1
Fenotypová identifikace Zástupci rodu Enterococcus jsou obecně známí jako bakterie typicky schopné růstu v rozmezí 10 až 45°C a v 6,5 % NaCl v mediu, dále růstu na půdách se žlučí nebo azidem sodným, hydrolýzou eskulinu a produkcí skupinového D antigenu. Tyto testy jsou považovány jako klasické znaky využitelné pro jejich identifikaci a izolaci. Jak je však možno vidět v následující tabulce, tak ne všechny druhy (především ty nověji popsané) jsou pro tyto testy pozitivní. Stejně tak, jako fenotypová diferenciace enterokoků od dalších fenotypově podobných grampozitivních koků, je rovněž druhová identifikace enterokoků pomocí biochemických testů problematická. Výsledky mnoha biochemických testů (okyselování cukrů, produkce enzymů) jsou v mnoha případech variabilní, a proto nemusí umožňovat jejich spolehlivou identifikaci. Z tohoto důvodu může být pro jednoznačnou identifikaci enterokoků nezbytná aplikace molekulárně-biologických identifikačních metod. Identifikace molekulárně-biologickými metodami Pro identifikaci enterokoků bylo v literatuře popsáno široké spektrum molekulárně-biologických metod, které jsou využívány jak při popisu nových druhů, tak pro jejich identifikaci a typizaci. DNA fingerprintové metody: rep-PCR s primerem (GTG) (repetitive element sequence-based PCR) 5 ITS-PCR (internally transcribed 16S and 23S rRNA genes spacer region) tDNA-PCR (tDNA intergenic spacer PCR) ribotypizace (selektivní hybridizace restrikčních fragmentů nesoucích geny pro ribozomální RNA) Sekvenační metody: 16S rRNA (neodliší spolehlivě blízce příbuzné druhy) rpoA (RNA polymerase alpha subunit gene) pheS (phenylalanyl-tRNA synthase alpha subunit gene) atpA (ATP synthase alpha subunit gene) sodA (manganese-dependent superoxide dismutase gene) Další metody: analýza celkových buněčných proteinů metodou SDS-PAGE MALDI (matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry) Pavel Švec Česká sbírka mikroorganismů, Ústav experimentální biologie, Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita, Tvrdého 14, 602 00 Brno, Česká republika e-mail: [email protected] Závěr Prací zaměřených na taxonomické studium environmentálních enterokoků bylo doposud publikováno relativně malé množství. Přesto získané poznatky ukazují, že populace kmenů rodu Enterococcus jsou v prostředí, a to především ve vodách a na rostlinách, přirozeně značně rozšířeny a jsou taxonomicky velmi variabilní a heterogenní. Lze předpokládat, že budoucí studium populací enterokoků vyskytujících se ve vnějším prostředí přinese mnoho nových informací o taxonomii i ekologii tohoto rodu. Tato prezentace byla podpořena finančními prostředky z projektu CEB CZ.1.07/2.3.00/20.0183. Obr. 1. Vnitrodruhové členění rodu Enterococcus na základě fylogenetické analýzy genu pro 16S rRNA. Dendrogram byl zkonstruován metodou Neighbor – Joining s využitím Maximum Composite Likelihood modelu pomocí programu MEGA5. Jako kořen dendrogramu byla použita sekvence Vagococcus fluvialis (Y18098). Literatura Ludwig, W., Schleifer, K. H. & Whitman, W. B. (2009). Family IV. Enterococcaceae fam. nov. In Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, The Firmicutes, vol. 3, p. 594. Edited by P. De Vos, G. M. Garrity, D. Jones, N. R. Krieg, W. Ludwig, F. A. Rainey, K. H. Schleifer & W. B. Whitman. New York: Springer. Niemi, R. M., Ollinkangas, T., Paulin, L., Švec, P., Vandamme, P., Karkman, A., Kosina, M. & Lindström, K. (2012). Enterococcus rivorum sp. nov., from water of pristine brooks. Int J Syst Evol Microbiol 62, 2169-2173. Sedláček, I., Holochová, P., Mašlanová, I., Kosina, M., Spröer, C., Bryndová, H., Vandamme, P., Rudolf, I., Hubálek, Z., Švec P. (v tisku). Enterococcus ureilyticus sp. nov. and Enterococcus rotai sp. nov., two novel urease producing enterococci from the environment. Int J Syst Evol Microbiol Sistek, V., Maheux, A. F., Boissinot, M., Bernard, K. A., Cantin, P., Cleenwerck, I., De Vos, P. & Bergeron, M. G. (2012). Enterococcus ureasiticus sp. nov. and Enterococcus quebecensis sp. nov., isolated from water. Int J Syst Evol Microbiol 62, 1314-1320. VP Švec, P. & Devriese, L. A. (2009). Genus I. Enterococcus (ex Thiercelin and Jouhaud 1903) Schleifer and Kilpper-Bälz 1984, 32 . In Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, The Firmicutes, vol. 3, pp. 594-607. Edited by P. De Vos, G. M. Garrity, D. Jones, N. R. Krieg, W. Ludwig, F. A. Rainey, K. H. Schleifer & W. B. Whitman. New York: Springer. Švec, P., Vandamme, P. A., Bryndová, H., Holochová, P., Kosina, M., Mašlaňová, I. & Sedláček, I. (2012). Enterococcus plantarum sp. nov., isolated from plants. Int J Syst Evol Microbiol 62, 1499-1505. Ekologie rodu Enterococcus Enterokoky jsou obecně známé především jako přirození obyvatelé trávicího traktu člověka a živočichů. Z pohledu významu pro člověka jsou enterokoky především původci pestré škály infekcí, a to včetně infekcí nosokomiálních. V této souvislosti hraje důležitou roli produkce různých virulentních faktorů, rezistence k pestré škále antibiotik, a také schopnost enterokoků frekventované výměny genetického materiálu, a to jak vzájemně mezi sebou, tak s bakteriemi z jiných rodů, při které dochází k šíření genů nesoucích faktory virulence a rezistence. Na druhé straně mají enterokoky pro člověka pozitivní využití při výrobě fermentovaných potravin a některé kmeny jsou rovněž využívány jako probiotika. Z těchto důvodů jsou právě druhy a kmeny enterokoků izolované z humánního klinického materiálu a z potravin nejčastěji studovány (Švec a Devriese, 2009). Mnohem méně prací bylo doposud věnováno environmentálním enterokokům Navzdory tomu byla většina nových druhů enterokoků popsaných v posledních letech izolována právě ze vzorků z prostředí. Sladká i slaná voda představuje bohatý zdroj environmentálních kmenů enterokoků, kteří jsou zde však většinou považováni, především v případě jejich zvýšené koncentrace, jako fekální kontaminanty humánního či živočišného původu. Především Ent. faecalis a Ent. faecium, kteří představují spolu s Ent. durans a Ent. hirae nejčastější druhy vyskytující se ve vodě, jsou považováni za typické druhy související s fekální kontaminací. Z vodního prostředí však byli izolováni také zástupci klasických druhů, jako je Ent. casseliflavus, či zástupci druhů, kteří byly popsáni poměrně nedávno nebo o jejichž ekologii a výskytu je doposud známo jen málo informací (Ent. haemoperoxidus, Ent. moraviensis, Ent. quebecensis, Ent. rivorum, Ent. rotai, Ent. ureilyticus nebo Ent. ureasiticus) (Švec a Devriese, 2009; Sistek a kol., 2012; Sedláček a kol., v tisku). Rostliny jsou osídleny populacemi enterokoků, které jsou taxonomicky velmi bohaté a významná část těchto kmenů představuje pravděpodobně nové, doposud nepopsané, druhy. Typickými druhy osidlujícími rostliny jsou Ent. faecalis, Ent. faecium, Ent. sulfureus , Ent. mundtii , Ent. casseliflavus , Ent. haemoperoxidus, a pravděpodobně také v letošním roce popsané druhy Ent. plantarum, Ent. rotai a Ent. ureilyticus (Švec a Devriese, 2009; Švec a kol., 2012; Sedláček a kol., v tisku). Půda je dalším významným ekosystémem vnějšího prostředí, která však ve srovnání s vodou nebo rostlinami není přirozeně osídlena enterokoky a jejich ojedinělý výskyt zde souvisí s kontaminací z živočichů nebo z jiných zdrojů (Švec a Devriese, 2009). Niemi a kol., 2012; Taxonomie a ekologie rodu Enterococcus Charakteristika rodu Enterococcus Bakteriální rod Enterococcus dnes zahrnuje 43 druhů, které byly izolovány z nejrůznějších prostředí. Fylogeneticky patří rod Enterococcus společně s rody Melissococcus , Tetragenococcus , Vagococcus , Catellicoccus a Pilibacter do čeledě Enterococcaceae (Ludwig a kol., 2009). Jedná se o grampozitivní, kataláza negativní ovoidní koky až kokotyčky, které netvoří endospóry, mohou být pohyblivé a mohou produkovat žlutý pigment. Na základě fylogenetické analýzy genu pro 16S rRNA (Obr. 1.) je možno enterokoky rozdělit do několika vnitrodruhových fylogenetických skupin. Jednotlivé druhy začleněné v těchto skupinách vykazují vysokou podobnost sekvence genu pro 16S rRNA, a také sdílí některé společné fenotypové znaky (Švec a Devriese, 2009). Czech Collection of Microorganisms http://www.sci.muni.cz/ccm/ Mikrobiológia vody a životného prostredia 2012 12. 9. – 14. 9. 2012 Kongresové centrum Nový Smokovec fylogenetická skupina druh rok popisu žlutý pigment pohyb 10 °C 45 °C 6,5 % NaCl D antigen eskulin výskyt Ent. faecalis Ent. caccae 2006 - - + + + stolice člověka, ječmen (zrno) Ent. faecalis 1984 - - + + + + + člověk (velký klinický význam), živočichové (obratlovci i bezobratlí), potraviny, voda (sladká i slaná), rostliny Ent. haemoperoxidus 2001 d - + + + + sladká voda, rostliny Ent. moraviensis 2001 - - + + + + sladká voda Ent. plantarum 2012 w - + + + + + rostliny Ent. quebecensis 2012 - - - - + studniční voda Ent. rivorum 2012 - w d d d + čistá povrchová voda Ent. rotai v tisku + - + - + + + voda, rostliny, komáři Ent. silesiacus 2006 - - + - + sladká voda Ent. termitis 2006 - - + + + střevo termitů Ent. ureasiticus v tisku - - + - + studniční voda Ent. ureilyticus 2012 + - + - + + + voda, rostliny Ent. faecium Ent. canis 2003 - - + d + výkaly psů Ent. durans 1984 - - + + + + + humánní i veterinární klinický materiál, potraviny (mléčné i masné výrobky), voda (sladká i slaná) Ent. faecium 1984 - - + + + + + člověk (velký klinický význam), živočichové (obratlovci i bezobratlí), potraviny, voda (sladká i slaná), rostliny Ent. hirae 1985 - - + + + + + častý ve veteriálním materiálu, vzácný v humánním klinickém materiálu, rostliny, sladká a slaná voda Ent. lactis 2012 - - + + + + Italský sýr Bitto Ent. mundtii 1986 + - + + + + + typický na rostlinách, vzácně humánní klinický materiál, verinární materiály (obratlovci i bezobratlí), potraviny, sladká i slaná voda Ent. ratti 2001 - - + + + w + výkaly krys s průjmem Ent. thailandicus 2008 - - - + + + fermentovaný masný výrobek Mum (Thajsko) Ent. villorum 2001 - - + + + trávící trakt prasat Ent. avium Ent. avium 1984 - - + + d d + veterinární materiál, vzácně humánní infekce, potraviny, voda Ent. devriesei 2005 - + - + d dobytek, fermentované masné výrobky, kozí mléko, uzená mihule říční Ent. gilvus 2002 + - + + + + + humánní klinický materiál, potraviny (sýry, maso, fermentované masné výrobky) Ent. malodoratus 1984 - - + d + + + veterinární materiál, mléčné výrobky (kozí sýry), maso a fermentované masné výrobky Ent. pseudoavium 1989 - - + + - - + výskyt nejasný, původně izolován z mastitidy dobytka, avšak žádné další kmeny nebyly u dobytka doposud nalezeny, jeden kmen byl izolován ze střeva kapra Ent. raffinosus 1989 - - d + + d + humánní klinický materiál, vzácně veterinární materiál, voda Ent. viikkiensis 2011 - + - + + d vzduch továrny zpracovávající brojlery Ent. cecorum Ent. cecorum 1989 - - - + - - + veterinární materiál (pes, kočka, holub, kuře, dobytek, koně), velmi vzácně humánní infekce a voda Ent. columbae 1993 - d d - + typický ve střevě holubů, vzácně ve vodě Ent. dispar Ent. canintestini 2005 - - + - + výkaly zdravých psů Ent. dispar 1991 - - + - + - + humánní klinický materiál, psí výkaly Ent. gallinarum Ent. casseliflavus 1984 + + + + + + + typicky izolovaný z rostlin, člověk i živočichové (obratlovci i bezobratlí), potraviny, voda Ent. gallinarum 1984 - + + + + + + humánní i veterimármí klinický materiál, potraviny (maso, fermentované masné výrobky), voda (sladká i slaná) Ent. italicus Ent. camelliae 2007 - - - + - + fermentované čajové lístky Ent. italicus 2004 - - w d - + mléčné výrobky Nezařazené druhy Ent. aquimarinus 2005 - - + - mořská voda Ent. asini 1998 - - w w - + + střevní obsah osla, psí výkaly Ent. hermanniensis 2004 - + - d - w krční mandle psů, maso brojlerů, fermentované masné výrobky Ent. pallens 2002 + - + + + + + humánní klinický materiál, psi Ent. phoeniculicola 2003 - - - kostrční žláza Dudkovce stromového Ent. saccharolyticus 1991 - - + + w - + hnůj, chlévská podestýlka Ent. sulfureus 1991 + - + - + - + rostliny +, pozitivní; -, negativní; d, variabilní; w, slabě pozitivní 100 96 79 54 55 60 56 67 99 97 99 95 61 99 100 98 60 82 64 99 99 66 86 71 85 68 63 Ent. ratti (AF326472) Ent. faecium Ent. dispar Ent. avium Ent. faecalis Ent. cecorum Ent. casseliflavus Ent. italicus Ent. faecium (AJ276355) Ent. lactis (GU983697) Ent. hirae (AF061011) Ent. durans (AJ276354) Ent. villorum (AJ271329) Ent. canis (X76177) Ent. mundtii (AF061013) Ent. thailandicus (EF197994) Ent. phoeniculicola (AY028437) Ent. devriesei (AJ891167) Ent. viikkiensis (HQ378515) Ent. pseudoavium (AF061002) Ent. avium (AF133535) Ent. malodoratus (AJ301835) Ent. raffinosus (Y18296) Ent. gilvus (DQ411810) Ent. hermanniensis (AY396047) Ent. pallens (DQ411812) Ent. asini (Y11621) Ent. dispar (AF061007) Ent. canintestini (AJ888906) Ent. gallinarum (AF039900) Ent. casseliflavus (AF039903) Ent. faecalis (AB012212) Ent. rivorum (FN822765) Ent. termitis (AM039968) Ent. plantarum (HQ847537) Ent. moraviensis (AF286831) Ent. ureilyticus (AJ276352) Ent. rotai (AJ276353) Ent. ureasiticus (GU457264) Ent. haemoperoxidus (AF286832) Ent. quebecensis (GU457262) Ent. silesiacus (AM039966) Ent. caccae (AY943820) Ent. aquimarinus (AJ877015) Ent. saccharolyticus (AF061004) Ent. sulfureus (AF061001) Ent. camelliae (EF154454) Ent. italicus (AJ626902) Ent. cecorum (AF061009) Ent. columbae (AF061006) V. fluvialis (Y18098) 0.5 %
