Sekundární metabolity

Většina uhlíku je v rostlinách vázánav produktech primárního metabolismu,jako jsou sacharidy, bílkoviny, tuky atd.Kromě těch však rostliny vytvářejí ještědalší sloučeniny — sekundární metabolity.Jejich chemická rozmanitost je ohromujícía my z nich dosud známe pouze nepatrnéprocento. Do dnešní doby byla z tohotohlediska chemicky prozkoumána asi 4 %rostlinných druhů a z nich izolováno vícenež 100 000 látek, přičemž každý rok při-bývá asi 4 000 dalších. Pro rostliny jsoutyto látky důležité zejména při adaptaci napodmínky vnějšího prostředí. Díky vlast-nostem sekundárních metabolitů byly urči-té rostliny pro lidstvo odedávna zdrojemléčiv, aromatických látek, ochucovadel,barviv a mnoha dalších produktů, pro něžčlověk nacházel a stále nachází nová uplat-nění.

Hledání nových cest

Už v raných dobách rozkvětu farmaceu-tického průmyslu si velké společnosti nají-maly špičkové etnobotaniky a farmako-gnosty (hledače nových léčivých látek),kteří se na svých dobrodružných expedi-cích do všech koutů světa snažili pro dobrolidstva (a své firmy) nalézt nové účinnélátky a zejména jejich zdroje. Za doby kolo-niálních mocností (a i poté) se některé pro-dukty rostlinného původu stávaly důleži-tým těžítkem na misce vah ekonomického

(obchod s kořením) i vojenského soupeře-ní. Během druhé světové války, kdy japon-ské a německé armády měly pod kontrolou90 % světových zásob chininu a všechnyvýznamné oblasti jeho produkce, onemoc-nělo malárií přes 600 000 amerických vojá-ků. Syntetická příprava chininu byla složitáa pro výrobu ve velkém příliš nákladná.Nastupující syntetická léčiva, i když nako-nec zachránila situaci, měla v té době protichininu řadu nevýhod. Tento příklad nasti-ňuje důležitost objevování, poznávání a zís-kávání nových zdrojů léčiv a dalších látekpocházejících z říše rostlin.

Jeden z nejčastějších modelů používa-ných při pátrání po nových látkách a jejichzdrojích vypadá ve zkratce asi takto: Všezačíná shromažďováním a studiem informa-cí o rostlinách používaných v různých tra-dičních systémech — tedy etnobotanic-kým průzkumem. U perspektivních rostlins požadovaným účinkem následuje ověřeníjejich možného využití, izolace a identifi-kace aktivních látek. Pokud látka projdesítem celé řady testů (od předběžnýchscreeningových až po klinické studie), ná-sleduje další krok, a tím je zajištění produk-ce takového množství látky, které by zaracionálních ekonomických podmínek po-krylo poptávku. V případě, že daná rostlinavytváří kýženou látku v dostatečném množ-ství a zároveň lze zajistit obnovitelný zdrojrostlinného materiálu, většinou již nic ne-brání na cestě k využití této látky. Jestližeale není možno z nějakého důvodu splnitněkterou z těchto podmínek, celý výzkum

se musí vrátit o několik kroků zpět a snažitse nalézt alternativní cesty.

K těm patří např. hledání jiného druhuprodukujícího stejnou látku, chemická syn-téza a v poslední době také čím dál častějisnaha o produkci látek in vitro, tzn. za říze-ných podmínek v laboratorním prostředípomocí buněčných a orgánových kultur.Ty jsou již delší dobu považovány za velminadějnou metodu produkce sekundárníchmetabolitů. Původně tomu tak ovšem ne-bylo. Nejprve převažoval názor, že struk-turně nediferencované buňky, jako kaluso-vé nebo suspenzní kultury, nejsou schopnyprodukovat žádné sekundární metabolity.Koncem 50. let minulého století se začalyve vědeckém tisku množit zprávy, kterétuto teorii popíraly. V následujících letechbylo u několika kultur dosaženo poměrněvysokých výnosů určitých látek, což vzbu-dilo velké očekávání, které se však nakonectak úplně nenaplnilo. V té době se také sestřídavými výsledky uskutečnilo mnohozajímavých průkopnických pokusů o ko-merční využití těchto metod. Japonskáfirma Japan Tobacco Inc. dokonce zkouše-la pěstovat buňky tabáku jako surovinu provýrobu cigaret.

Jedna z nejvyšších produkcí byla zazna-menána u suspenzní kultury kamejky rudo-kořenné (Lithospermum erythrorhizon),kde antimikrobiální látka shikonin tvořila12,4 % sušiny, což je přibližně 10× více, nežobsahují intaktní rostliny. Tento případ jevšak bohužel spíše výjimka potvrzující pra-vidlo. Hlavní překážkou komerčního využi-tí je totiž ve většině případů nízká produk-ce žádané látky a s tím spojená finančnínerentabilita. Uvádí se, že cena za 1 kg pro-duktu musí dosahovat alespoň 1 000 USD,

Rostliny in vitro —továrny na léčiva?

Pavel Klouček, Přemysl Landa, Tomáš Vaněk

„Kdysi vše zelené, co z půdy vyrazilo,výtečnou bylinou pro naše otce bylo.“

(R. Kipling)

CCCC MMMM YYYY KKKK

246 živa 6/2005www.cas.cz/ziva

Vlevo kořenová kultura ženšenu (Panax gin-seng). Z několika desítek gramů kořenů pěstova-ných in vitro bylo za dva měsíce získáno stejnémnožství účinných látek, jaké nahromadí jednarostlina za 8 let © Experimentální bioreaktor(Lambda Laboratory Instruments, objem 4,5 l)na pracovišti Ústavu organické chemie a bio-chemie AV ČR slouží ke kultivaci buněčnýcha orgánových kultur za řízených podmínek(pH, teplota, provzdušnění) v kultivačnímmédiu, vpravo

aby se produkce in vitro vyplatila. Tutohranici některé látky přesahují i o několikřádů (viz tab.). Příkladem může být alka-loid vinkristin, izolovaný z druhu katarantrůžový (Catharantus roseus, dříve Vincarosea), používaný při léčbě leukémie a dal-ších forem rakoviny, jehož cena je asi2 000 000 USD/kg. Díky vysoké poptávcepo těchto látkách se do popředí zájmu bio-technologů dostávají vybrané perspektivnídruhy rostlin. Pro průmyslové využití při-padají v úvahu dva typy kultur: suspenznía orgánové.

Suspenzní kultury

Jsou inspirovány mikrobiálními kultura-mi využívanými pro produkci klasickýchantibiotik a mají s nimi i hodně společné-ho. V ideálním případě by mělo jít o jednot-livé buňky nebo malé shluky, strukturněnediferencované, volně se vznášející v živ-ném médiu. Toho lze dosáhnout vhodnýmsložením média a kombinací fytohormonů.Složení pěstebního média závisí na druhurostliny. Obecně platí, že makroelementy(N, P, K, Ca, Mg a S) jsou v 1 l média pří-tomny v milimolárních koncentracích, za-

tímco mikroelementy (Fe, Mn, Zn, B, Cu,Mo a Co) pouze v mikromolárních. Nezbyt-nou součástí je zdroj uhlíku (většinou veformě sacharózy), protože buněčné kultu-ry většinou nefotosyntetizují. Další složkyovlivňující kvalitu média jsou vitaminy a ami-nokyseliny. Koncentrace a poměr mezi fy-tohormony auxiny a cytokininy má výraznývliv na procesy v buňce a hraje v médiuvelmi významnou roli. Důležité je také pHmédia, často se pohybuje okolo 5,7.

Rostlinné suspenzní kultury však majíproti mikrobiálním buňkám určité nevýho-dy. Generační doba rostlinných buněk sena rozdíl od mikrobiálních neměří na minu-ty či hodiny, ale na dny — jeden kultivačnícyklus trvá průměrně dva až tři týdny. Jsoutaké mnohem náchylnější na mechanicképoškození, což činí problémy při velko-objemové kultivaci. Pokud se však podařínalézt vhodný a technicky uskutečnitelnýsystém pro kultivaci ve velkoobjemovýchfermentorech a je splněna nezbytná pod-mínka ekonomické rentability, může setakový případ zařadit mezi ty, které seuplatnily v průmyslovém využití. Těch všakdosud mnoho není.

Jedním z prvních a nejúspěšnějších je jižzmíněná produkce shikoninu suspenzníkulturou kamejky rudokořenné (výtěžnostlátky 4g/l média), kterou zahájila v 70. le-tech japonská společnost Mitsui Petroche-mical Industry. Ta se pokoušela i o produk-ci berberinu (alkaloid s antimikrobiálníaktivitou) suspenzní kulturou Coptis japo-nica (3,5 g/l média). Jiná japonská firma,Nitto Denko, produkovala biomasu ženše-

nu ve fermentorech o objemu 20 m3 jakosurovinu pro výrobu potravních doplňků.Dalšími pokusy byly produkce antioxidač-ních látek ubichinon–10 (koenzym Q10)a kyseliny rozmarýnové. Všechny látkyvznikaly v letech 1976–1986.

V současnosti se pro komerční produkcivyužívají pouze suspenzní kultury výšezmiňované kamejky rudokořenné a někte-rých druhů tisu (Taxus spp.) pro výrobuprotirakovinné látky taxol. Proč, když exis-tuje celá řada prací informujících o produk-ci cenných látek v podmínkách in vitro?Odpovědi musíme hledat přímo v rostli-nách. Syntéza rostlinných sekundárníchmetabolitů je totiž oproti živočišným nebomikrobiálním komplexnější a zajištění vhod-ných podmínek pro produkci tudíž kompli-kovanější. S tím souvisí ekonomická nároč-nost výroby. Pořizovací i provozní nákladyreaktorů pro kultivaci rostlinných buněknebo orgánů jsou velmi vysoké.

Orgánové kultury

U orgánových kultur se využívá faktu, žestrukturně diferencované rostlinné buňkymají větší schopnost syntézy sekundárníchmetabolitů než buňky nediferencované.Jde tedy o kultivaci celých rostlin nebojejich částí. Z orgánových kultur se dostávánejvětší pozornosti kulturám kořenovým,a to hlavně transformovaným (tzv. hairyroots). Bakterie Agrobacterium rhizoge-nes, původce choroby zvané hairy–rootdisease, způsobuje u citlivých druhů dvou-děložných rostlin nekontrolovatelný růstkořenů. Mechanismus je velmi podobnýjako u známějšího druhu A. tumefaciens.Oba druhy bakterií způsobují vývoj abnor-málního typu pletiva pomocí začleněníčásti genomu do hostitelské DNA. V pod-mínkách in vitro lze tyto transformovanékořeny poměrně snadno odvodit a samo-statně kultivovat. Vyznačují se rychlým růs-tem, bohatým větvením a intenzivní tvor-bou kořenových vlásků. Jejich výhodou jegenetická stabilita (na rozdíl od suspenz-ních kultur) a vysoká biosyntetická kapaci-ta, ve které mnohdy předčí mateřskou rost-linu. Kořenová kultura blínu bezbranného(Hyoscyamus muticus) vykazovala několi-kanásobně vyšší produkci hyoscyaminu (al-kaloid používaný při poruchách trávicíhotraktu) než kořeny normálních rostlin, a tostabilně více než 15 let. Objevují se alei problémy, zejména při kultivaci ve vel-kých fermentorech. Kořenové kultury sicenetrpí mechanickým stresem, ale jejichnárůst je nerovnoměrný, čímž se kompliku-je provzdušnění a dodávka živin.

A jak je to s využitím orgánových kulturpro získávání farmaceutik? Jejich studiumtrvá kratší dobu než studium buněčnýchkultur a dosud je znám pouze jeden případkomerční produkce. Jihokorejská společ-nost CBN Biotech od r. 2001 produkujekořínky ženšenu jako surovinu pro kosme-tický a potravinářský průmysl. Kořenovékultury ženšenu jsou jedním z nejintenziv-něji zkoumaných případů. Na pracovištiÚstavu organické chemie a biochemie(ÚOCHB) AV ČR v Praze bylo z několikadesítek gramů kořenů pěstovaných in vitroza dva měsíce získáno stejné množství gin-senosidů, jaké nahromadí jedna rostlina za8 let. V takovýchto případech, kdy nárůstbiomasy přirozenou cestou trvá relativnědlouhou dobu, mohou být kořenové kultu-ry vynikající alternativou.

LLááttkkaa ÚÚččiinneekk RRoossttlliinnnnýý ddrruuhh CCeennaa ((UUSSDD zzaa kkgg))

Chinin antimalarický Cinchona ledgeriana 500Berberin střevní choroby Coptis japonica 3 250Shikonin antibakteriální Lithospermum erythrorhizon 4 500Ajmalicin antihypertenzivum Catharantus roseus 37 000Elipticin protirakovinný Orchrosia elliptica 240 000Morfin sedativum Papaver somniferum 340 000Kamptotecin protirakovinný Camptotheca acuminata 432 000Paclitaxel protirakovinný Taxus brevifolia 600 000Vinblastin protirakovinný Catharantus roseus 1 000 000Vinkristin protirakovinný Catharantus roseus 2 000 000

Tab. Vybrané rostlinné produkty používané ve farmacii a jejich orientační ceny

CCCC MMMM YYYY KKKK

247živa 6/2005 www.cas.cz/ziva

Ženšen (Panax ginseng) je jednou z nejintenziv-něji zkoumaných rostlin. Jeho kořeny předsta-vují cennou surovinu pro kosmetický, farma-ceutický a potravinářský průmysl. Jihokorejskáspolečnost CBN Biotech je zatím pravděpodob-ně jediná na světě, která kořeny ženšenukomerčně produkuje pomocí nejmodernějšíchtechnologií v bioreaktorech

Kudy dál?

Zůstane většina výzkumných prací jen napapíře, nebo nabere produkce sekundár-ních metabolitů in vitro druhý dech? Novétypy bioreaktorů s jednoduchou konstrukcíusnadňující udržení sterilního prostředímohou být jednou z cest. Někteří vědcisměrují vývoj poněkud odlišným směrem,než se dosud ubíral. Vychází ze skutečnosti,že je lepší pěstovat celé fotosyntetizujícírostliny, které nevyžadují přítomnost cukrův médiu, a to se pak stává méně příznivépro napadení nežádoucími mikroorganis-my. Výsledek — nižší nároky na sterilitua tím i nižší cena. Tento způsob blížící seaeroponii nebo hydroponii stále dovolujevyužití elicitace (zvyšování produkcepomocí stresových faktorů), dodávání pre-kurzorů, průběžného odebírání produktu

z média a dalších metod zvyšování produkce.Kromě těchto způsobů existuje ještě je-

den směr, do něhož se vkládají nemalénaděje — metabolické inženýrství. Tatotechnologie využívá genových manipulacípro upravení buněčné aktivity souvisejícís enzymatickými, transportními a regulační-mi funkcemi.

Snad si říkáte: „Proč zavírat rostliny donějakých nádob a tam je všemožně týrat,

když můžeme klasickým způsobem na polijednoduše vypěstovat, co potřebujeme?“ Vevětšině případů máte pravdu, ale v budouc-nosti by se nám takové poznatky mohlyhodit. Až se vydáme na cesty vesmírem, budebioreaktor spíše ve výhodě před záhonem.

Ale vraťme se na Zemi a do přítomnosti.I v současnosti existují případy, ve kterýchse využití rostlinných biotechnologií jevíjako výhodnější alternativa. Nemusí jít jeno rostliny pomalu rostoucí nebo ohroženénadměrným sběrem či devastací jejich při-rozených stanovišť. Zneužití rostlinnýchomamných látek, proměnlivá politická situa-ce v dodávající zemi nebo nevyzpytatel-nost přírody jsou další faktory mluvící veprospěch kultur in vitro. Je ale možné, žesi za několik let koupíte bylinný preparát,na němž bude napsáno: „Vyrobeno z umělepěstovaných rostlin.“

Komerční bioreaktory jihokorejské společnostiCBN Biotech, největší o objemu 10 000 l, vlevo.Nejdůležitější podmínkou úspěšné kultivaceje udržení sterilního prostředí v bioreaktoru© Sklizeň kořínků ženšenu (Panax ginseng)z komerčních bioreaktorů CBN Biotech, vpra-vo. Tyto kořínky obsahují stejné účinné látkyjako kořeny klasicky pěstovaných rostlin. Sním-ky T. Vaňka

CCCC MMMM YYYY KKKK

248 živa 6/2005www.cas.cz/ziva