020
6420
12010080604020
6420
+
-
A)
C
C
C
C
C
2
200
150
100
50
8640 2
200
150
100
50
8640
200
150
100
50
8640
200
150
100
50
86420
200
150
100
50
86420
200
150
100
50
86420
200
150
100
50
86420200
150
100
50
86420
200
150
100
50
86420
200
150
100
50
8640 2
200
150
100
50
8640 2
C A
B
0
3
6
9
12
segundos
Resultados
89
Figura 7. Producción de ROS en neutrófilos humanos durante la fase de rodamiento. Neutrófilos humanos cargados con DHE se utilizaron para estudiar la producción de ROS intracelular durante la fase de rodamiento en cámara de flujo (4 dinas/cm2). La fluorescencia de los neutrófilos es proporcional a la producción de ROS. Las gráficas representan la relación entre la fluorescencia emitida y la distancia recorrida de 6 células independientes en cada segundo. La fluorescencia se representa como un incremento de ésta respecto a la inicial, al comenzar el rodamiento, que se consideró 0. El espacio se representa como la distancia recorrida al origen del rodamiento, que se consideró como punto 0.
0 100 200 300 400
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
0 100 200 300 400
0
20
40
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140
160
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0 200 400 600
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5
10
15
20
0 200 400 600
0
5
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200 100 200 300 400
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0 100 200 300 400
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0 100 200 300 400 500
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0 100 200 300 400 500
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1200 200 400 600 800
0
10
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50
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0 200 400 600 800
0
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0 100 200 300 400
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80
0 100 200 300 400
0
20
40
60
80
Distancia recorrida desde el inicio del rodamiento (micras)
Incr
emen
to d
e flu
ores
cenc
ia r
espe
cto
a la
inic
ial
Resultados .
90
7. Caracterización del anticuerpo monoclonal anti-ADAM -8.
Ya se ha comentado que la selectina-L se libera rápidamente de la
superficie celular de los neutrófilos durante la fase de rodamiento. La correcta
regulación del corte enzimático del ectodominio de la selectina-L durante esta
fase es de gran importancia para que la extravasación de los neutrófilos hacia
el foco inflamatorio sea eficaz (42). Se ha observado en experimentos in vitro
que el bloqueo de este procesamiento de la selectina-L causa una reducción en
la velocidad de rodamiento y un aumento en la capacidad de los neutrófilos
para migrar (41). El ADAM-17 o TACE, ha mostrado capacidad proteolítica
sobre la selectina-L (46). Sin embargo, el hecho de que células deficientes en
TACE procesen significativamente la selectina-L (47), junto a otras evidencias
(42), sugieren que otras metaloproteasas (ADAM), estén implicadas en este
proceso.
El ADAM-8 es otro miembro de la familia ADAM que participa en la
respuesta alérgica (160) y que parece estar implicado en procesos de
infiltración leucocitaria (164). Sin embargo, el verdadero papel de esta
metaloproteasa en la respuesta inflamatoria no ha sido investigado.
Para comenzar a estudiar la regulación y función del ADAM-8 en
neutrófilos humanos, testamos la especificidad de un anticuerpo monoclonal
comercial de ratón anti-ADAM-8 humano (clon 143338) en neutrófilo humanos.
El análisis por western-blot mostró dos bandas mayoritarias de 120 y 90 KD,
las cuales en el lisado de neutrófilos coinciden con el peso molecular descrito
para el ADAM-8 (162), pero en el lisado de HUVEC no se observó nada
(Figura 8A ). Seguidamente, se transfectaron transitoriamente células HEK 293
con un plásmido conteniendo el ADNc nativo del ADAM-8 (ADAM-8 fl) (162) o
con el vector vacío (pcDNA3), como control. Como se muestra en la
inmunofluorescencia (Figura 8B ), el anticuerpo monoclonal anti-ADAM-8
reconoció una proteína inmunoreactiva en células no permeabilizadas y
transfectadas con ADAM-8 fl, pero no en las transfectadas con el plásmido
control. De forma similar, células Jurkat J77 se tranfectaron, pero de manera
Resultados
91
estable, con el mismo vector y sólo las células transfectadas con ADAM-8 fl se
marcaron con el anticuerpo anti-ADAM-8 en citometría de flujo (Figura 8C ).
Como una primera aproximación para determinar su distribución celular, se
analizó por inmunofluorescencia la localización del ADAM-8 en neutrófilos
humanos no permeabilizados y permeabilizados con 0,1% TritonX-100. Se
encontró proteína inmunoreactiva para el anticuerpo anti-ADAM-8 en la
membrana plasmática de las células no permeabilizadas, y un patrón vesicular
en el citoplasma de las células permeabilizadas (Figura 8D ).
Estos datos muestran que el ADAM-8 se expresa tanto en la membrana
plasmática como en el citoplasma de los neutrófilos humanos no activados, lo
que sugiere que el ADAM-8 podría estar almacenado presintetizado en los
gránulos intracelulares de los neutrófilos.
Resultados .
92
A) B) C)
D)
Figura 8. Expresión del ADAM-8 en células humanas. A) Western-blot para el ADAM-8 de lisados de neutrófilos humanos y HUVEC. B) Immunofluorescencia de células HEK 293 transfectadas con un plásmido de ADAM-8 fl y con un vector de expresión vacío. A las 48 h después de la transfección, las células se incubaron con el anticuerpo monoclonal anti-ADAM-8. C) Expresión en superficie del ADAM-8 analizado por citometría de flujo en células Jurkat J77 transfectadas de manera estable con ADAM-8 fl (histograma gris), y el vector de expresión vacío (histograma transparente). El histograma con línea discontinua representa el control negativo de fluorescencia (mieloma P3X63). D) Distribución por inmunohistoquímica del ADAM-8 en neutrófilos humanos no activados. Un grupo de células se permeabilizaron a 4°C con 0,5% Tritón X-100 durante 1 min, mientras otras se mantuvieron en PBS. Las células de los paneles B y D se estudiaron por microscopía de fluorescencia confocal.
pcDNA3-ADAM-8 flpcDNA3
Ant
i-AD
AM
-8C
ontr
ol
pcDNA3-ADAM-8 flpcDNA3
Ant
i-AD
AM
-8C
ontr
ol
100
101 102
10 3 104
Intensidad de Fluorescencia
0
64
Núm
ero
de c
élul
as
100
101 102
10 3 104
100
100
101101 102
102
10 310 3 104
104
Intensidad de Fluorescencia
0
64
Núm
ero
de c
élul
as
Control Anti-ADAM-8Control Anti-ADAM-8
no-permeabilizadas permeabilizadas
Control Anti-ADAM-8Control Anti-ADAM-8
no-permeabilizadas
Control Anti-ADAM-8
no-permeabilizadas
Control Anti-ADAM-8Control Anti-ADAM-8
no-permeabilizadas permeabilizadas
Control Anti-ADAM-8Control Anti-ADAM-8
no-permeabilizadas
Control Anti-ADAM-8
no-permeabilizadas
HU
VE
C
Neu
tróf
ilos
ADAM-8h
98
64
Kd
HU
VE
C
Neu
tróf
ilos
HU
VE
C
Neu
tróf
ilos
ADAM-8h
98
64
Kd
ADAM-8h
98
64
Kd
Resultados
93
8. Localización subcelular del ADAM-8 en neutrófilo s humanos.
Para determinar de una manera más precisa la localización celular del
ADAM-8, realizamos un ensayo de fraccionamiento subcelular de neutrófilos.
El anticuerpo monoclonal anti-ADAM-8 reconoció por western-blot una banda
de 90 KD en el extracto postnuclear (E) y en la fracción de la membrana de
neutrófilos (M), pero no en la fracción soluble (S) contenida en el citosol
(Figura 9A ). La Figura 9B muestra la distribución de la proteína en las
diferentes fracciones subcelulares de los neutrófilos humanos no activados. El
ADAM-8 se distribuyó ampliamente y se localizó tanto en la membrana
plasmática como en la membrana de los diferentes gránulos citoplasmáticos.
Esta metaloproteasa se observó principalmente en las fracciones subcelulares
de la 4 a la 6 (gránulos terciarios y específicos), con localización secundaria en
las fracciones 2 y 3 (membrana plasmática) y, en menor cantidad, en las
fracciones 7 y 8 (gránulos azurófilos). Las condiciones del fraccionamiento
subcelular usados podrían no separar las vesículas secretoras de la fracción
que contiene la membrana celular (173). Por tanto, la localización del ADAM-8
en las fracciones de la membrana plasmática podría incluir también a estas
organelas subcelulares. Cuando los neutrófilos se activaron con PMA, que
induce la secreción selectiva de los gránulos específicos y terciarios, pero no
de los gránulos azurófilos (180), se observó un incremento relativo en el
contenido del ADAM-8 en la fracción 2 (fracción de la membrana plasmática),
simultáneamente a una reducción importante en las fracciones desde la 4 a la
6 (gránulos terciarios y específicos). Esto sugiere que la secreción de los
gránulos terciarios y específicos durante la activación con PMA incorpora el
ADAM-8 presente en la membrana de los gránulos a la membrana plasmática.
En la fracción 7, y principalmente en la 8 (fracción de los gránulos azurófilos),
se observó un incremento relativo en la inmunoreactividad del ADAM-8 (Figura
9B). Este incremento aparente en el contenido de ADAM-8 en fracciones más
densas, podría explicarse por una fusión de los gránulos intracelulares durante
la estimulación celular, un proceso que ha sido observado durante la exocitosis
en los neutrófilos (172, 181).
Resultados .
94
Mediante estudios de microscopía electrónica con inmuno-oro en
neutrófilos no activados, se detectó ADAM-8 tanto en la membrana plasmática
como en las membranas de gránulos y vesículas electrodensas (Figura 10 ). El
ADAM-8 se detectó en la cara externa de la membrana plasmática (Figura
10A) y en la cara interna de la membrana de gránulos y vesículas
intracelulares (Figura 10B ). Usando un contaje directo de 16 secciones
celulares seleccionadas al azar, la distribución relativa del ADAM-8 en
neutrófilos no activados fue: 52% en gránulos electrodensos, 39% en vesículas
electrodensas, y 9% en membrana plasmática. Para confirmar la localización
del ADAM-8 en los diferentes gránulos citoplasmáticos y vesículas, las
criosecciones de los neutrófilos se analizaron mediante doble marcaje,
combinando el monoclonal anti-ADAM-8h con marcajes específicos
(anticuerpos policlonales de conejo) para los diferentes gránulos y vesículas.
Encontramos co-localización entre el ADAM-8 y la albúmina, un marcador para
vesículas de secreción (Figura 10C ), el ADAM-8 y la gelatinasa, un marcador
de gránulos terciarios (Figura 10D ), el ADAM-8 y la lactoferrina, un marcador
de gránulos específicos (Figura 10E ), y el ADAM-8 y la mieloperoxidasa, un
marcador de gránulos azurofílicos (Figura 10F ). También se observó el ADAM-
8 localizado en los fagolisosomas de neutrófilos humanos después de la
fagocitosis de gránulos de látex (Figura 10G ).
Estos datos muestran que el ADAM-8 se localiza constitutivamente en
los gránulos terciarios, en los específicos y en las vesículas de secreción de
los neutrófilos, estructuras intracelulares que se funden con la membrana
plasmática tras la activación celular.
Resultados
95
A)
B)
Figura 9. Distribución subcelular del ADAM-8 en neutrófilos humanos. A) Western-blot para ADAM-8 de extractos de proteínas postnucleares (E), solubles (S), y de membrana (M) procedentes de lisados de neutrófilos humanos en reposo. B) Actividad enzimática e inmunoreactiva para ADAM-8 en las fracciones subcelulares de neutrófilos. Los neutrófilos se disgregaron en fracciones subcelulares. Las fracciones se recogieron y se analizó la actividad específica de cada organela. Los datos se representan normalizados a la fracción con actividad máxima que se consideró 100. Se analizaron los siguientes marcadores: Citosol: lactato deshidrogenasa ( ); membrana plasmática: HLA ( ); gránulos terciarios: gelatinasa ( ); gránulos específicos: lactoferrina ( ); gránulos azurofílico: peroxidasa ( ). Por western-blot se analizó el ADAM-8 de las fracciones subcelulares (50 µgr) de neutrófilos humanos basales y activados (1 µgr/mL PMA, 10 min). También se analizaron las membranas de las fracciones enriquecidas en membrana plasmática, en gránulos terciarios, en gránulos específicos, y gránulos azurofílicos. El peso molecular (KD) de la proteína marcada se indicó a la izquierda. Todos los datos mostrados son representativos de tres experimentos independientes.
Kd
98 -64 -
E S MKd
98 -64 -
E S M
◊ lactato deshidrogenasa (citosol)
■ HLA (m. plasmatica)∆ gelatinasa (gr. terciarios).● lactoferrina (gr. especificos)○ peroxidasa (gr. azurofílicos)
Gránulosespecíficos
Neutrófilosbasales
Neutrófilosactivados
Kd
0 1 2 3 4 5 6 7 8
0
20
40
60
80
100
% A
ctiv
idad
enz
imát
ica
Tot
alA
DA
M-8
inm
unor
eact
ivo fracciones subcelulares
98 -64 -
98 -64 -
Membranaplasmática
Gránulosterciarios
Gránulosazurofílicos
◊ lactato deshidrogenasa (citosol)
■ HLA (m. plasmatica)∆ gelatinasa (gr. terciarios).● lactoferrina (gr. especificos)○ peroxidasa (gr. azurofílicos)
Gránulosespecíficos
Neutrófilosbasales
Neutrófilosactivados
Kd
0 1 2 3 4 5 6 7 8
0
20
40
60
80
100
% A
ctiv
idad
enz
imát
ica
Tot
alA
DA
M-8
inm
unor
eact
ivo fracciones subcelulares
98 -64 -
98 -64 -
Membranaplasmática
Gránulosterciarios
Gránulosazurofílicos
Gránulosespecíficos
Neutrófilosbasales
Neutrófilosactivados
Kd
0 1 2 3 4 5 6 7 8
0
20
40
60
80
100
% A
ctiv
idad
enz
imát
ica
Tot
alA
DA
M-8
inm
unor
eact
ivo fracciones subcelulares
98 -64 -
98 -64 -
Membranaplasmática
Gránulosterciarios
Gránulosazurofílicos
Resultados .
96
Figura 10. Localización del ADAM-8 en la membrana plasmática y en la membrana de los gránulos intracelulares de los neutrófilos. A) Microscopía electrónica de neutrófilos en reposo. Criosecciones de neutrófilos marcados con un Ac. anti-ADAM-8 unido a oro (10nm). El ADAM-8 se detectó tanto en la membrana plasmática como en la de gránulos (g) y vesículas (v). B) El ADAM-8 se marcó (flechas) en la cara exterior de la membrana plasmática y en la cara interna de los gránulos y vesículas. Los neutrófilos se procesaron para doble marcaje con ADAM-8 unido a oro (10nm) y respectivamente con la albúmina (C), gelatinasa (D), lactoferrina (E), o mieloperoxidasa (MPO) (F) unidos a oro (15nm). En el inserto de la figura D se observa la presencia de dos partículas de oro en un gránulo positivo para gelatinasa. G) Localización del ADAM-8 en neutrófilos después de la fagocitosis de granulos de latex. El ADAM-8 se localizó en fagolisosomas (ph). Barra, 200 nm.
Resultados
97
9. El ADAM-8 es transportado a la membrana celular y secretado
durante la activación del neutrófilo .
La distribución del ADAM-8 en los diferentes gránulos de los neutrófilos
junto a su aumento en la membrana plasmática después de la activación
celular, sugería que la translocación de esta proteína a la membrana celular
estaba ligada al proceso de degranulación. Para testar esta posibilidad,
analizamos por citometría de flujo la cinética de expresión en superficie del
ADAM-8 en neutrófilos incubados a 37ºC durante diferentes tiempos. La
expresión basal de esta metaloproteasa en superficie aumentó con el tiempo,
con un pico máximo después de 15 min de cultivo, seguido de una reducción
significativa a los 45 min, y mostrando un perfil similar al que se observó con el
CD11b (172) (Figura 11A ). Además, se quiso determinar si la reducción en la
expresión del ADAM-8 después del pico máximo era debido a fenómenos de
internalización, degradación o liberación de la proteína al medio. Para ello, se
estudió el efecto de un inhibidor de metaloproteasas basado en el ac.
hidroxámico, el KD-IX-73-4 (165), sobre la expresión del ADAM-8 en superficie
en respuesta a la activación de los neutrófilos. Como muestra la Figura 11B , la
presencia de KD-IX-73-4 previno la pérdida de expresión en superficie del
ADAM-8 inducida por temperatura. Resultados similares se obtuvieron cuando
los neutrófilos se estimularon con TNF-α en presencia de KD-IX-73-4. Se
observó que la reducción en la expresión del ADAM-8 de la membrana
plasmática, producida por esta citoquina, era debida al corte del ectodominio
del ADAM-8 por metaloproteasas. En la Figura 11C se muestra que la pérdida
de la expresión en superficie del ADAM-8 durante la activación neutrofílica con
TNF-α o PMA, se acompañó de un incremento del ADAM-8 soluble (ADAM-8s)
en los sobrenadantes de cultivos de manera dependiente del tiempo. Además,
el pretratamiento de estas células con KD-IX-73-4 previno el corte del ADAM-8,
confirmando un mecanismo dependiente de metaloproteasas para el
procesamiento del ADAM-8 de la membrana plasmática (Figura 11C ).
Resultados .
98
Para analizar si la expresión del ADAM-8 podía variar en respuesta a la
interacción célula-célula, un hecho necesario en la cascada de adhesión (182)
(98), se estudió la variación de la expresión en la superficie celular del ADAM-8
en los neutrófilos, en respuesta a la interacción con HUVEC activadas. Este
ensayo mostró que la expresión en la membrana celular del ADAM-8 era
mayor en neutrófilos que habían mantenido una interacción física con el
endotelio activado, en comparación con las células que no interactuaron con
las células endoteliales (Figura 11D ).
Resultados
99
A) B)
C) D) Figura 11. El ADAM-8 en neutrófilos es translocado a la membr ana plasmática y luego liberado al medio. A) Cinética de la expresión del ADAM-8 en neutrófilos. Las células se incubaron a diferentes tiempos y la expresión del ADAM-8 ( ) y del CD11b ( ) se analizó por citomería de flujo. Los datos se analizaron considerando 1 la expresión basal de la selectina-L y del CD11b. La figura muestra un experimento representativo de cinco independientes. B) Expresión de ADAM-8 y selectina-L en neutrófilos. Los neutrófilos se preincubaron en ausencia o presencia de KD-IX-73-4, seguido de incubación con o sin TNF-α. La expresión del ADAM-8 y selectina-L se analizó por citometría de flujo. Los datos mostrados representan la media ± E.S. de la IFMr de cinco experimentos independientes. La expresión basal (neutrófilos a 4ºC) de ADAM-8 se consideró 1 y la de selectina-L 100% *, p < 0.05 por Test de Wilcoxon. C) Corte del ADAM-8 en neutrófilos. Las células se preincubaron en la ausencia ( ) o presencia ( ) de KD-IX-73-4, y luego se incubaron con o sin TNF-α o PMA. El ADAM-8s se midió en el sobrenadante sin células mediante ELISA. Los datos representan la media ± E.S. de la concentración de ADAM-8 relativa de cinco experimentos independientes considerando la expresión de neutrófilos a 4ºC como 1. D) Histogramas de citometría de flujo de la expresión de ADAM-8 en neutrófilos. A un monocapa de HUVEC confluentes activadas con TNF-α se le añadieron neutrófilos no activados en condiciones estáticas. Tras 30 min a 37ºC, se recogieron separadamente tanto los neutrófilos en suspensión como los unidos a las HUVEC. El histograma transparente representan la expresión del ADAM-8 de neutrófilos en suspensión, el histograma gris representa la expresión del ADAM-8 en neutrófilos adheridos al endotelio, y el de trazo discontinuo representa el control negativo. Se muestra un experimento representativo de tres.
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
Intensidad de Fluorescencia
0
48
Núm
ero
de c
élul
as
10 01010 0 10 110 110 1 10 210 2 10 310 3 10 410 4
Intensidad de Fluorescencia
0
48
Núm
ero
de c
élul
astiempo (min)
0 30 60
Exp
resi
ón e
n su
perf
icie
(IF
Mr)
1
2
3
tiempo (min)
0 30 60
Exp
resi
ón e
n su
perf
icie
(IF
Mr)
1
2
3ba
sal 4
ºC
basa
l 15
min
37º
C
basa
l 30
min
37º
C
PM
A 1
5 m
in37
ºC
PM
A 3
0 m
in37
ºC
TN
F-α
15 m
in37
ºC
TN
F-α
30 m
in37
ºC
AD
AM
-8 s
olub
le (
uni
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s re
lativ
as)
0
2
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8
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l 4º
C
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l 15
min
37º
C
basa
l 30
min
37º
C
PM
A 1
5 m
in37
ºC
PM
A 3
0 m
in37
ºC
TN
F-α
15 m
in37
ºC
TN
F-α
30 m
in37
ºC
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AM
-8 s
olub
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uni
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lativ
as)
0
2
4
6
8
basa
l 4ºC
basa
l 37º
C
37ºC
+K
D-I
X
37ºC
+T
NF
-α
37ºC
+K
D-I
X+
TN
F-α
Exp
resi
ón d
e A
DA
M-8
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IFM
r)
0
1
2
3
4
Expresión de selectina-L (%
IFM
r)
0
20
40
60
80
100
120* *
basa
l 4ºC
basa
l 37º
C
37ºC
+K
D-I
X
37ºC
+T
NF
-α
37ºC
+K
D-I
X+
TN
F-α
Exp
resi
ón d
e A
DA
M-8
(%
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0
1
2
3
4
Expresión de selectina-L (%
IFM
r)
0
20
40
60
80
100
120* *
Resultados .
100
10. El ADAM-8 se sobreexpresa en neutrófilos durant e la respuesta
inflamatoria in vivo .
Los resultados de este estudio mostraban que la activación in vitro de
los neutrófilos por citoquinas proinflamatorias, ésteres de forbol, o por adhesión
a HUVEC activadas indujeron una translocación del ADAM-8 de los gránulos a
la membrana celular, seguido de su corte por un mecanismo dependiente
metaloproteasas. Para determinar si el ADAM-8 es regulado de forma similar
durante la respuesta inflamatoria in vivo, se estudió esta molécula en
neutrófilos aislados simultáneamente de líquido sinovial y de sangre periférica
de pacientes con AR, una enfermedad caracterizada por la inflamación crónica
de las articulaciones. Los neutrófilos que se aislaron del líquido sinovial,
expresaban una gran cantidad de ADAM-8 en la superficie con respecto a los
que se aislaron de sangre periférica (Figura 12A ). Cuando estas células se
incubaron a 37ºC, la concentración del ADAM-8s, detectado por ELISA, en el
sobrenadante de neutrófilos aislados de líquido sinovial era mayor que en el de
los neutrófilos de sangre periférica. Además, se observó un incremento en la
concentración del ADAM-8s en respuesta al TNF-α, en los neutrófilos aislados
de ambos compartimentos. La concentración del ADAM-8s en los líquidos
sinoviales extraídos de pacientes con AR (n=5) fue 6 veces mayor que en el de
los pacientes con artrosis (n=5) (Figura 12C ). Cuando la concentración de
ADAM-8s se representó junto al contaje de leucocitos de los líquidos sinoviales
de estos pacientes, se encontró una correlación directa entre el incremento de
la concentración de esta metaloproteasa y la cantidad de células blancas en el
líquido (coeficiente de correlación r = 0.87, p ≤ 0.01) (inserto en Figura 12C ).
Resultados
101
A) B)
C)
Figura12. Expresión del ADAM-8 en neutrófilos de líquido sin ovial y sangre periférica de pacientes con AR . A) Citometría de flujo de la expresión basal del ADAM-8 en neutrófilos aislados de sangre periférica (histograma transparente) y líquido sinovial de pacientes con AR activa (histograma gris). El histograma de trazo discontinuo representa el control negativo (mieloma P3X63). Se muestra un experimento representativo de cuatro independientes. B) Concentración del ADAM-8s en sobrenadante de sangre periférica ( ) y líquido sinovial ( ) de pacientes con AR. Las células se aislaron y se mantuvieron en medio a 4°C, como control, o se incubaron a 37°C con o sin TNF-α. Después de 1 h, el sobrenadante sin células se recogió y la concentración de ADAM-8s se determinó por ELISA. Los resultados representa la media ± E.S. de ADAM-8s, en unidades relativas, de tres experimentos independentes. C) Concentración del ADAM-8s en líquido sinovial. Se analizó por ELISA la concentración del ADAM8s de líquido sinovial de rodillas de cinco pacientes con AR y cinco con artrosis. Los datos representan la media ± E.S. de la concentración de ADAM-8s en líquido sinovial (picogramos por mililitro). **, p < 0,001 vs artrosis por test Wilcoxon. La gráfica del inserto representa la correlación entre el incremento del ADAM-8s y la cantidad de células blancas en líquido sinovial de todos los pacientes estudiados. Se encontró una correlación directa entre la concentración de ADAM-8s y la cantidad de células blancas en el líquido sinovial. (r = 0,87, p < 0,01).
basa
l 4º
C
basa
l 37º
C
basa
l 37º
C +
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F-α
AD
AM
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2
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10
12
basa
l 4º
C
basa
l 37º
C
basa
l 37º
C +
TN
F-α
AD
AM
8 so
lubl
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nida
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tivas
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2
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48
Núm
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as
10 0 10 1 10 2 10 3 10 40
48
10 010 0 10 110 1 10 210 2 10 310 3 10 410 40
48
Núm
ero
de c
élul
as[A
DA
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] (pg
/ml)
0
500
1000
1500
2000
Artrosis Artritis reumatoide
[ADAM8s] (pg/ml)
Cél
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L.S
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0
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20000
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r=0,87p<0,01
**
[AD
AM
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pg/m
l)
0
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1500
2000
Artrosis Artritis reumatoide
[ADAM8s] (pg/ml)
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20000
2500030000
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0
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1500
2000
2500
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15000
20000
2500030000
r=0,87p<0,01
**
Resultados .
102
11. El ADAM-8 es capaz de inducir el corte de la se lectina-L.
Después de la activación de los neutrófilos, la selectina-L se corta en la
membrana celular, facilitando la extravasación celular (165). Ya que el
aumento del ADAM-8 y la disminución de la expresión de la selectina-L
parecían eventos concurrentes en la membrana celular del neutrófilo, se
decidió comprobar la posibilidad de que el ectodominio de la selectina-L
pudiera ser procesado, al menos en parte, por el ADAM-8 durante la activación
celular. Para testar esta posibilidad, cotransfectamos células HEK 293 con
selectina-L humana y con ADAM-8 fl o ADAM-8 mut (H604A, H608A) (162). Se
observó un aumento en la cantidad de selectina-L en el sobrenadante de las
células con ADAM-8 fl (Figura 13A ), en comparación con las células
transfectadas con ADAM-8 mut o con el vector de expresión vacío. El
incremento en la concentración de la selectina-L soluble (selectina-Ls) en el
sobrenadante de células que expresan el ADAM-8 fl se previno con el inhibidor
de metaloproteasas KD-IX-73-4. Los análisis de western-blot mostraron una
cantidad equivalente de selectina-L en las células HEK 293 transfectadas con
el ADAM-8 fl que con el mutado (Figura 13A ).
Para confirmar estos datos, células CEM, una línea celular linfoblástica
que expresa constitutivamente la selectina-L, se transfectó con el ADAM-8 fl y
con el ADAM-8 mut. Se observó que la cantidad de selectina-Ls presente en el
sobrenadante sin células era mayor en las células transfectadas con ADAM-8 fl
que en las células transfectadas con el vector de expresión vacío (pcDNA3) o
con el ADAM-8 mut. Además, la presencia de inhibidor KD-IX-73-4 previno el
corte de la selectina-L en células transfectadas con el ADAM-8 fl (Figura 13B ).
Los niveles de expresión en superficie en células CEM se redujeron
claramente con el ADAM-8 fl, pero no el ADAM-8 mut (Figura 13C ).
Estudios previos han observado que el ADAM-8s es capaz de
transformar un número de moléculas unidas a membrana en formas solubles
(162). Para demostrar que el corte de la selectina-L endógena se podía
producir por el ADAM-8s, se incubaron neutrófilos humanos durante 20 min a
Resultados
103
37°C en la presencia de la forma activa e inactiva del ADAM-8s (pto. 5.4 de
Material y Métodos). El ADAM-8s activado causó una reducción significativa en
la expresión en superficie de la selectina-L, sin observarse ningún aumento en
la expresión de CD11b en neutrófilos (Figura 14A ). El corte de la selectina-L
es el resultado de su corte proteolítico producido, al menos en ciertos tipos
celulares y bajo ciertas condiciones, por el TACE (46). Para averiguar el papel
potencial del TACE en la disminución de la regulación de la actividad de la
selectina-L, se analizó el efecto del ADAM-8s activo en las células DRM (-/-).
Cuando esta línea celular se cultivó durante 3 h a 37°C en la presencia del
ADAM-8s activo, se observó una importante reducción de la expresión en
superficie de la selectina-L. Sin embargo, este efecto no se observó en estas
células incubadas con la forma inactiva del ADAM-8s (Figura 14B ).
Todos estos datos sugieren que las formas unidas a membrana y las
solubles del ADAM-8, son capaces de cortar el ectodominio de la selectina-L.
El procesamiento de la selectina-L por el ADAM-8 requiere de la integridad de
su dominio catalítico, o sea, de la presencia de la forma proteolíticamente
activa, y además, esto es independiente de la presencia de TACE.
Resultados .
104
A) B)
C)
Figura 13. El corte de la selectina-L es producida por el ADA M-8. A) Concentración de selectina-Ls en sobrenadantes de células HEK 293. Las células se cotransfectaron con selectina-L humana con y sin ADAM-8 fl o ADAM-8 mut. Luego se incubaron durante 48 h en ausencia ( ) o en presencia ( ) de KD-IX-73-4. La concentración de selectina-Ls se midió por ELISA en sobrenadantes sin células. Los datos representan la media ± E.S. del contenido de la selectina-Ls de seis experimentos independientes. Los western-blot muestran el ADAM-8, selectina-L, y la α-tubulina en células lisadas de un experimento representativo. B) [Selectina-Ls] en sobrenadantes de células CEM. Las células se transfectaron con ADAM-8 fl, con ADAM-8 mut o con el vector vacío. Las células se incubaron durante 24 h en la ausencia ( ) o presencia ( ) de KD-IX-73-4 y la concentración de selectina-Ls en el sobrenadante se analizó por ELISA. Los datos representan la media ± E.S. de la concentración de selectina-Ls relativa de cuatro experimentos independientes. *, p < 0.05; **, p < 0.001 por el test de Wilcoxon. Los western-blot muestran el ADAM-8 y la α-tubulina en células lisadas de un experimento representativo. C) Citometría de flujo de la selectina-L y del ADAM-8 en células CEM transfectadas con ADAM-8. Los histogramas discontinuos representan el control de isotipo; con fondo gris representan la expresión en superficie del ADAM-8 y los histogramas transparentes corresponden a la expresión en superficie de la selectina-L. Se muestra un experimento representativo de tres independientes.
ADAM-8mut
100 101 102 103 104
Intensidad de fluorescencia
100 101 102 103 104
064
064
ADAM-8
pcDNA 3
064
064
06
40
64
064
064
ADAM-8selectina-L
100 101 102 103 104
064
núm
ero
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as
ADAM-8mut
100 101 102 103 104
Intensidad de fluorescencia
100 101 102 103 104
064
064
ADAM-8
pcDNA 3
064
064
06
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064
064
ADAM-8selectina-L
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ADAM-8
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3
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ADAM-8
***- KD-IX
+KD-IX
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-8m
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AD
AM
-8 fl
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3
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α-Tubulina
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AM
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AD
AM
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el-L
AD
AM
-8 fl
+sel
-L
pcD
NA
3+se
l-L
[sel
ectin
a-Ls
] (un
idad
es r
elat
ivas
)
0
1
2
3
4
5
6- KD-IX+KD-IX * *
98
60
55
ADAM-8
basa
l
Resultados
105
A)
B) Figura 14. Efecto de la forma soluble del ADAM-8 en la expre sión de la selectina-L en neutrófilos humanos y DRM deficientes en TACE (DRM (-/-)). A) Histogramas de citometría de flujo de la expresión de selectina-L y CD11b en neutrófilos humanos. Las células se incubaron en la presencia de ADAM-8s activado o no activado. Los histogramas discontinuos representan el control de isotipo, con fondo gris representan la expresión de la selectina-L y del CD11b en la presencia ADAM-8s activo, los transparentes representan la selectina-L y del CD11b de neutrofilos incubados con ADAM-8 inactivo. Se muestra un experimento representativo de cuatro. La gráfica de barras muestra la IFMr de la expresión de la selectina-L en neutrofilos incubados con la forma activa e inactiva del ADAM-8s. Los datos representan la media ± E.S. de cuatro experimentos independientes. B) Citometría de flujo de la selectina-L en células DRM. Las células DRM (-/-) se incubaron en la presencia de ADAM-8s activo o inactivo. Los histogramas discontinuos representan el control de isotipo; con fondo gris representan la expresión basal de la selectina-L y los transparentes representan la expresión de la selectina-L de células que se incubaron en la presencia de ADAM-8s activo. La gráfica de barras muestra IFMr de expresión de la selectina-L en células DRM (-/-) que se incubaron con la forma activa e inactiva de ADAM-8s. Los datos representan la media ± E.S. de cuatro experimentos independientes. *, p < 0.05 por test de Wilcoxom.
AD
AM
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Núm
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Intensidad de fluorescencia
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64
Intensidad de fluorescencia
selectina-L
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101
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CD11b
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Intensidad de fluorescencia
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10
20
30
40*
DISCUSIÓN
Discusión
109
DISCUSIÓN.
La selectina-L es una molécula de adhesión que se expresa
constitutivamente por los neutrófilos circulantes y juega un papel esencial en la
interacción inicial entre los leucocitos y la CE durante la respuesta inflamatoria.
La selectina-L es cortada y liberada al medio por la acción de metaloproteasas
de superficie durante la fase rodamiento de la cascada de adhesión. Sin
embargo, diversos aspectos de la regulación del procesamiento del ectodominio
de la selectina-L durante la interacción neutrófilo-CE no han sido aún aclarados.
En esta tesis se estudia la implicación potencial de los ROS producidos por los
neutrófilos, durante las fases iniciales de la cascada inflamatoria, en la
liberación de la selectina-L y el papel del ADAM-8 en este proceso.
Los datos obtenidos en este trabajo señalan que: 1) los neutrófilos
generan ROS durante la fase de rodamiento de forma proporcional a la
distancia que recorren sobre el endotelio, 2) la liberación de la selectina-L y la
producción de ROS son fenómenos simultáneos en neutrófilos humanos, 3) los
ROS inducen la pérdida de la selectina-L a través de un efecto auto-paracrino
mediante un mecanismo dependiente de ADAM-17, 4) el ADAM-8 se expresa
constitutivamente en la superficie de los neutrófilos humanos, y en los gránulos
y vesículas intracelulares, y en respuesta a la activación celular, es movilizado a
la superficie y liberado al medio por la acción de una metaloproteasa. 5) La
presencia de ADAM-8, tanto en la membrana celular, como en su forma soluble,
se asocia con un incremento en el corte y liberación de la selectina-L. Estos
hallazgos sugieren que en las fases tempranas de la respuesta inflamatoria, los
ROS pueden actuar como un sistema para regular la capacidad de
extravasación de los neutrófilos. Además, el ADAM-8 puede jugar un papel
relevante en la fase inicial de la cascada de adhesión participando en el corte de
la selectina-L en los neutrófilos.
Discusión .
110
Es bien conocido que los neutrófilos aceleran su consumo de oxígeno en
el foco inflamatorio, en un proceso conocido como estallido respiratorio
produciendo una gran cantidad de radicales libres que participan en la
eliminación de los elementos fagocitados (179). La generación de ROS ha sido
implicada en una gran variedad de procesos patogénicos causando daños
tisulares durante la inflamación al reaccionar con lípidos y proteínas (179, 183,
184). Entre los efectos biológicos perjudiciales mediados por los ROS en el
ambiente articular destacan, la despolimerización del ácido hialurónico (185), la
activación de MMP (186) y la inactivación de inhibidores de proteasas (187).
Debido a este efecto destructor tisular, se ha creído clásicamente que las
células fagocíticas sólo reciben el estímulo necesario para producir ROS una
vez que han migrado a los tejidos y no durante el proceso de transmigración.
Sin embargo, en los experimentos de interacción dinámica neutrófilo-endotelio
en cámara de flujo se observó que los neutrófilos que rodaban sobre el
endotelio incrementaban su estado oxidativo intracelular de forma proporcional
a la distancia que recorrían, permaneciendo este estado invariable una vez que
la célula entraba en la fase de adhesión firme. Este dato sugiere que durante la
interacción dinámica del neutrófilo con el endotelio se produce señales
intracelulares que inducen el estallido respiratorio celular, estímulos que se
interrumpen cuando el neutrófilo deja de rodar. Una explicación posible a esta
observación podría ser que las selectinas, y mayoritariamente la selectina-L
enviara durante la fase de rodamiento señales intracelulares implicadas en la
inducción del estallido respiratorio en respuesta a la interacción con sus
receptores endoteliales. En este sentido, ha sido descrito que el cross-link de la
selectina-L por anticuerpos monoclonales potencia el estallido respiratorio en
neutrófilos humanos (188). Este resultado sugiere que la activación del
neutrófilo comienza tempranamente durante la interacción adhesiva entre el
neutrófilo y la célula endotelial, antes incluso de que la señalización por
integrinas tenga lugar.
Discusión
111
Recientemente se ha descrito, que los ROS pueden inducir el corte y
liberación de la selectina-L en diversas líneas celulares (112) (189) (190). El
cultivo de neutrófilos humanos con H2O2 indujo una pérdida significativa dosis-
dependiente de la selectina-L sin afectar la expresión basal de CD11b. Este
efecto se revertió por sustancias reductoras, por inhibidores de metaloproteasas
basados en el ácido hidroxámico (KD-IX-73-4 o GM6001), y dependía de la
presencia de ADAM-17. Estos datos indicaban que los ROS son capaces de
activar al ADAM-17 de forma directa, posiblemente liberando el prodominio de
su unión al Zn++, activando el dominio catalítico de las ADAM. Para determinar
si la producción endógena de ROS era capaz de regular la expresión de
selectina-L en neutrófilos, incubamos estas células en presencia de diversos
AINE. Se ha descrito que algunos AINE son capaces de producir el corte de la
selectina-L en neutrófilos humanos por un mecanismo relacionado con la
disminución en la capacidad de producir ATP a nivel mitocondrial (150, 153,
176). También se ha descrito que algunos AINE son capaces de producir ROS
en neutrófilos (177, 178, 191), y sin embargo, otros son capaces de actuar como
scavenger de estos ROS (192). La correlación inversa que se observó entre la
capacidad de liberar la selectina-L y la inducción de ROS en neutrófilos
incubados con AINE sugiere que estos dos procesos están funcionalmente
relacionados.
Desde hace tiempo se ha establecido que la actividad enzimática que
procesa el ectodominio de la selectina-L en neutrófilos reside en la membrana
celular y no es un factor soluble (165). Sin embargo, nuestros datos no encajan
con esta visión clásica. En este trabajo observamos que la actividad anti-
selectina-L puede ser transferida a células en reposo por un factor que se
encuentra en el sobrenadante de neutrófilos activados. Se comprobó que este
factor era muy inestable debido a que al poco tiempo (minutos) perdía su
capacidad para liberar la selectina-L. Además, se trata de un factor oxidante
porque al ser pretratadas las células con productos antioxidantes se prevenían
su acción sobre la selectina-L.
Discusión .
112
En los neutrófilos humanos, el ADAM-8 está presente en los gránulos
terciarios, en los gránulos específicos y también en las vesículas secretoras,
con localización secundaria en la membrana plasmática y en los gránulos
azurofílicos. Esta es la primera descripción de una proteína de la familia ADAM
en los compartimentos secretores de los neutrófilos y sugiere que la
composición en metaloproteasas de estas estructuras subcelulares es más
complejo de lo esperado, incluyendo a un miembro de la familia ADAM a las
metaloproteasas previamente descritas como MMP-8, MMP-9 y la MMP-tipo 6
de membrana (193). En neutrófilos en reposo, la mayor parte del ADAM-8 se
encuentra en las organelas subcelulares. En respuesta a la activación celular, el
ADAM-8 es movilizado hacia la membrana plasmática como consecuencia del
proceso de degranulación, lo que supone un sistema de regulación de la
actividad del ADAM-8. Los sustratos actualmente descritos para esta
metaloproteasa de superficie se localizan en la membrana plasmática (162, 163),
lo que indica que estos puede ser cortados de una manera eficiente, solo
cuando ocurre la degranulación de gránulos específicos y terciarios, en
respuesta a estímulos proinflamatorios. El ADAM-8 está presente también en
gránulos azurofílicos, que contienen una gran cantidad de enzimas microbicidas.
Este tipo de gránulos son movilizadas después de la activación celular y
principalmente se fusionan con los fagosomas durante la fagocitosis (172, 194).
Con respecto a esto, nosotros observamos el ADAM-8 en fagosomas de
neutrófilos humanos después de la fagocitosis de granos de latex. El papel
potencial que esta metaloproteasa en el proceso de fagocitosis y muerte de
microorganismos por neutrófilos deberá ser mejor estudiado.
La reducción en el nivel de expresión del ADAM-8 observado en la
membrana celular después de la activación celular, y la presencia de la forma
soluble de esta enzima en el sobrenadante celular, sugiere la existencia de un
sistema de corte y liberación al medio (161, 195). La generación de la forma
soluble de esta metaloproteasa, pero no su movilización a la membrana celular,
se inhibió por el KD-IX-73-4. Este dato indicaba que, a diferencia de otras
Discusión
113
metaloproteasas de gránulos que son secretadas durante la activación
neutrofílica (193), el ADAM-8 es primero movilizado a la membrana celular y
luego procesado por proteolisis y liberado al medio. Aunque la metaloproteasa
responsable de este corte es desconocida, ha sido descrito que el ADAM-8
tiene capacidad autocatalítica, sugiriendo que esta enzima podría mediar su
propia liberación. La observación del ADAM-8 en dobletes en los estudios de
microoscopía electrónica en este trabajo podría encajar con la posibilidad de un
autoprocesamiento.
Los neutrófilos participan en la inmunidad innata y en el daño del tejido
mediante la liberación de diferentes enzimas catalíticas y polipéptidos
antimicrobianos almacenados en sus gránulos intracelulares (194). La actividad
de los miembros de la familia ADAM como procesadores de los ectodominio de
múltiples proteínas de superficie, su implicación en la rotura de componentes
de la matriz extracelular (196), junto a la actividad funcional ya descrita para la
forma soluble del ADAM-8 (161, 195) sugieren que esta metaloproteasa
debería jugar un importante papel en la respuesta inflamatoria patológica. La
expresión del ADAM-8 en la superficie los neutrófilos se incrementó en
respuesta a la interacción física con las células endoteliales. Este hecho podría
sugerir un importante papel regulador del ADAM-8 en la fase inicial de la
cascada de adhesión, probablemente a través del procesamiento de moléculas
de superficie que participan en la interacción inicial neutrófilo-endotelio durante
la respuesta inflamatoria. A este respecto, los neutrófilos aislados de líquido
sinovial de pacientes con AR activa expresan mayor cantidad en superficie y
liberan más ADAM-8 que los neutrófilos de sangre periférica de los mismos
pacientes. Además, la concentración de ADAM-8s que se encuentra en el
líquido sinovial de las articulaciones de pacientes con AR, era proporcional a la
intensidad de la inflamación, lo que sugiere que tanto la movilización del
ADAM-8 a la superficie celular como su secreción, debería ser inducida por la
migración y acumulación de neutrófilos en el foco inflamatorio. El hecho de que
otras metaloproteasas presentes en gránulos jueguen un papel importante en
Discusión .
114
la degradación de la matriz extracelular (197), hace razonable pensar que la
alta expresión de ADAM-8 en las articulaciones inflamadas de pacientes con
AR contribuya al progreso de la degradación articular. Esta idea es reforzada
por el papel que ha mostrado el ADAM-8s en la formación de OCL (161),
células encargadas de la reabsorción de los huesos, y por el hecho de que el
ADAM-8 está sobrexpresado en el tejido que circunda a los implantes metálicos
en hueso que no consolidan (198). Por todo esto, es asumible que el ADAM-8,
tanto en su forma de membrana como en la forma soluble pueda jugar un papel
importante en el desarrollo del daño tisular en las enfermedades inflamatorias
crónicas como la AR, bien participando en la regulación de la migración
transendotelial de los leucocitos durante la respuesta inflamatoria, o a través de
un efecto directo en la degradación de la matriz extracelular del tejido articular.
La selectina-L juega un papel esencial en la fase de rodamiento de los
leucocitos sobre el endotelio activado antes de la adhesión firme. Aunque el
corte del ectodominio de la selectina-L no es esencial para el reclutamiento
leucocitario, éste puede jugar un papel importante en la correcta extravasación
endotelial (42). En trabajos ya clásicos se ha descrito que los AINE pueden
inducir el corte de la selectina-L en neutrófilos al menos en parte a través de la
actividad del ADAM-17 (176). Este miembro de la familia de las ADAM procesa
un péptido que corresponde al TNF-α, su substrato mejor conocido, 2250 veces
más eficazmente que a la selectina-L (46). Este hecho junto a que células
deficientes en ADAM-17 son capaces de cortar y liberar la selectina-L de
membrana (47), sugiere que el ADAM-17 no es el principal regulador fisiológico
de la rápida pérdida de expresión que sufre la selectina-L durante la activación
de los neutrófilos (38). En este trabajo se demuestra que la presencia de
ADAM-8 en la superficie celular se asocia con el procesamiento de la selectina-
L. Este efecto era dependiente de la actividad catalítica de la enzima, y no por
la señalización producida por el dominio disintegrina, ya que una mutación en
el dominio catalítico o la acción del inhibidor de metaloproteasas KD-IX-73-4
inhibieron el corte de la selectina-L. Además, la forma soluble del ADAM-8
Discusión
115
también indujo el corte de esta molécula en neutrófilos, sin causar cambios
significativos en la expresión basal del CD11b en neutrófilos, indicando que
este efecto no era debido a la activación celular inespecífica (90). ADAM-17 y
ADAM-8 tienen una distribución celular diferencial y su nivel de expresión es
regulada por estímulos distintos en neutrófilos. El ADAM-17 está expresado de
forma constitutiva en la membrana celular de neutrófilos, mientras que el
ADAM-8 está localizado tanto en la membrana celular como en los gránulos
secretores. El PMA induce una reducción en la superficie celular del ADAM-17
por internalización, sin producir su forma soluble (199). Por el contrario, el PMA
induce la translocación del ADAM-8 a la membrana celular procedentes de los
gránulos y vesículas intracelulares, y seguidamente la liberación de la forma
activa de la enzima al medio extracelular. Además, el ADAM-17 y el ADAM-8
tienen distintas dianas moleculares. El TNF-α, la principal diana del ADAM-17,
no es cortada por el ADAM-8, que tampoco es capaz de procesar otras
moléculas proinflamatorias como el IL-1β o IL-6 (161). En contraste, el CD23 y
el CHL1 son procesadas por el ADAM-8 pero no por el ADAM-17 (162, 163).
Estos resultados sugieren que el corte de la selectina-L por el ADAM-8 y
ADAM-17 puede tener lugar en diferentes procesos fisiológicos y patológicos,
debiendo ser regulados por señales distintas. Con respecto a esto, nuestros
resultados con una línea celular deficiente en ADAM-17 (DRM (-/-)) indican que
el corte de la selectina-L inducido por el ADAM-8, al menos por su forma
soluble, es independiente de la actividad del ADAM-17. Nosotros proponemos
que, durante la cascada de adhesión los neutrófilos son activados por el
contacto con el endotelio y el ADAM-8 es movilizado a la membrana celular,
donde participa en el corte de la selectina-L, facilitando la extrasavasación de
los neutrófilos. Se ha demostrado que la forma soluble de la selectina-L
disminuye la migración de los neutrófilos al foco de inflamación (200, 201). De
esta forma, el corte de la selectina-L mediado por el ADAM-8, podría modular el
reclutamiento de leucocitos a los tejidos, actuando como un feedback negativo
de la respuesta inflamatoria.
CONCLUSIONES
Conclusiones
119
CONCLUSIONES.
1) Los neutrófilos humanos, en respuesta a la adhesión, liberan un factor
soluble que es capaz de inducir la liberación de la selectina-L en otros
neutrófilos cercanos, mediante un mecanismo que requiere de la
presencia de metaloproteasas de superficie, y es independiente de la
activación celular.
2) Este factor se degrada rápidamente y tiene actividad oxidante
comportándose como un radical libre de oxígeno.
3) Los neutrófilos humanos producen radicales libres de oxígeno durante la
fase más temprana de la cascada inflamatoria, de forma proporcional al
espacio recorrido por el neutrófilo sobre el endotelio vascular.
4) El ADAM-8 se expresa constitutivamente en la superficie celular, y en la
membrana de los gránulos y en vesículas intracelulares de los
neutrófilos humanos no activados.
5) En respuesta a la activación celular, tanto in vitro como in vivo, los
neutrófilos traslocan rápidamente el ADAM-8 desde las vesículas y
gránulos intercelulares hacia la membrana celular, desde donde es
rápidamente liberada al medio por un mecanismo dependiente de
metaloproteasas.
6) Tanto el ADAM-8 expresado en la membrana celular como su forma
soluble, son capaces de procesar el ectodominio de la selectina-L
produciendo su corte y liberación al medio.
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ANEXO
Anexo
140
PUBLICACIONES OBTENIDAS DURANTE LA TESIS.
• Maria Gómez-Gaviro, María Domínguez-Luis , Javier Canchado, Jero
Calafat, Hans Janssen, Enrique Lara-Pezzi, Anne Fourie, Antonio Tugores,
Agustín Valenzuela-Fernández, Faustino Mollinedo, Francisco Sánchez-Madrid,
and Federico Díaz-González. Expression and Regulation of the
Metalloproteinase ADAM-8 during Human Neutrophil Pathophysiological
Activation and Its Catalytic Activity on L-Selectin Shedding. The Journal of
Immunology. 2007, 178: 8053–8063.
• García-Vicuña R, Gómez-Gaviro MV, Domínguez-Luis MJ , Pec MK,
González-Alvaro I, Alvaro-Gracia JM, Díaz-González. CC and CXC chemokine
receptors mediate migration, proliferation, and matrix metalloproteinase
production by fibroblast-like synoviocytes from rheumatoid arthritis patients.
Artritis & Rheumatism. 2004, 50: 3866-3877.
141
