Chlorofylová termoluminiscence listových terčíků

Martin JanoškaOstravská Univerzita v Ostravě

2008/2009

Experimentální metody studia fotosyntézy

Chlorophyll thermoluminescence of leaf discs: simple instruments and progress in signal interpretation open the way to

new ecophysiological indicators

Autor: Jean-Marc Ducruetz: Journal of Experimental Botany 2003

Výchozí článek:

Termoluminiscence:• dále jen TL• TL = tepelné vysvěcování • Luminiscence, která je vyvolána vzrůstem teploty po předchozím dodání energie (=

excitaci)

• Excitace však musí proběhnout za tak nízké teploty, aby excitované elektrony zůstaly „polapeny“ v záchytných centrech.

– Jakmile budou tato centra zcela zaplněna, zastavíme excitaci a počkáme až dozní fluorescence - jakákoliv emise světla

– Pak postupně zvyšujeme teplotu až dojdeme k teplotě, při které se elektrony uvolní ze záchytných center nacházejících se ve fotosystému II, a tak začne další emise světla – uvolněné elektrony rekombinují s ionizovanými aktivátory – vzniká termoluminiscence.

• Pomocí TL můžeme odhalit emisní pásy, které jsou mnohem více rozpoznatelné než při měřeních využívajících konstantní teplotu.

• Časový interval mezi excitací a tepelnou aktivací může být značně dlouhý.

Termoluminiscence – termoluminiscenční křivka:

• Graf závislosti intenzity luminiscence na teplotě při lineárním vzrůstu teploty – termoluminiscenční křivka– Její intenzita nejdříve stoupá, dokud roste pravděpodobnost

uvolnění elektronů, ale jakmile se zásoba „polapených“ elektronů vyčerpá klesne opět na nulu

– podle termoluminiscenční křivky a podle polohy maxima Tmax můžeme zjistit hloubku záchytných center

– Průběh termoluminiscenční křivky závisí na dvou parametrech:

» Frekvenčním faktoru s» Hloubce záchytného centra E

• Intenzita TL Bte charakterizuje rychlost úbytku elektronů na záchytných centrech dn/dt

Termoluminiscenční křivka

Obr.1: Termoluminiscenční křivka při lineárním vzestupu teploty T = b.t

Model Fotosystému II

• V 60 – tých letech byl pomocí fluorescence chlorofylu u luminiscence úspěšně vytvořen model PS II, který byl poté v 80 - tých letech podpořen výsledky TL.

• Nabité páry jsou uloženy jako:• Elektrony na primárním chinonickém akceptoru jako Qa

- (centra jsou uzavřena), a krom toho na sekundárním akceptoru jako Qb

- (centra otevřena)• Čtveřice + díry uspořádané jako S1

+, S2+, S3

+, S4+

komplex, z nichž pouze S2 a S3 jsou schopné se znovu smísit s Qa a Qb.

Signální analýzy• Teorie „rekombinace náboje“ byla poprvé vypracována

pro minerály Randallem a Wilkinsenem (1945)

• Předpokládali, že rekombinace fixních +/- nabitých párů se podrobí kinetice prvního řádu

• Teoretická simulace kinetiky prvního řádu se dobře hodí k nejdůležitější části B pásu indukované jednotlivými záblesky, které jen vytvářejí dvojici S2Qb

-, mimo okrajů při nízké a vysoké teplotě způsobené minoritními pásy.

• Simulace je nezbytná pro rozklad signálu termoluminiscence na elementární pásy.

• To se provádí upravením tří parametrů každého pásu; jde o Ea = aktivační energie, N = počet nabitých párů, N0 = počáteční koncentrace nabitých párů zjištěná měřícím systémem

Název Tm standart

(0C) Posun v Tm (0C) Původ

Pásy fotosystému II      

(před iluminací)      

       

A -15   Z+Qb-

Q 5   S2Qa-

B 35 28 S2Qb-

  45 22 S3Qb-

AG 55 35 S2/S3Qb+e-

C     D+Qa-

       

Oxidativní pásy      

(nezávislé na iluminaci)      

       

HTL1 65-85   aldehydy a H2O2

HTL2 120-140   lipid. Peroxidy

HTL3 více než 160   Zahřívání

Tabulka č.1: Pásy pozorované při luminiscenci listu, hodnoty Tm

korespondují se zahřívacím poměrem 0,50C/s.

Měření termoluminiscence

• Termoluminiscence je jednoznačně destruktivní technikou, i když do jisté míry neinvazivní

• Měření probíhá na čerstvých listových terčících, které nabízejí ještě lepší úroveň integrity než intaktní chloroplasty a protoplasty

• TL je speciální metodou, která poskytuje lepší rozlišení signálu z vyzařujících záchytných center na úkor tepelného zpracování vzorku

• Pokrok v termoelektrických Peltierových prvcích (jedna strana chladí, druhá hřeje) a lehkých kompaktních detektorech umožnily rozvoj jednoduchých, cenově dostupných a přenosných přístrojů.

• Jak se TL stává nástrojem rostlinné ekofyziologii, může se stát nutností důkladnější úprava listů mimo termoluminiscenční komory

Obr.2: Termoluminiscence (čáry) a fluorescence (tečky) listového terčíku z inbredního druhu kukuřice po 30 s excitaci červeným světlem. Zahřívací poměry: tlusté čáry nebo tečky – 0,5 0C/s; tenké čáry nebo tečky – 0,25 0C/s

Měření termoluminiscence

Obr.3: Přístroj pro měření termoluminiscence listu – verze s detektorem PMT (fotonásobič) blízko u vzorku a vodou chlazeném Peltierovým prvkem

LG - světlovod

FP – řídící jednotka

FB – Walzova žárovka

C – spojovací box

DAQ – A/D převodník

PMT - detektor

S - vzorek

EM - elektromagnet

PU – řídící jednotka

WI – přístup vody

TR – tepl. regulovatelný blok

WO – výstup vody

Měření termoluminiscence

Obr.4: Přístroj pro měření termoluminiscence listu – verze, kdy držák vzorku je držen bokem na jednom rameni světlovodu a se vzduchem chlazeným Peltierovým prvkem

P – Peltierova destička

R + F – ohřívač + fen

HRP – tepelně odolný plast

LG - světlovod

R – mosazný kruh

N2 – přívod dusíku

Klasické TL pásy in vivo• B pás (při 35 0C) je důležitý ve zdravém na tmu adaptovaném listu

podrobenému jednomu nebo několika jednoduchým zábleskům, ačkoliv minoritní pásy mohou být také detekovány: například Q pás na spodním okraji, AG nebo C pásy na horním okraji.

• Vzrůst Q pásu (Tm = 5 0C) obecně spojován s C pásem (Tm = 55 0C), což odráží poškození sekundárního chinonického akceptoru v PS II Qb, indukovaném například při fotoinhibici.

• Pás A se objeví v případě poškození kyslík vyvíjejícího komplexu.

• Kromě objevení nových stresem indukovaných pásů, může být charakterizace B pásu sama o sobě velmi informativní.

• Během působení fotoinhibitorů, se intenzita B pásu snižuje souběžně s hodnotou fluorescenčního parametru FV/FM, odrážející destrukci PS II center.

• Z experimentu bylo zjištěno, že u zmrazených listů je nejvyšší pík B pásu při 35 0C aniž by záleželo na počtu záblesků, kdežto u nezmrazených listů po jednom záblesku nejvyšší pík při 32 0C a po třech záblescích v blízkosti 28 0C.

Pásy vysoké teploty (HTL)

• Detekujeme je, když vzorek vystavíme velkému stresovému působení – rozmezí teplot zcela destruktivním pro PS II

• Mohou být pozorovány okolo 50 – 60 0C, a sice bez předchozího osvětlení

• Okolo roku 1990 byly objeveny v Moskvě u řas nebo listů vystavených oxidativnímu stresu TL pásy okolo teploty 60 0C, s hlavním pásem dokonce až při teplotě 130 0C

• Dále byly také objeveny pásy vyvolané oxidativním působením vrcholící při 75 0C

• Podobné pásy byly nalezeny i u tabáku ošetřeného houbovým elicitorem

• Konečně pás při 130 0C se objevil, když byl vzorek stlačen v suché „klasické“ termoluminiscenční atmosféře, kde kapalný dusík působil jako vysoušeč, a intenzita tohoto pásu byla korelována obsahem lipidových peroxidů – které se vytvořily během zahřívání

• Naproti tomu, když byly vzorky uchovávány ve vodním médiu o 100 0C, aby se zabránilo vysychání, jak se obvykle pří TL fotosyntetických studiích dělá, byl pozorován pouze pás při 75 0C

• Ostatní pásy poté byly pozorovány při 60 – 90 0C

• Pás při 130 0C může sloužit jako indikátor oxidativního stresu

Obr.5: HTL emise u listových terčíků špenátu nalepených na měděném plechu, zmrazených na 20 hodin při -20 0C, a pak hodinu rozmrzávajícpři pokojové teplotě. Sucho – terčík vysušen ve vakuu před TL bez skleněné destičky; Vlhko – nevysušený disk, TL probíhající bez skleněné desky nad vzorkem; Kontrolní vzorek – nemrznoucí, suché podmínky

Perspektivy termoluminiscence

• Mezi alternativní metody patří tzv. DLE (delayed light emission) – zpožděná světelná emise – jejíž lepším názvem by byls možná světlem modulovaná luminiscence– DLE produkuje zajímavé výsledky, jako je například teplota zlomu shodná

s tepelnou adaptací různých druhů rostlin nebo rozdíly v charakteristických teplotách mrazu , které rozdělují thylakoidy v různých druzích pšenice různících se mrazovou odolností

– DLE si zaslouží být označena jako metoda doplňující TL

• Experimenty na nezmrzlých listových terčících pomocí jednotlivých záblesků, nebo dalekým červeným světlem při přítomnosti specifických inhibitorů vedly k lepšímu porozumění in vivo TL signálů

• TL stejně jako fluorescence chlorofylu informuje nejen o stavu fotosystému II v listových pletivech, ale dává také náhled na energetický stav uvnitř chloroplastů

• Fotosyntetická TL a HTL může být využita v rámci ekofyziologického výzkumu

Využití termoluminiscence:

• Termoluminiscenční dozimetrie

Obrázek 6: Automatický měřící TLD systém Dosacus

Využití termoluminiscence:

• Historické datování stáří předmětů v archeologii

• Radioterapeutické metody ozařování• Studium fotosyntézy

Děkuji za pozornost!